Summary
本介绍的目的是在体内和体外技术用于昆虫致病性线虫的饲养证明， 在体内方法考虑这些线虫的饲养与昆虫宿主，而在体外方法利用丰富的琼脂培养基。
Abstract
昆虫病原线虫（EPN）（ 斯氏和异小 ）与革兰氏阴性伽马变形菌的肠杆菌科细菌， 嗜菌与steinernematids线虫相关的家人互惠的伙伴关系，而Photorhabdus是heterorhabditids的共生体。一起线虫和细菌形成一个强有力的杀虫复杂，杀死了广泛的昆虫物种中的亲密和特殊的伙伴关系。在此，我们证明在体内和这些线虫在实验室条件下饲养常用的体外技术。此外，这些技术代表了成功建立EPN文化的关键步骤，并且还形成了基础，利用这些微生物为研究其它生物检测。的aposymbiotic（共生免费）线虫的生产往往是一个深入和多方面的方法来共生的研究是至关重要的。这协议不要求另外的抗生素，并且可以在时间与标准实验室设备很短的量来完成。以这种方式生产的线虫是比较稳健的，虽然根据所使用的种类及其在存储存活率可能会发生变化。在此演示文稿详细的技术对应于那些由不同作者的P.股票的实验室，亚利桑那大学（图森，亚利桑那州，美国）描述和细化。这些技术是从的技术，在大规模生产这些生物虫害管理的目的所使用的身体明显。
Introduction
昆虫病原线虫（EPN）， 斯氏和异小杆菌。 （斯氏，异小）及其共生细菌， 致病杆菌属和Photorhabdus菌（肠杆菌科）被认为是陆生动物，微生物的共生关系2-4,6,10,19。 嗜和Photorhabdus属一个新兴的模式。被包藏的共生体中的线虫的唯一自由生活阶段的肠，也被称为感染性（IJ）或第三阶段感染性8,10,13。细菌线虫对是致病性，适用范围广的昆虫，并已成功地在生物防治和综合虫害管理方案的全球6,8落实。
在这里我们将展示一系列的体内和被频繁运用的EPN的实验室条件下饲养体外技术， 我Ñ 体内方法考虑的昆虫宿主线虫的饲养。通常，各种昆虫的订单（ 即鳞翅目 ， 鞘翅目 ， 双翅目 ， 等 ）的未成熟阶段被认为是合适的宿主， 在体内方法通常被认为是对维护线虫培养物在实验室中。考虑到大规模生产的线虫时，这种方法可能不适合。可能需要用于此目的，要求更多的时间和相关的养虫额外成本大量昆虫宿主的。
昆虫致病性线虫，也可以在体外培养的几个媒体。根据不同的研究的目标; 体外方法可以或者考虑的共生细菌在媒体的掺入。在这份报告中，我们将介绍两种常用的方法EPN的传播。媒体的成份提供营养的共生杆菌的来源第二固醇源线虫。 体外方法提供了优势EPN的饲养没有昆虫宿主。
起初，许多体外媒体发展的被用于EPN的乘法时适合昆虫宿主不可用。然而，在过去几年中， 在体外饲养方法已被广泛应用在研究旨在了解EPN及其共生细菌17,19之间的互惠关系。
在此演示文稿详细的技术对应于那些由不同作者的库存实验室，亚利桑那州（亚利桑那州图森，美国）大学描述和细化。这些技术是从的技术，在大规模生产这些生物虫害管理的目的所使用的身体明显。
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Protocol
1 在体内的线虫的饲养与他们Symboitic细菌
- 翻转100×15毫米的塑料培养皿中，并将滤纸（90 MM）两张碟的菜的盖子。
- 均匀分布1毫升的IJ（感染性幼虫）的水悬浮液（在1000-2000 IJ / ml浓度）在滤纸上。
注：IJS不需要进行表面灭菌。 - 添加更多的waxmoth 大蜡螟的10末龄幼虫的菜。的目标是提供大约100-200 IJS /幼虫。
- 盖上培养皿（ 图1）的底部的盖子和标签的培养皿中。何况下面的信息：线虫种类名称（如已知）;隔离代码/名称;最新感染的陷阱设置。
- 里面放置一个松散的密封塑料袋的菜（以保存水分），并保持它在黑暗中，在室温或在20-25℃的恒温箱。检查每天的菜
注：黑暗便于线虫感染，因为它模仿自然感染状况，在土壤中。 - 3-5天后，取出尸体线虫感染的迹象，以修改后的白色陷阱7。
注意：如果尸体腐烂的气味，这可能是一个迹象表明，培养不成功和/或有污染。有一批新的线虫和昆虫树立了新的传染箱。
2， 体外线虫的饲养与他们共生菌
- 肝肾阴虚型琼脂法9,19
- 斩肝肾小块（2 毫升或更小），并放入用NaCl，琼脂搅拌机及300ml水并混合，直到肉变成液体浆，厚浆或果浆。然后，转移混合物至1升的锥形烧瓶中。
- 添加最终200毫升水，以搅拌机容器中，并弃去剩余的存储介质插入锥形烧瓶中。高压釜中进行15分钟，在121℃。可高压灭菌后的琼脂冷却浇注前触及。
注：中移液不建议，因为这种媒介往往有大块的肉。 - 倒〜20毫升琼脂到5（或6）厘米的培养皿中，同时用手搅拌或纷飞的锥形瓶中，注入了更均匀的介质。让琼脂在4℃下固化和存储菜肴，直到需要
注意：使用火焰消毒金属铲，打破了任何大块的肉倒入培养皿中。
- 脂琼脂法9,19
- 通过营养肉汤，琼脂和酵母提取物混合在一起制备脂质琼脂培养基倒入混合到2升的锥形烧瓶中。加蒸馏水H 2 O和氯化镁2•6H 2 O和高压灭菌15分钟，在121℃。
- 添加玉米油和玉米糖浆混合无菌混合，搅拌或摇动剧烈，经常均匀地分散油滴。
- 倒〜20毫升琼脂到5（或6）厘米的培养皿中，并允许琼脂在4°C，直到需要巩固和存储菜肴。
- 数所需的共生细菌到脂质琼脂平板上，孵育板在28℃，24〜48小时。
注：价差100-200微升过夜（12-16小时）的LB亚文化。 - 一天后，加入约表面消毒线虫悬浮液（或鸡蛋感染幼体）0.4毫升培养板在室温下在黑暗中或在孵化器在22±3℃。
注意：不要添加超过0.4毫升线虫悬浮液，因为它可以创建一个过于潮湿的环境，不利于线虫生长。 - 日常监测的文化。文化应该生产出新一代IJS在12天左右（ 图2）。
- 转底菜用琼脂时，线虫看到爬行的菜（ 图3A）的两侧，以修改后的白色陷阱（见奥罗斯科等 12）收获IJS（ 图3B）。执行下在层流罩此步骤，以降低介质的污染。
- 出苗后，收集修改的白色陷阱IJS和冲洗IJ停牌，以消除任何媒体碎片。商店IJ在无菌蒸馏水在10℃下（在冷温度下孵化或冷室中）或立即使用，如果需要的。
注：根据本研究的目的，与种子或者共生，殖民或aposymbiotic线虫板。
3， 体外 Aposymbiotic的饲养（共生免费）昆虫病原线虫
- 感染10-20 G.蜡螟幼虫所需的线虫种类IJS（见第1节）。后3或4天（此时IJS应该已经成熟第一代成虫）收集尸体。
注：到期日，并需要获得卵子足够数量将种不同的女性数量。感染多G。蜡螟幼虫如果有必要，并早在48小时后感染，以评估他们是否在正确的发展阶段开始解剖。 - 单独将每个尸体在培养皿用生理盐水溶液（M9缓冲18）。拉它的头用细尖镊子解剖尸体。
- 收集至少20妊娠（里面的蛋）女性用细针（L型最好），并放置在含有10毫升M9的缓冲区（ 图4A）手表玻璃。
- 通过考虑下列成分制备axenizing解决方案：6.75蒸馏水，1.25毫升5N的NaOH和2.25毫升市售漂白水稀释成3％的次氯酸盐。
注：氢氧化钠是碱性溶液，手套，护目镜和其他适当的保护衣服应穿。
注：准备新鲜axenizing溶液各一次，如漂白剂降解的光。准备axenizing液多批次，并在多个钟表眼镜进行表面灭菌的鸡蛋和收获。 - 冲洗女性至少三次，M9缓冲填充表玻璃用缓冲溶液，吸干缓冲用移液管。确保女性留在表玻璃。重复此步骤两次。
- 立即添加axenizing溶液并让女性保持在该溶液中不超过10-15分钟以上。观察线虫组织开始崩解，而鸡蛋（它们是耐axenizing溶液）保持不变。
- 手动扰乱女性的身体，以加快这一进程，通过削减他们用针或手术刀（ 图4B，C）。吹打成的1.5 ml离心管中，避免将任何不溶解的组织取出鸡蛋。
注：使用为M任何微量离心管中根据需要来收集鸡蛋，并迅速工作，如卵的存活力将减少曝光的长时间来axenizing溶液。 - 使用“高速设置”涡流管，持续15秒，以进一步除去附着在卵线虫组织。另外，如果一个涡流，则无法使用吸管上下溶液数次。
- 沉淀蛋离心大约在18,000 g下2分钟。提高速度，如果鸡蛋没有足够的沉淀。除去axenizing溶液并用无菌蒸馏水和离心机填充离心管中再一次在900×g离心1分钟，冲洗两次。
- 最后一次洗涤后，悬浮鸡蛋300-500微升的无菌蒸馏水，并将其放置在无菌3厘米培养皿或消毒手表玻璃。请记住，鸡蛋是现在表面消毒，所以用无菌吸管和/或pippetter提示和水，以保持蛋的清洁度。
- 检查解剖显微镜（30-50X倍）下的蛋，以确认他们是否完好（ 图4D），并将它们转移到5cm的薄层板上，以肝肾阴虚型琼脂（参见2.1节）
注意：不要在板上增加超过400微升的卵悬浮液，因为它会使琼脂过度潮湿。 - 标板的相关信息和在黑暗中直立存放在28℃。种蛋应该是很明显过夜。
注：上冷凝水盘的盖子，但术后1〜2天就会蒸发。在这个时候，将培养皿在塑料袋中，以保持在琼脂的水分并避免其干燥。 - 定期观察菜肴和丢弃显示真菌或细菌污染的迹象，任何菜肴。一旦IJS被视为迁移了培养皿的壁，取下盖子，并用琼脂转让的底部培养皿，以修改后的白色陷阱12。转碟入modifie时，要考虑无菌条件d白平衡陷阱，以避免暴露介质的污染。
- 继续监测白色陷阱和收获IJ需要。
注：Aposymbiotic线虫会继续入主陷阱的水中迁移了好几天，甚至几个星期。
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Representative Results
体内饲养方法使用活虫为线虫生长和繁殖的主机。感染室是用于曝光的昆虫IJS的有效方法。这是线虫的生命周期载体的细菌共生的一种昆虫主机之间的唯一舞台。 图1显示了设立感染室，以及建立该室所需要的材料， 在体外饲养方式让EPN成长没有昆虫宿主，但也实施了aposymbiotic（共生免费）线虫饲养。 图2显示了一个脂质琼脂平板上用不同的线虫阶段。脂质琼脂平板，也可以在所需要的基础上的生物物种概念验证线虫身份交叉杂交试验考虑。肝肾琼脂方法最初是由Poinar和托马斯（1966年）14描述。这种方法允许线虫成熟和reproducë没有昆虫宿主和可用于后线虫而不与其共生菌（ 即产生aposymbiotic线虫）。这种方法的缺点是，它是由于它们的丰富性容易发生污染，使不需要的细菌或真菌生长。 图3A示肝肾琼脂平板IJS爬行在板的一侧。在这个阶段，培养皿的底部可以被转移到修改后的白色陷阱。 图3B展示了肝肾板与斯氏线虫在修改后的白色陷阱IJS后代的收获。 图4a显示的手表玻璃妊娠斯氏女性之前，他们的axenization。 图4B显示了女性用解剖针的破坏。 图4C示出了在axenizing溶液打乱女性。 图4D示出了线虫Steinernem的一个完整的蛋àcarpocapsae。
感染腔体内饲养EPN的图1成立。顶行示出了将5cm陪替氏培养皿和滤纸。最下面一行显示一个10cm培养皿和滤纸。添加到每个腔感染昆虫幼虫的通知数量。
图2。脂琼脂方法在体外培育的EPN的图像显示了成年线虫发展中的一盘菜的特写（放大20倍）。
图3：肝肾阴虚型琼脂平板上，左边形象的展示与线虫的成功增长的菜。注意线虫爬行的菜一边。 图像 B显示了肝肾阴虚型琼脂平板放置在修改后的白色陷阱IJ线虫的收获。
图4表镜与妊娠女性axenizing解决方案。形象的展示妊娠女性的axenizing解决方案。图片B显示了解剖针女性的磨削。图像C显示打乱女性。图片D显示了斯氏线虫carpocapsae的一个完整的鸡蛋。
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Discussion
使用合适的主机是成功的 EPN 体内饲养的关键因素。通常情况下，无论steinernematids和heterorhabditids可以复制，成功地完成其生命周期中的大蜡蛾， 大蜡螟 （鳞翅目：螟蛾科）幼虫。然而，其他的昆虫物种，从不同的家庭和/或单可以考虑。一些目前描述的线虫种类已知有特异性特定昆虫宿主。例如，S。 kushidai和S。 scarabaei都不是很致命的，以鳞翅目幼虫，需要鞘翅目幼虫，如甲虫的幼虫（金龟子），成功饲养在实验室。另一个物种，S scapterisci，喜欢直翅目昆虫，如蟋蟀或蝼蛄。
当一个合适的宿主是不可用或当实验条件需要， 体外方法可用于EP的饲养N.这些方法使用，提供营养物质的线虫及其共生细菌的丰富来源媒体。在这份报告中，我们描述了两种类型的琼脂（肝，肾，脂），可用于成功的生长和繁殖EPN有或没有他们的共生细菌。
用户应该知道，肝肾阴虚型琼脂是一种富媒体，因此容易受到污染。无菌技术建议中，在所有步骤的程序的处理既axenized鸡蛋和接种的平板上。被污染的细菌或真菌板应立即丢弃。
当饲养aposymbiotic 斯氏 IJS，应小心以正确裂解雌线虫的组织，因为它们可能怀有致病杆菌属的细菌。此外，为了验证IJ确实是免费的共生细菌，我们建议新鲜收获IJS在LB样品的研磨与手持摩托车R-驱动杵按（Heungens 等，2002），7和片式悬架上NBTA媒体1。如果细菌菌落被发现（过夜孵育后）将是要么指示的差axenization技术的或污染的结果。
的aposymbiotic 斯氏线虫的饲养是，也可以用在程序和实验各种各样考虑的技术。读者应该知道，饲养斯氏线虫共生而不在多代的影响可能有超过代次线虫健康和生存造成影响。一些研究表明，其配对的自然系统5,11,15-17的必要性。然而，这些研究已经完成对物种的数量有限，并进一步探索是必要的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢过去的库存实验室的成员：铭敏李凯瑟琳Plichta，维多利亚米兰达 - 汤普森和萨姆 - 金圭他们对许多这些协议的改进作出贡献。这项工作是由美国国家科学基金会资助的IOS-0840932和IOS-0724978 SP的股票投资部分
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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