Protocol
NOTA: Los protocolos experimentales descritas en el presente documento realizado en la Universidad del Medio Oeste fueron aprobados por el medio oeste de la Universidad IACUC.
1. Requisitos de habitación
- Asegure una sala de procedimientos que ha de agua corriente fría y caliente, y una manera de quitar el agua del tanque, por lo general un desagüe en el suelo.
- Utilice una mesa de estudio en el que colocar el tanque de buceo. Desde habitaciones con desagües de piso son típicamente contorneados para el drenaje, reducir los tapones de goma y colocarlos bajo las patas de la mesa para asegurar que la superficie de la mesa, y por lo tanto la superficie del agua en el tanque, es nivel.
2. Tanque de Buceo
- Tanque de Buceo Construcción
- Construir un tanque rectangular (100 x 60 x 15 cm) utilizando 3/4 en plexiglás de espesor para la parte inferior y media en Plexiglas para las paredes laterales (Figura 1). Adjuntar permanentemente las piezas de plexiglás fuera del tanque junto con cemento de cianoacrilato o Solvents tales como triclorometano.
- Divida el tanque en 5 canales cada uno de aproximadamente 100 cm de longitud, mediante el uso de plexiglás extraíble 1/2 pulgada de espesor cortadas en 85 x 15 cm piezas. Permanentemente colocar ranuras en la parte inferior y los bordes del tanque en el que estos divisores de canal puede ser ranurados en su posición.
- Suspender piezas horizontales de plexiglás de los divisores de canal para crear un "techo" para una inmersión túnel bajo el agua ".
- En una esquina del lugar del depósito una plataforma elevada extraíble, la "zona de llegada", para las ratas con el arrastre del agua y el descanso entre las pruebas de natación y buceo. Las ratas usualmente se acicalan y eliminan el agua de su piel, mientras que en la zona de meta. Coloque lados altos alrededor de los bordes de la zona de llegada para asegurar que las ratas se mantienen en la plataforma entre los ensayos de formación.
- En la esquina opuesta del tanque de la zona de acabado de colocar una cámara que sólo permite el acceso bajo el agua para el laberinto. Este extraíble "iniciar unrea "sólo se utiliza para los ensayos de buceo.
NOTA: Al comienzo de un ensayo de buceo una rata se baja en el agua mientras está sentado en una plataforma dentro de la cámara de inicio; por lo tanto, esta plataforma se llama el "ascensor".
NOTA: Utilice un diseño modular, donde la zona de salida, zona de meta, y todos los canales divisores son removibles del tanque. Esto se hace por dos razones: 1) para facilitar el llenado y vaciado del tanque con agua después de la eliminación de todos los divisores de canal, y 2) si una rata se desorienta, especialmente bajo el agua, las piezas se pueden desmontar rápidamente para rescatar a la rata de la agua.
- Llenado y vaciado el tanque con agua
- Llenar el tanque con agua
- Al comienzo de cada sesión de entrenamiento, llenar el tanque con 32 ° C de agua fresca del grifo a una profundidad de unos 12 cm. Se agita el agua en el tanque para minimizar los bolsillos calientes o fríos.
NOTA: Por lo general toma alrededor de 2 horas para capacitar a 12 ratas. Durante este tiempola temperatura del agua disminuye en alrededor de 4 ° C. Al final de la sesión de entrenamiento el agua se enfría a aproximadamente 28 ° C. Desde 30 ° C el agua es termoneutral a ratas, el uso de este agua tibia en lugar de agua a temperatura ambiente, reduzca al mínimo la pérdida de calor durante el entrenamiento repetitivo.
- Al comienzo de cada sesión de entrenamiento, llenar el tanque con 32 ° C de agua fresca del grifo a una profundidad de unos 12 cm. Se agita el agua en el tanque para minimizar los bolsillos calientes o fríos.
- Vaciar el tanque con agua
- Al final de cada sesión de entrenamiento, drenar el agua del tanque usando una manguera grande, tal como una pieza larga de tubo de 4 m de diámetro interno de 1 pulgada. Sumerja completamente el tubo en el tanque, asegurando no hay bolsas de aire se encuentran en el tubo. Colocar rápidamente un extremo de la tubería en el desagüe en el suelo. El efecto sifón resultante drenar el agua del tanque.
- Mientras se mantiene el extremo del tanque de la tubería bajo la superficie del agua para mantener el sifón, inclinar el tanque en el borde para facilitar el drenaje completo del agua.
NOTA: De forma alternativa, y en lugar de sifón, instale un grifo cerca de la base del tanque, y conectaruna manguera desde el tanque de toque para el desagüe en el suelo.
- Llenar el tanque con agua
3. Consideraciones Rata alérgenos
- Use guantes desechables cada vez que la manipulación y la formación de las ratas. Los guantes limitar el contacto con el agua en el tanque, que invariablemente contendrá la orina de rata.
NOTA: Las ratas se convertirán en mojado durante la formación, y la habitación se llenó de un olor "mojado-rata". Por consiguiente, un régimen profiláctico de los antihistamínicos puede prevenir o limitar los efectos de las alergias de rata. Los capacitadores también pueden necesitar usar máscaras contra el polvo desechables o máscaras N95, en caso de ser sensible a los alérgenos de rata.
4. Entrenamiento de natación
- Entrenamiento de natación diaria
NOTA: La experiencia personal indica que las ratas más jóvenes aprenden el laberinto mejor y más rápido, y comenzando así la formación con 35 g de ratas recién destetados es preferible el uso de ratas adultas.- Llene el tanque con agua. Ver 2.2.1.
- Insertar acabadode área y de los canales divisores para crear 5 canales de natación.
- Durante la primera sesión de entrenamiento baje suavemente las ratas con la mano en el agua unos 3-5 cm de la zona de meta.
NOTA: Después de su introducción a las ratas de agua aparecerá inestable, ya que en primer lugar se encuentran con la sensación de estar flotando. Las ratas se acerca remar de manera descoordinada al tratar de localizar a una manera de salir del agua, llegando finalmente a la zona de meta cerca. Debido a su habilidad innata para nadar, en ensayos posteriores las ratas nadan de una manera mucho más coordinada hacia la zona de meta.
NOTA: Apoyar a las ratas de debajo para que sus pies están en las manos de los investigadores. Baje suavemente las ratas en el agua, y dejar que ellos nadan lejos de la mano, en lugar de dejarlos caer en el agua. - Entre los ensayos permiten a las ratas se mantienen en la zona de meta durante al menos 1 min. Esto es para permitir que las ratas que se acicalan y explorar, por lo que ellos consideran la zona de meta como un lugar "seguro"ir entre los ensayos. Esto está en contraste con el acaparamiento de una rata que acaba de terminar un ensayo e inmediatamente colocándolo de nuevo en el agua para empezar el próximo juicio.
NOTA: No utilice recompensa externa (es decir, los alimentos) durante la capacitación, a fin de evitar la activación de los circuitos de recompensa en el cerebro. - Después del período de espera zona de meta, coloque un lado las ratas durante 1 min antes de iniciar la siguiente prueba. Seque suavemente las ratas con una toalla durante esta retención preventiva desde la entrada repetitivo en el agua hará que las ratas a llegar muy húmedo, y secarlos evitará la hipotermia.
- Repita 4.1.3. a través de 4.1.5. para completar 3 a 5 ensayos para cada rata para ser entrenado durante una sesión de entrenamiento de natación todos los días.
- Retire todos los divisores de canal y terminar área del tanque.
- Vaciar el agua del tanque. Ver 2.2.2.
- Programa de entrenamiento de natación semanal
- Llevar a cabo sesiones de entrenamiento al día (ver 4.1.) 5 días por semana, idealmente al mismo tiempocada día.
- Comienza el primer ensayo de la distancia negociado con éxito en el día anterior. Comience la segunda y tercera pruebas de un aumento de la distancia.
- Con cada sesión de entrenamiento diario posterior aumentar la distancia entre el lugar donde las ratas se colocan en el agua y la zona de meta. Durante las primeras sesiones de entrenamiento aumentar esta distancia por 5-10 cm. Después de que las ratas parecen más cómodo con la natación, aumentar las distancias de 30-50 cm.
- Utilice mayores aumentos en las distancias de natación, mientras que las ratas están aprendiendo a nadar una parte recta de un canal de natación. Por el contrario, aprender a nadar la curvas cerradas entre canales puede tardar 2-3 sesiones de entrenamiento.
NOTA: A menudo, mientras espera en la zona de meta, las ratas se volverá a entrar en el agua para nadar, y / o sumergir su cabeza bajo el agua, mientras que todavía se sienta en la plataforma de zona de meta. - Repita este protocolo de entrenamiento todos los días más de 3 semanas para asegurarse de la natación con éxito de la totalidad de los 5 canales.Este protocolo de entrenamiento repetitivo asegura la finalización con éxito del laberinto, sobre todo porque el laberinto incluye alternando turnos horquilla izquierdo y derecho.
5. Formación de buceo
NOTA: Después de que las ratas han aprendido a negociar con éxito la natación a través del laberinto que están listos para comenzar a entrenar de buceo.
- Entrenamiento de buceo inicial (primer día)
- Inserte cámara de inicio. Llene el tanque con agua (véase 2.2.1.). Asegurar el nivel de agua es de 1 cm por debajo de la apertura de la zona de salida.
- Inserte zona de meta y divisores de canal para crear 5 canales de natación.
- Durante la primera sesión de buceo entrenan las ratas para bajar en el ascensor en el agua dentro de la cámara de inicio. El acceso al laberinto es desde la parte inferior de la cámara de inicio. Durante este primer período de sesiones el nivel de agua es lo suficientemente baja para que la rata puede nadar fácilmente desde la cámara de inicio en el laberinto. Deje que la rata para continuar nadando a través del laberinto dela zona de meta.
- Entre los ensayos permiten a las ratas se mantienen en la zona de meta durante al menos 1 min.
NOTA: No utilice recompensa externa (es decir, los alimentos) durante la capacitación, a fin de evitar la activación de los circuitos de recompensa en el cerebro. - Después del período de espera zona de meta, coloque un lado las ratas durante 1 min antes de iniciar la siguiente prueba. Seque suavemente las ratas con una toalla durante esta retención preventiva.
- Repita 5.1.3. a través de 5.1.5. para completar 3 ensayos para cada rata para ser entrenado durante esta sesión inicial de entrenamiento de buceo.
- Retire todos los divisores de canal, iniciar la cámara y terminar el área del tanque.
- Vaciar el agua del tanque. Ver 2.2.2.
- Entrenamiento de buceo inicial (segundo día)
- Inserte cámara de inicio. Llene el tanque con agua (véase 2.2.1.). Asegúrese de nivel de agua es ligeramente por encima de la apertura a la zona de salida.
- Inserte zona de meta y divisores de canal para crear 5 canales de natación.
- Durante la segunda inmersiónperíodo de sesiones el nivel de agua de formación se ha planteado de manera que al salir de la cámara de inicio de la rata tiene que sumergir la cabeza bajo el borde de la cámara de inicio para entrar en el laberinto. Considere esto como primera inmersión de la rata. Deje que la rata para luego continuar nadando a través del laberinto a la zona de meta.
- Deje que las ratas se mantienen en la zona de meta durante al menos 1 minuto entre los ensayos.
NOTA: No utilice recompensa externa (es decir, los alimentos) durante la capacitación, a fin de evitar la activación de los circuitos de recompensa en el cerebro. - Después del período de espera zona de meta, coloque un lado las ratas durante 1 min antes de iniciar la siguiente prueba. Seque suavemente las ratas con una toalla durante esta retención preventiva.
- Repita 5.2.3. a través de 5.2.5. para completar 3 ensayos para cada rata para ser entrenado durante esta sesión de entrenamiento de buceo.
- Retire todos los divisores de canal, iniciar la cámara y terminar el área del tanque.
- Vaciar el agua del tanque. Ver 2.2.2.
- Entrenamiento de buceo inicial (third días)
- Inserte cámara de inicio. Llene el tanque con agua (véase 2.2.1.), Asegurando que el nivel de agua está por encima de la apertura de la zona de salida.
- Inserte zona de meta y divisores de canal para crear 5 canales de natación. Coloque un pedazo de plexiglás horizontal inmediatamente fuera de la zona de salida para crear un túnel de 5 cm de largo buceo.
- Durante la tercera sesión de entrenamiento de buceo la rata tiene que sumergir la cabeza bajo el borde de la cámara de inicio y nadar 5 cm bajo el agua para llegar a las aguas abiertas del canal de natación. Deje que la rata para luego continuar nadando a través del laberinto a la zona de meta.
NOTA: Una vez colocado en la zona de salida, ratas iniciar su propia inmersión bajo el agua, y por lo tanto estos son considerados como inmersiones "voluntarias". - Deje que las ratas se mantienen en la zona de meta durante al menos 1 minuto entre los ensayos.
NOTA: No utilice recompensa externa (es decir, los alimentos) durante la capacitación, a fin de evitar la activación de los circuitos de recompensa en el cerebro. - Después del período de espera zona de meta, coloque un lado las ratas durante 1 min antes de iniciar la siguiente prueba. Seque suavemente las ratas con una toalla durante esta retención preventiva.
- Repita 5.3.3. a través de 5.3.5. para completar 3 a 5 ensayos para cada rata para ser entrenado durante esta sesión de entrenamiento de buceo.
- Retire todos los divisores de canal, iniciar la cámara y terminar el área del tanque.
- Vaciar el agua del tanque. Ver 2.2.2.
- Programa de entrenamiento de buceo semanal
- Llevar a cabo sesiones de entrenamiento al día (ver 5.3.) 5 días por semana, a ser posible, al mismo tiempo cada día.
- Comienza el primer ensayo de la distancia negociado con éxito en el día anterior. Comience la segunda y tercera ensayos con un aumento de la distancia de buceo.
- Con cada sesión de entrenamiento diario posterior aumentar la longitud del túnel de buceo mediante la adición de divisores horizontales adicionales para ampliar la distancia de las ratas tienen que nadar bajo el agua. Para las primeras sesiones de entrenamiento aumento this distancia de 5-10 cm. Después de que las ratas parecen más cómodos con el buceo, aumentar las distancias de 30-50 cm.
NOTA: no fuerce la distancia de buceo intentado durante los ensayos sucesivos. Si es necesario, levante el extremo de la cubierta de canal horizontal para proporcionar distancias más cortas de buceo. Si durante un ensayo de inmersión a una rata no alcanza el final del túnel de buceo y comienza a girar alrededor de submarina, rápidamente levantar el extremo de la cubierta de canal y permitir la rata a la superficie y continuar su baño. Esto permitirá a la rata para completar con éxito una distancia de buceo más largo. Este refuerzo positivo mantendrá la rata se mueve hacia adelante a través del túnel bajo el agua con cada ensayo de buceo. - Utilice mayores aumentos en las distancias de buceo, mientras que las ratas están aprendiendo a bucear una parte recta de un canal de natación. Por el contrario, aprender a bucear alrededor de la curvas cerradas entre canales puede tardar 2-3 sesiones de entrenamiento.
NOTA: A menudo, mientras espera en la zona de meta, las ratas se vuelva a introducir ªe agua para nadar, y / o sumergir su cabeza bajo el agua, mientras que todavía se sienta en la plataforma de zona de meta. - Repita este protocolo de entrenamiento todos los días más de 3 semanas para asegurarse de buceo con éxito de la totalidad de los 5 canales. Este protocolo de entrenamiento repetitivo asegura la finalización con éxito del laberinto, sobre todo porque el laberinto incluye alternando turnos horquilla izquierdo y derecho.
NOTA: El programa de entrenamiento de natación y buceo completo 6 semanas coincide con el crecimiento de 35 g ratas recién destetadas a alcanzar un peso corporal de 300 g. - Después de las sesiones de entrenamiento diarias son completas, y las ratas han sido devueltos a sus jaulas, garantizar ratas se secan rápidamente su piel a través de la preparación, o si es necesario, colocar una almohadilla térmica bajo su jaula para mantener las ratas caliente hasta que su piel esté seca.
6. variaciones experimentales
NOTA: La puesta a punto y de los animales la formación experimental básica se han descrito anteriormente. Sin embargo, la formación del comportamiento sólo provides un modelo para ser utilizado con otras técnicas experimentales para recoger datos de interés. Protocolos básicos se modifican para investigar aspectos específicos de la respuesta de buceo. Ejemplos de estas modificaciones, y algunas consideraciones para la recogida de datos mediante estas técnicas fisiológicas y neuroanatómicas, se dan a continuación.
- Implantables transmisores telemétricos
- Tras la finalización de la formación, utilizar los transmisores de telemetría disponibles comercialmente para transmitir la presión arterial pulsátil de natación y buceo ratas. Obtener la aprobación del IACUC local para procedimientos relacionados con la cirugía y la recuperación post-quirúrgica. Siga los procedimientos de implantación sugeridas por la compañía para su transmisor, y asegurar la recuperación completa de la cirugía antes de regresar a la rata en el agua.
- Asegúrese de que la antena que recibe la señal de radio está cerca cuando la rata está en el agua.
NOTA: El agua atenúa las señales de radio, por lo que la distancia de la señal de radio neEDS para viajar a través del agua se convierte en un factor limitante de las dimensiones del tanque. - Utilice una antena varita de mano, en lugar de una antena de tamaño de jaula de la rata, para seguir la rata a medida que avanza a través del laberinto. Mantenga la antena varita dentro de los 30 cm de la rata para asegurar que la señal de radio no se pierde, mientras que la rata está bajo el agua.
- Trailing cánulas
- Rediseñar los divisores de canal y piezas horizontales que crean el techo del túnel de buceo para que senderos de la cánula a lo largo de detrás de la rata durante su progresión a través del laberinto.
NOTA: El diseño modular de los canales es de suma importancia y debe también permitir recuperarse rápido de la rata del laberinto submarino. Si un enganchones cánula y se desprendió de la rata, la rata pronto podría sangrar a cabo bajo el agua si la cánula no se vuelve a unir de forma rápida. - Utilice posterior cánulas arterial para registrar la presión sanguínea arterial y la frecuencia cardíaca en ratas voluntariamente de buceo. Utilice un trozo de 90 cm de PE50 comouna cánula trasera.
NOTA: Esta longitud de la cánula es suficientemente largos para conectar la rata al transductor de presión al tiempo que permite la rata para el progreso a través del laberinto, aunque es suficientemente corto para minimizar el espacio muerto de la cánula y está lo suficientemente cerca del transductor de presión para permitir que la fidelidad suficiente de la señal de la presión arterial. - Utilice de salida venoso (o arterial) cánulas para inyectar agentes farmacéuticos tales como los agonistas y antagonistas simpático y parasimpático, o inyectar trazadores o colorantes que determinan la distribución del gasto cardíaco.
- Extraer muestras de sangre de las ratas utilizando las cánulas venosa (o arterial), mientras que las ratas están bajo el agua para determinar los niveles de catecolaminas bajo el agua o química sanguínea.
NOTA: Minimizar la longitud de la cánula de salida y dan cuenta de la cánula espacio muerto durante las extracciones de sangre.
- Rediseñar los divisores de canal y piezas horizontales que crean el techo del túnel de buceo para que senderos de la cánula a lo largo de detrás de la rata durante su progresión a través del laberinto.
- Detección de las neuronas del tronco cerebral activados
- Utilice la detección inmunológica de la proteína Fos para identiáreas específicas de fy el tronco del encéfalo que son parte de la respuesta de buceo.
NOTA: Durante la iniciación repetitivo de un reflejo cardiorrespiratoria, las neuronas del tronco cerebral que forman parte de ese circuito reflejo puede activarse y producir una proteína llamada Fos. - Repetitivamente bucear ratas en el laberinto cada 5 minutos durante 2 horas para un total de 24 inmersiones.
NOTA: Otros protocolos que también inducen la producción neuronal Fos también se puede utilizar. Para evitar la activación de las neuronas del tronco cerebral implicadas en la respuesta al estrés, el comportamiento que se repite debe ser incluido como parte de la formación del comportamiento.
- Utilice la detección inmunológica de la proteína Fos para identiáreas específicas de fy el tronco del encéfalo que son parte de la respuesta de buceo.
- Niveles de corticosterona de sangre durante el buceo
- Utilice corticosterona como un indicador del nivel de experiencia de las ratas de estrés durante la natación y el buceo.
- Para obtener sangre para el análisis de corticosterona, dibujar 0,1 ml muestras de sangre de la vena de la cola de las ratas 15 min después de 3 o nada inmersiones voluntarias.
NOTA: Los experimentos preliminares indicaron que 15 minutos es Dotiempo ficiente para permitir la producción y liberación de corticosterona en la circulación y provocar un pico en los niveles de corticosterona en plasma. Dado que los niveles de corticosterona tienen un ritmo circadiano, programar toda la sangre atrae a la misma hora del día y la correspondencia con el calendario de las sesiones de entrenamiento.
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Representative Results
La conclusión con éxito de los procedimientos de entrenamiento de natación y buceo descritas puede disminuir el estrés experimentado por las ratas cuando se bucea bajo el agua. Niveles de corticosterona de sangre indican que el entrenamiento diario repetitivo disminuye la stressfulness asociado con el buceo voluntaria, y las ratas entrenadas a encontrar el buceo no es más estresante que se manejan a diario por un humano (Figura 2; 17). Por el contrario, las ratas no entrenados en el protocolo de buceo encuentran buceo voluntaria estresante (Figura 2; 17). Además, tanto en ratas entrenados y no entrenados encuentran buceo obligados a ser el más estresante (Figura 2; 17).
Las respuestas cardiovasculares de la natación, el buceo de buceo voluntaria y ratas forzadas han sido grabados con dispositivos implantados de telemetría (Figura 3; 8,17-20) y cánulas de salida (Figura 4; 21-23). Inmediatamente después de voluntariainmersión, y dentro de un solo latido, frecuencia cardíaca disminuye en un 78% y la media de la sangre arterial que disminuye la presión en un 25% 17. Estos resultados muestran que las ratas voluntariamente buceo exhiben los mismos cambios cardiorrespiratorios típicamente vistos en otros animales de buceo. Trailing cánulas arteriales se han utilizado para inyectar el antagonista muscarínico atropina, que elimina la bradicardia asociada con el buceo voluntaria (Figura 4; 21), y para determinar la distribución del gasto cardíaco 22, incluyendo el flujo sanguíneo cerebral 23, durante la inmersión voluntaria. Cánulas se arrastran también se han utilizado para demostrar que las ratas ignoran cada vez mayor hipoxemia arterial y la hipercapnia mientras están sumergidos 18, y que la unidad preexistente quimiorreceptores no tiene ningún efecto sobre las respuestas cardiovasculares al buceo voluntaria 21.
Las neuronas dentro de las láminas I y II del asta dorsal medular ventral (MDH) expresan Fos during buceo voluntaria, y estas neuronas pueden constituir el relé aferente tronco cerebral inicial de la respuesta de buceo (Figura 5; 24). Importantes áreas de control cardiorrespiratorio del tronco cerebral, como la zona del compresor caudal (CPA), solitarios núcleo del tracto (NTS), médula ventrolateral rostral (RVLM), y regiones peribrachial, todo espectáculo aumentaron etiquetado Fos durante la inmersión voluntaria en comparación con la natación 25. Las neuronas en regiones quimiosensibles del tronco cerebral expresan Fos después de larga duración obligó inmersiones 18.
Figura 1:. Esquemática de tanque de buceo Un tanque de plexiglás (100 x 60 x 15 cm) se utilizó para crear un laberinto simple que consiste en cinco canales largos 1 m. El tanque se llena con 30 ° C el agua del grifo, y las ratas fueron inicialmente entrenado para negotiate el laberinto nadando en la superficie del agua, desde la zona de salida (arriba a la izquierda) a la zona de meta (abajo a la derecha). Las ratas fueron entrenadas para bucear a través del laberinto, mantienen bajo el agua por piezas de plexiglás horizontales colocados 2-3 cm por debajo de la superficie del agua. [Esta cifra se ha modificado desde el 26]
Figura 2: Mediciones de corticosterona. La extracción de sangre de venas de la cola de rata se utilizan para medir las concentraciones de corticosterona (media ± DE) de las ratas que quedan en sus jaulas (Naïve), ratas manejadas durante 10 min / día (Mango), las ratas entrenadas para nadar y bucear (especializado), y ratas que no recibieron nadar o bucear formación (sin formación). Corticosterona se midió después de ratas entrenadas habían completado su entrenamiento de natación (establecido Izquierda de barras), las ratas después de entrenados habían completado su div voluntariaformación e (conjunto Centro de barras), y después de ratas entrenadas habían completado su entrenamiento de buceo forzada (Derecho conjunto de barras). 1 indica que el valor es significativamente mayor que Naïve; 2 indica el valor es significativamente mayor que manipulado; 3 indica el valor es significativamente mayor que capacitado; * Indica que el valor en ratas entrenadas durante la inmersión forzada es significativamente mayor que durante la inmersión voluntaria. [Esta cifra se ha modificado a partir de 17]
Figura 3: huellas de la presión arterial de los transmisores de telemetría rastros de datos crudos que muestran la presión arterial pulsátil durante la natación (columna izquierda), buceo voluntaria (columna central), y el buceo forzada (columna derecha) de ratas entrenadas para nadar y bucear a través del laberinto. (fila inferior) y de las ratas que no habían tenido la traiprocedimiento Ning (fila superior). Buceo bajo el agua (tanto voluntario como inmersión forzada) produjo una bradicardia inmediata y más lento aumento en la presión arterial inicio, mientras que la natación en la superficie del agua no causó dichos cambios cardiovasculares. Bares bajo trazas indican períodos de inmersión. Las interrupciones de la traza indican períodos en los que se pierde la señal de telemetría. [Esta cifra se ha modificado a partir de 17]
Figura 4: La atropina elimina bradicardia buceo. Grabaciones originales de la presión sanguínea arterial pulsátil de ratas voluntariamente buceo (A) antes y (b) después de la atropina pre-tratamiento. Las huellas se obtuvieron usando una cánula arterial de salida. Antes de atropina pre-tratamiento, la presión arterial disminuyó ligeramente a la inmersión, pero tgallina aumentó a más de pre-inmersión para el resto de la inmersión. La frecuencia cardíaca se determinó a partir de intervalos de presión de pulso adyacentes. Tras la inmersión había una bradicardia inmediata y sustancial que se mantuvo durante la duración de la inmersión. Después de bloqueo parasimpático por atropina pretratamiento el bradicardia fue eliminado. También hubo un aumento en la presión arterial durante la inmersión. La barra bajo la traza indica el período de sumersión. [McCulloch, inédito]
Figura 5: Fos etiquetado dentro de la MDH. Las microfotografías del cuerno dorsal medular del trigémino (MDH) y el tracto espinal del trigémino (SP5) en ratas entrenadas para bucear bajo el agua. (A) En una rata de control que no bucear repetitiva no hay etiquetado Fos. (B) En una rata nadar allí está muy iluminadoTLE Fos etiqueta en el MDH (punta de flecha grande) o núcleo paratrigeminal (flecha pequeña) dentro de SP5. (C) en una rata de buceo hay más etiquetado Fos ventralmente tanto en el MDH (punta de flecha grande) y el núcleo paratrigeminal (flechas pequeñas) en comparación con la natación y desratización. Inserte en el panel (A) indica la ubicación rostral-caudal de paneles AC. Barra de escala en el panel C es de 100 micras. [Esta cifra se ha modificado desde el 24]
Figura 6: Activado neuronas catecolaminérgicos de ratas de buceo. Las fotomicrografías muestran las médulas de una rata no buceo control (A, C, y E) y una rata voluntariamente buceo (B, D, y F). El tejido cerebral se procesó para immunohistologically tanto un Fosd hidroxilasa tirosina (TH), produciendo somas TH marrón y núcleos negros Fos. Puntas de flecha abiertas identificar una sola etiqueta neuronas TH-positivas, mientras que las flechas sólidas identifican Fos + TH neuronas doble etiquetado. A1 neuronas se identifican en las neuronas A y B. C1 se identifican en C y D. A5 neuronas se identifican en E y F. Más Fos y TH doble marcado con se ven en la A1, C1, y las regiones A5 de la rata de buceo de en la rata control no buceo. Barra de calibración en E es de paneles de AF, y es de 250 micras. Barra de calibración en la inserción en F es para todas las inserciones, y es de 50 micras. [Esta cifra se ha modificado desde el 26]
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Discussion
Ratas en su forma salvaje pueden y de hecho explotar ambientes semi-acuáticos, y lo hará a menudo bucear bajo el agua, mientras que la búsqueda de alimentos 6. Así, no es demasiado sorprendente que las ratas pueden ser fácilmente entrenados para bucear voluntariamente bajo el agua. Los procedimientos de formación descritas pueden durar hasta 6 semanas, lo que traerá ratas recién destetadas a un tamaño corporal utilizado en la mayoría de los atlas del cerebro de rata adulta (~ 300 g). Así, los cerebros de estos animales entrenados serán más fácilmente comparables a las estructuras anatómicas identificadas en estos atlas.
Después de ser colocado en la zona de salida mayoría de las ratas comenzarán su nadar bajo el agua dentro de 20 seg. Sin embargo, de vez en cuando una rata se llevará a hasta 5 minutos o más antes de iniciar su inmersión voluntaria. Si bien puede ser tentador en esta etapa para forzar a las ratas en el túnel bajo el agua, por regla general, se debe evitar para prevenir las ratas de asociar el agua con una experiencia negativa. Los roedores pueden ser terco y mayo inialiado niegan a bucear durante las sesiones de entrenamiento, pero una vez que se dan cuenta de la única manera de salir del agua es completando la inmersión a través del laberinto, por lo general inician sus inmersiones poco después de ser colocado en la zona de salida.
Un aspecto crítico de los procedimientos de formación repetitivas y metódicas es que se llevan a cabo de tal manera para reducir el estrés experimentado por las ratas. Dejar que las ratas a explorar su entorno, especialmente mientras que en la zona de acabado entre los ensayos, parece reducir aún más el estrés. Las ratas a menudo volver a entrar en el agua para nadar, y / o sumergir su cabeza bajo el agua, mientras que todavía se sienta en la plataforma de zona de meta. Esto sugiere que las ratas no son inherentemente agua aversivo. Además, aunque no es raro que las ratas para producir bolitas fecales durante la natación o el buceo, o cuando se espera en la zona de meta, resultados diarias de entrenamiento en menos de 17 partículas fecales. En general, el menos estresado las ratas son durante el entrenamiento, menos peletes van a producir. Cualquier bolitas fecales que se producen se retiran de la zona de aguas o acabado tan pronto como sea posible para mantener el agua relativamente limpia.
Las ratas pueden ocasionalmente llegar narices ensangrentadas mientras que la natación y el buceo, que puede ser una consecuencia de la insuflación de agua en los conductos nasales. La aparición de sangre puede ser debido a las tensiones osmóticas dentro de la mucosa nasal. Mientras que en la zona de meta entre los ensayos las ratas se asearse. Como consecuencia de la sangre de la nariz pueden quedar redistribuida sobre la cabeza y el hocico ratas, dando a las ratas un ligero tinte rojizo, especialmente alrededor de los ojos, durante el curso de una sesión de entrenamiento. También, una rata ocasional puede encontrar buceo estresante y / o tener experiencias de buceo negativos (es decir, por dar la vuelta y perderse bajo el agua buceo (ver nota después 5.4.3. Sobre la manera de evitar que esto ocurra)). En estas ratas porfirina puede aparecer en las esquinas de sus ojos, lo que indica una respons estrése.
El tamaño del tanque de buceo a un cierto grado de determinar los requisitos de las habitaciones. El tanque descrito está diseñado para tener ratas nadan 2-3 cm bajo la superficie del agua a través de unos 5 m de largo laberinto de plexiglás para dar una duración de natación bajo el agua de 10 a 15 seg 17,19,24,26,27. En caso de que un experimento se diseñó para medir las respuestas de una duración más larga de buceo, o de una inmersión más profunda bajo el agua, puede ser necesario el tanque para ser re-diseñado. Los requisitos de las habitaciones podrían entonces también cambiar para adaptarse a las dimensiones de un tanque de buceo nuevo diseño. Si no hay drenaje de suelo disponible en la sala de procedimiento, el agua del tanque se puede recoger en un recipiente grande, tal como un cubo de basura 60 gal puede, que luego se puede vaciar en otra parte de una manera conveniente.
La técnica Fos se puede utilizar con otros métodos de detección neuronal para identificar y caracterizar más neuronas que son parte de la circuitería de la respuesta del tronco encefálico buceo. Por ejemplo,Detección de Fos en conjunción con la tinción de la tirosina hidroxilasa ha identificado neuronas catecolaminérgicas en el A1, C1, A2, A5 y áreas sub-coeruleus (Figura 6; 26), y las neuronas globosa dentro de la zona lateral A7 26,27, que se activan durante voluntaria buceo. Además, la detección de Fos en conjunción con el trazador retrógrado de la toxina del cólera ha identificado los cuerpos celulares de las neuronas motoras vagal cardíaco dentro de la formación externa de la núcleo ambiguo que se activan durante la inmersión voluntaria 20.
La investigación de la integración nervioso central de las respuestas cardiorrespiratorias a buceo es importante para un número de razones 6,8,28. La respuesta de buceo permite a los animales, incluyendo seres humanos, para permanecer bajo el agua sin respirar sumergido por largos períodos de tiempo. La respuesta de buceo representa una reorganización funcional de control homeostático del tronco cerebral, y demuestra una de las pa más potentetterns de reflejos autonómicos observados en los animales. La respuesta de buceo también puede ser clínicamente importante en los seres humanos como parte del reflejo trigémino-cardiaca, reflejo de la nasofaringe, y / o síndrome de muerte súbita del lactante. Finalmente, una comprensión de la circuitería neuronal que existe dentro del tronco cerebral de ratas ayudará a determinar cómo cortical señales aferentes puede modificar tronco cerebral básica reflejos autonómicos. Todas estas consideraciones hacen que el estudio de los aspectos centrales de la respuesta de buceo de los mamíferos inherentemente valioso e interesante. Usando los procedimientos descritos para entrenar ratas para bucear voluntariamente bajo el agua permitirá una mejor investigación de los aspectos centrales de la respuesta de buceo de los mamíferos que hará el uso de animales buceado forzados. Esto se debe a que los procedimientos de entrenamiento como se describe 1) reducen la activación de los circuitos de tensión del SNC, y 2) no se activan SNC circuito de recompensa, porque las recompensas externas no se utilizan.
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Disclosures
El autor es consultor para Stoelting Empresa, y siempre que el diseño y las especificaciones de la McCulloch buceo Tanque Maze general para fines comerciales.
Acknowledgments
La investigación financiada por la Oficina de Programas de Investigación y patrocinado Universidad del Medio Oeste. Gracias también al Fondo para el Medio Oeste de la Universidad de Animales y Erik Warren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
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