Protocol
ملاحظة: وصف البروتوكولات التجريبية التي أجريت هنا في جامعة الغرب الأوسط وتمت الموافقة من قبل الغرب الأوسط جامعة IACUC.
1. متطلبات غرفة
- تأمين غرفة الإجراء الذي تعمل المياه الباردة والساخنة على التوالي، وطريقة لإزالة المياه من الخزان، وعادة ما يكون نزيف في الكلمة.
- استخدام جدول الدراسة التي وضع خزان الغوص. منذ غرف مع المصارف الطابق عادة ما احيط لتصريف المياه، وخفض السدادات المطاطية ووضعها تحت أرجل الطاولة لضمان أعلى الجدول، وبالتالي سطح الماء في الخزان، هو مستوى.
2. الغوص تانك
- تانك الغوص البناء
- بناء خزان مستطيلة (100 × 60 × 15 سم) باستخدام 3/4 في زجاجي سميك لأسفل و02/01 زجاجي لفي الجدران الجانبية (الشكل 1). دائم إرفاق زجاجي خارج قطعة من خزان معا باستخدام الاسمنت cyanoacrylate أو solvenTS مثل المخففة.
- تقسيم الخزان الى 5 سم تقريبا كل القنوات 100 في الطول، باستخدام زجاجي سميك 1/2 بوصة قابلة للإزالة يقتطع 85 × 15 سم قطعة. وضع دائم الأخاديد في القاع والحواف للدبابات في هذه فواصل القناة التي يمكن مشقوق في الموقف.
- تعليق قطع زجاجي أفقية من فواصل قناة لإنشاء "سقف" للغوص "نفق تحت الماء.
- في أحد أركان المكان خزان منصة مرتفعة القابلة للإزالة، "منطقة النهاية"، على الفئران لنقل الخروج من الماء والراحة بين السباحة والغوص المحاكمات. الفئران عادة العريس أنفسهم وإزالة المياه من الفراء، بينما في منطقة النهاية. وضع الجانبين طويل القامة حول حواف المنطقة النهاية لضمان تبقى الفئران على منصة بين التجارب التدريب.
- في الزاوية المقابلة للدبابات من منطقة المركز غرفة التي تسمح فقط الوصول إلى متاهة تحت الماء. هذا قابل للإزالة "بدءالجرمية "يستخدم فقط للمحاكمات الغوص.
ملاحظة: في بداية المحاكمة الغوص وخفضت فأر في الماء أثناء الجلوس على منصة داخل غرفة البداية. وبالتالي يسمى هذا النظام الأساسي على "المصعد".
ملاحظة: استخدام تصميم وحدات، حيث المنطقة بداية، منطقة النهاية، وجميع القنوات فواصل قابلة للنزع من الخزان. يتم ذلك لسببين: 1) لتسهيل ملء وتفريغ الخزان بالماء بعد إزالة جميع فواصل قناة، و2) إذا كان يحصل مشوشا فأر، وخاصة حين تحت الماء، وقطع يمكن تفكيكها بسرعة لانقاذ الفئران من المياه.
- ملء وتفريغ الخزان بالماء
- ملء الخزان بالماء
- في بداية كل دورة تدريبية، وملء خزان مع المياه 32 درجة C الحنفية العذبة على عمق حوالي 12 سم. حرك الماء في الخزان لتقليل جيوب دافئة أو باردة.
ملاحظة: عادة ما يستغرق حوالي 2 ساعة لتدريب 12 الفئران. خلال هذا الوقتدرجة حرارة الماء تنخفض بنحو 4 درجات مئوية. بنهاية الدورة التدريبية الماء يبرد إلى حوالي 28 درجة مئوية. منذ 30 درجة مئوية الماء معتدلة الحرارة على الفئران، وذلك باستخدام هذا الماء الدافئ بدلا من الماء درجة حرارة الغرفة، وتقليل فقدان الحرارة خلال التدريب المتكرر.
- في بداية كل دورة تدريبية، وملء خزان مع المياه 32 درجة C الحنفية العذبة على عمق حوالي 12 سم. حرك الماء في الخزان لتقليل جيوب دافئة أو باردة.
- تفريغ الخزان بالماء
- في نهاية كل دورة تدريبية، واستنزاف المياه من الخزان باستخدام خرطوم كبير، مثل 4 م قطعة طويلة من 1 بوصة قطرها الداخلي الأنابيب. تماما غمر الأنابيب في خزان، وضمان عدم وجود جيوب الهواء هي في الأنبوب. مكان بسرعة واحدة من نهاية الأنبوب إلى استنزاف الأرض. سوف يضخ الأثر الناتج استنزاف المياه من الخزان.
- مع الحفاظ على نهاية خزان للأنابيب تحت سطح الماء للحفاظ على شفط، تقلب دبابة على الحافة لتسهيل التصريف الكامل للمياه.
ملاحظة: بدلا من ذلك، وبدلا من شفط وتركيب حنفية بالقرب من قاعدة للدبابات، والاتصالخرطوم من خزان الصنبور إلى استنزاف الأرض.
- ملء الخزان بالماء
3. اعتبارات الجرذ مسببات الحساسية
- ارتداء قفازات يمكن التخلص منها كلما المناولة وتدريب الفئران. وقفازات تقيد اتصال مع الماء في الخزان، والتي سوف تحتوي دائما الفئران البول.
ملاحظة: إن الفئران أصبحت مبلل أثناء التدريب، وسوف تملأ الغرفة مع "الرطب الفئران" رائحة. بالتالي نظام وقائي من مضادات الهيستامين التي قد تمنع أو تحد من آثار الحساسية الفئران. قد تحتاج المدربين أيضا لارتداء أقنعة الغبار القابل للتصرف، أو أقنعة N95، ينبغي أن تصبح حساسة لمسببات الحساسية الفئران.
4. تدريب السباحة
- تدريب السباحة اليومي
ملاحظة: التجربة الشخصية إلى أن الفئران الأصغر سنا يتعلمون المتاهة بشكل أفضل وأسرع، وبالتالي البدء في التدريب مع 35 غ الفئران مفطوم حديثا هو الأفضل لاستخدام الفئران الكبار.- ملء الخزان بالماء. رؤية 2.2.1.
- الانتهاء من إدراجمنطقة وقناة فواصل لإنشاء 5 قنوات السباحة.
- خلال الدورة التدريبية الأولى خفض بلطف الفئران باليد في الماء حوالي 3-5 سم من منطقة النهاية.
ملاحظة: عند بدء العمل بها للفئران الماء سوف تظهر متقلب لأنها تواجه أول الإحساس العائمة. سوف الفئران مجداف حول بطريقة غير منسقة بينما كان يحاول العثور على طريقة للخروج من المياه ويصل في النهاية إلى منطقة النهاية قريبة. نظرا لقدرة فطرية على السباحة، في التجارب اللاحقة على الفئران وتسبح في أكثر بكثير بطريقة منسقة تجاه منطقة النهاية.
ملاحظة: دعم الفئران من تحت أقدامهم حتى تكون على أيدي المحققين. خفض بلطف الفئران في الماء، والسماح لهم بالسباحة بعيدا عن متناول اليد، بدلا من إفلاتها في الماء. - بين التجارب السماح تبقى الفئران في المنطقة النهاية لا يقل عن 1 دقيقة. هذا هو السماح للفئران لالعريس واستكشاف، حتى أنهم يعتبرون المنطقة النهاية مكانا "آمنا"الذهاب بين التجارب. هذا هو على النقيض من الاستيلاء على الفئران أن أكملت للتو المحاكمة وتحديد المواقع مرة أخرى في الماء لبدء المحاكمة المقبلة على الفور.
ملاحظة: لا تستخدم مكافأة الخارجية (أي الطعام) خلال التدريب، وذلك لمنع تفعيل الدوائر المكافأة في المخ. - بعد فترة الانتظار منطقة النهاية، عقد بلطف الفئران لمدة 1 دقيقة قبل الشروع في المحاكمة القادمة. يجف بلطف بمنشفة الفئران خلال هذا الانتظار قبل المحاكمة منذ دخول المتكررة في الماء سوف يسبب الفئران للحصول على الرطب جدا، وسوف تجفيفها منع انخفاض حرارة الجسم.
- تكرار 4.1.3. من خلال 4.1.5. لإكمال 3 إلى 5 محاكمات لكل فأر لتدريبهم خلال جلسة تدريب السباحة اليومية.
- إزالة جميع فواصل قناة والانتهاء من منطقة الخزان.
- إفراغ المياه من الخزان. رؤية 2.2.2.
- الجدول الزمني للتدريب السباحة الأسبوعية
- دورات تدريبية السلوك اليومي (انظر 4.1). 5 أيام في الأسبوع، من الناحية المثالية في نفس الوقتكل يوم.
- بدء أول محاكمة من المسافة عن طريق التفاوض بنجاح في اليوم السابق. بدء التجارب الثانية والثالثة من زيادة المسافة.
- مع كل دورة تدريبية اليومية اللاحقة زيادة المسافة بين حيث يتم وضع الفئران في الماء ومنطقة النهاية. للدورات التدريبية القليلة الأولى زيادة هذه المسافة من خلال 5-10 سم. بعد ظهور الفئران أكثر راحة مع السباحة، وزيادة المسافات بنسبة 30-50 سم.
- استخدام الزيادات الكبيرة في المسافات السباحة في حين أن الفئران تتعلم السباحة جزء مباشرة من قناة السباحة. في المقابل، تعلم السباحة في منعطف حاد ينتقل بين القنوات قد يستغرق 2-3 دورات تدريبية.
ملاحظة: في كثير من الأحيان، في الوقت الذي تنتظر في منطقة النهاية، والفئران وإعادة إدخال المياه للسباحة، و / أو غمر رأسه تحت الماء في حين لا يزال جالسا على منصة منطقة النهاية. - تكرار هذا البروتوكول التدريب اليومي على مدى 3 أسابيع لضمان السباحة الناجحة ل5 قنوات كاملة.هذا البروتوكول تدريب التكرار يضمن الانتهاء بنجاح من المتاهة، وخاصة منذ المتاهة تشمل بالتناوب المنعطفات دبوس الشعر الأيمن والأيسر.
5. تدريب الغوص
ملاحظة: بعد أن تعلمت الفئران للتفاوض السباحة من خلال المتاهة بنجاح انهم مستعدون لبدء تدريب الغوص.
- تدريب الغوص الأولي (اليوم الأول)
- أدخل غرفة البداية. ملء الخزان بالماء (انظر 2.2.1). ضمان مستوى المياه هو 1 سم تحت الانفتاح على منطقة البداية.
- إدراج منطقة النهاية وفواصل قناة لإنشاء 5 قنوات السباحة.
- خلال الدورة الأولى للغوص تدريب الفئران أن خفض على المصعد في الماء داخل غرفة البداية. الدخول الى متاهات هو من الجزء السفلي من الغرفة البداية. خلال هذه الدورة الأولى على مستوى المياه منخفض بما فيه الكفاية بحيث الفئران يمكن أن تسبح بسهولة من غرفة البداية في المتاهة. السماح للفئران لمواصلة السباحة من خلال المتاهة لمنطقة النهاية.
- بين التجارب السماح تبقى الفئران في المنطقة النهاية لا يقل عن 1 دقيقة.
ملاحظة: لا تستخدم مكافأة الخارجية (أي الطعام) خلال التدريب، وذلك لمنع تفعيل الدوائر المكافأة في المخ. - بعد فترة الانتظار منطقة النهاية، عقد بلطف الفئران لمدة 1 دقيقة قبل الشروع في المحاكمة القادمة. يجف بلطف بمنشفة الفئران خلال هذا الانتظار قبل المحاكمة.
- تكرار 5.1.3. من خلال 5.1.5. لاستكمال 3 محاكمات لكل فأر لتدريبهم خلال هذه الدورة تدريب الغوص الأولية.
- إزالة كافة فواصل القناة، تبدأ غرفة والانتهاء من منطقة الخزان.
- إفراغ المياه من الخزان. رؤية 2.2.2.
- تدريب الغوص الأولي (اليوم الثاني)
- أدخل غرفة البداية. ملء الخزان بالماء (انظر 2.2.1). ضمان مستوى المياه أعلى قليلا من الانفتاح على منطقة البداية.
- إدراج منطقة النهاية وفواصل قناة لإنشاء 5 قنوات السباحة.
- أثناء الغوص الثانيةوقد أثيرت دورة تدريبية منسوب المياه بحيث للخروج من الغرفة بداية الفئران أن تراجع رأسه تحت حافة الغرفة بداية لدخول المتاهة. نعتبر هذا الغوص الأولى في الفئران. السماح للفئران لثم يستمر السباحة من خلال المتاهة إلى منطقة النهاية.
- دعونا تبقى الفئران في المنطقة النهاية لا يقل عن 1 دقيقة بين التجارب.
ملاحظة: لا تستخدم مكافأة الخارجية (أي الطعام) خلال التدريب، وذلك لمنع تفعيل الدوائر المكافأة في المخ. - بعد فترة الانتظار منطقة النهاية، عقد بلطف الفئران لمدة 1 دقيقة قبل الشروع في المحاكمة القادمة. يجف بلطف بمنشفة الفئران خلال هذا الانتظار قبل المحاكمة.
- تكرار 5.2.3. من خلال 5.2.5. لاستكمال 3 محاكمات لكل فأر لتدريبهم خلال هذه الدورة تدريب الغوص.
- إزالة كافة فواصل القناة، تبدأ غرفة والانتهاء من منطقة الخزان.
- إفراغ المياه من الخزان. رؤية 2.2.2.
- تدريب الغوص الأولي (رهيرد اليوم)
- أدخل غرفة البداية. ملء الخزان بالماء (انظر 2.2.1.)، التأكد من أن مستوى المياه أعلى من الانفتاح على منطقة البداية.
- إدراج منطقة النهاية وفواصل قناة لإنشاء 5 قنوات السباحة. وضع قطعة الأفقي للزجاجي على الفور خارج منطقة البدء في إنشاء 5 سم الغوص طويلة النفق.
- خلال الدورة التدريبية الثالثة الغوص الفئران أن تراجع رأسه تحت حافة الغرفة البداية والسباحة 5 سم تحت الماء للوصول إلى المياه المفتوحة للقناة السباحة. السماح للفئران لثم يستمر السباحة من خلال المتاهة إلى منطقة النهاية.
ملاحظة: بمجرد وضعها في منطقة البداية والجرذان الشروع غرق تحت الماء الخاصة بها، وتعتبر بالتالي هذه لتكون الغطس "الطوعية". - دعونا تبقى الفئران في المنطقة النهاية لا يقل عن 1 دقيقة بين التجارب.
ملاحظة: لا تستخدم مكافأة الخارجية (أي الطعام) خلال التدريب، وذلك لمنع تفعيل الدوائر المكافأة في المخ. - بعد فترة الانتظار منطقة النهاية، عقد بلطف الفئران لمدة 1 دقيقة قبل الشروع في المحاكمة القادمة. يجف بلطف بمنشفة الفئران خلال هذا الانتظار قبل المحاكمة.
- تكرار 5.3.3. من خلال 5.3.5. لإكمال 3 إلى 5 محاكمات لكل فأر لتدريبهم خلال هذه الدورة تدريب الغوص.
- إزالة كافة فواصل القناة، تبدأ غرفة والانتهاء من منطقة الخزان.
- إفراغ المياه من الخزان. رؤية 2.2.2.
- الجدول الزمني للتدريب الغوص الأسبوعي
- إجراء دورات تدريبية اليومية (انظر 5.3). 5 أيام في الأسبوع، من الناحية المثالية في نفس الوقت كل يوم.
- بدء أول محاكمة من المسافة عن طريق التفاوض بنجاح في اليوم السابق. بدء التجارب الثانية والثالثة مع زيادة المسافة الغوص.
- مع كل دورة تدريبية اليومية اللاحقة زيادة طول النفق الغوص بإضافة فواصل أفقية إضافية لتوسيع المسافة الفئران لها أن تسبح تحت الماء. للدورات التدريبية القليلة الأولى زيادة ثيS المسافة 5-10 سم. بعد ظهور الفئران أكثر راحة مع الغوص، وزيادة المسافات بنسبة 30-50 سم.
ملاحظة: لا تجهد المسافة الغوص حاول خلال التجارب المتعاقبة. إذا لزم الأمر، وترفع من نهاية غطاء قناة الأفقي لتوفير مسافات أقصر الغوص. إذا أثناء محاكمة الغوص الفئران لا يصل إلى نهاية النفق الغوص ويبدأ في الالتفاف تحت الماء، وبسرعة رفع نهاية غطاء القناة والسماح الفئران على السطح، ويستمر تسبح له. وهذا سيمكن الفئران لإكمال مسافة أطول الغوص بنجاح. وهذا التعزيز الإيجابي حفاظ على الفئران تتحرك إلى الأمام من خلال نفق تحت الماء مع كل تجربة الغوص. - استخدام الزيادات الكبيرة في المسافات الغوص في حين أن الفئران تتعلم الغوص جزء مباشرة من قناة السباحة. في المقابل، تعلم الغوص حول منعطف حاد ينتقل بين القنوات قد يستغرق 2-3 دورات تدريبية.
ملاحظة: في كثير من الأحيان، في الوقت الذي تنتظر في منطقة النهاية، والفئران وإعادة إدخال الالمياه الإلكترونية للسباحة، و / أو غمر رأسه تحت الماء في حين لا يزال جالسا على منصة منطقة النهاية. - تكرار هذا البروتوكول التدريب اليومي على مدى 3 أسابيع لضمان الغوص الناجح ل5 قنوات كاملة. هذا البروتوكول تدريب التكرار يضمن الانتهاء بنجاح من المتاهة، وخاصة منذ المتاهة تشمل بالتناوب المنعطفات دبوس الشعر الأيمن والأيسر.
ملاحظة: الجدول الزمني السباحة والغوص التدريب الكامل 6 أسابيع يتزامن مع نمو 35 غ الفئران مفطوم حديثا للوصول إلى وزن الجسم من 300 غرام. - بعد جلسات تدريبية يومية كاملة، وقد عاد إلى قفص الفئران وطنهم، وضمان الفئران يجف بسرعة فرائها من خلال الاستمالة، أو إذا لزم الأمر، ضع وسادة التدفئة تحت القفص للحفاظ على الفئران دافئة حتى يكون فرائها الجاف.
6. الاختلافات التجريبية
ملاحظة: انشاء وحيوانات التجارب التدريب الأساسي وقد وصفت أعلاه. ومع ذلك، والتدريب السلوكي العلاقات العامة فقطovides نموذجا ليتم استخدامها مع تقنيات تجريبية أخرى لجمع البيانات من الفائدة. يتم تعديل البروتوكولات الأساسية للتحقيق في جوانب محددة للاستجابة للغوص. الأمثلة على هذه التعديلات، وبعض الاعتبارات لجمع البيانات باستخدام هذه التقنيات الفسيولوجية وتشريحي عصبي، وترد أدناه.
- زرع القياس عن بعد المرسلات
- بعد الانتهاء من التدريب، واستخدام أجهزة الإرسال القياس عن بعد المتاحة تجاريا لنقل نابض ضغط الدم الشرياني من السباحة والغطس الفئران. الحصول على موافقة IACUC المحلية عن الإجراءات المتعلقة الجراحة والشفاء بعد العمليات الجراحية. اتبع الإجراءات غرس اقترح من قبل الشركة للمرسل لهم، وضمان التعافي الكامل من عملية جراحية قبل العودة الفئران في الماء.
- ضمان هوائي استقبال إشارات الراديو هو قريب عند الفئران في الماء.
ملاحظة: المياه خفف إشارات الراديو، وذلك بعد أن شمال شرق إشارة الراديومحرران من السفر عبر يصبح الماء عاملا مقيدا للأبعاد الخزان. - استخدام هوائي عصا باليد، بدلا من الهوائي الفئران القفص الحجم، لمتابعة الفئران أنها تقدم من خلال المتاهة. إبقاء الهوائي عصا في غضون 30 سم من الفئران للتأكد من أن إشارات الراديو لا تضيع في حين أن الفئران هو تحت الماء.
- حقنة عادية زائدة
- إعادة تصميم فواصل القناة وقطع أفقية خلق سقف النفق الغوص بحيث مسارات قنية على طول وراء الفئران خلال التقدم من خلال المتاهة.
ملاحظة: تصميم وحدات من القنوات أمر في غاية الأهمية، ويجب أن تسمح أيضا للتعافي سريعا من الفئران من متاهة تحت الماء. إذا كان عقبات قنية وأصبح طردت من الفئران، يمكن أن الفئران ينزف قريبا تحت الماء بينما إذا لم يتم تثبيتها قنية بسرعة. - استخدام حقنة عادية زائدة الشرايين لتسجيل ضغط الدم الشرياني ومعدل ضربات القلب في الفئران الغوص طوعا. استخدام 90 سم قطعة من PE50 كماقنية زائدة.
ملاحظة: هذا هو طول قنية طويلة بما يكفي لتوصيل الفئران للضغط على المفاتيح في حين لا يزال يسمح الفئران على التقدم من خلال المتاهة، ولكن قصيرة بما فيه الكفاية لتقليل مساحة قنية قتيلا وقريب بما فيه الكفاية لمحول الضغط للسماح الإخلاص كافية لل إشارة الضغط الشرياني. - استخدام زائدة الوريدي (أو الشرايين) حقنة عادية لحقن مواد صيدلانية مثل منبهات ومضادات السمبتاوي ومتعاطفة، أو لحقن استشفاف أو الأصباغ التي تحدد توزيع النتاج القلبي.
- سحب عينات الدم من الفئران باستخدام الوريدي (أو الشرايين) حقنة عادية في حين أن الفئران هي تحت الماء لتحديد مستويات الكاتيكولامينات تحت الماء أو كيمياء الدم.
ملاحظة: تصغير طول قنية زائدة وتشكل مساحة قنية القتلى خلال توجه الدم.
- إعادة تصميم فواصل القناة وقطع أفقية خلق سقف النفق الغوص بحيث مسارات قنية على طول وراء الفئران خلال التقدم من خلال المتاهة.
- الكشف عن الخلايا العصبية الدماغ المنشط
- استخدام الكشف المناعي للبروتين فوس لهوية منذمناطق معينة من جذع الدماغ السنة المالية التي هي جزء من الاستجابة للغوص.
ملاحظة: أثناء بدء المتكررة من رد فعل القلبية التنفسية، عصبونات الدماغ التي هي جزء من تلك الدائرة المنعكس يمكن أن تصبح تنشيط وانتاج بروتين يسمى فو. - الغوص متكرر الفئران من خلال المتاهة كل 5 دقائق لمدة 2 ساعة أي ما مجموعه 24 الغطس.
ملاحظة: يمكن أيضا البروتوكولات الأخرى التي تحفز أيضا إنتاج فو العصبية استخدامها. لتجنب تنشيط الخلايا العصبية الدماغ تشارك في الاستجابة للإجهاد، وينبغي أن تدرج السلوك الذي يتكرر كجزء من التدريب السلوكي.
- استخدام الكشف المناعي للبروتين فوس لهوية منذمناطق معينة من جذع الدماغ السنة المالية التي هي جزء من الاستجابة للغوص.
- مستويات الكورتيزون في الدم أثناء الغوص
- استخدام الكورتيزون كمؤشر لمستوى من الخبرة الفئران الإجهاد أثناء السباحة والغطس.
- للحصول على الدم لتحليل كورتيزون، ووضع 0.1 مل عينات الدم من الوريد ذيل الفئران 15 دقيقة بعد 3 تسبح الطوعية أو الغطس.
ملاحظة: أشارت التجارب الأولية إلى أن 15 دقيقة هو سوfficient الوقت للسماح لإنتاج وإطلاق كورتيزون في الدورة الدموية ويتسبب في ذروة في مستويات كورتيزون البلازما. منذ مستويات الكورتيزون لها إيقاع الساعة البيولوجية، والجدول الزمني ويعتمد كل الدم في نفس الوقت من اليوم، وتقابل مع توقيت الدورات التدريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الانتهاء بنجاح من إجراءات التدريب السباحة والغطس وصفها يمكن أن تقلل من التوتر التي يعيشها الفئران عند الغوص تحت الماء. مستويات الكورتيزون في الدم تشير إلى أن التدريب اليومي المتكرر يقلل من stressfulness المرتبطة الغوص التطوعي، والفئران المدربة تجد الغوص لا أكثر إرهاقا مما يجري التعامل معها يوميا من قبل الإنسان (الشكل 2، 17). على العكس، لا الفئران المدربة في بروتوكول الغوص تجد الغوص التطوعي المجهدة (الشكل 2، 17). بالإضافة إلى ذلك، والعثور على كل من الفئران المدربة وغير المدربة أجبر الغوص لتكون الأكثر إرهاقا (الشكل 2، 17).
وقد سجلت ردود القلب والأوعية الدموية من السباحة والغطس الطوعي والقسري الفئران الغوص باستخدام أجهزة القياس عن بعد زرعها (الشكل 3؛ 8،17-20) وراء حقنة عادية (الشكل 4، 21-23). فور طوعيةغمر، وضمن فوز واحد، وانخفاض معدل ضربات القلب بنسبة 78٪ ويعني انخفاض ضغط الدم الشرياني بنسبة 25٪ 17. وتبين هذه النتائج أن الفئران الغوص طوعا يحمل نفس التغييرات القلبية التنفسية ينظر عادة في الحيوانات الغوص الأخرى. وقد استخدمت حقنة عادية زائدة الشريانية لحقن الأتروبين خصم المسكارينية، الذي يلغي بطء القلب المرتبطة الغوص التطوعي (الشكل 4 و 21)، وتحديد توزيع النتاج القلبي 22، بما في ذلك تدفق الدم الدماغي 23، خلال الغوص التطوعي. كما استخدمت حقنة عادية زائدة لإثبات أن الفئران تجاهل تزايد نقص الأكسجة وفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم الشرياني في حين أنها غارقة 18، وذلك قبل القائمة محرك مستقبلة كيميائية ليس لديها أي تأثير على استجابات القلب والأوعية الدموية إلى الغوص التطوعي 21.
الخلايا العصبية داخل صفيحة الأول والثاني من القرن الظهري البطني النخاع (مليون درهم) التعبير عن فوس الزيتوز الغوص التطوعي، وهذه الخلايا العصبية يمكن أن تشكل الأولي تتابع الدماغ وارد الاستجابة الغوص (الشكل 5؛ 24). المناطق الهامة الدماغ السيطرة القلبية التنفسية، مثل منطقة رافع للضغط الذيلية (CPA)، المنعزلون نواة السبيل (NTS)، منقاري النخاع بطناني (RVLM)، والمناطق peribrachial، ازداد عرض كل العلامات فو أثناء الغوص التطوعي مقارنة مع السباحة 25. الخلايا العصبية في مناطق من الدماغ حساس للكيماويات تعبر فو بعد مدة طويلة أجبرت الغطس 18.
وقد استخدم تخطيطي للغطس دبابة دبابة زجاجي (100 × 60 × 15 سم) لإنشاء متاهة بسيطة تتكون من خمسة 1 م القنوات طويلة: الرقم 1. امتلأ الخزان مع 30 ° C المياه الحنفية، وتم تدريب الفئران في البداية لnegotiatالبريد المتاهة عن طريق السباحة على سطح الماء، من منطقة ابدأ (أعلى اليسار) إلى منطقة إنهاء (أسفل اليمين). ثم تم تدريب الفئران على الغوص من خلال المتاهة، وأبقى تحت الماء بواسطة قطعة زجاجي الأفقية وضعت 2-3 سم تحت سطح الماء. [تم تعديل هذا الرقم من 26]
الشكل 2: القياسات كورتيزون. توجه الدم من الأوردة ذيل الفئران كانت تستخدم لقياس تركيز الكورتيزون (يعني ± SE) من الفئران ترك في أقفاصها (ساذج)، تناولت الفئران لمدة 10 دقيقة / يوم (المتداولة)، دربت الفئران على السباحة والغوص (مدربون)، والجرذان التي لم تتلق أي تدريب السباحة أو الغوص (غير مدرب). وقد تم قياس كورتيزون بعد الفئران المدربة قد أكملت تدريب السباحة الخاصة بهم (مجموعة اليسار من الحانات)، قد دربت الفئران بعد أكملت شعبة الطوعيوكان التدريب الإلكتروني (المركز مجموعة من القضبان)، وبعد الانتهاء من تدريب الفئران المدربة الغوص قسرا (مجموعة حق القضبان). 1 يشير إلى القيمة أكبر بكثير من السذاجة. 2 يشير إلى القيمة أكبر بكثير من تعامل العالم. 3 يشير إلى القيمة أكبر بكثير من المدربين؛ * يشير إلى أن قيمة في تدريب الفئران خلال الغوص القسري هو أكبر بكثير من خلال الغوص التطوعي. [تم تعديل هذا الرقم من 17]
الرقم 3: آثار ضغط الدم الشرياني من أجهزة الإرسال القياس عن بعد آثار تظهر البيانات الخام نابض ضغط الدم الشرياني أثناء السباحة (العمود الأيسر)، الغوص التطوعي (العمود الأوسط)، واضطر للغوص (العمود الأيمن) من الفئران المدربة على السباحة والغوص من خلال المتاهة. (الصف السفلي) ومن الفئران التي لم يكن لديه وتريالإجراء نينغ (الصف العلوي). الغوص تحت الماء (سواء الطوعي والقسري الغمر) أنتجت بطء الفوري وأبطأ زيادة الظهور في الضغط الشرياني، في حين السباحة على سطح الماء لا تسبب هذه التغيرات القلب والأوعية الدموية. القضبان دون آثار تشير إلى فترات الغمر. فواصل في أثر تشير الفترات التي فقدت إشارة القياس عن بعد. [تم تعديل هذا الرقم من 17]
الشكل 4: الأتروبين يزيل بطء الغوص. التسجيلات الأصلية للنابض ضغط الدم الشرياني من الفئران الغوص طوعا (A) قبل و (ب) بعد الأتروبين قبل العلاج. وقد تم الحصول على آثار استخدام قنية الشرياني زائدة. قبل الأتروبين قبل العلاج، وانخفض الضغط الشرياني قليلا على غمر، ولكن رارتفعت الدجاجة إلى أكبر من قبل الغوص للفترة المتبقية من الغوص. وتم تحديد معدل ضربات القلب من فترات الضغط نبض المجاورة. على غمر كان هناك بطء فوري وكبير الذي استمر لمدة الغوص. بعد الحصار السمبتاوي من قبل الأتروبين قبل المعالجة والقضاء على بطء القلب. كان هناك أيضا زيادة في الضغط الشرياني أثناء الغوص. شريط تحت أثر يشير إلى فترة من الغرق. [مكولوتش، غير منشورة]
الرقم 5: وضع العلامات فو داخل مليون درهم. Photomicrographs من مثلث التوائم القرن النخاع الظهري (مليون درهم) والمسالك مثلث التوائم الشوكي (SP5) في الفئران المدربة للغوص تحت الماء. (A) في الفئران التحكم التي لم الغوص متكرر ليس هناك وسم فوس. (ب) في الفئران السباحة هناك مضاءة جداTLE التسمية في مليون درهم (رأس السهم كبير) أو نواة نظير الثلاثي التوائم (السهم الصغير) فو داخل SP5. (C) في الفئران الغوص هناك المزيد من العلامات فو البطني في كل مليون درهم (رأس السهم كبير) ونواة نظير الثلاثي التوائم (الأسهم الصغيرة) مقارنة السباحة ومكافحة الفئران. إدراج في لوحة (A) يشير إلى موقع منقاري-الذيلية لوحات AC. شريط النطاق في لوحة C هو 100 ميكرون. [تم تعديل هذا الرقم من 24]
الرقم 6: تنشيط الخلايا العصبية من الفئران كاتيكولاميني الغوص. تظهر Photomicrographs وmedullas لمكافحة الفئران غير الغوص (A، C، و E) والفئران الغوص طوعا (B، D و F). تم معالجة أنسجة المخ immunohistologically لكلا من فود هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وتنتج البني somas TH ونوى فو السوداء. النصال مفتوحة تحديد احدة وصفت الخلايا العصبية الإيجابية TH-، بينما السهام صلبة تحدد فو + TH الخلايا العصبية المزدوج المسمى. ويتم تحديد الخلايا العصبية في A1 A و B. C1 الخلايا العصبية المحددة في C و D. يتم تحديد الخلايا العصبية A5 في E و F. المزيد فوس وTH ينظر في A1، C1 المزدوج المسمى، والمناطق A5 من الفئران الغوص من في الفئران السيطرة غير الغوص. شريط المعايرة في E هو لوحات AF، و250 ميكرون. شريط المعايرة في أقحم في F هو لجميع إدراجات، و 50 ميكرون. [تم تعديل هذا الرقم من 26]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفئران في حياتهم وحشي شكل العلبة والقيام استغلال البيئات شبه المائية، وكثيرا ما يغوص تحت الماء في حين يتطلعون للحصول على الغذاء 6. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب جدا أن الفئران يمكن تدريبها بسهولة جدا للغوص تحت الماء طوعا. قد تستمر إجراءات التدريب وصفه تصل إلى 6 أسابيع، والتي سوف تجلب الفئران مفطوم حديثا إلى حجم الجسم المستخدمة في معظم الأطالس الفئران الكبار الدماغ (~ 300 غ). وبالتالي العقول من هذه الحيوانات المدربة يكون أكثر قابلية للمقارنة بسهولة لالهياكل التشريحية المحددة في هذه الأطالس.
بعد وضعه في المنطقة بداية معظم الفئران ستبدأ السباحة الخاصة بهم تحت الماء في غضون 20 ثانية. ومع ذلك، أحيانا سوف فأر يستغرق فترة تصل الى 5 دقائق أو أكثر قبل الشروع في الغوص في طوعي. في حين أنه قد يكون مغريا في هذه المرحلة لإجبار الفئران داخل النفق تحت الماء، وهذا عموما يجب تجنبها لمنع الفئران من ربط المياه مع تجربة سلبية. يمكن أن تكون عنيدة والقوارض قد initiرفض حليف للغوص خلال الدورات التدريبية، ولكن بمجرد أنهم يدركون السبيل الوحيد للخروج من المياه من خلال استكمال الغوص من خلال المتاهة، وعادة ما يشرع الغطس لهم بعد فترة وجيزة يتم وضعها في منطقة البداية.
وثمة جانب بالغ الأهمية من إجراءات التدريب المتكرر والمنهجي هو أنها تجري في مثل هذه الطريقة للحد من التوتر التي يعيشها الفئران. السماح الفئران استكشاف بيئتهم، وخاصة أثناء وجوده في منطقة التشطيب بين التجارب، يبدو لزيادة خفض الضغط. سوف الفئران في كثير من الأحيان إعادة إدخال المياه للسباحة، و / أو غمر رأسه تحت الماء في حين لا يزال جالسا على منصة منطقة النهاية. هذا يشير إلى أن الفئران ليست ماء مكره بطبيعتها. بالإضافة إلى ذلك، في حين أنه ليس من غير المألوف بالنسبة للفئران لإنتاج الكريات البرازية أثناء السباحة أو الغوص، أو عندما تنتظر في منطقة النهاية، ونتائج التدريب اليومية في عدد أقل من الكريات البرازية 17. بشكل عام شدد على أقل من الفئران خلال التدريب، وعدد أقل من PEllets أنها سوف تنتج. تتم إزالة أي الكريات البرازية التي يتم إنتاجها من منطقة المياه أو النهاية في أسرع وقت ممكن للحفاظ على مياه نظيفة نسبيا.
الفئران قد تحصل أحيانا أنوف الدموية أثناء السباحة والغوص، والتي قد تكون نتيجة للنفخ من المياه في الممرات الأنفية. قد يكون بسبب الضغط الاسموزي داخل الغشاء المخاطي للأنف ظهور الدم. بينما في منطقة النهاية بين التجارب على الفئران والعريس أنفسهم. ونتيجة لذلك الدم من الأنف يمكن الحصول توزيعها على رأسه الفئران والخطم، وإعطاء الفئران المحمر مسحة طفيفة، خاصة حول العينين، أثناء دورة تدريبية. أيضا، قد تجد بين الحين والجرذان الغوص المجهدة و / أو لديهم تجارب الغوص السلبية (أي عن طريق الدوران في المكان والتخبط في حين الغوص تحت الماء (انظر الملاحظة بعد 5.4.3. حول كيفية منع هذا من الحدوث)). في هذه الفئران قد تظهر البورفيرين في زوايا عيونهم، مما يشير إلى رد و الإجهاده.
فإن حجم خزان الغوص إلى حد تحديد متطلبات الغرفة. تم تصميم خزان وصفه لديك الفئران تسبح 2-3 سم تحت سطح الماء من خلال 5 م زجاجي متاهة طويلة لإعطاء السباحة تحت الماء مدة من 10-15 ثانية 17،19،24،26،27. وينبغي تصميم تجربة لقياس ردود من مدة الغوص أطول، أو من الغوص تحت الماء أعمق، قد تحتاج الدبابة إلى إعادة تصميم. يمكن أن متطلبات الغرفة ثم تتغير أيضا لتناسب أبعاد إعادة تصميم خزان الغوص. إذا لم يكن هناك استنزاف الأرض المتاحة في الغرفة الداخلي، والماء من الخزان يمكن جمعها في وعاء كبير، مثل يمكن للقمامة 60 غال، والتي يمكن بعد ذلك تفرغ في أماكن أخرى بطريقة مريحة.
ويمكن استخدام هذه التقنية فو مع طرق الكشف العصبية الأخرى لتحديد المزيد من خصوصية وتميز الخلايا العصبية التي تشكل جزءا من الدوائر الدماغ من الاستجابة الغوص. على سبيل المثال،وقد حددت كشف فوس بالتعاون مع هيدروكسيلاز التيروزين تلطيخ الخلايا العصبية كاتيكولاميني في A1، C1، A2، A5 والمناطق coeruleus الفرعية (الشكل 6؛ 26)، والخلايا العصبية كروية داخل منطقة الجانبية A7 26،27، التي يتم تفعيلها خلال طوعية الغوص. أيضا، حددت كشف فوس بالتعاون مع التتبع الرجعي الكوليرا السم الهيئات خلية من motorneurons العصب الحائر القلب ضمن تشكيل الخارجي للambiguus النواة التي يتم تفعيلها خلال الغوص التطوعي 20.
التحقيق في التكامل العصبي المركزي الردود القلبية التنفسية للغوص المهم لعدد من الأسباب 6،8،28. رد الغوص تمكن الحيوانات، بما فيها الإنسان، ليبقى تحت الماء دون تنفس المغمورة لفترات طويلة من الزمن. تمثل استجابة الغوص إعادة تنظيم وظيفي من الدماغ السيطرة التماثل الساكن، وتبين واحدة من أقوى سنوياtterns من ردود الفعل اللاإرادي لوحظ في الحيوانات. قد يكون استجابة الغوص أيضا مهم سريريا في البشر كجزء من رد الفعل، trigemino القلب، منعكسة البلعوم، و / أو متلازمة موت الرضع المفاجئ. أخيرا، فإن فهم الدوائر العصبية الموجودة داخل الدماغ من الفئران تساعد على تحديد كيفية القشرية يمكن أن إشارات الدماغ وارد تعديل الأساسي ردود الفعل اللاإرادي. كل هذه الاعتبارات تجعل دراسة الجوانب المركزية للاستجابة الغوص الثدييات بطبيعتها جديرة بالاهتمام ومثيرة للاهتمام. باستخدام الإجراءات الموضحة لتدريب الفئران على الغوص تحت الماء طوعا سيسمح تحقيق أفضل الجوانب المركزية للاستجابة الغوص من الثدييات فإن استخدام الحيوانات ارتمى القسري. وذلك لأن إجراءات التدريب كما هو موضح 1) تقلل التوتر العصبي المركزي تفعيل الدوائر، و2) لم تقم بتنشيط الجهاز العصبي المركزي الإثابة بسبب المكافآت الخارجية لا يتم استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلف هو مستشار لشركة Stoelting، وتوفير تصميم ومواصفات مكولوتش الغوص تانك المتاهة العام لهم لأغراض تجارية.
Acknowledgments
بحوث مدعومة بتمويل من مكتب جامعة الغرب الأوسط للأبحاث ورعاية البرامج. الشكر أيضا لمرفق جامعة الغرب الأوسط الحيوانية وإريك وارن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
References
- Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
- Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
- Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
- Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
- Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
- McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
- Krogh, A. The progress of physiology. Am. J. Physiol. 90, 243-251 (1929).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
- Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
- Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
- Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
- Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
- Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
- Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
- MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
- McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
- McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
- Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
- Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
- McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
- Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
- Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
- McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
- Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
- McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
- McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
- Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).
