Summary
L'obiettivo di questa presentazione è quello di dimostrare in vivo e in vitro tecniche per l'allevamento di nematodi entomopatogeni. Metodi in vivo considerano l'allevamento di questi nematodi con un host insetto, mentre i metodi in vitro utilizzano rich media agar.
Abstract
Nematodi entomopatogeni (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) hanno una partnership mutualistico con Gram-negativi Gamma-Proteobacteria della famiglia Enterobacteriaceae batteri. Xenorhabdus sono associati con steinernematids nematodi, mentre Photorhabdus sono simbionti di heterorhabditids. Insieme nematodi e batteri formano un complesso potente insetticida che uccide una vasta gamma di specie di insetti in una intima e specifico. Qui, dimostriamo in vivo e in vitro tecniche comunemente utilizzate nell'allevamento di questi nematodi in condizioni di laboratorio. Inoltre, queste tecniche rappresentano passaggi fondamentali per la creazione di successo di culture EPN e costituiscono anche la base per altri test biologici che utilizzano questi organismi per la ricerca. La produzione di aposymbiotic nematodi (senza simbionti) è spesso fondamentale per un approfondito e approccio multiforme allo studio della simbiosi. Questoprotocollo non richiede l'aggiunta di antibiotici e può essere realizzato in un breve lasso di tempo con attrezzature di laboratorio standard. Nematodi prodotti in questo modo sono relativamente robusti, anche se la loro sopravvivenza in deposito possono variare a seconda delle specie utilizzate. Le tecniche descritti in questa presentazione corrispondono a quelli descritti da vari autori e raffinato dal Laboratorio di P. Archivio, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Queste tecniche sono distinti dal corpo di tecniche che vengono utilizzati nella produzione di massa di tali organismi a fini di gestione nocivo.
Introduction
Nematodi entomopatogeni (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e dei loro simbionti batterici, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) sono considerati un modello emergente di animali terrestri-microbici relazioni simbiotiche 2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. sono nutrito come simbionti nell'intestino della sola fase di vita libera dei nematodi, noto anche come il giovanile infettiva (IJ) o stadio 3 ° infettivo giovanile 8,10,13. La coppia batterio-nematode è patogeno per una vasta gamma di insetti ed è stato implementato con successo in programmi di lotta biologica e lotta integrata in tutto il mondo 6,8.
Qui mostriamo una selezione di in vivo e in vitro tecniche che sono spesso esercitati per l'allevamento di EPN in condizioni di laboratorio. In metodi in vivo contemplano un host insetto per l'allevamento dei nematodi. Di solito, stadi immaturi di vari ordini di insetti (ad esempio Lepidotteri, Coleotteri, Ditteri, ecc.) Sono considerati host adatti. In vivo i metodi sono di solito presi in considerazione per la manutenzione delle culture nematodi in laboratorio. Questo metodo potrebbe non essere adatto se si considera la produzione di massa dei nematodi. Grandi quantità di insetti ospiti possono essere richiesti a tale scopo chiedendo più tempo e costi supplementari connesse con l'allevamento degli insetti.
Nematodi entomopatogeni possono anche essere coltivate in vitro su diversi supporti. A seconda l'obiettivo dello studio, metodi in vitro può o prendere in considerazione l'incorporazione dei batteri simbiotici nei media. In questa presentazione, descriviamo due metodi comunemente utilizzati per la propagazione della EPN. Gli ingredienti dei media forniscono una fonte di nutrienti per il batterio simbiotico unMetodi in vitro trovare una fonte di steroli per i nematodi. offrono il vantaggio l'allevamento di EPN senza un host insetto.
In origine, molti dei media in vitro sviluppati sono stati utilizzati per la moltiplicazione di EPN quando adatti insetti ospiti non sono disponibili. Tuttavia, negli ultimi anni, in vitro metodi di allevamento sono diventati largamente impiegato nel campo della ricerca al fine di comprendere il rapporto mutualistico tra EPN ed i loro batteri simbionti 17,19.
Le tecniche descritti in questa presentazione corrispondono a quelli descritti da vari autori e raffinato dal laboratorio Stock, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Queste tecniche sono distinti dal corpo di tecniche che vengono utilizzati nella produzione di massa di tali organismi a fini di gestione nocivo.
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Protocol
1 In vivo Allevamento di Nematodi entomopatogeni con i loro batteri Symboitic
- Invertire una capsula di Petri in plastica 100 x 15 mm e collocare due dischi di carta da filtro (90 mm) nel coperchio del piatto.
- Distribuire uniformemente 1 ml della sospensione acqua IJ (larve infettive) (ad una concentrazione di 1.000-2.000 IJ / ml) sulla carta da filtro.
NOTA: IJs non devono essere sterilizzati in superficie. - Aggiungere 10 ultimo instar larve della maggior waxmoth Galleria mellonella al piatto. L'obiettivo è quello di fornire circa 100-200 IJs / larva.
- Coprire il coperchio con la parte inferiore della scatola di Petri (Figura 1) ed etichettare la piastra di Petri. Indicare le seguenti informazioni: nematode nome della specie (se noto); isolare il codice / designazione; trappola infezione data è stata impostata.
- Porre la capsula all'interno di un sacchetto di plastica sigillato liberamente (per conservare l'umidità) e tenerlo al buio sia a temperatura ambiente o in un incubatore tra i 20-25 ° C. Controllare i piatti tutti i giorni
NOTA: L'oscurità facilita l'infezione da nematodi, in quanto imita le condizioni naturali di infezione nel terreno. - Dopo 3-5 giorni, rimuovere i cadaveri con segni di infezione da nematodi ad una modifica trappola Bianco 7.
NOTA: Se i cadaveri odore putrido, questo può essere un'indicazione che la coltura non ha avuto successo e / o c'era contaminazione. Impostare una nuova camera di infezione con un nuovo lotto di nematodi e insetti.
2 in vitro Allevamento di Nematodi entomopatogeni con i loro batteri simbionti
- Fegato-rene Agar Metodo di 9,19
- Tritate il fegato e reni in piccoli pezzi (da 2 cm 3 o più piccoli) e mettere in un frullatore con NaCl, agar e 300 ml di acqua e mescolare fino a quando la carne diventa una poltiglia liquida, pasta spessa o purea. Poi, il trasferimento miscela di un pallone da 1 L Erlenmeyer.
- Aggiungere gli ultimi 200 ml di acqua al vaso frullatore e decantare eventuali supporti rimasti nelBeuta. Autoclave per 15 minuti a 121 ° C. Dopo la sterilizzazione in autoclave agar lasciare raffreddare a toccare prima di versare.
NOTA: dispensazione dei media non è raccomandato perché questo mezzo tende ad avere pezzi di carne. - Versare ~ 20 ml di agar su 5 (o 6) cm piastre di Petri agitando la mano o agitando la beuta tra versa per un supporto più omogeneo. Lasciare agar per solidificare e piatti conservare a 4 ° C fino al momento
NOTA: Utilizzare una spatola di metallo-sterilizzati fiamma per rompere tutti i grandi pezzi di carne versato nella piastra di Petri.
- Lipid Agar Metodo 9,19
- Preparare mezzo lipidico agar mescolando brodo nutriente, estratto di agar e il lievito e mescolare versare in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Aggiungere acqua distillata H 2 O e MgCl 2 • 6H 2 O e autoclave per 15 minuti a 121 ° C.
- Aggiungere miscela sterile di olio e di sciroppo di mais mais mix e mescolare o agitare energicamente e spesso per disperdere goccioline di olio in modo uniforme.
- Versare ~ 20 ml di agar su un 5 (o 6) cm piastre di Petri e lasciare solidificare l'agar e piatti conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Streak il batteri simbionti desiderato sulla piastra di agar lipidi e incubare le piastre a 28 ° C per 24-48 ore.
NOTA: Stendere 100-200 ml di una notte (12-16 ore) LB sottocultura. - Il giorno dopo, aggiungere circa 0,4 ml di sospensione sterile superficie nematode (uova o larve infettive) e incubare le piastre a temperatura ambiente al buio o in un incubatore a 22 ± 3 ° C.
NOTA: Non aggiungere più di 0,4 ml di sospensione nematode come si può creare un ambiente eccessivamente umido che è sfavorevole alla crescita nematode. - Monitorare culture quotidiana. Le culture dovrebbero produrre una nuova generazione di IJs in circa 12 giorni (Figura 2).
- Trasferire piatto fondo con agar quando nematodi sono visti strisciare i lati del piatto (Figura 3A) ad una trappola Bianco modificata (vedi Orozco et al. 12) per raccogliere IJs (Figura 3B). Eseguire questo passaggio sotto una cappa a flusso laminare per ridurre la contaminazione dei media.
- Raccogliere IJs dalla trappola Bianco modificato sulla nascita e risciacquare sospensione IJ per rimuovere eventuali detriti mezzo. Conservare IJ in acqua distillata sterilizzata a 10 ° C (in un incubatore a freddo-temperatura o cella frigorifera) o utilizzare immediatamente, se necessario.
NOTA: A seconda l'obiettivo dello studio, il seme piatti sia con nematodi simbionti-colonizzati o aposymbiotic.
3. in vitro allevamento di Aposymbiotic (Symbiont-gratuito) Nematodi entomopatogeni
- Infettare 10-20 G. mellonella larve con IJs delle specie di nematodi desiderati (vedi capitolo 1). Dopo 3 o 4 giorni (in questo momento IJs avrebbe maturatoagli adulti di prima generazione) raccogliere cadaveri.
NOTA: Il tempo a scadenza e numero di femmine necessari per ottenere un adeguato numero di uova può variare da specie. Infettare più G. mellonella larve se necessario e iniziare dissezioni già alla 48 ore dopo l'infezione per valutare se sono in fase di sviluppo destra. - Mettete ogni cadavere singolarmente in una capsula di Petri con una soluzione salina (tampone M9 18). Sezionare un cadavere tirando la sua testa con una pinza sottile punta.
- Raccogliere almeno 20 gravido (con le uova all'interno) femmine con un ago sottile (L-forma preferibilmente) e metterli in un vetro da orologio contenente 10 ml di tampone M9 (Figura 4A).
- Preparare una soluzione axenizing considerando i seguenti ingredienti: 6,75 ml di acqua distillata, 1,25 ml 5 N NaOH, e 2,25 ml di soluzione di candeggina disponibile in commercio diluito al 3% di ipoclorito.
NOTA: NaOH è una soluzione di base-guanti, occhiali e altro adeguato di protezioneabbigliamento deve essere indossato.
NOTA: Preparare soluzione axenizing fresco ogni volta, come candeggina degrada alla luce. Preparare diversi lotti di soluzione axenizing ed eseguire la sterilizzazione di superficie e la raccolta delle uova in più vetri da orologio. - Risciacquare femmine almeno tre volte con riempimento del buffer M9 vetro d'orologio con soluzione tampone e succhiare buffer con una pipetta. Assicurarsi che le femmine rimangono nel vetro d'orologio. Ripetere questa operazione altre due volte.
- Aggiungere immediatamente la soluzione axenizing e permettono le femmine di rimanere in questa soluzione per non più di 10-15 minuti. Osservare i tessuti nematode cominciano a disintegrarsi, mentre le uova (che sono resistenti alla soluzione axenizing) rimangono intatti.
- Interrompere manualmente corpi femminili per accelerare il processo, tagliandoli con un ago o un bisturi (Figura 4B, C). Rimuovere le uova da loro pipettando in provette da 1,5 ml microcentrifuga, evitando l'aggiunta di qualsiasi tessuto non disciolto.
NOTA: Utilizzare come meventuali microprovette se necessario per raccogliere le uova e lavorare rapidamente, come la vitalità delle uova diminuisce per un periodo prolungato di esposizione alla soluzione di axenizing. - Tubi vortex per 15 secondi utilizzando l'impostazione "alta velocità" per rimuovere ulteriormente i tessuti nematodi attaccati alle uova. In alternativa, se un vortice non è disponibile, pipettare su e giù per le soluzioni più volte.
- Uova pellet di centrifugazione a 18.000 g per circa 2 min. Aumentare la velocità se le uova non fanno sufficientemente pellet. Rimuovere la soluzione axenizing e risciacquare due volte riempiendo la provetta con acqua distillata sterile e centrifugare ancora una volta a 900 xg per 1 min.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le uova in 300-500 ml di acqua distillata sterile e metterli in una sterile 3 centimetri scatola di Petri o vetro da orologio sterilizzati. Ricordate che le uova sono ormai sterilizzato superficie, in modo da utilizzare pipette sterili e / o suggerimenti pippetter e acqua per mantenere la pulizia delle uova.
- Esaminare le uova sotto un microscopio da dissezione (30-50X ingrandimento) per confermare che sono intatti (Figura 4D) e trasferirli in una piastra 5 cm e agar fegato-rene (vedere paragrafo 2.1)
NOTA: Non aggiungere più di 400 microlitri della sospensione uovo sulle piastre come farà l'agar eccessivamente bagnato. - Le targhette di identificazione con le informazioni appropriate e memorizzarli in posizione verticale al buio a 28 ° C. Schiusa delle uova dovrebbe essere evidente durante la notte.
NOTA: L'acqua può condensare sul coperchio del piatto ma evapora dopo 1 o 2 giorni. A questo punto, porre il recipiente in sacchetto di plastica per trattenere l'umidità del agar ed evitare la sua essiccazione. - Osservare piatti periodicamente e scartare tutti i piatti che mostrano segni di contaminazione batterica o fungina. Una volta IJs sono visti migrare il muro della capsula di Petri, togliere il coperchio e trasferire il piatto fondo con agar ad una modifica trappola Bianco 12. Considerare condizioni sterili quando si trasferisce il piatto nel Modified trappola bianco per evitare la contaminazione dei mezzi esposti.
- Continua il monitoraggio delle trappole bianche e raccolto IJ, se necessario.
NOTA: nematodi Aposymbiotic continueranno a migrare in acqua della trappola Bianca per molti giorni e addirittura settimane.
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Representative Results
Il metodo di allevamento in vivo utilizza insetti vivi come host per la crescita e la riproduzione dei nematodi. Camere di infezione sono un metodo efficiente per esporre insetti IJs. Questa è l'unica fase del ciclo di vita dei nematodi 'che i vettori simbionti batterici da un insetto host all'altro. Figura 1 mostra il set up per una camera un'infezione così come i materiali necessari per costruire questa camera. In vitro metodi di allevamento consentono EPN a crescere senza un host insetto, ma sono anche implementate per l'allevamento dei aposymbiotic nematodi (senza simbionti). figura 2 mostra una piastra di agar lipidico con diverse fasi di nematodi. Piastre di agar lipidi possono essere considerati anche in prove di cross-ibridazione che sono necessari per convalidare l'identità nematode basato sul concetto di specie biologica. Il metodo di agar rene fegato è stato originariamente descritto da Poinar & Thomas (1966) 14. Questo metodo permette ai nematodi a maturare e la riproduzionee senza un host insetto e può essere utilizzato per nematodi posteriori senza i loro batteri simbionti (cioè quelli che producono nematodi aposymbiotic). Uno svantaggio di questo metodo è che è incline alla contaminazione a causa della loro natura ricca, permettendo batteri o funghi indesiderati a crescere. Figura 3A mostra piastre di agar fegato-rene con IJS strisciando sul lato della piastra. In questa fase la parte inferiore della scatola di Petri può essere trasferito ad una trappola bianca modificata. Figura 3B mostra un piatto di fegato-rene con nematodi Steinernema in una trappola Bianco modificato per la raccolta di IJs progenie. Figura 4A mostra un vetro da orologio con gravido femmine Steinernema prima della loro axenization. Figura 4B mostra la perturbazione delle femmine con un ago dissezione. Figura 4C mostra interrotto femmine nella soluzione axenizing. figura 4D mostra un uovo intatto del nematode Steinernemun carpocapsae.
Figura 1 Messa a punto di una camera di infezione in vivo per l'allevamento di EPN. Inizio riga mostra un documento di cinque centimetri piastra di Petri e filtro. La riga in basso visualizza un piatto e filtro di carta 10 centimetri Petri. Numero del bando di larve di insetti aggiunto ad ogni camera di infezione.
Figura 2 Lipid metodo agar per allevamento in vitro di EPN. L'immagine mostra un primo piano (20X ingrandimenti) di un piatto con nematodi adulti in via di sviluppo sul supporto.
Figura 3 fegato-rene agar piastra. Immagine A sulla sinistra mostra un piatto con una crescita di successo di nematodi. Avviso nematodi che strisciano sul lato del piatto. Immagine B mostra una piastra di agar fegato-rene collocato in una trappola Bianco modificato per la raccolta di nematodi IJ.
Figura 4 Orologio vetro con le femmine gravide in axenizing soluzione. Immagine A mostra femmine gravide nella soluzione axenizing. Immagine B mostra la macinazione delle femmine con un ago da dissezione. Visualizza immagine C interrotti femmine. Immagine D mostra un uovo intatto del nematode Steinernema carpocapsae.
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Discussion
Utilizzando un ospite adatto è un fattore chiave per il successo in allevamento vivo di EPN. Di solito, sia steinernematids e heterorhabditids possono riprodursi e completare il loro ciclo di vita in larve della maggiore tarma della cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Tuttavia, altre specie di insetti provenienti da diverse famiglie e / o gli ordini possono essere considerati. Alcune delle specie di nematodi attualmente descritte sono noti per avere specificità per un particolare host insetto. Ad esempio, S. kushidai e S. scarabaei non sono molto virulento di larve di lepidotteri, e hanno bisogno di larve di coleotteri, come scarabeo larve (Scarabaeidae) per l'allevamento di successo in laboratorio. Un'altra specie, S. scapterisci, preferisce gli insetti ortotteri, come grilli o grilli talpa.
Quando un host appropriato non sia disponibile o quando le condizioni lo richiedono sperimentali, metodi in vitro può essere impiegato per l'allevamento del PEN. Questi metodi utilizzano supporti che offrono una ricca fonte di nutrienti per i nematodi e dei loro simbionti batterici. In questa presentazione abbiamo descritto due tipi di agar (fegato-rene e lipidi) che può essere utilizzato per la crescita di successo e la riproduzione di EPN con o senza i loro batteri simbionti.
Gli utenti devono essere consapevoli che l'agar fegato-rene è un rich media ed è quindi facilmente contaminato. Tecnica sterile è raccomandato nella gestione sia le uova axenized e le piastre inoculate durante tutte le fasi della procedura. Piatti che sono contaminati con batteri o funghi devono essere eliminati immediatamente.
Quando allevamento aposymbiotic Steinernema IJs, la cura dovrebbe essere presa per lisare correttamente i tessuti nematode femminili, in quanto potrebbero ospitare batteri Xenorhabdus. Inoltre, per verificare che IJ sono davvero privi di batteri simbiotici, si consiglia la macinazione di un campione di IJs appena raccolte in LB con una moto a manopestello R-driven come da (Heungens et al. 2002) 7 e piastra sospensione su supporti NBTA 1. Se colonie di batteri si trovano (dopo incubazione durante la notte) sarà sia un'indicazione di una tecnica axenization povero o il risultato di una contaminazione.
L'allevamento di nematodi Steinernema aposymbiotic è una tecnica che può anche essere presa in considerazione in una vasta gamma di procedure ed esperimenti. I lettori devono essere consapevoli che l'impatto di allevamento nematodi Steinernema senza simbionti su più generazioni, può avere un impatto sulla nematode fitness e sopravvivenza rispetto tempi di generazione. Alcuni studi suggeriscono la necessità del loro accoppiamento nei sistemi naturali 5,11,15-17. Tuttavia, questi studi sono stati condotti su un numero limitato di specie e non è necessario un ulteriore approfondimento.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati della Fotografico laboratorio: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson e Sam-Kyu Kim per il loro contributo al miglioramento di molti di questi protocolli. Questo lavoro è stato finanziato in parte mediante la concessione National Science Foundation IOS e IOS-0840932-0724978 SP Archivio
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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