Protocol
BEMÆRK: Eksperimentelle heri beskrevne protokoller udført på Midwestern University blev godkendt af det midtvestlige University IACUC.
1. værelse krav
- Fastgør en procedure rum, der har rindende varmt og koldt vand, og en måde at fjerne vandet fra tanken, typisk et dræn i gulvet.
- Brug en undersøgelse bordet, som skal placere dykning tank. Da værelser med gulvafløb typisk formstøbte dræning, skære ned gummipropper og placere dem under bordbenene for at sikre, at bordpladen og dermed vandoverfladen i tanken, er niveau.
2. Dykning Tank
- Dykning Tank Construction
- Konstruere en rektangulær tank (100 x 60 x 15 cm) under anvendelse af 3/4 tykke plexiglas til bunden og 1/2 i plexiglas for sidevæggene (figur 1). Permanent vedhæfte de udvendige plexiglas stykker af tanken sammen ved hjælp cyanoacrylate cement eller solvents såsom trichlormethan.
- Opdel tanken i 5 kanaler hver ca. 100 cm i længde, ved brug af et flytbart 1/2 tommer tykke plexiglas skåret i 85 x 15 cm stykker. Permanent placere riller i bunden og kanter af tanken, i hvilket disse kanal dividers kan indpasses i position.
- Suspendere vandrette plexiglas stykker fra kanalerne dividers at skabe et "tag" til en undervands dyk "tunnel.
- I det ene hjørne af tanken sted en aftagelig hævet platform, "finish område", for rotter til at trække ud af vandet og hvile mellem svømning og dykning forsøg. Rotter normalt soignere sig selv og fjerne vand fra deres pels, mens i målområdet. Placer høje sider omkring kanterne af målområdet for at sikre rotterne forblive på platformen mellem uddannelse forsøg.
- På det modsatte hjørne af beholderen fra målområdet placere et kammer, der kun tillader vandet adgang til labyrinten. Denne flytbare "start enrea "bruges kun til dykning forsøg.
BEMÆRK: I begyndelsen af en dykning retssag en rotte sænkes ned i vandet, mens du sidder på en platform inden starten kammer; derfor denne platform kaldes "elevator".
BEMÆRK: Brug et modulært design, hvor startområdet, målområdet, og alle kanaler dividers er aftagelig fra tanken. Dette gøres af to grunde: 1) at lette fyldning og tømning af tanken med vand efter fjernelse af alle kanal dividers, og 2) hvis en rotte bliver desorienteret, især mens undersøiske, stykkerne kan hurtigt afmonteres for at redde rotten fra vand.
- Fyldning og tømning af tanken med vand
- Tanken fyldes med vand
- Ved begyndelsen af hver træningssession, fylde tanken med frisk 32 ° C vand fra hanen til en dybde på omkring 12 cm. Rør vandet i tanken til at minimere varme eller kolde lommer.
BEMÆRK: Typisk tager det omkring 2 timer til at træne 12 rotter. I løbet af denne tidvandtemperaturen falder med ca. 4 ° C. Ved udgangen af træningspasset vandet køler til ca. 28 ° C. Da 30 ° C vand er termoneutrale til rotter under anvendelse af denne varme vand snarere end vand ved stuetemperatur, vil minimere varmetabet under gentagen træning.
- Ved begyndelsen af hver træningssession, fylde tanken med frisk 32 ° C vand fra hanen til en dybde på omkring 12 cm. Rør vandet i tanken til at minimere varme eller kolde lommer.
- Tømning af tank med vand
- Ved slutningen af hver træningssession, dræne vand fra tanken ved hjælp af en stor slange, såsom en 4 m lang stykke 1 inch indre diameter rør. Helt nedsænke slangen i tanken, hvilket sikrer ingen luftlommer er i slangen. Hurtigt placere den ene ende af slangen i gulvafløbet. Den resulterende vandlåseffekt vil dræne vandet fra tanken.
- Samtidig med at tanken ende af slangen under vandoverfladen for at opretholde sifonering, tip tanken på kanten til at lette fuldstændig dræning af vandet.
BEMÆRK: Alternativt og snarere end opsugning, installere en tap nær bunden af tanken, og tilsluten slange fra tanken trykke til gulvafløbet.
- Tanken fyldes med vand
3. Rat Allergen Overvejelser
- Bær engangshandsker, når håndtering og træning af rotter. Handskerne vil begrænse kontakt med vand i tanken, hvilket uvægerligt vil indeholde rotteurin.
BEMÆRK: Rotterne bliver våd under uddannelsen, og rummet vil blive fyldt med en "wet-rotte" lugt. Derfor en profylaktisk regime af anti-histaminer kan forhindre eller begrænse virkningerne af rotte allergi. Undervisere kan også være nødvendigt at bære engangs støvmasker, eller N95 masker, hvis de skulle blive følsomme over for rotte allergener.
4. Swim Training
- Daglig svømme træning
BEMÆRK: Personlig erfaring viser, at yngre rotter lærer labyrinten bedre og hurtigere, og dermed starter træningen med 35 g nyligt fravænnede rotter er at foretrække at bruge voksne rotter.- Fyld tanken med vand. Se 2.2.1.
- Indsæt slutområdet og kanal dividers at skabe 5 svømning kanaler.
- Under den første træningssession forsigtigt sænke rotter ved hånden i vandet omkring 3-5 cm fra målområdet.
BEMÆRK: Ved deres introduktion til vandhunde vises ustabil, da de først støder på sensation flydende. Rotterne vil padle rundt i en ukoordineret måde, samtidig med at forsøge at finde en måde at forlade vandet, til sidst at nå det nærliggende målområdet. På grund af deres iboende evne til at svømme i efterfølgende forsøg rotterne vil svømme i en langt mere koordineret måde mod målområdet.
Bemærk: Understøttelse rotterne fra undersiden, så deres fødder er på efterforskerne hænder. Sænk forsigtigt rotterne i vandet, og lad dem svømme væk fra den side, snarere end at tabe dem i vandet. - Mellem forsøg lade rotterne forblive i målområdet i mindst 1 min. Dette er at give rotterne at soignere og udforske, så de betragter målområdet som en "sikker" stedat gå mellem forsøg. Dette er i modsætning til fanger en rotte, der netop har afsluttet en prøve og umiddelbart placere den tilbage i vandet for at starte den næste forsøg.
BEMÆRK: Brug ikke ekstern belønning (dvs. fødevarer) i løbet af uddannelsen, således at forhindre aktivering af belønning kredsløb i hjernen. - Efter målområdet venteperioden, hold forsigtigt rotterne i 1 min før initiering af næste forsøg. Forsigtigt tørre rotter med et håndklæde i løbet af denne forud for retssagen hold da gentagne indrejse i vandet vil medføre rotter at få meget våd, og tørre dem vil forhindre hypotermi.
- Gentag 4.1.3. gennem 4.1.5. at fuldføre 3 til 5 forsøg for hver rotte at blive uddannet under en daglig svømmetur træningssession.
- Fjern alle kanal dividers og målområde fra tanken.
- Tøm vand fra tanken. Se 2.2.2.
- Ugentlig svømmetur træningsskema
- Den daglige træning (se 4.1.) 5 dage om ugen, helst på samme tidhver dag.
- Begynd den første retssag fra afstanden forhandlet på den foregående dag. Begynder den anden og tredje forsøg fra en øget afstand.
- Med hver efterfølgende daglige træning øge afstanden mellem, hvor rotter anbringes i vandet og målområdet. For de første par træningssessioner øge denne afstand af 5-10 cm. Efter rotterne vises mere komfortabel med svømning, øge afstande med 30-50 cm.
- Brug større stigninger i swimming afstande mens rotterne er ved at lære at svømme en lige del af en svømmetur kanal. I modsætning, at lære at svømme hårnålesving mellem kanalerne kan tage 2-3 træningssessioner.
BEMÆRK: Ofte mens han ventede i målområdet, rotter vil genindtræde i vandet for at svømme, og / eller nedsænke deres hoved under vandet, mens du stadig sidder på målområdet platform. - Gentag denne daglige træning protokol over 3 uger for at sikre en vellykket svømning for hele 5 kanaler.Denne monotone træning protokol sikres en vellykket gennemførelse af labyrinten, især da labyrinten omfatter skiftevis venstre og højre hårnålesving.
5. Dive Træning
BEMÆRK: Når rotterne har lært at held forhandle svømning gennem labyrinten, de er klar til at starte dykke uddannelse.
- Indledende dykke uddannelse (første dag)
- Indsæt start- kammer. Fyld tanken med vand (se 2.2.1.). Sikre vandstanden er 1 cm under åbningen til startområdet.
- Indsæt målområdet og kanal dividers at skabe 5 svømning kanaler.
- Under den første dykning session træne rotter at blive sænket på elevatoren i vandet i starten kammer. Adgang til labyrinten fra bunden af start kammeret. Under denne første session vand er lavt nok, så rotten nemt kan svømme fra starten kammer i labyrinten. Lad rotten til at fortsætte svømning gennem labyrinten tilmålområdet.
- Mellem forsøg lade rotterne forblive i målområdet i mindst 1 min.
BEMÆRK: Brug ikke ekstern belønning (dvs. fødevarer) i løbet af uddannelsen, således at forhindre aktivering af belønning kredsløb i hjernen. - Efter målområdet venteperioden, hold forsigtigt rotterne i 1 min før initiering af næste forsøg. Forsigtigt tørre rotter med et håndklæde i løbet af denne forud for retssagen hold.
- Gentag 5.1.3. gennem 5.1.5. at fuldføre 3-forsøg for hver rotte at blive uddannet under denne indledende dykke træningssession.
- Fjern alle kanal dividers, start kammer og målområde fra tanken.
- Tøm vand fra tanken. Se 2.2.2.
- Indledende dykke uddannelse (anden dag)
- Indsæt start- kammer. Fyld tanken med vand (se 2.2.1.). Sikre vandstanden er lidt over åbningen til startområdet.
- Indsæt målområdet og kanal dividers at skabe 5 svømning kanaler.
- Under den anden dykketræningssession vandstanden er hævet, så at afslutte start kammer rotten har at dyppe sit hoved under kanten af starten kammer til at indtaste labyrinten. Betragt dette som rottens første dyk. Lad rotten derefter fortsætte svømning gennem labyrinten til målområdet.
- Lad rotterne forblive i målområdet i mindst 1 min mellem forsøg.
BEMÆRK: Brug ikke ekstern belønning (dvs. fødevarer) i løbet af uddannelsen, således at forhindre aktivering af belønning kredsløb i hjernen. - Efter målområdet venteperioden, hold forsigtigt rotterne i 1 min før initiering af næste forsøg. Forsigtigt tørre rotter med et håndklæde i løbet af denne forud for retssagen hold.
- Gentag 5.2.3. gennem 5.2.5. at fuldføre 3-forsøg for hver rotte at blive trænet i løbet af denne dykke træningssession.
- Fjern alle kanal dividers, start kammer og målområde fra tanken.
- Tøm vand fra tanken. Se 2.2.2.
- Indledende dykke uddannelse (tredjemandsratingv dag)
- Indsæt start- kammer. Fyld tanken med vand (se 2.2.1.), Der sikrer, at vandstanden er over åbningen til startområdet.
- Indsæt målområdet og kanal dividers at skabe 5 svømning kanaler. Placer en vandret stykke plexiglas umiddelbart uden for starten område for at skabe en 5 cm lang dykning tunnel.
- I tredje dyk træningssession rotten har at dyppe sit hoved under kanten af start- kammer og svømme 5 cm under vandet for at nå det åbne vand i svømme-kanalen. Lad rotten derefter fortsætte svømning gennem labyrinten til målområdet.
BEMÆRK: Når den er placeret i startområdet, rotter indlede deres egen undersøiske oversvømmelse, og dermed disse anses for at være "frivillige" dives. - Lad rotterne forblive i målområdet i mindst 1 min mellem forsøg.
BEMÆRK: Brug ikke ekstern belønning (dvs. fødevarer) i løbet af uddannelsen, således at forhindre aktivering af belønning kredsløb i hjernen. - Efter målområdet venteperioden, hold forsigtigt rotterne i 1 min før initiering af næste forsøg. Forsigtigt tørre rotter med et håndklæde i løbet af denne forud for retssagen hold.
- Gentag 5.3.3. gennem 5.3.5. at fuldføre 3 til 5 forsøg for hver rotte at blive trænet i løbet af denne dykke træningssession.
- Fjern alle kanal dividers, start kammer og målområde fra tanken.
- Tøm vand fra tanken. Se 2.2.2.
- Ugentlig dykke træningsskema
- Den daglige træning (se 5.3.) 5 dage om ugen, helst på samme tidspunkt hver dag.
- Begynd den første retssag fra afstanden forhandlet på den foregående dag. Begynder den anden og tredje forsøg med en øget dykning afstand.
- Med hver efterfølgende daglige træning øge længden af dykke tunnel ved at tilføje yderligere horisontale dividers at forlænge afstanden rotterne skal svømme under vandet. For første par træningssessioner stigning this afstand af 5-10 cm. Efter rotterne synes mere komfortable med dykning, øge afstanden med 30-50 cm.
BEMÆRK: Du må ikke overbelaste dykke distance forsøges anvendt under successive forsøg. Hvis det er nødvendigt, løfte enden af den vandrette kanaldækslet at give kortere dykke afstande. Hvis der i løbet af et dyk retssag en rotte ikke nå enden af dykket tunnel og begynder at vende rundt under vandet, hurtigt løfte enden af kanalen låg og lad rotten til overfladen og fortsætte sin svømmetur. Dette vil gøre det muligt for rotten at fuldføre en længere dyk afstand. Denne positiv forstærkning vil holde rotten bevæger sig fremad gennem den undersøiske tunnel med hver dykke retssag. - Bruge større Stigninger i dykning afstande mens rotterne er ved at lære at dykke en lige del af en svømmetur kanal. I modsætning, at lære at dykke omkring hårnålesving mellem kanalerne kan tage 2-3 træningssessioner.
BEMÆRK: Ofte mens han ventede i målområdet, rotter vil genindtræde the vand at svømme, og / eller nedsænke deres hoved under vandet, mens du stadig sidder på målområdet platform. - Gentag denne daglige træning protokol over 3 uger for at sikre en vellykket dykning af hele 5 kanaler. Denne monotone træning protokol sikres en vellykket gennemførelse af labyrinten, især da labyrinten omfatter skiftevis venstre og højre hårnålesving.
BEMÆRK: Den fulde 6 uger svømme og dykke uddannelse tidsplan falder sammen med vækst på 35 g nyligt fravænnede rotter for at nå en kropsvægt på 300 g. - Efter daglige træningssessioner er komplette, og rotterne er blevet returneret til deres hjem bur, sikre rotter hurtigt tørre deres pels gennem grooming, eller hvis det er nødvendigt, skal du placere en varmepude under deres bur for at holde rotterne varm indtil deres pels er tør.
6. Eksperimentelle Variationer
BEMÆRK: Den grundlæggende eksperimentelle opsætning og træning af dyr er blevet beskrevet ovenfor. Men adfærdsmæssige uddannelse kun provides en model, der skal anvendes sammen med andre eksperimentelle teknikker til at indsamle data af interesse. Grundlæggende protokoller er modificeret til at undersøge specifikke aspekter af dykning respons. Eksempler på disse ændringer og nogle overvejelser for indsamling af data ved hjælp af disse fysiologiske og neuroanatomiske teknikker, er angivet nedenfor.
- Implanterbare Telemetri sendere
- Efter afslutning af uddannelsen, skal du bruge kommercielt tilgængelige telemetriske sendere at transmittere pulserende arterielt blodtryk fra svømning og dykning rotter. Opnå lokal IACUC godkendelse til procedurer vedrørende kirurgi og post-kirurgisk opsving. Følg implantation procedurer foreslået af virksomheden for deres sender, og sikre fuldstændig genopretning fra kirurgi inden returnering rotten i vandet.
- Sørg for, at antennen modtager radiosignalet er i nærheden, når rotten er i vandet.
BEMÆRK: Vand dæmper radiosignaler, og så afstanden radiosignalet neEDS til at rejse gennem vandet bliver en begrænsende faktor af tanken dimensioner. - Bruge en håndholdt antenne wand, snarere end en rotte-bur størrelse antenne, til at følge rotten som den skrider frem gennem labyrinten. Hold wand antenne inden for 30 cm fra rotte til at sikre, at radiosignalet er ikke tabt, mens rotten er under vandet.
- Trailing Kanyler
- Redesign kanal skillevægge og vandrette stykker skaber taget af dykning tunnelen, således at kanylen stier langs bag rotter i sin progression gennem labyrinten.
BEMÆRK: Det modulære design af kanalerne er af allerstørste betydning og skal også gøre det muligt hurtigt komme af rotte fra den undersøiske labyrint. Hvis en kanyle rifter og blev løsnet fra rotten, kunne rotten hurtigt bløder ud, mens undersøiske, hvis kanylen er ikke hurtigt sættes på igen. - Brug efterfølgende arteriel kanyler til at optage arterielt blodtryk og puls i frivilligt dykning rotter. Brug et 90 cm stykke PE50 somen bageste kanyle.
BEMÆRK: Denne kanyle længde er lang nok til at forbinde rotte til tryktransduceren mens det stadig tillader rotten til fremskridt gennem labyrinten, men er kort nok til at minimere kanylen døde rum og er tæt nok på tryktransducer at give tilstrækkelig nøjagtighed for de arterietryk signal. - Brug efterfølgende venøs (eller arteriel) kanyler at injicere farmaceutiske midler, såsom parasympatiske og sympatiske agonister og antagonister, eller at injicere sporstoffer eller farvestoffer, der bestemmer fordelingen af minutvolumen.
- Trække blodprøver fra rotterne ved hjælp af venøse (eller arteriel) kanyler mens rotterne vandet for at bestemme undersøiske catecholaminkoncentrationer eller blodkemi.
BEMÆRK: Minimer længden af den bageste kanyle og redegøre for kanylen døde rum, når blodet trækker.
- Redesign kanal skillevægge og vandrette stykker skaber taget af dykning tunnelen, således at kanylen stier langs bag rotter i sin progression gennem labyrinten.
- Påvisning af Aktiveret hjernestamme neuroner
- Brug immunologisk påvisning af Fos-proteinet til identifikationfy specifikke områder af hjernestammen, som er en del af dykning respons.
BEMÆRK: Under gentagne indledning af en kardiorespiratoriske refleks, hjernestamme neuroner, der er en del af denne refleks kredsløb kan blive aktiveret, og producere et protein kaldet Fos. - Repetitivt dykke rotter gennem labyrinten hver 5 min i 2 timer for i alt 24 dives.
BEMÆRK: Andre protokoller, som også inducerer neuronal Fos produktion kan også anvendes. For at undgå aktivering af hjernestamme neuroner involveret i reaktion på stress, bør den adfærd, der gentages indgå som en del af den adfærdsmæssige træning.
- Brug immunologisk påvisning af Fos-proteinet til identifikationfy specifikke områder af hjernestammen, som er en del af dykning respons.
- Blood corticosteron niveauer under dykning
- Brug corticosteron som en indikator for niveauet af stress rotter oplevelse under svømning og dykning.
- For at opnå blod til corticosteron analyse trække 0,1 ml blodprøver fra halevenen af rotterne 15 min efter 3 frivillige svømmer eller dives.
BEMÆRK: Indledende forsøg viste, at 15 min er sufficient tid til at give mulighed for produktion og frigivelse af kortikosteron i blodbanen og forårsage et højdepunkt i plasma corticosteron niveauer. Da corticosterone niveauer har en døgnrytme, planlægge alt blod trækker på samme tidspunkt af dagen og svarede med timingen af træningssessioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket gennemførelse af de beskrevne svømning og dykning uddannelsesprocedurer kan mindske stress opleves af rotter, når dykning under vand. Blood corticosterone niveauer indikerer, at gentagne daglige træning nedsætter stressfulness forbundet med frivillig dykning og uddannede rotter finde dykning ikke mere stressende end at blive håndteret dagligt af et menneske (figur 2, 17). Omvendt rotterne ikke er uddannet i dykning protokollen finde frivillige dykning stressende (figur 2, 17). Derudover finde både uddannet og uuddannet rotter tvunget dykning at være den mest stressende (figur 2; 17).
De kardiovaskulære reaktioner fra svømning, frivillig dykning og tvunget dykning rotter er indspillet ved brug implanterede telemetri enheder (figur 3; 8,17-20), og efterstillede kanyler (figur 4, 21-23). Umiddelbart efter frivillignedsænkning, og inden for et enkelt slag, hjertefrekvens falder med 78% og gennemsnitlige arterielle blodtryk falder med 25% 17. Disse resultater viser, at frivilligt dykning rotter udviser de samme kardiorespiratoriske ændringer, der typisk ses i andre dyr dykning. Trailing arterielle kanyler er blevet anvendt til at injicere muscarinantagonist atropin, hvilket eliminerer bradykardi forbundet med frivillig dykning (figur 4, 21), og at bestemme fordelingen af minutvolumen 22, herunder cerebral blodstrøm 23 under frivillig dykning. Trailing kanyler er også blevet anvendt til at vise, at rotter ignorerer stigende arteriel hypoxæmi og hyperkapni, mens de er neddykkede 18, og at allerede eksisterende kemoreceptorernes drev ikke har nogen effekt på det kardiovaskulære reaktioner på frivillig dykning 21.
Neuroner inden laminae I og II i den ventrale medullære dorsale horn (MDH) udtrykker Fos during frivillig dykning, og disse neuroner kan udgøre den indledende hjernestammen afferent relæ af dykning respons (figur 5; 24). Vigtige hjernestamme kardiorespiratoriske kontrolområder, såsom caudale pressor område (CPA), nucleus tractus eneboere (NTS), rostrale ventrolaterale medulla (RVLM) og peribrachial regioner, alle show steg Fos mærkning under frivillig dykning sammenlignet med swimming 25. Neuroner i chemosensitive regioner af hjernestammen udtrykker Fos efter lang varighed tvunget dyk 18.
Figur 1:. Skematisk of Diving Tank A Plexiglas tank (100 x 60 x 15 cm) blev anvendt til at oprette en simpel labyrint bestående af fem 1 meter lange kanaler. Tanken blev fyldt med 30 ° C ledningsvand og hanrotter blev indledningsvis trænet til negotiate labyrinten ved at svømme på overfladen af vandet, fra Start Area (øverst til venstre) til målområdet (nederst til højre). Rotterne blev derefter uddannet til at dykke gennem labyrinten, holdt under vandet af horisontale plexiglas stykker placeret 2-3 cm under vandoverfladen. [Dette tal er blevet ændret fra 26]
Figur 2: corticosteron målinger. Blodprøver fra rotte halevener blev anvendt til måling corticosteron koncentrationer (gennemsnit ± SE) fra rotter tilbage i deres bure (Naive), rotter behandlet i 10 min / dag (håndteres), rotter trænet til at svømme og dykke (uddannet) og rotter der modtog ingen svømmetur eller dykke uddannelse (Uuddannet). Corticosteron blev målt efter uddannede rotter havde afsluttet deres svømmetur uddannelse (Venstre sæt af søjler), havde efter uddannede rotter afsluttet deres frivillige dive uddannelse (center sæt af søjler), og efter uddannede rotter havde afsluttet deres tvungne dykke uddannelse (rigtige kombination af søjler). 1 indikerer værdi er betydeligt større end naive; 2 indikerer værdi er betydeligt større end Handled; 3 angiver værdi er betydeligt større end Uddannet; * Angiver, at der i Uddannet rotter værdi under tvungen dyk er betydeligt større end under frivillig dykke. [Dette tal er blevet ændret fra 17]
Figur 3: arterieblodtryk spor fra telemetriske sendere rådata spor viser pulserende arterielt blodtryk under svømning (venstre spalte), frivillig dykning (midterste søjle) og tvang dykning (højre kolonne) fra rotter uddannet til at svømme og dykke gennem labyrinten. (nederste række) og fra rotter, der ikke havde haft trning procedure (øverste række). Dykning undervands (både frivillig og tvungen nedsænkning) frembragte en øjeblikkelig bradykardi og langsommere indsættende stigning i arterietryk, mens svømning på overfladen af vandet forårsagede ingen sådanne kardiovaskulære ændringer. Søjler under spor indikerer perioder nedsænkning. Afbrydelser spor angiver perioder, hvor telemetrisk signal blev tabt. [Dette tal er blevet ændret fra 17]
Figur 4: Atropin eliminerer dykning bradykardi. Originale optagelser af pulserende arterielt blodtryk frivilligt dykning rotter (A) før og (B) efter atropin forbehandling. Spor blev opnået ved hjælp af en bageste arteriekanylen. Før atropin forbehandling, arterietryk faldt en smule ved nedsænkning, men thøne steg til mere end pre-dive for resten af dykket. Pulsen blev bestemt fra tilstødende puls trykintervaller. Ved nedsænkning var der en umiddelbar og væsentlig bradykardi der blev opretholdt for varigheden af dykket. Efter parasympatisk blokade af atropin forbehandling bradykardi blev elimineret. Der var også en stigning i arterietryk under dykke. Linjen under spor angiver den periode, nedsænkning. [McCulloch, upubliceret]
Figur 5: Fos etikettering i MDH. Mikrofotografier af trigeminus medullære dorsale horn (MDH) og spinal trigeminus tarmkanalen (SP5) hos rotter uddannet til at dykke under vandet. (A) I en kontrolgruppe rotte, der ikke repetitively dykke er der ingen Fos mærkning. (B) i en swimming rotte der er meget tændtTLE Fos etiket i MDH (stor pilespids) eller paratrigeminal kerne (lille pil) inden SP5. (C) i en dykning rotte der er mere Fos mærkning ventralt i både MDH (stor pilespids) og paratrigeminal nucleus (små pile) i forhold til svømning og kontrol rotte. Indsæt i panel (A) angiver rostral-caudal placering af paneler AC. Målestokken i panel C er 100 um. [Dette tal er blevet ændret fra 24]
Figur 6: Aktiveret catecholaminerge neuroner fra dykning rotter. Mikrofotografier viser medullas af ikke-dykning kontrol rotte (A, C og E) og et frivilligt dykning rotte (B, D og F). Hjernevævet blev immunhistologisk forarbejdet til både Fos end tyrosin hydroxylase (TH) producerer brun TH SOMA og sorte Fos kerner. Åbne pilespidser identificere enkelt-mærket TH-positive neuroner, hvorimod optrukne pile identificere Fos + TH dobbelt-mærkede neuroner. A1 neuroner er identificeret i A og B. C1 neuroner er identificeret i C og D. A5 neuroner er identificeret i E og F. Flere Fos og TH dobbelt-mærket ses i A1, C1, og A5 regioner dykning rotte end i den ikke-dykning kontrol rotte. Calibration bar i E er til paneler AF, og er 250 um. Calibration bar i indsatte i F er for alle insets, og er 50 um. [Dette tal er blevet ændret fra 26]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotter i deres vildtlevende form, kan og vil udnytte semi-vandmiljøer, og vil ofte dykke under vandet, mens søgning efter føde 6. Således er det ikke så overraskende, at rotter kan meget let trænet til frivilligt dykke under vandet. De beskrevne uddannelsesprocedurer kan vare op til 6 uger, hvilket vil bringe nyligt fravænnede rotter til et organ, der skal bruges i de fleste voksne rotte hjerne atlas (~ 300 g). Således hjernerne fra disse dresserede dyr vil være mere umiddelbart sammenlignelige med de anatomiske strukturer identificeret i disse atlas.
Efter at være blevet placeret i startområdet fleste rotter vil begynde deres undervands svømme inden for 20 sek. Men lejlighedsvis en rotte vil tage op til 5 minutter eller mere, før indledningen af frivillig dykke. Selv om det kan være fristende på dette stadium at tvinge rotterne ind i den undersøiske tunnel, dette generelt bør undgås for at forhindre rotterne i at knytte vandet med en negativ oplevelse. Gnavere kan være stædig og kan initiallieret nægter at dykke under træning, men når de indser den eneste måde at forlade vandet er ved at udfylde dyk gennem labyrinten, de normalt indlede deres dyk snart efter at blive placeret i startområdet.
Et kritisk aspekt af monotone og metodiske træning procedurer er, at de gennemføres på en sådan måde at reducere stress opleves af rotter. Udlejning rotter udforske deres omgivelser, især mens i målområdet mellem forsøg, synes yderligere at reducere stress. Rotter vil ofte genindtræde i vandet for at svømme, og / eller nedsænke deres hoved under vandet, mens du stadig sidder på målområdet platform. Dette antyder, at rotter er ikke i sig selv vand aversive. Og mens det ikke er ualmindeligt for rotter til at producere fækalpellets under svømning eller dykning, eller når venter i målområdet, daglig træning resulterer i færre fækalpellets 17. Generelt mindre stressede rotterne er under uddannelse, jo færre pellets de vil producere. Eventuelle fækalier, der er produceret fjernes fra vandet eller målområdet så hurtigt som muligt at holde vandet relativt rene.
Rotter kan lejlighedsvis få blodige næser, mens svømning og dykning, som kan være et resultat af indblæsning af vand i de nasale passager. Udseendet af blod kan være på grund af osmotiske spændinger i den nasale slimhinde. Mens der i målområdet mellem forsøg rotterne vil soignere sig selv. Som en konsekvens blod fra næsen kan få omfordelt over rotter hoved og snude, hvilket giver rotterne en let rødlig tone, især omkring øjnene, i løbet af en træningssession. Ligeledes kan en lejlighedsvis rotte finde dykning stressende og / eller have negative dykning erfaringer (dvs. ved at dreje rundt og farer vild, mens dykning undervands (se note efter 5.4.3. Om hvordan man kan forhindre dette i at ske)). I disse rotter porphyrin kan vises i hjørnerne af deres øjne, signalering en stress response.
Størrelsen af dykning akvarium vil til en vis grad bestemme værelse krav. Den beskrevne beholder er designet til at have rotter svømme 2-3 cm under overfladen af vandet gennem en 5 m lang plexiglas maze at give en undersøisk svømning varighed på 10-15 sek 17,19,24,26,27. Skulle et eksperiment være designet til at måle svar fra en længere varighed dyk, eller fra et dybere dyk under vandet, kan tanken være nødvendigt at re-designet. De værelse krav kunne så også ændre til at passe til dimensionerne af en re-designet dykning tank. Hvis der ikke er gulvafløb tilgængelig i proceduren rum, kan vandet fra tanken opsamles i en stor beholder, såsom en 60 gal skraldespand, som derefter kan tømmes andetsteds på en bekvem måde.
Fos teknik kan anvendes med andre metoder neuronal afsløring til yderligere at identificere og karakterisere neuroner, der er en del af hjernestammen kredsløb i dykning respons. For eksempel,Fos påvisning sammenholdt med tyrosin hydroxylase farvning har identificeret catecholaminerge neuroner i A1, C1, A2, A5 og sub-Coeruleus områder (figur 6; 26), og globosa neuroner i den laterale A7 område 26,27, der aktiveres under frivillig dykning. Også har Fos påvisning sammenholdt med retrograd sporstof Choleratoksin identificeret cellelegemer af hjerte- vagus motorneurons inden den eksterne dannelse af kernen ambiguus der aktiveres under frivillig dykning 20.
Undersøgelse af centralnervesystemet integration af kardiorespiratoriske svar på dykning er vigtigt for en række årsager 6,8,28. Dykning respons giver dyr, herunder mennesker, til at forblive neddykket under vandet uden at trække vejret i længere perioder. Dykning reaktion repræsenterer en funktionel reorganisering af hjernestammen homøostatisk kontrol, og viser en af de mest magtfulde patterns af autonome reflekser observeret hos dyr. Dykning reaktion kan også være vigtigt klinisk i mennesker som en del af trigemino hjertebypass refleks, nasopharyngeal refleks, og / eller vuggedød. Endelig vil en forståelse af den neuronale kredsløb, der findes inden hjernestammen hos rotter til at bestemme, hvordan cortical afferente signaler kan ændre grundlæggende hjernestamme autonome reflekser. Alle disse overvejelser gør studiet af de centrale aspekter af pattedyr dykning svar iboende værd og interessant. Anvendelse af de beskrevne procedurer for at uddanne rotter til frivilligt dykke under vandet, vil give mulighed for bedre undersøgelse af de centrale aspekter af pattedyr dykning respons end vil brugen af tvang dykket dyr. Dette skyldes, at uddannelse procedurer som beskrevet 1) reducere aktivering af CNS stress kredsløb, og 2) ikke aktiverer CNS belønning kredsløb fordi de eksterne belønninger ikke bliver brugt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren er en konsulent for Stoelting Company, og forudsat det overordnede design og specifikationer for McCulloch Dive Tank Maze dem til kommercielle formål.
Acknowledgments
Forskning støttet af midler fra Midwestern University Office of Research og sponsorerede programmer. Tak også til Midwestern University Animal Facility og Erik Warren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
References
- Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
- Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
- Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
- Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
- Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
- McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
- Krogh, A. The progress of physiology. Am. J. Physiol. 90, 243-251 (1929).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
- Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
- Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
- Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
- Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
- Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
- Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
- MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
- McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
- McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
- Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
- Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
- McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
- Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
- Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
- McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
- Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
- McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
- McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
- Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).
