Protocol
OPMERKING: Experimentele protocollen hierin beschreven uitgevoerd aan het Midwesten University werden goedgekeurd door het Midwesten University IACUC.
1. Kamer Eisen
- Bevestig een procedure kamer dat heeft stromend warm en koud stromend water, en een manier om het water uit de tank in de grond te verwijderen, meestal een drain.
- Gebruik een studie tafel waarop de duiken tank te plaatsen. Sinds kamers met afvoerputjes doorgaans worden vormgegeven voor een drainage, gekapt een rubberen stop en leg ze onder de tafelpoten om ervoor te zorgen dat het tafelblad, en dus ook het water oppervlak in de tank, is niveau.
2. Duiken Tank
- Duiken tankbouw
- Teken een rechthoekige tank (100 x 60 x 15 cm) met 3/4 dikke plexiglas voor de bodem en 1/2 in plexiglas voor de zijwanden (figuur 1). Permanent hechten de buitenkant plexiglas stukken van de tank aan elkaar met cyanoacrylaat cement of solvents zoals trichloormethaan.
- Verdeel de tank in 5 kanalen elk ongeveer 100 cm lang, met behulp van verwijderbare 1/2 inch dik plexiglas gesneden in 85 x 15 cm stukken. Permanent plaats groeven in de bodem en de randen van de tank waarin deze kanaal verdelers kunnen worden gestoken in positie.
- Opschorten horizontale Plexiglas stukken uit het kanaal verdelers om een "dak" voor een onderwater duik "tunnel te creëren.
- In een hoek van de tank plaats een verwijderbare verhoogd platform, de "finish", voor ratten te halen uit het water en rust tussen zwemmen en duiken proeven. Ratten zich meestal bruidegom en verwijder het water uit hun vacht, terwijl in de finish area. Plaats hoge rand rond de randen van de finish gebied om te verzekeren de ratten blijven op het platform tussen opleiding proeven.
- Op de tegenoverliggende hoek van de tank van de finish gebied plaatst een kamer die alleen toestaat onder water toegang tot het doolhof. Deze verwijderbare "start eenrea "wordt alleen gebruikt voor het duiken proeven.
OPMERKING: Bij het begin van een snoekduik proef een rat wordt neergelaten in het water terwijl het zitten op een platform in de start kamer; vandaar dit platform wordt de "lift".
OPMERKING: Gebruik een modulair ontwerp, waar het startgebied, eindig gebied, en alle kanalen verdelers zijn verwijderbaar van de tank. Dit wordt gedaan om twee redenen: 1) om te vergemakkelijken het vullen en legen van de tank met water na verwijdering van alle kanalen verdelers, en 2) als een rat raakt gedesoriënteerd, vooral onder water, de stukken kan snel worden gedemonteerd om de rat uit het redden water.
- Het vullen en legen van de tank met water
- Het vullen van de tank met water
- Aan het begin van elke trainingssessie, vul de tank met nieuwe 32 ° C kraanwater tot een diepte van ongeveer 12 cm. Roer het water in de tank te warm of koel zakken minimaliseren.
OPMERKING: Meestal duurt het ongeveer 2 uur tot 12 ratten te trainen. Gedurende deze tijdwatertemperatuur daalt met ongeveer 4 ° C. Tegen het einde van de training koelt het water tot ongeveer 28 ° C. Sinds 30 ° C water is thermoneutrale aan ratten, met behulp van dit warme water, in plaats van water op kamertemperatuur, zal minimaliseren warmteverlies tijdens repetitieve training.
- Aan het begin van elke trainingssessie, vul de tank met nieuwe 32 ° C kraanwater tot een diepte van ongeveer 12 cm. Roer het water in de tank te warm of koel zakken minimaliseren.
- Het legen van de tank met water
- Aan het einde van elke trainingssessie, moet het water uit de tank met een grote slang, zoals een 4 m lang stuk van 1 cm inwendige diameter buis. Volledig onderdompelen slangen in de tank, zodat er geen luchtbellen in de buis. Plaats snel een uiteinde van de slang in de afvoer. De resulterende sifoneffect zal het water uit de tank.
- Terwijl de tank uiteinde van de slang onder het wateroppervlak om de overheveling te behouden, kantel de tank op rand om volledige afvoer van het water te vergemakkelijken.
OPMERKING: Als alternatief, en in plaats van overheveling, installeren van een kraan in de buurt van de bodem van de tank, en sluiteen slang uit de tank tikken om het afvoerputje.
- Het vullen van de tank met water
3. Rat Allergen Overwegingen
- Wegwerphandschoenen te dragen wanneer het hanteren en het trainen van de ratten. De handschoenen zullen contact met het water in de tank, die steevast zal rat urine bevatten te beperken.
OPMERKING: De ratten zullen nat worden tijdens de training, en de kamer zal worden gevuld met een "nat-rat" geur. Dientengevolge een profylactisch regime van antihistaminica kunnen voorkomen of de effecten van allergieën rat beperken. Trainers moet mogelijk ook wegwerp stofmaskers, of N95 maskers dragen, zouden ze ook gevoelig voor allergenen rat geworden.
4. Swim Training
- Dagelijks zwemtraining
OPMERKING: Persoonlijke ervaringen blijkt dat de jongere ratten leren het doolhof beter en sneller, en dus beginnen de training met 35 g pasgespeende ratten de voorkeur aan het gebruik van volwassen ratten.- Vul de tank met water. Zie 2.2.1.
- Afwerking Insertgebied en het kanaal verdelers tot 5 zwemmen kanalen te creëren.
- Tijdens de eerste training voorzichtig lager de ratten met de hand in het water ongeveer 3-5 cm van de finish gebied.
OPMERKING: Bij hun introductie tot waterratten onvast zal verschijnen als ze voor het eerst het gevoel dat u zweeft tegenkomen. De ratten zullen ongeveer peddelen op een ongecoördineerde wijze terwijl het proberen om een manier om het water af te sluiten lokaliseren en kwam uiteindelijk tot de nabijgelegen finish. Door hun aangeboren vermogen om te zwemmen in volgende studies de ratten zwemmen in een meer gecoördineerd naar de finish.
OPMERKING: Ondersteuning van de ratten van onder, zodat hun voeten op de onderzoekers handen. Sluit voorzichtig de ratten in het water, en laat ze weg te zwemmen van de hand, in plaats van ze te laten vallen in het water. - Tussen trials liet de ratten blijven de aankomst gedurende ten minste 1 min. Dit is om de ratten te verzorgen en te verkennen, zodat zij beschouwen de finish gebied als een "veilige" plekte gaan tussen de trials. Dit in tegenstelling tot het grijpen van een rat die zojuist voltooide een proces en direct positioneren terug in het water om de volgende proef te starten.
OPMERKING: Sluit de externe beloning (dwz, voedsel) niet te gebruiken tijdens de training, om activering van beloning circuits in de hersenen voorkomen. - Na de finish gebied wachttijd, zachtjes houd de ratten gedurende 1 minuut voor het begin van de volgende proef. Zachtjes droog de ratten met een handdoek tijdens deze pre-trial hold sinds repetitieve binnenkomst in het water zullen ratten leiden tot zeer nat, en het drogen van hen zal onderkoeling te voorkomen.
- Herhaal 4.1.3. door 4.1.5. te voltooien 3 tot 5 proeven voor elke rat tijdens een dagelijkse duik training worden opgeleid.
- Verwijder alle kanalen verdelers en finish gebied van de tank.
- Leeg het water uit de tank. Zie 2.2.2.
- Wekelijkse zwemtraining schema
- Voer het dagelijks trainingssessies (zie 4.1.) 5 dagen per week, idealiter tegelijkertijdelke dag.
- Begin de eerste proef van de afstand met succes onderhandeld over de vorige dag. Begin van de tweede en derde trials uit een grotere afstand.
- Met elke volgende dagelijkse training vergroot de afstand tussen waar de ratten in het water en de afwerking gebied worden geplaatst. Voor de eerste paar trainingen verhogen deze afstand van 5-10 cm. Nadat de ratten lijken meer comfortabel met zwemmen, verhoogt u de afstanden van 30-50 cm.
- Gebruik grotere stijgingen in het zwemmen afstanden, terwijl de ratten leren om een recht gedeelte van een duik kanaal zwemmen. In tegenstelling, het leren van de hairpin zwemmen blijkt tussen kanalen misschien 2-3 trainingen vinden.
OPMERKING: Vaak, tijdens het wachten in de aankomstzone, ratten zal opnieuw in het water te zwemmen en / of dompel hun hoofd onder water, terwijl nog steeds zittend op de finish gebied platform. - Herhaal deze dagelijkse training protocol over 3 weken om succesvol te zwemmen van de gehele 5 kanalen te garanderen.Deze herhaling training protocol waarborgt een succesvolle afronding van het doolhof, vooral omdat het doolhof bevat afwisselend links en rechts haarspeldbochten.
5. Duiktraining
OPMERKING: Nadat de ratten hebben geleerd om met succes te onderhandelen zwemmen door het doolhof zijn ze klaar om duikopleiding te beginnen.
- Initial duikopleiding (eerste dag)
- Steek start kamer. Vul de tank met water (zie 2.2.1.). Zorg ervoor waterniveau is 1 cm onder de opening naar het startgebied.
- Plaats finish en kanaal verdelers tot 5 zwemmen kanalen te creëren.
- Tijdens de eerste duik sessie trainen de ratten te worden neergelaten op de lift in het water binnen de start kamer. Toegang tot de doolhof is vanaf de bodem van de start kamer. Tijdens deze eerste sessie is het waterpeil laag genoeg zodat de rat gemakkelijk kunnen zwemmen vanaf de start kamer in het doolhof. Laat de rat te blijven zwemmen door het doolhof aande finish gebied.
- Tussen trials liet de ratten blijven de aankomst gedurende ten minste 1 min.
OPMERKING: Sluit de externe beloning (dwz, voedsel) niet te gebruiken tijdens de training, om activering van beloning circuits in de hersenen voorkomen. - Na de finish gebied wachttijd, zachtjes houd de ratten gedurende 1 minuut voor het begin van de volgende proef. Zachtjes droog de ratten met een handdoek tijdens deze pre-trial hold.
- Herhaal 5.1.3. door 5.1.5. tot 3 trials vullen voor elke rat tijdens deze eerste duik training worden opgeleid.
- Verwijder alle kanalen verdelers, beginnen kamer en finish gebied van de tank.
- Leeg het water uit de tank. Zie 2.2.2.
- Initial duikopleiding (tweede dag)
- Steek start kamer. Vul de tank met water (zie 2.2.1.). Zorgen voor water niveau is iets boven de opening naar het startgebied.
- Plaats finish en kanaal verdelers tot 5 zwemmen kanalen te creëren.
- Tijdens de tweede duiktrainingssessie het waterpeil is verhoogd, zodat aan het begin de kamer van de rat heeft om het hoofd te dompelen onder de rand van de start kamer naar de doolhof betreden verlaten. Beschouw dit als de rat's eerste duik. Laat de rat om dan verder te zwemmen door het doolhof naar de finish gebied.
- Laat de ratten blijven de aankomst gedurende ten minste 1 minuut tussen studies.
OPMERKING: Sluit de externe beloning (dwz, voedsel) niet te gebruiken tijdens de training, om activering van beloning circuits in de hersenen voorkomen. - Na de finish gebied wachttijd, zachtjes houd de ratten gedurende 1 minuut voor het begin van de volgende proef. Zachtjes droog de ratten met een handdoek tijdens deze pre-trial hold.
- Herhaal 5.2.3. door 5.2.5. tot 3 trials vullen voor elke rat tijdens deze duik training worden opgeleid.
- Verwijder alle kanalen verdelers, beginnen kamer en finish gebied van de tank.
- Leeg het water uit de tank. Zie 2.2.2.
- Initial duikopleiding (tHird dag)
- Steek start kamer. Vul de tank met water (zie 2.2.1.), Ervoor te zorgen dat het waterniveau boven de opening naar het startgebied.
- Plaats finish en kanaal verdelers tot 5 zwemmen kanalen te creëren. Plaats een horizontaal stuk plexiglas onmiddellijk buiten het startgebied van een 5 cm lang duiken tunnel te creëren.
- Tijdens de derde duik trainingssessie de rat heeft om het hoofd te dompelen onder de rand van de start kamer en zwem 5 cm onder water naar het open water van het zwemmen kanaal te bereiken. Laat de rat om dan verder te zwemmen door het doolhof naar de finish gebied.
OPMERKING: Eenmaal geplaatst in het startgebied, ratten starten hun eigen onderwater overstroming, en dus deze worden beschouwd als "vrijwillige" duiken zijn. - Laat de ratten blijven de aankomst gedurende ten minste 1 minuut tussen studies.
OPMERKING: Sluit de externe beloning (dwz, voedsel) niet te gebruiken tijdens de training, om activering van beloning circuits in de hersenen voorkomen. - Na de finish gebied wachttijd, zachtjes houd de ratten gedurende 1 minuut voor het begin van de volgende proef. Zachtjes droog de ratten met een handdoek tijdens deze pre-trial hold.
- Herhaal 5.3.3. door 5.3.5. te voltooien 3 tot 5 proeven voor elke rat tijdens deze duik training worden opgeleid.
- Verwijder alle kanalen verdelers, beginnen kamer en finish gebied van de tank.
- Leeg het water uit de tank. Zie 2.2.2.
- Wekelijkse duik trainingsschema
- Voer het dagelijks trainingen (zie 5.3.) 5 dagen per week, idealiter op hetzelfde tijdstip iedere dag.
- Begin de eerste proef van de afstand met succes onderhandeld over de vorige dag. Begin de tweede en derde trials met een verhoogd duiken afstand.
- Met elke volgende dagelijkse trainingssessie verhogen van de lengte van de duik tunnel door het toevoegen van extra horizontale verdelers om de afstand van de ratten moeten zwemmen onder water uit te breiden. Voor de eerste paar trainingen toename this afstand van 5-10 cm. Nadat de ratten lijken meer comfortabel met duiken, verhoogt u de afstanden van 30-50 cm.
OPMERKING: Niet soms gedwongen de duik afstand geprobeerd tijdens opeenvolgende trials. Eventueel til het einde van de horizontale kanaalbedekking kortere duiken afstanden inhouden. Als er tijdens een duik proef een rat niet het einde van de duik tunnel bereiken en begint rond onderwater zetten, snel til het einde van het kanaal deksel en laat de rat aan de oppervlakte en verder zijn zwemmen. Dit zal de rat in staat stellen om met succes te voltooien een langere duik afstand. Deze positieve bekrachtiging zal de rat blijven bewegen naar voren door de onderwater tunnel met elke duik trial. - Gebruik grotere stijgingen in het duiken afstanden, terwijl de ratten leren om een recht gedeelte van een duik kanaal duiken. In tegenstelling, leren duiken rond de haarspeldbochten tussen kanalen misschien 2-3 trainingen vinden.
OPMERKING: Vaak, tijdens het wachten in de aankomstzone, ratten zal opnieuw invoeren the water om te zwemmen, en / of onder te dompelen hun hoofd onder water, terwijl nog steeds zittend op de finish gebied platform. - Herhaal deze dagelijkse training protocol over 3 weken de tijd om een succesvolle duiken van de gehele 5 kanalen te garanderen. Deze herhaling training protocol waarborgt een succesvolle afronding van het doolhof, vooral omdat het doolhof bevat afwisselend links en rechts haarspeldbochten.
NB: De volledige 6 weken zwemmen en duiken trainingsschema valt samen met de groei van 35 g pasgespeende ratten tot een lichaamsgewicht van 300 gram te bereiken. - Na de dagelijkse trainingen zijn voltooid, en de ratten zijn teruggekeerd naar hun kooi, zorgen ratten snel hun vacht te drogen door middel van het verzorgen, of indien nodig, plaats een verwarmingselement onder hun kooi aan de ratten warm te houden totdat hun vacht droog is.
6. Experimentele Variaties
OPMERKING: De basis experimentele set-up en dierlijke training zijn hierboven beschreven. Echter, gedragstraining alleen provides een model voor gebruik met andere experimentele technieken om gegevens van belang te verzamelen. Basic protocollen worden aangepast aan de specifieke aspecten van het duiken respons te onderzoeken. Voorbeelden van deze modificaties en enkele overwegingen voor het verzamelen van gegevens met behulp van deze fysiologische en neuroanatomisch technieken worden hieronder gegeven.
- Implanteerbare Telemetric Zenders
- Na voltooiing van de opleiding, in de handel verkrijgbare telemetrische zenders pulserende arteriële bloeddruk te verzenden van zwemmen en duiken ratten. Verkrijgen lokale IACUC goedkeuring voor de procedures met betrekking tot chirurgie en postoperatieve herstel. Volg de implantatie procedures voorgesteld door de onderneming voor hun zender, en zorgen voor volledig herstel van de operatie voordat u terugkeert van de rat in het water.
- Zorg ervoor dat de antenne ontvangen van het radiosignaal is vlakbij als de rat in het water.
OPMERKING: Water verzwakt radiosignalen, en dus de afstand het radiosignaal needs om te reizen door het water wordt het een beperkende factor van de afmetingen van de tanks. - Gebruik een handheld antenne wand in plaats van een rat kooi sized antenne, de rat volgen bij het doorlopen van de doolhof. Houd de wand antenne binnen 30 cm van de rat zodat het radiosignaal niet verloren gaat terwijl de rat onder water.
- Trailing Canules
- Herontwerp van de channel verdelers en horizontale stukken maken het dak van de tunnel duiken, zodat de canule paden langs achter de rat tijdens de progressie door het doolhof.
OPMERKING: Het modulaire ontwerp van de kanalen is van het allergrootste belang en moet ook zorgen voor een snelle herstellen van de rat uit de onderwater doolhof. Als een canule haken en ogen en werd verdreven uit de rat, kon de rat snel doodbloeden terwijl onderwater als de canule wordt niet snel weer vastgemaakt. - Gebruik trailing arteriële canules om de arteriële bloeddruk en de hartslag op te nemen in vrijwillig duiken ratten. Gebruik een 90 cm stuk PE50 alsslepend canule.
Opmerking: Deze canule lengte is lang genoeg om de rat verbinden met de drukomvormer terwijl nog steeds de rat om de voortgang door de doolhof, maar is kort genoeg om canule dode ruimte te minimaliseren en is dicht genoeg bij de drukopnemer voldoende betrouwbaarheid van de allow arteriële druksignaal. - Gebruik achterste veneuze (of arteriële) canules farmaceutische middelen zoals parasympathische en sympathische agonisten en antagonisten injecteren, of tracers of kleurstoffen die de verdeling van hartdebiet bepalen injecteren.
- Trekken bloedmonsters van de ratten met behulp van de veneuze (of arteriële) cannulae terwijl de ratten zijn onderwater onderwater catecholamine niveaus of samenstelling van het bloed te bepalen.
OPMERKING: Beperk de lengte van de trailing canule en zijn goed voor de canule dode ruimte in het bloed trekt.
- Herontwerp van de channel verdelers en horizontale stukken maken het dak van de tunnel duiken, zodat de canule paden langs achter de rat tijdens de progressie door het doolhof.
- Detectie van Geactiveerde Brainstem Neuronen
- Gebruik immunologische detectie van de Fos eiwit te identify specifieke gebieden van de hersenstam die deel uitmaken van het duiken respons.
OPMERKING: Bij herhaalde opening van een cardiorespiratoire reflex, hersenstam neuronen die deel uitmaken van deze reflex circuit geactiveerd kan worden en produceren een eiwit Fos. - Herhaaldelijk duiken ratten door het doolhof om de 5 min 2 uur voor een totaal van 24 duiken.
Opmerking Andere protocollen die ook neuronale Fos productie induceren kunnen ook worden gebruikt. Activering van hersenstam neuronen bij de respons op stress te voorkomen, dient het gedrag herhaald worden opgenomen als onderdeel van de gedragstraining.
- Gebruik immunologische detectie van de Fos eiwit te identify specifieke gebieden van de hersenstam die deel uitmaken van het duiken respons.
- Blood corticosteronspiegels tijdens Duiken
- Gebruik corticosteron als een indicator van het niveau van stress ratten ervaring tijdens het zwemmen en duiken.
- Om bloed te verkrijgen voor corticosteron analyse, trekken 0,1 ml bloedmonsters uit de staartader van ratten 15 min na 3 vrijwillige zwemmen of duiken.
OPMERKING: Voorlopige experimenten bleek dat 15 min is sufficient tijd overlaat voor de productie en afgifte van corticosteron in de circulatie en veroorzaken een piek in plasma corticosteron niveaus. Aangezien corticosteronspiegels een circadiane ritme, schema alle bloedafnames op hetzelfde tijdstip en correspondeerde met de timing trainingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle afronding van de beschreven zwemmen en duiken training procedures kan de stress ervaren door ratten bij het duiken onder water te verlagen. Bloed corticosteron niveaus geven aan dat repetitieve dagelijkse training vermindert de stressfulness geassocieerd met vrijwillige duiken, en opgeleid ratten vind duiken niet meer stress dan wordt dagelijks behandeld door een mens (figuur 2; 17). Omgekeerd ratten niet getraind in het duiken protocol vinden vrijwillige duiken stressvolle (figuur 2; 17). Bovendien, zowel getrainde en ongetrainde ratten vinden gedwongen te duiken om de meest stressvolle (figuur 2; 17) zijn.
De cardiovasculaire reacties van zwemmen, duiken vrijwillige en gedwongen duiken ratten werden opgenomen met geïmplanteerde telemetrietoestellen (figuur 3; 8,17-20) en achterrand canules (figuur 4; 21-23). Onmiddellijk na vrijwilligeonderdompeling, en binnen één beat, de hartslag daalt met 78% en de gemiddelde arteriële bloeddruk daalt met 25% 17. Deze resultaten tonen dat vrijwillig duiken ratten vertonen dezelfde cardiorespiratoire veranderingen typisch gezien in andere dieren duiken. Trailing arteriële canules zijn gebruikt om de muscarine antagonist atropine, die bradycardie verbonden vrijwillige duiken (figuur 4; 21) elimineert injecteren, en de verdeling van hartdebiet 22, inclusief cerebrale bloedstroom 23, bepaalt gedurende vrijwillige duiken. Trailing canules zijn ook gebruikt om aan te tonen dat ratten negeren toenemende arteriële hypoxemie en hypercapnie terwijl ze ondergedompeld 18, en die bestaande chemoreceptor drive heeft geen effect op het cardiovasculaire reacties op vrijwillige duiken 21 niet.
Neuronen in laminae I en II van het ventrale medullaire dorsale hoorn (MDH) uiten Fos during vrijwillige duiken, en deze neuronen kunnen de initiële hersenstam afferente relais van de duik-respons (; 24 Figuur 5) vormen. Belangrijke hersenstam cardiorespiratoire controle gebieden, zoals de caudale pressor gebied (CPA), nucleus tractus eenlingen (NTS), rostral ventrolaterale medulla (RVLM), en peribrachial regio's, alle tonen verhoogde Fos etikettering tijdens vrijwillige duiken vergelijking met zwemmen 25. Neuronen in chemotherapie gevoelig gebieden van de hersenstam te uiten Fos na lange duur gedwongen duiken 18.
Figuur 1:. Schema van Duiktank A Plexiglas tank (100 x 60 x 15 cm) werd gebruikt om een eenvoudige doolhof bestaat uit vijf 1 m kanalen te creëren. De tank was gevuld met 30 ° C leidingwater, en ratten werden aanvankelijk getraind om onderhandelingspositiee het doolhof door te zwemmen aan de oppervlakte van het water, uit het startgebied (linksboven) naar de Finish Area (rechtsonder). De ratten werden vervolgens getraind duiken door de doolhof gehouden onderwater horizontale plexiglas stukken geplaatst onder het wateroppervlak 2-3 cm. [Dit cijfer is aangepast van 26]
Figuur 2: corticosteron metingen. Bloed trekt uit rattenstaart aders werden gebruikt om corticosteron concentraties (gemiddelde ± SE) van ratten verlaten in hun kooien (Naïve) te meten, ratten behandeld gedurende 10 min / dag (Behandeld), ratten getraind om te zwemmen en duiken (Opgeleid), en ratten dat u niet zwemmen of duiken training (Untrained) ontvangen. Corticosteron werd gemeten na getrainde ratten hun zwemtraining (Links set van bars) had voltooid, had na getrainde ratten hun vrijwillige div afgeronde opleiding (Center set van bars), en na getrainde ratten hadden hun gedwongen duikopleiding (juiste set van bars) afgerond. 1 aangegeven waarde aanzienlijk groter is dan Naïve; 2 geeft waarde aanzienlijk groter is dan afgehandeld; 3 geeft waarde aanzienlijk groter is dan opgeleid; * Geeft aan dat Getrainde ratten waarde tijdens geforceerde duik aanzienlijk hoger dan tijdens vrijwillige duiken. [Dit cijfer is aangepast van 17]
Figuur 3: Arteriële bloeddruk sporen van telemetrische transmitters Ruwe data sporen waaruit pulserende bloeddruk tijdens zwemmen (linker kolom), vrijwillige duiken (middelste kolom) en gedwongen duiken (rechterkant) van ratten getraind om zwemmen en duiken door het doolhof. (onderste rij) en van ratten die niet de trai hadning procedure (bovenste rij). Duiken onder water (zowel vrijwillige als gedwongen overstroming) produceerde een onmiddellijke bradycardie en tragere onset toename van de arteriële druk, terwijl zwemmen op het oppervlak van het water veroorzaakt geen dergelijke cardiovasculaire veranderingen. Balken onder de sporen te geven perioden van onderdompeling. Breuken in trace geven perioden waarin de telemetrische signaal werd verloren. [Dit cijfer is aangepast van 17]
Figuur 4: Atropine elimineert duiken bradycardie. Originele opnamen van pulserende arteriële bloeddruk van vrijwillig duiken ratten (A) voor en (B) na atropine pre-behandeling. Sporen werden verkregen met een achterste arteriële canule. Voordat atropine pre-behandeling, arteriële druk daalde licht na onderdompeling, maar tduivin gestegen tot meer dan pre-duik voor de rest van de duik. De hartslag werd bepaald uit aangrenzende polsdruk intervallen. Na onderdompeling was er een onmiddellijke en aanzienlijke bradycardie die werd opgelopen voor de duur van de duik. Na parasympathische blokkade door atropine voorbehandeling de bradycardie werd geëlimineerd. Er was ook een toename van de arteriële druk tijdens de duik. De balk onder het spoor geeft de periode van onderdompeling. [McCulloch, ongepubliceerd]
Figuur 5: Fos etikettering binnen de MDH. Microfoto van de nervus medullaire dorsale hoorn (MDH) en de spinale trigeminus-darmkanaal (SP5) bij ratten getraind om te duiken onder water. (A) In een controlegroep ratten die niet herhaaldelijk deed duiken er geen Fos etikettering. (B) In een zwemmende rat er is zeer verlichttle Fos label in het MDH (grote pijlpunt) of paratrigeminal nucleus (kleine pijl) binnen SP5. (C) In een duiken rat er meer Fos etikettering ventraal zowel het MDH (grote pijl) en paratrigeminal nucleus (pijltjes) vergeleken het zwemmen en controle ratten. Plaats in paneel (A) geeft de rostrale-caudale locatie van panelen AC. Schaal bar in paneel C is 100 micrometer. [Dit cijfer is aangepast van 24]
Figuur 6: Activated catecholaminerge neuronen duiken ratten. Microfoto tonen medullas van een niet-diving control rat (A, C en E) en een vrijwillig duiken rat (B, D en F). Het hersenweefsel werd immunohistologisch verwerkt voor zowel Fos eend tyrosine hydroxylase (TH), de productie van bruin TH SOMA en zwarte Fos kernen. Open pijlpunten identificeren single-label TH-positieve neuronen, terwijl stevige pijlen identificeren Fos + TH double-gelabelde neuronen. A1 neuronen zijn geïdentificeerd in A en B. C1 neuronen zijn geïdentificeerd in C en D. A5 neuronen zijn geïdentificeerd in E en F. Meer Fos en TH dubbel gelabeld worden gezien in de A1, C1 en A5 gebieden van de rat dan duiken in de niet-duik controle ratten. Kalibratiebalk in E is voor panelen AF, en is 250 pm. Kalibratiebalk in inzet in F is voor alle bijvoegsels, en is 50 micrometer. [Dit cijfer is aangepast van 26]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ratten in hun wilde vorm kan en doen exploiteren semi-aquatische milieus, en zal vaak duiken onder water, terwijl op zoek naar voedsel 6. Het is dus niet zo verwonderlijk dat ratten heel gemakkelijk kunnen worden opgeleid om vrijwillig onder water duiken. De beschreven training procedures kan duren tot 6 weken, die pas gespeende ratten zal brengen aan een lichaamslengte gebruikt in de meeste volwassen hersenen van de rat atlassen (~ 300 g). Dus de hersenen van deze getrainde dieren gemakkelijker vergelijkbaar met de anatomische structuren die in deze atlassen zijn.
Nadat in het startgebied wordt geplaatst meeste ratten zullen hun onderwater zwemmen binnen 20 seconden beginnen. Echter, af en toe een rat zal duren tot 5 min of meer voor de aanvang van haar vrijwillige duik. Hoewel het misschien verleidelijk in dit stadium de ratten ver in de onderwater tunnel, dit algemeen moet worden vermeden om te voorkomen dat de ratten welke de water met een negatieve ervaring. Knaagdieren kunnen koppig zijn en moge initibondgenoot weigeren om te duiken tijdens de trainingen, maar zodra ze beseffen de enige manier om het water af te sluiten is door het invullen van de duik door het doolhof, zijn ze meestal initiëren hun duiken kort na in het startgebied wordt geplaatst.
Een kritisch aspect van de herhalingen en methodische opleidingsprocedures is dat zij wordt uitgevoerd op zodanige wijze om de spanning ervaren door de ratten te verminderen. Letting ratten verkennen hun omgeving, in het bijzonder, terwijl in de afwerking gebied tussen trials, lijkt om stress te verminderen. Ratten zullen vaak opnieuw in te voeren het water om te zwemmen, en / of onder te dompelen hun hoofd onder water, terwijl nog steeds zittend op de finish gebied platform. Dit suggereert dat ratten zijn niet inherent water aversieve. Bovendien, terwijl het niet ongewoon voor ratten fecale pellets tijdens het zwemmen of duiken of tijdens het wachten op de aankomst gebied, dagelijkse training resulteert in minder fecale pellets 17. In het algemeen is het minder gestrest de ratten zijn tijdens de opleiding, hoe minder pellets zij zullen produceren. Elke fecale pellets die geproduceerd worden uit het water of finish zo snel mogelijk het water betrekkelijk schoon.
Ratten kunnen af en toe krijgen bloedneuzen tijdens het zwemmen en duiken, die een gevolg is van het inblazen van water in de neus kunnen zijn. Het uiterlijk van bloed kan worden veroorzaakt osmotische spanningen binnen het neusslijmvlies. Terwijl in de afwerking gebied tussen trials de ratten zelf zal verzorgen. Bijgevolg bloed uit de neus kan krijgen gedistribueerd via ratten hoofd en snuit, waardoor de ratten licht roodachtige tint, vooral rond de ogen, tijdens een training. Ook kan af en toe een rat vinden duiken stressvolle en / of negatieve ervaringen te duiken (dwz, door zich om te draaien en te verdwalen tijdens het duiken onder water (zie opmerking na 5.4.3. Over hoe om dit te voorkomen)). In deze ratten kunnen porphyrin verschijnen in de hoeken van hun ogen, het signaleren van een stress-response.
De grootte van het duiken tank enigszins bepalen de ruimte vereisten. De beschreven reservoir bestemd is om ratten zwemmen 2-3 cm onder het oppervlak van het water door een 5 m lang plexiglas doolhof om een onderwater zwemmen duur van 10-15 sec 17,19,24,26,27 geven. Indien een experiment ontworpen om reacties van een langere duur duik meten of uit een dieper water, moet de tank worden herontworpen. De kamer eisen zou dan ook veranderen de afmetingen van een opnieuw ontworpen diving tank past. Als er geen afvoer in de procedurekamer, kan het water uit de tank worden verzameld in een grote houder, zoals een 60 gal vuilnisbak, die vervolgens elders kan worden geleegd op een gunstige manier.
De Fos techniek kan worden gebruikt met andere neuronale detectiemethoden neuronen die deel uitmaken van de hersenstam schakeling van het duiken respons verder identificeren en te karakteriseren. Bijvoorbeeld,En globosa neuronen in de laterale A7 zone 26,27, dat tijdens vrijwillige worden geactiveerd; Fos detectie in combinatie met tyrosine hydroxylase vlekken heeft catecholaminerge neuronen in de A1, C1, A2, A5 en sub-coeruleus gebieden (26 Figuur 6) geïdentificeerd duiken. Ook is Fos detectie in combinatie met de retrograde tracer Cholera toxine de cellichamen van cardiale vagale motorneuronen in de uitwendige vormen van de nucleus ambiguus die tijdens vrijwillige duiken 20 geactiveerd geïdentificeerd.
Onderzoekt het centrale zenuwstelsel integratie van de cardiorespiratoire reacties duiken is belangrijk voor een aantal redenen 6,8,28. Het duiken respons maakt dieren, waaronder mensen, om ondergedompeld onder water blijven zonder ademhaling gedurende langere tijd. Het duiken respons is een functionele reorganisatie van hersenstam homeostatische controle, en toont één van de meest krachtige patterns van autonome reflexen waargenomen bij dieren. Het duiken respons kan ook belangrijk klinisch bij de mens als onderdeel van het trigemino-cardiale reflex, nasofaryngeale reflex, en / of wiegendood zijn. Tenslotte zal een begrip van de neuronale circuits die in de hersenstam van ratten bestaat te bepalen hoe corticale afferente signalen basis- hersenstam autonome reflexen kunnen wijzigen. Al deze overwegingen maken studie van de centrale aspecten van de zoogdieren duiken reactie inherent waardevol en interessant. Met behulp van de beschreven procedures om ratten op te leiden om op vrijwillige basis te duiken onder water zal beter onderzoek van de centrale aspecten van de zoogdieren duiken respons dan zal het gebruik van gedwongen dook dieren mogelijk maken. Dit komt omdat de training procedures beschreven 1) verminderen activering van CZS spanning circuits, en 2) niet activeert CNS beloning circuit omdat externe beloningen niet worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur is een consultant voor Stoelting Company, en op voorwaarde dat het totale ontwerp en de specificaties van de McCulloch Dive Tank Maze om ze voor commerciële doeleinden.
Acknowledgments
Onderzoek ondersteund door financiering uit het Midwesten University Office of Research en gesponsorde programma's. Dank ook aan het Midwesten University Animal Facility en Erik Warren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
References
- Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
- Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
- Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
- Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
- Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
- McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
- Krogh, A. The progress of physiology. Am. J. Physiol. 90, 243-251 (1929).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
- Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
- Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
- Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
- Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
- Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
- Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
- MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
- McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
- McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
- Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
- Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
- McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
- Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
- Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
- McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
- Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
- McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
- McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
- Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).
