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Behavior

Rats de formation à volontairement plongée sous-marine: Enquêtes de la réponse de la plongée sous-marine mammifères

Published: November 12, 2014 doi: 10.3791/52093

Protocol

REMARQUE: Les protocoles expérimentaux décrits ici menée à l'Université du Midwest ont été approuvés par le Midwest Université IACUC.

1. Exigences de la chambre

  1. Fixez une salle de procédure qui a de l'eau courante chaude et froide, et une façon d'enlever l'eau du réservoir, généralement un drain dans le plancher.
  2. Utilisez une table de travail sur laquelle placer le réservoir de plongée. Depuis chambres avec siphons de sol sont généralement profilée pour drainage, de réduire les bouchons en caoutchouc et les placer sous les pieds de la table pour s'assurer que le haut du tableau, et donc la surface de l'eau dans le réservoir, est de niveau.

2. Plongée réservoir

  1. Plongée construction de réservoirs
    1. Construction d'un réservoir rectangulaire (100 x 60 x 15 cm) en utilisant 3/4 en Plexiglas d'épaisseur pour la partie inférieure et la moitié en plexiglas pour les parois latérales (figure 1). Fixer de façon permanente les pièces en plexiglas à l'extérieur de la cuve ainsi que l'aide de ciment à base de cyanoacrylate ou solvents tel que le trichlorométhane.
    2. Diviser le réservoir en 5 canaux chacun environ 100 cm de longueur, à l'aide amovibles en plexiglas épaisseur de 1/2 de pouce coupé en 85 x 15 cm de côté. Place de façon permanente des rainures dans le fond et les bords du réservoir dans lequel ces diviseurs de canaux peuvent être insérées dans la position.
    3. Suspendre horizontales pièces en plexiglas des diviseurs de canaux pour créer un «toit» pour une plongée "tunnel sous-marin.
    4. Dans un coin de la place du réservoir d'une plate-forme amovible soulevé, la «zone de finition", pour les rats pour transporter de l'eau et de repos entre natation et de plongée essais. Les rats se toilettent et éliminer l'eau de leur fourrure alors que dans la zone de finition habituellement. Placez grands côtés sur les bords de l'aire d'arrivée pour assurer les rats restent sur la plate-forme entre les essais de formation.
    5. A l'angle opposé de la cuve de la zone d'arrivée de placer une chambre qui permet seulement un accès sous-marin à labyrinthe. Cette amovible "commencer unerea »est utilisé seulement pour les essais de plongée.
      NOTE: Au début d'un essai de plongée un rat est descendu dans l'eau alors qu'il était assis sur une plate-forme à l'intérieur de la chambre de départ; donc cette plate-forme est appelée «l'ascenseur».
      REMARQUE: Utilisez une conception modulaire, où la zone de départ, zone d'arrivée, et tous les canaux intercalaires sont amovibles du réservoir. Ceci est fait pour deux raisons: 1) pour faciliter le remplissage et la vidange du réservoir avec de l'eau après le retrait de tous les diviseurs de canaux, et 2) si un rat se désorienté, surtout sous l'eau, les pièces peuvent être rapidement démontés pour sauver le rat de la eau.
  2. Remplissage et la vidange du réservoir avec de l'eau
    1. Remplissage du réservoir avec de l'eau
      1. Au début de chaque session de formation, remplir le réservoir à 32 ° C l'eau du robinet fraîche à une profondeur d'environ 12 cm. Incorporer l'eau dans le réservoir afin de limiter poches chaudes ou froides.
        Remarque: En général, il faut environ 2 heures pour former 12 rats. Pendant ce temps,température de l'eau diminue d'environ 4 ° C. A la fin de la session de formation l'eau se refroidit à environ 28 ° C. Depuis 30 ° C l'eau est thermoneutre à des rats, en utilisant cette eau chaude, plutôt que de l'eau à température ambiante, permettra de minimiser les pertes de chaleur pendant l'entraînement répétitif.
    2. Vider le réservoir avec de l'eau
      1. A la fin de chaque séance d'entraînement, vider l'eau de la cuve à l'aide d'un grand tuyau, par exemple un long morceau de tube de diamètre interne de 1 pouce de 4 m. Immerger complètement le tube dans le réservoir, en veillant à poches d'air sont dans le tube. Placer rapidement une extrémité du tuyau dans le drain de plancher. L'effet de siphon résultant vider l'eau du réservoir.
      2. Tout en maintenant l'extrémité de la tubulure de réservoir sous la surface de l'eau pour maintenir le siphon, la pointe du réservoir sur le bord de faciliter une vidange complète de l'eau.
        Remarque: vous pouvez et, plutôt que de siphon, installer un robinet près de la base du réservoir, et se connecterun tuyau du réservoir appuyez sur pour le drain de plancher.

3. Considérations Rat allergènes

  1. Porter des gants jetables lors de la manipulation et de la formation des rats. Les gants de limiter le contact avec l'eau dans le réservoir, qui sera toujours contenir l'urine de rat.
    NOTE: Les rats vont devenir humide au cours de la formation, et la salle sera remplie avec une odeur "humide-rat". Par conséquent, un régime prophylactique d'anti-histaminiques peut prévenir ou de limiter les effets des allergies chez le rat. Les formateurs peuvent aussi avoir besoin de porter des masques anti-poussière jetables, ou masques N95, devraient-ils devenir sensibles aux allergènes de rat.

4. Formation de natation

  1. Formation de natation tous les jours
    REMARQUE: L'expérience personnelle indique que les rats plus jeunes apprennent le labyrinthe mieux et plus vite, et commencent donc la formation avec 35 g rats sevrés est préférable d'utiliser des rats adultes.
    1. Remplir le réservoir avec de l'eau. Voir 2.2.1.
    2. Insérer finitionrégion et canaux séparateurs pour créer 5 chaînes de natation.
    3. Au cours de la première session de formation abaisser doucement les rats à la main dans l'eau d'environ 3-5 cm de l'aire d'arrivée.
      REMARQUE: lors de l'introduction de rats d'eau apparaît comme instable ils rencontrent d'abord la sensation de flotter. Les rats vont pagayer sur de façon non coordonnée, tout en essayant de trouver un moyen de sortir de l'eau, pour finalement atteindre la zone d'arrivée à proximité. En raison de leur capacité innée à nager, dans des essais ultérieurs, les rats vont nager dans une manière beaucoup plus coordonnée vers l'aire d'arrivée.
      Note: Le support des rats de dessous de sorte que leurs pieds sont sur les enquêteurs mains. Abaissez doucement les rats dans l'eau, et laissez-les nager loin de la main, plutôt que de les laisser tomber dans l'eau.
    4. Entre les essais laisser les rats restent dans l'aire d'arrivée pour au moins 1 min. Ceci est de permettre aux rats de toiletter et d'explorer, de sorte qu'ils considèrent l'aire d'arrivée comme un lieu «sûr»pour aller entre les essais. Ceci est en contraste saisissant à un rat qui vient de terminer un essai et immédiatement positionner en arrière dans l'eau pour commencer l'essai suivant.
      NOTE: Ne pas utiliser récompense externe (c.-à-alimentaire) au cours de la formation, de manière à empêcher l'activation des circuits de récompense dans le cerveau.
    5. Après la période d'attente de la zone d'arrivée, tenir doucement les rats pendant 1 min avant de commencer l'essai suivant. Séchez délicatement les rats avec une serviette pendant cette attente provisoire depuis l'entrée répétitive dans l'eau entraîne des rats à devenir très humide et les sécher permettra d'éviter l'hypothermie.
    6. Répétez 4.1.3. par 4.1.5. à compléter 3 à 5 essais pour chaque rat à être formé au cours d'une séance quotidienne d'entraînement de natation.
    7. Retirez tous les diviseurs de canaux et terminer la zone du réservoir.
    8. Vider l'eau de la cuve. Voir 2.2.2.
  2. Programme d'entraînement de natation hebdomadaire
    1. Des séances de formation par jour (voir 4.1.) 5 jours par semaine, idéalement en même tempschaque jour.
    2. Commencez la première épreuve de la distance négocié avec succès la veille. Commencer les deuxième et troisième essais à partir d'une distance accrue.
    3. Avec chaque séance d'entraînement quotidienne ultérieure augmenter la distance entre l'endroit où les rats sont placés dans l'eau et l'aire d'arrivée. Pour les quelques premières sessions de formation augmenter cette distance de 5-10 cm. Après les rats semblent plus à l'aise avec piscine, augmenter les distances de 30-50 cm.
    4. Utilisez des augmentations plus importantes dans les distances de nage tandis que les rats apprennent à nager une partie droite d'un canal de natation. En revanche, apprendre à nager le virages entre les canaux peut prendre 2-3 séances de formation.
      REMARQUE: Souvent, en attendant dans l'aire d'arrivée, les rats rentrer à la nage, et / ou plonger leur tête sous l'eau alors qu'il siégeait encore sur la plate-forme de la zone d'arrivée.
    5. Répétez ce protocole d'entraînement quotidien plus de 3 semaines afin d'assurer piscine succès de l'ensemble des 5 canaux.Ce protocole de formation répétitif assure la réussite du labyrinthe, en particulier depuis le labyrinthe comprend en alternance des virages en épingle à cheveux à gauche et à droite.

5. Formation de plongée

NOTE: Après les rats ont appris à négocier natation à travers le labyrinthe avec succès, ils sont prêts à commencer la formation de plongée.

  1. Formation de plongée initiale (premier jour)
    1. Insérez chambre de démarrage. Remplir le réservoir avec de l'eau (voir 2.2.1.). Assurer un niveau de l'eau est de 1 cm en dessous de l'ouverture de la zone de départ.
    2. Insérez aire d'arrivée et diviseurs de canaux pour créer les 5 chaînes de natation.
    3. Au cours de la première session de plongée former les rats à être abaissés sur l'ascenseur dans l'eau dans la chambre de départ. L'accès au labyrinthe est à partir du fond de la chambre de départ. Au cours de cette première session, le niveau d'eau est suffisamment faible pour le rat peut nager facilement de la chambre de départ dans le labyrinthe. Laisser le rat à continuer à nager à travers le labyrinthe del'aire d'arrivée.
    4. Entre les essais laisser les rats restent dans l'aire d'arrivée pour au moins 1 min.
      NOTE: Ne pas utiliser récompense externe (c.-à-alimentaire) au cours de la formation, de manière à empêcher l'activation des circuits de récompense dans le cerveau.
    5. Après la période d'attente de la zone d'arrivée, tenir doucement les rats pendant 1 min avant de commencer l'essai suivant. Séchez délicatement les rats avec une serviette pendant cette attente avant le procès.
    6. Répétez 5.1.3. par 5.1.5. à effectuer 3 essais pour chaque rat à être formé au cours de cette session de formation initiale de plongée.
    7. Retirez tous les diviseurs de canaux, commencer et finir chambre zone du réservoir.
    8. Vider l'eau de la cuve. Voir 2.2.2.
  2. Formation de plongée initiale (deuxième jour)
    1. Insérez chambre de démarrage. Remplir le réservoir avec de l'eau (voir 2.2.1.). Assurez niveau de l'eau est légèrement au-dessus de l'ouverture de la zone de départ.
    2. Insérez aire d'arrivée et diviseurs de canaux pour créer les 5 chaînes de natation.
    3. Au cours de la deuxième plongéesession de formation du niveau de l'eau a été soulevée de sorte que pour sortir de la chambre de démarrage, le rat doit mettre la tête sous le bord de la chambre de démarrage pour entrer dans le labyrinthe. Considérez cela comme première plongée du rat. Laisser le rat de continuer ensuite la natation à travers le labyrinthe de l'aire d'arrivée.
    4. Que les rats restent dans l'aire d'arrivée pour au moins 1 min entre les essais.
      NOTE: Ne pas utiliser récompense externe (c.-à-alimentaire) au cours de la formation, de manière à empêcher l'activation des circuits de récompense dans le cerveau.
    5. Après la période d'attente de la zone d'arrivée, tenir doucement les rats pendant 1 min avant de commencer l'essai suivant. Séchez délicatement les rats avec une serviette pendant cette attente avant le procès.
    6. Répétez 5.2.3. par 5.2.5. à effectuer 3 essais pour chaque rat à être formé au cours de cette session de formation de plongée.
    7. Retirez tous les diviseurs de canaux, commencer et finir chambre zone du réservoir.
    8. Vider l'eau de la cuve. Voir 2.2.2.
  3. Formation de plongée initiale (troisième jour)
    1. Insérez chambre de démarrage. Remplir le réservoir avec de l'eau (voir 2.2.1.), Veiller à ce que le niveau d'eau est au-dessus de l'ouverture de la zone de départ.
    2. Insérez aire d'arrivée et diviseurs de canaux pour créer les 5 chaînes de natation. Placer un morceau de Plexiglas horizontal immédiatement à l'extérieur de la zone de départ pour créer un tunnel sous-marine à long 5 cm.
    3. Au cours de la troisième session de formation de plongée, le rat doit mettre la tête sous le bord de la chambre de début et nager 5 cm sous l'eau pour atteindre l'eau ouverte du canal de natation. Laisser le rat de continuer ensuite la natation à travers le labyrinthe de l'aire d'arrivée.
      REMARQUE: Une fois placé dans la zone de départ, les rats lancer leur propre submersion marine, et donc ceux-ci sont considérés comme des plongées «volontaires».
    4. Que les rats restent dans l'aire d'arrivée pour au moins 1 min entre les essais.
      NOTE: Ne pas utiliser récompense externe (c.-à-alimentaire) au cours de la formation, de manière à empêcher l'activation des circuits de récompense dans le cerveau.
    5. Après la période d'attente de la zone d'arrivée, tenir doucement les rats pendant 1 min avant de commencer l'essai suivant. Séchez délicatement les rats avec une serviette pendant cette attente avant le procès.
    6. Répétez 5.3.3. par 5.3.5. à compléter 3 à 5 essais pour chaque rat à être formé au cours de cette session de formation de plongée.
    7. Retirez tous les diviseurs de canaux, commencer et finir chambre zone du réservoir.
    8. Vider l'eau de la cuve. Voir 2.2.2.
  4. Programme de formation de plongée hebdomadaire
    1. Organiser des séances d'entraînement quotidiennes (voir 5.3.) 5 jours par semaine, idéalement à la même heure chaque jour.
    2. Commencez la première épreuve de la distance négocié avec succès la veille. Commencer les deuxième et troisième essais avec une distance accrue plongée.
    3. Avec chaque séance d'entraînement quotidienne ultérieure augmenter la longueur du tunnel de plongée en ajoutant séparateurs horizontaux supplémentaires pour étendre la distance les rats ont à nager sous l'eau. Pour la première quelques séances de formation augmentation this la distance de 5-10 cm. Après les rats semblent plus à l'aise avec la plongée, augmenter les distances de 30-50 cm.
      REMARQUE: Ne pas disperser et la distance de plongée tenté au cours des essais successifs. Si nécessaire, soulevez la fin de la couverture du canal horizontal à fournir plus courtes distances de plongée. Si lors d'un essai de plongée un rat ne parvient pas au bout du tunnel de plongée et se met à tourner autour de sous-marin, rapidement soulever la fin de la couverture de canal et permettre le rat à la surface et de poursuivre son bain. Cela permettra au rat pour mener à bien une distance de plongée plus. Ce renforcement positif tiendra le rat aller de l'avant à travers le tunnel sous-marin avec chaque essai de plongée.
    4. Utilisez des augmentations plus importantes dans les distances de plongée tandis que les rats apprennent à plonger une partie droite d'un canal de natation. En revanche, apprendre à plonger dans le virages entre les canaux peut prendre 2-3 séances de formation.
      REMARQUE: Souvent, en attendant dans l'aire d'arrivée, les rats réintégrer ee l'eau pour nager, et / ou plonger leur tête sous l'eau alors qu'il siégeait encore sur la plate-forme de la zone d'arrivée.
    5. Répétez ce protocole d'entraînement quotidien plus de 3 semaines pour assurer le succès de plongée de l'ensemble des 5 canaux. Ce protocole de formation répétitif assure la réussite du labyrinthe, en particulier depuis le labyrinthe comprend en alternance des virages en épingle à cheveux à gauche et à droite.
      REMARQUE: Le programme d'entraînement de natation et de plongée complet 6 semaines coïncide avec la croissance de 35 g rats sevrés à atteindre un poids de 300 g.
    6. Après des séances d'entraînement quotidiennes sont terminées, et les rats ont été renvoyés dans leur cage, assurer rats sèchent rapidement leur fourrure par le toilettage, ou si nécessaire, placez un coussin chauffant sous leur cage pour garder les rats chaud jusqu'à ce que leur fourrure est sèche.

6. Les variations expérimentales

REMARQUE: La mise en place et l'animal expérimental formation de base ont été décrits ci-dessus. Cependant, la formation comportementale seulement provides un modèle pour être utilisé avec d'autres techniques expérimentales pour collecter des données d'intérêt. Protocoles de base sont modifiés pour étudier les aspects spécifiques de la réponse de plongée. Des exemples de ces modifications, et certaines considérations pour la collecte de données à l'aide de ces techniques physiologiques et neuro-anatomiques, sont donnés ci-dessous.

  1. Implantables émetteurs télémétriques
    1. Après l'achèvement de la formation, utiliser des émetteurs télémétriques disponibles dans le commerce pour transmettre pulsatile de la pression artérielle de natation et de plongée rats. Obtenir l'approbation locale IACUC pour les procédures relatives à la chirurgie et la récupération post-chirurgicale. Suivez les procédures d'implantation proposés par la société pour leur émetteur, et assurer une récupération complète de la chirurgie avant de retourner le rat dans l'eau.
    2. Assurez-vous de l'antenne de réception du signal radio est à proximité lorsque le rat est dans l'eau.
      REMARQUE: L'eau atténue les signaux de radio, et donc la distance de la NE du signal radioeds de se déplacer dans l'eau devient un facteur de limitation des dimensions du réservoir.
    3. Utiliser une antenne baguette à main, plutôt que d'une antenne de taille rat en cage, pour suivre le rat à mesure qu'elle progresse dans le dédale. Maintenir l'antenne à l'intérieur de la baguette de 30 cm du rat à faire en sorte que le signal radio ne sont pas perdues pendant le rat est sous l'eau.
  2. Trailing canules
    1. Réaménager les diviseurs de canaux et pièces horizontales créant le toit du tunnel de plongée ainsi que les sentiers le long de la canule derrière le rat au cours de sa progression à travers le labyrinthe.
      REMARQUE: La conception modulaire des canaux est d'une importance capitale et doit également permettre la récupération rapide du rat du labyrinthe sous-marin. Si un accrocs de la canule et se décrochent du rat, le rat pourrait bientôt saigner sous l'eau si la canule est pas rapidement remis en place.
    2. Utilisez fuite canules artérielle pour enregistrer la pression artérielle et la fréquence cardiaque chez les rats volontairement plongée. Utilisez un morceau de 90 cm de PE50 commeune canule arrière.
      REMARQUE: Cette longueur de la canule est assez long pour connecter le rat pour le transducteur de pression tout en permettant au rat pour progresser à travers le labyrinthe, tout en étant suffisamment court pour minimiser canule espace mort et est suffisamment proche du capteur de pression pour permettre une fidélité suffisante de la signal de la pression artérielle.
    3. Utilisation de fuite veineuse (ou artérielle) canules à injecter des agents pharmaceutiques tels que des agonistes et des antagonistes parasympathique et sympathique, ou pour injecter des traceurs ou des colorants qui déterminent la répartition du débit cardiaque.
    4. Prélever des échantillons de sang chez les rats à l'aide de la canule veineuse (ou artérielle), tandis que les rats sont sous l'eau afin de déterminer les taux de catécholamines sous l'eau ou de la chimie du sang.
      REMARQUE: Réduire la longueur de la canule arrière et tenir compte de l'espace mort de la canule pendant les prises de sang.
  3. Détection de neurones du tronc cérébral Activé
    1. Utiliser la détection immunologique de la protéine Fos à identidomaines spécifiques fy du tronc cérébral qui font partie de la réponse de plongée.
      Remarque: Au cours de l'initiation répétitive d'un réflexe cardio-respiratoire, les neurones du tronc cérébral qui font partie de ce circuit réflexe peut devenir actif et produire une protéine appelée Fos.
    2. Plonger répétitive rats à travers le labyrinthe toutes les 5 minutes pendant 2 heures pour un total de 24 plongées.
      REMARQUE: Les autres protocoles qui induisent également la production de neurones Fos peut également être utilisé. Pour éviter l'activation des neurones du tronc cérébral impliquées dans la réponse au stress, le comportement qui se répète devrait être inclus dans le cadre de la formation comportementale.
  4. les niveaux de corticostérone dans le sang au cours de plongée sous-marine
    1. Utilisez corticostérone comme un indicateur du niveau de rats de stress expérience pendant la baignade et la plongée.
    2. Pour obtenir du sang pour l'analyse de la corticostérone, attirer 0,1 ml des échantillons de sang de la veine de la queue des rats 15 min après 3 nage volontaires ou des plongées.
      REMARQUE: Des expériences préliminaires ont indiqué que 15 min est suFFICIENT temps pour permettre la production et la libération de corticostérone dans la circulation et provoquer un pic dans les niveaux plasmatiques de corticostérone. Puisque les niveaux de corticostérone ont un rythme circadien, planifier tous les prélèvements sanguins à la même heure de la journée et correspondu avec le calendrier des sessions de formation.

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Representative Results

La réussite des procédures de formation de natation et de plongée décrits peut diminuer le stress vécu par les rats lors d'une plongée sous l'eau. les taux de corticostérone dans le sang de tous les jours indiquent que la formation répétitive diminue la pénibilité associés à la plongée volontaire, et des rats entraînés à trouver plongée plus stressant que d'être manipulés quotidiennement par un être humain (Figure 2; 17). A l'inverse, les rats ne sont pas formés dans le protocole de la plongée sous-marine volontaire trouver stressant (Figure 2; 17). En outre, les deux rats entraînés et non entraînés trouveront obligés de plongée à être le plus stressant (Figure 2; 17).

Les réponses cardiovasculaires de natation, de plongeon volontaire et rats plongée forcés ont été enregistrés à l'aide de dispositifs implantés de télémétrie (figure 3; 8,17-20) et canules de fuite (Figure 4; 21-23). Immédiatement après volontairesubmersion, et dans un seul battement, diminue la fréquence cardiaque de 78% et artérielle moyenne diminue la pression artérielle de 25% 17. Ces résultats montrent que les rats volontairement plongée présentent les mêmes modifications cardiorespiratoires généralement observés chez les autres animaux de plongée. Suivi canules artérielles ont été utilisées pour injecter le atropine antagoniste muscarinique, ce qui élimine la bradycardie associés à la plongée volontaire (figure 4; 21), et de déterminer la répartition du débit cardiaque 22, y compris le débit sanguin cérébral 23, au cours de la plongée volontaire. Canules de suivi ont également été utilisés pour montrer que les rats ignorent de plus en plus hypoxémie artérielle et hypercapnie alors qu'ils sont immergés 18, et que la pré-existant lecteur chemoreceptor n'a pas d'effet sur ​​les réponses cardiovasculaires à la plongée volontaire 21.

Neurones dans les couches I et II de la corne dorsale médullaire ventrale (MDH) exprimer Fos During de plongée volontaire, et ces neurones peuvent constituer le premier relais cérébral afférente du réflexe de plongée (Figure 5; 24). Tronc cérébral importantes zones de contrôle cardio-respiratoires, comme la zone de compresseur caudale (CPA), solitaires noyau de Maissiat (NTS), rostral bulbe ventrolatéral (RVLM), et les régions peribrachial, tout spectacle augmenté étiquetage Fos pendant la plongée volontaire rapport avec piscine 25. Neurones dans des régions chimiosensible du tronc cérébral expriment Fos après une longue durée forcé plongées 18.

Figure 1
Figure 1:. Schéma de plongée réservoir Un réservoir en plexiglas (100 x 60 x 15 cm) a été utilisé pour créer un labyrinthe simple, consistant en cinq canaux 1 m de long. Le réservoir a été rempli avec 30 ° C l'eau du robinet, et les rats ont été formés à négociate le labyrinthe en nageant à la surface de l'eau, de l'aire de départ (en haut à gauche) à l'aire d'arrivée (en bas à droite). Les rats ont ensuite été entraînés à plonger dans le labyrinthe, maintenus sous l'eau par des pièces en plexiglas horizontale placée 2-3 cm en dessous de la surface de l'eau. [Ce chiffre a été modifié depuis 26]

Figure 2
Figure 2: mesures corticostérone. Prélèvements sanguins de queue de rat veines ont été utilisés pour mesurer les concentrations de corticostérone (moyenne ± SE) de rats laissés dans leur cage (Naïve), les rats traités pendant 10 min / jour (traitées), les rats entraînés à nager et plonger (formé), et les rats qui n'a reçu aucune nager ou plonger formation (non formés). Corticostérone a été mesurée après des rats entraînés avaient terminé leur formation de natation (gauche ensemble de barres), les rats après formés avaient terminé leur div volontaireformation de e (Centre de jeu de barres), et après des rats entraînés avaient terminé leur formation de plongée forcé (bon ensemble de barres). 1 indique que la valeur est nettement supérieure à Naïve; 2 indique la valeur est nettement supérieure à manipuler; 3 indique la valeur est nettement supérieure formés; * Indique que la valeur des rats entraînés pendant plongée forcé est nettement supérieure au cours de plongée volontaire. [Ce chiffre a été modifié depuis 17]

Figure 3
Figure 3: artériels traces de la pression artérielle des émetteurs télémétriques traces de données brutes montrant pulsatile de la pression artérielle au cours de natation (colonne de gauche), plongée volontaire (colonne du milieu), et la plongée forcé (colonne de droite) de rats entraînés à nager et de plonger dans le labyrinthe. (rangée du bas) et de rats qui avaient pas eu le traiprocédure Ning (rangée du haut). Plongée sous-marine (à la fois volontaire et forcé submersion) produit une bradycardie immédiate et augmentation apparition lente de la pression artérielle, tandis que la natation sur la surface de l'eau n'a pas causé de tels changements cardiovasculaires. Bars en vertu de traces indiquent les périodes de submersion. Les ruptures de trace indiquent les périodes où le signal télémétrique a été perdu. [Ce chiffre a été modifié depuis 17]

Figure 4
Figure 4: L'atropine élimine bradycardie plongée. Enregistrements originaux de pulsatile de la pression artérielle de rats volontairement plongée (A) avant et (B) après atropine pré-traitement. Des traces ont été obtenus en utilisant une canule artérielle de fuite. Avant atropine pré-traitement, la pression artérielle a diminué légèrement à la submersion, mais tpoule augmenté de plus de pré-plongée pour le reste de la plongée. La fréquence cardiaque a été déterminée à partir des intervalles d'impulsions de pression adjacentes. Sur submersion il y avait une bradycardie immédiate et substantielle qui a été maintenue pendant la durée de la plongée. Après blocus parasympathique par l'atropine pré-traitement de la bradycardie a été éliminé. Il y avait aussi une augmentation de la pression artérielle au cours de la plongée. Le bar sous la trace indique la période de submersion. [McCulloch, non publié]

Figure 5
Figure 5: étiquetage Fos dans la MDH. Microphotographies de la corne dorsale médullaire trijumeau (MDH) et le tractus spinal du trijumeau (SP5) chez des rats entraînés à plonger sous l'eau. (A) Dans un rat témoin qui n'a pas répétitive plonger il n'y a pas d'étiquetage Fos. (B) Dans un rat de natation, il est très éclairétle Fos étiquette dans le MDH (grande flèche) ou noyau paratrijumeau (petite flèche) dans SP5. (C) Dans un rat de plongée, il est plus étiquetage Fos ventralement à la fois dans le MDH (grande flèche) et le noyau paratrijumeau (petites flèches) par rapport à la piscine et le contrôle rat. Insérez dans le panneau (A) indique la position rostrale-caudale de panneaux AC. La barre d'échelle dans le panneau C est de 100 um. [Ce chiffre a été modifié depuis 24]

Figure 6
Figure 6: Activé neurones catécholaminergiques de rats plongée. Microphotographies montrent les moelles d'un contrôle non-rat de plongée (A, C, et E) et un rat volontairement plongée (B, D et F). Le tissu cérébral a été immunohistologically traitée à la fois un Fosd tyrosine hydroxylase (TH), la production de brun somas de TH et noir noyaux Fos. Pointes de flèches ouvertes identifier unique marqué neurones TH-positifs, tandis que les flèches solides identifier Fos + TH neurones doublement marquées. A1 neurones sont identifiés dans les neurones A et B. C1 sont identifiés dans C et D. neurones A5 sont identifiés dans E et F. Plus de Fos et TH doublement marquée sont vu dans l'A1, C1, et les régions de l'A5 rat de plongée de chez le rat de contrôle non-plongée. bar d'étalonnage dans E est pour panneaux AF, et est de 250 um. bar d'étalonnage en encart dans F est pour tous les encarts, et est de 50 um. [Ce chiffre a été modifié depuis 26]

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Discussion

Rats dans leur forme sauvage peuvent et exploiter des environnements semi-aquatiques, et sera souvent plonger sous l'eau tandis que la recherche de nourriture 6. Ainsi, il est pas trop surprenant que les rats peuvent être très facilement entraînés à plonger volontairement sous-marin. Les procédures de formation décrits peuvent durer jusqu'à 6 semaines, ce qui portera rats sevrés à une taille de corps utilisés dans la plupart des atlas de cerveau de rat adulte (~ 300 g). Ainsi, les cerveaux de ces animaux formés seront plus facilement comparable aux structures anatomiques identifiées dans ces atlas.

Après avoir été placé dans la zone de départ la plupart des rats vont commencer leur nage sous l'eau à moins de 20 sec. Cependant, de temps en temps un rat peut prendre jusqu'à 5 minutes ou plus avant d'entamer sa plongée volontaire. Bien qu'il puisse être tentant à ce stade de forcer les rats dans le tunnel sous-marin, ce devrait généralement être évitée afin de prévenir les rats d'associer l'eau avec une expérience négative. Les rongeurs peuvent être têtu et peut initiallié refusent de plonger pendant les sessions de formation, mais une fois qu'ils se rendent compte de la seule façon de sortir de l'eau est de remplir la plongée à travers le labyrinthe, ils initient généralement leurs plongées peu après avoir été placé dans la zone de départ.

Un aspect essentiel de la procédure de formation répétitives et méthodique est qu'elles sont conduites de manière à réduire le stress vécu par les rats. Laisser rats explorent leur environnement, en particulier alors que dans la zone de finition entre les essais, semble réduire encore le stress. Les rats sont souvent ré-entrer dans l'eau pour nager, et / ou plonger leur tête sous l'eau alors qu'il siégeait encore sur la plate-forme de la zone d'arrivée. Ceci suggère que les rats ne sont pas intrinsèquement eau aversif. En outre, alors il est pas rare que les rats pour produire des pelotes fécales pendant la baignade ou la plongée, ou lors de l'attente dans l'aire d'arrivée, les résultats d'entraînement quotidiennes à moins de 17 pelotes fécales. En général, le moins souligné les rats sont au cours de la formation, le moins pelets qu'ils produiront. Les pelotes fécales qui sont produites sont retirés de la zone de l'eau ou d'arrivée dès que possible pour garder l'eau relativement propre.

Les rats peuvent parfois obtenir saignements de nez pendant la baignade et la plongée, qui peut être le résultat de l'insufflation de l'eau dans les voies nasales. L'apparition de sang peut être due à des contraintes osmotiques au sein de la muqueuse nasale. Alors que dans l'aire d'arrivée entre les essais, les rats vont se toiletter. En conséquence de sang par le nez peut se redistribuer sur la tête des rats et le museau, ce qui donne les rats une légère teinte rougeâtre, surtout autour des yeux, au cours d'une session de formation. En outre, un rat peut parfois trouver plongée stressant et / ou des expériences de plongée négative (en tournant autour et se perdre tout en plongée sous-marine (voir note après 5.4.3. Sur la façon d'empêcher que cela se produise)). Chez ces rats porphyrine peut apparaître dans les coins de leurs yeux, un effort de signalisation responsabe.

La taille de la fosse de plongée sera dans une certaine mesure de déterminer les besoins de la pièce. Le réservoir décrit est conçu pour avoir rats nagent 2-3 cm sous la surface de l'eau à travers un 5 m de long plexiglas labyrinthe de donner une durée de nage sous-marine de 10-15 sec 17,19,24,26,27. Si une expérience est conçu pour mesurer les réponses d'une durée plus longue plongée, ou d'une plongée sous-marine profonde, le réservoir peut être nécessaire de re-conçu. Les besoins en salles pourraient alors également changer en fonction des dimensions d'un réservoir sous-marine re-conçu. Si il n'y a pas de siphon de sol disponible dans la salle d'intervention, l'eau du réservoir peut être recueillie dans un grand récipient, comme une poubelle 60 gal possible, qui peut ensuite être vidé ailleurs d'une manière commode.

La technique Fos peut être utilisé avec d'autres méthodes de détection neuronal pour identifier et caractériser davantage les neurones qui font partie du circuit du tronc de la réponse de plongée. Par exemple,Détection de Fos en conjonction avec la tyrosine hydroxylase coloration a identifié les neurones catécholaminergiques dans le A1, C1, A2, A5 et les zones sous-coeruleus (Figure 6; 26), et les neurones dans la zone globosa latérale A7 26,27, qui sont activés pendant volontaire plongée. En outre, la détection de Fos en liaison avec le traceur rétrograde toxine du choléra a identifié les corps cellulaires des neurones moteurs vagaux cardiaques à l'intérieur de la formation externe du noyau ambigu qui sont activés lors de la plongée volontaire 20.

Étude de l'intégration nerveux central des réponses cardiorespiratoires à la plongée est important pour un certain nombre de raisons 6,8,28. La réponse de plongée permet animaux, y compris les humains, de rester sous l'eau sans respirer immergé pendant de longues périodes de temps. La réponse de plongée représente une réorganisation fonctionnelle du tronc cérébral contrôle homéostatique, et démontre l'un des plus puissant patterns de réflexes autonomes observés chez les animaux. La réponse de plongée peut également être cliniquement importante chez l'homme dans le cadre du réflexe trigémino cardiaque, réflexe du nasopharynx, et / ou le syndrome de mort subite du nourrisson. Enfin, une compréhension de la circuiterie neuronale qui existe dans le tronc cérébral de rats aideront à déterminer comment corticale signaux afférents peuvent modifier tronc cérébral base réflexes autonomes. Toutes ces considérations font étude des aspects centraux de la réponse de plongée mammifères intrinsèquement utile et intéressant. En utilisant les procédures décrites à former rats à plonger volontairement sous-marin permettra de mieux enquête des aspects centraux de la réponse de plongée mammifères que sera l'utilisation d'animaux plongé forcés. Ceci est parce que les procédures de formation comme décrit 1) réduire l'activation du système nerveux central circuits de stress, et 2) de ne pas activer CNS circuit de la récompense, car les récompenses externes ne sont pas utilisés.

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Disclosures

L'auteur est un consultant pour Stoelting Société, et a assuré la conception et les spécifications de la Dive Maze réservoir McCulloch globale à des fins commerciales.

Acknowledgments

Recherche appuyée par un financement de l'Office des programmes de recherche et parrainés par des universités du Midwest. Merci également à la facilité du Midwest Université animaux et Erik Warren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McCulloch Diving Tank Maze Stoelting Company 60139
1 inch internal diameter tubing  Fisher 14-169-63 Used to fill or drain tank
Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) Braintree FB-M/L  For forced dives
Telemetric transmitters  DSI Model PA-C40 (270-0040-008) Used to transmit pulsatile arterial blood pressure
Hand-held antenna wand DSI Model RLA 3000 (272-5007) Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze
Intramedic PE50, 0.023" ID Fisher 14-170-12B Used as trailing arterial cannula
N95 mask - Moldex #2300N Series Fisher 19-003-246D Used to limit inhalation of rat allergens

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References

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Comportement Numéro 93 Rat, Plongée volontaire réponse sous-marine plongée réflexe réflexe autonome l'intégration central
Rats de formation à volontairement plongée sous-marine: Enquêtes de la réponse de la plongée sous-marine mammifères
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McCulloch, P. F. Training Rats toMore

McCulloch, P. F. Training Rats to Voluntarily Dive Underwater: Investigations of the Mammalian Diving Response. J. Vis. Exp. (93), e52093, doi:10.3791/52093 (2014).

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