Summary
El objetivo de esta presentación es demostrar en vivo y en técnicas in vitro para la crianza de los nematodos entomopatógenos. Métodos in vivo consideran la crianza de estos nematodos con un insecto huésped, mientras que los métodos in vitro utilizan rich media agar.
Abstract
Nematodos entomopatógenos (NEP) (Steinernematidae y Heterorhabditidae) tienen una asociación mutualista con Gram-negativas Gamma-Proteobacteria en la familia Enterobacteriaceae bacterias. Xenorhabdus se asocian con steinernematids nematodos mientras Photorhabdus son simbiontes de heterorhabditids. Junto nematodos y bacterias forman un complejo insecticida potente que mata a una amplia gama de especies de insectos en una asociación íntima y específica. En la presente memoria, se demuestra in vivo e in vitro técnicas comúnmente usadas en la cría de estos nematodos en condiciones de laboratorio. Además, estas técnicas representan pasos clave para el éxito del establecimiento de cultivos de EPN y también forman la base para otros bioensayos que utilizan estos organismos para la investigación. La producción de nematodos (-simbionte libre) aposymbiotic suele ser crítico para un análisis en profundidad y enfoque multifacético para el estudio de la simbiosis. Esteprotocolo no requiere la adición de antibióticos y se puede lograr en un corto período de tiempo con el equipo de laboratorio estándar. Los nematodos producidos de esta manera son relativamente robusta, aunque su supervivencia en el almacenamiento puede variar dependiendo de las especies utilizadas. Las técnicas que se detallan en esta presentación corresponden a los descritos por diversos autores y refinado por el Laboratorio de la Universidad de Arizona (Tucson, AZ, EE.UU.) de P. Stock. Estas técnicas son distinta del cuerpo de las técnicas que se utilizan en la producción masiva de estos organismos con fines de gestión de plagas.
Introduction
Nematodos entomopatógenos (EPN) Steinernema y Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) y sus bacterias simbiontes, Xenorhabdus y Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) se consideran un modelo emergente de los Animales Terrestres microbica relaciones simbióticas 2-4,6,10,19. Xenorhabdus y Photorhabdus spp. se albergaron como simbiontes en el intestino de la única etapa de vida libre de los nematodos, también conocido como el infectivo juvenil (IJ) o etapa 3 rd infectivos juveniles 8,10,13. La pareja bacteria-nematodo es patógeno para una amplia gama de insectos y con éxito se ha implementado en el control biológico y los programas de manejo integrado de plagas en todo el mundo 6,8.
Aquí mostramos una selección de in vivo e in vitro técnicas que se ejercen con frecuencia para la cría de EPN en condiciones de laboratorio. In métodos in vivo contemplan un insecto huésped para la cría de los nematodos. Por lo general, los estados inmaduros de diferentes órdenes de insectos (es decir, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) Se consideran hospedadores adecuados. In vivo métodos suelen ser considerados para el mantenimiento de cultivos de nematodos en el laboratorio. Este método puede no ser adecuado cuando se considera la producción en masa de los nematodos. Grandes cantidades de insectos hospedadores pueden ser necesarios para tal fin exigir más tiempo y costes adicionales relacionados con la cría de insectos.
Nematodos entomopatógenos también pueden ser cultivadas in vitro en varios medios de comunicación. Dependiendo del objetivo del estudio; métodos in vitro o puede considerar la incorporación de las bacterias simbióticas en los medios de comunicación. En esta presentación, se describen dos métodos comúnmente usados para la propagación de EPN. Los ingredientes de los medios de comunicación proporcionan una fuente de nutrientes para la bacteria simbiótica unmétodos in vitro encontrar una fuente de esteroles de los nematodos. ofrecen la ventaja de la cría de EPN sin un insecto huésped.
Originalmente, muchos de los medios de comunicación in vitro desarrollado fueron utilizados para la multiplicación de EPN cuando los ejércitos de insectos adecuados no están disponibles. Sin embargo, en los últimos años, en los métodos de cría in vitro han sido ampliamente empleado en la investigación con el objetivo de entender la relación mutualista entre EPN y sus bacterias simbióticas 17,19.
Las técnicas que se detallan en esta presentación corresponden a los descritos por diversos autores y refinado por la Bolsa de Laboratorio de la Universidad de Arizona (Tucson, AZ, EE.UU.). Estas técnicas son distinta del cuerpo de las técnicas que se utilizan en la producción masiva de estos organismos con fines de gestión de plagas.
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Protocol
1. En vivo La cría de nematodos entomopatógenos con sus bacterias Symboitic
- Invertir un 100 x 15 mm placa Petri de plástico y colocar dos discos de papel de filtro (90 mm) en la tapa del plato.
- Distribuir uniformemente 1 ml de la IJ (juveniles infectivos) suspensión de agua (a una concentración de 1,000-2,000 IJ / ml) sobre el papel de filtro.
NOTA: JIs no necesitan ser esterilizados de la superficie. - Añadir 10 larvas de último instar de la mayor Galleria mellonella waxmoth al plato. El objetivo es proporcionar aproximadamente 100-200 JIs / larva.
- Cubra la tapa con la parte inferior de la placa de Petri (Figura 1) y la etiqueta de la placa de Petri. Mencione la siguiente información: nombre de la especie de nematodos (si se conoce); aislar código / designación; infección fecha trampa estaba tendida.
- Coloque el plato en una bolsa de plástico sin apretar sellada (para conservar la humedad) y mantenerlo en la oscuridad a temperatura ambiente o en una incubadora entre 20-25 ° C. Compruebe platos diariamente
NOTA: La oscuridad facilita la infección por nematodos, ya que imita las condiciones naturales de infección en el suelo. - Después de 3-5 días, retire cadáveres con signos de infección por nematodos a una trampa Blanco modificada 7.
NOTA: Si los cadáveres olor pútrido, esto puede ser una indicación de que el cultivo no tuvo éxito y / o no había contaminación. Configurar una nueva cámara de la infección con un nuevo lote de nematodos e insectos.
2. In vitro Crianza de nematodos entomopatógenos con sus bacterias simbióticas
- Hígado y riñón Agar Método 9,19
- Picar el hígado y el riñón en trozos pequeños (2 cm 3 o más pequeñas) y colocar en una licuadora con NaCl, agar y 300 ml de agua y mezclar hasta que la carne se convierte en una pasta líquida, pasta espesa o puré. A continuación, transferir la mezcla a un matraz Erlenmeyer de 1 l.
- Añadir los últimos 200 ml de agua al recipiente de la licuadora y decantar cualquier medio restante en laErlenmeyer. Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C. Después de la esterilización en autoclave permite agar enfriar a tocar antes de verter.
NOTA: El pipeteo de medio no es recomendable ya que este medio tiende a tener trozos de carne. - Vierta ~ 20 ml de agar a 5 (o 6) cm placas de Petri mientras se agita la mano o girando el matraz Erlenmeyer vierte entre los medios de comunicación para una más homogénea. Permitir agar para solidificar y almacenar platos a 4 ° C hasta que se necesite
NOTA: Use una espátula de metal llama-esterilizados para romper los trozos grandes de carne vierte en la placa de Petri.
- Lipid Agar Método 9,19
- Preparar medio de agar de lípidos mediante la mezcla de caldo nutriente, extracto de agar y la levadura y verter la mezcla en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Agregar destilada H 2 O y MgCl2 • 6H 2 O y autoclave durante 15 minutos a 121 ° C.
- Agregue la mezcla estéril de aceite y jarabe de maíz de mezcla de maíz y revuelva o agite vigorosamente y con frecuencia para dispersar las gotitas de aceite de manera uniforme.
- Vierta ~ 20 ml de agar en un 5 (o 6) cm placas de Petri y dejar solidificar el agar y almacenar platos a 4 ° C hasta que se necesite.
- La racha de bacterias simbióticas que desee en la placa de agar de lípidos e incubar las placas a 28 ° C durante 24-48 horas.
NOTA: Extienda 100-200 l de la noche (12-16 horas) LB subcultura. - El día después, agregar aproximadamente 0,4 ml de superficie esterilizada suspensión de nematodos (huevos o juveniles infectivos) e incubar las placas a temperatura ambiente en la oscuridad o en una incubadora a 22 ± 3 ° C.
NOTA: No agregue más de 0,4 ml de suspensión de nematodos, ya que puede crear un ambiente excesivamente húmedo que es desfavorable para el crecimiento de los nematodos. - Monitorear culturas diaria. Los cultivos deben producir una nueva generación de JIs en unos 12 días (Figura 2).
- Transferencia plato inferior con agar cuando los nematodos se ven arrastrándose los lados del plato (Figura 3A) a una trampa Blanco modificado (ver Orozco et al., 12) para cosechar JIs (Figura 3B). Realice este paso en una campana de flujo laminar para reducir la contaminación de los medios de comunicación.
- Recoger JIs de la trampa Blanco modificada en surgimiento y enjuague IJ suspensión para eliminar los residuos medio. Tienda IJ en agua destilada esterilizada a 10 ° C (en un incubador de temperatura fría o habitación fría) o utilizar de inmediato si es necesario.
NOTA: En función del objetivo del estudio, sembrar las placas, ya sea con nematodos simbiontes-colonizado o aposymbiotic.
3. In vitro Crianza de aposymbiotic (-Symbiont gratis) entomopatógenos nematodos
- Infectar 10-20 G. larvas mellonella con JIs de las especies de nematodos deseados (véase la sección 1). Después de 3 o 4 días (en este momento JIs debería haber maduradoa los adultos de la primera generación) recoger cadáveres.
NOTA: El tiempo de la madurez y el número de hembras necesarios para obtener un número suficiente de huevos varía según la especie. Infectar a más G. mellonella larvas si es necesario y comenzar disecciones ya en el post-infección de 48 horas para evaluar si se encuentran en la etapa de desarrollo adecuado. - Coloque cada cadáver individualmente en una placa de Petri con solución salina (tampón M9 18). Diseccionar un cadáver tirando su cabeza con unas pinzas de punta fina.
- Recoge al menos 20 grávido (con huevos dentro de) mujeres con una aguja fina (en forma de L de preferencia) y colocarlos en un vidrio de reloj que contiene 10 ml de tampón M9 (Figura 4A).
- Preparar una solución axenizing considerando los siguientes ingredientes: 6,75 ml de agua destilada, 1,25 ml de NaOH 5 N, y 2,25 ml de solución de lejía disponible comercialmente diluyó a 3% de hipoclorito.
NOTA: NaOH es una base de solución-guantes, gafas de protección y otra asistencia adecuada protecciónse debe usar ropa.
NOTA: Preparar solución axenizing nuevo cada vez, como la lejía se degrada en la luz. Prepare varios lotes de solución axenizing y realizar la esterilización de la superficie y la recolección de huevos en varios vidrios de reloj. - Enjuague hembras al menos tres veces con tampón M9 llenado vidrio de reloj con solución tampón y absorbiendo tampón con una pipeta. Asegúrese de que las hembras permanecen en el vidrio de reloj. Repita este paso dos veces más.
- Inmediatamente después, añadir la solución axenizing y permitir que las mujeres permanezcan en esta solución durante no más de 10-15 minutos. Observar los tejidos de nematodos que comienzan a desintegrarse mientras que los huevos (que son resistentes a la solución axenizing) permanecen intactos.
- Interrumpir manualmente cuerpos femeninos para acelerar el proceso, cortándolos con una aguja o un bisturí (Figura 4B, C). Retire los huevos con la pipeta ellos en 1,5 ml tubos de microcentrífuga, evitando la adición de cualquier tejido sin disolver.
NOTA: Uso como mcualquier tubos de microcentrífuga como sea necesario para recoger los huevos y trabajan rápidamente, ya que la viabilidad de los huevos disminuirá durante un período prolongado de exposición a la solución axenizing. - Tubos Vortex durante 15 segundos utilizando el "ajuste de alta velocidad" para eliminar aún más los tejidos de nematodos unidos a los huevos. Alternativamente, si un vórtice no está disponible, pipetear arriba y abajo las soluciones varias veces.
- Huevos de pellets por centrifugación a aproximadamente 18.000 g durante 2 min. Aumentar la velocidad si los huevos no hacen lo suficiente pellet. Retire la solución axenizing y enjuague dos veces llenando el tubo de microcentrífuga con agua destilada estéril y se centrifuga una vez más a 900 xg durante 1 min.
- Después del último lavado, resuspender huevos en 300-500 l de agua destilada estéril y colocarlos en un recipiente estéril 3 cm placa de Petri o vidrio de reloj esterilizado. Recuerde que los huevos son ahora esterilizados en superficie, a fin de utilizar pipetas estériles y / o consejos pippetter y agua para mantener la limpieza de los huevos.
- Examine los huevos bajo un microscopio de disección (ampliación 30-50X) para confirmar que están intactos (Figura 4D) y transferirlos a una placa 5 cm con agar hígado-riñón (ver sección 2.1)
NOTA: No agregue más de 400 l de la suspensión de huevos en las placas ya que hará que el agar excesivamente húmedo. - Las placas de identificación con la información apropiada y almacenarlos en posición vertical en la oscuridad a 28 ° C. La eclosión de los huevos debería ser evidente durante la noche.
NOTA: El agua puede condensarse en la tapa del plato, pero se evaporará después de 1 ó 2 días. En este momento, colocar la cápsula en la bolsa de plástico para retener la humedad del agar y evitar su secado. - Observe platos periódicamente y deseche cualquier platos que muestran signos de hongos o la contaminación bacteriana. Una vez JIs se ven migrar hasta la pared de la cápsula de Petri, quitar la tapa y transferir el plato inferior con agar a una trampa Blanco modificada 12. Considere condiciones estériles al transferir el plato en el modified trampa blanca para evitar la contaminación de los medios expuestos.
- Continuar el seguimiento de las trampas blancas y cosecha IJ según sea necesario.
NOTA: los nematodos aposymbiotic seguirán migrando hacia el agua de la trampa de Blanco durante muchos días e incluso semanas.
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Representative Results
El método de cría in vivo utiliza insectos vivos como anfitriones para el crecimiento y la reproducción de nematodos. Cámaras de infección son un método eficaz para la exposición de insectos JIs. Esta es la única etapa del ciclo de vida de los nematodos de que los vectores de las bacterias simbiontes de un insecto huésped a otro. Figura 1 muestra la puesta a punto para una cámara de infección, así como los materiales necesarios para construir esta cámara. In vitro métodos de crianza permiten EPN para crecer sin un insecto huésped, sino también se aplican para la cría de nematodos (-simbionte libre) aposymbiotic. Figura 2 muestra una placa de agar de lípidos con diferentes etapas de nematodos. Placas de agar de lípidos también pueden ser considerados en las pruebas de hibridación cruzada que se requieren para validar la identidad de nematodos basado en el concepto de especie biológica. El método de agar hígado riñón fue descrito originalmente por Poinar y Thomas (1966) 14. Este método permite a los nematodos maduren y reproE sin un insecto huésped y puede ser utilizado a los nematodos traseros sin sus bacterias simbióticas (es decir, producen nematodos aposymbiotic). Una desventaja de este método es que es propenso a la contaminación debido a su naturaleza rica, permitiendo que las bacterias u hongos no deseados crezcan. Figura 3A muestra las placas de agar de hígado y riñón con IJS se arrastra en el lado de la placa. En esta etapa la parte inferior de la placa de Petri se puede transferir a una trampa Blanco modificada. Figura 3B demuestra una placa de hígado y riñón con nematodos Steinernema en una trampa Blanco modificado para la recolección de JIs progenie. Figura 4A muestra un vidrio de reloj con grávido Steinernema hembras antes de su axenización. Figura 4B muestra la interrupción de las hembras con una aguja de disección. Figura 4C muestra las hembras interrumpido en la solución axenizing. Figura 4D muestra un huevo intacta del nematodo Steinernemun carpocapsae.
Figura 1 Set de una cámara de infección para la cría in vivo de EPN. Fila superior muestra un documento 5 cm placa de Petri y el filtro. La fila inferior muestra un plato y el filtro de papel 10 cm Petri. Número de anuncio de larvas de insectos añade a cada cámara de la infección.
Figura método de agar 2. lípidos para la cría in vitro de EPN. La imagen muestra un primer plano (aumento 20X) de un plato con nematodos adultos en desarrollo en el medio.
Figura 3. de hígado y riñón placa de agar. Image A de la izquierda muestra un plato con éxito el crecimiento de los nematodos. Observe nematodos que se arrastran en el lado del plato. Imagen B muestra una placa de agar de hígado y riñón colocado en una trampa Blanco modificado para la recolección de los nematodos IJ.
Figura 4. reloj de cristal con las hembras grávidas en axenizing solución. La imagen A muestra las hembras grávidas en la solución axenizing. Imagen B muestra la molienda de las hembras con una aguja de disección. La imagen C muestra interrumpieron las hembras. Imagen D muestra un huevo intacto del nematodo Steinernema carpocapsae.
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Discussion
El uso de un huésped adecuado es un factor clave para el éxito en la crianza vivo de EPN. Por lo general, ambos steinernematids y heterorhabditids pueden reproducirse y completar con éxito su ciclo de vida en las larvas de la polilla mayor de la cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Sin embargo, otras especies de insectos de diferentes familias y / o pedidos pueden ser considerados. Algunas de las especies de nematodos que se describen en la actualidad se sabe que tienen especificidad por un insecto huésped particular. Por ejemplo, S. kushidai y S. scarabaei no son muy virulenta para las larvas de lepidópteros, coleópteros y larvas necesitan como larvas de escarabajo (Scarabaeidae) Para criar con éxito en el laboratorio. Otra especie, S. scapterisci, prefiere insectos ortópteros tales como grillos o grillos topo.
Cuando un huésped adecuado no está disponible o cuando las condiciones experimentales requieren, métodos in vitro puede emplearse para la cría de EPN. Estos métodos utilizan los medios de comunicación que ofrecen una rica fuente de nutrientes para los nematodos y sus bacterias simbiontes. En esta presentación descrito dos tipos de agar (hígado-riñón y lípidos) que puede ser utilizado para el crecimiento y la reproducción exitosa de EPN con o sin sus bacterias simbióticas.
Los usuarios deben ser conscientes de que el agar de hígado-riñón es una rica medios y por lo tanto se contamina con facilidad. La técnica estéril se recomienda en el manejo de ambos los huevos axenized y las placas inoculadas durante todos los pasos del procedimiento. Las placas que están contaminados con bacterias u hongos se deben desechar inmediatamente.
Cuando la cría aposymbiotic Steinernema JIs, se debe tener cuidado para lisar adecuadamente los tejidos de nematodos femeninos, ya que podrían albergar bacterias Xenorhabdus. Además, para validar que IJ son realmente libres de bacterias simbióticas, recomendamos la molienda de una muestra de JIs recién cosechadas en LB con una moto de manor-impulsado maja según (Heungens et al. 2002) 7 y la placa de la suspensión en medios NBTA 1. Si se encuentran las colonias de bacterias (después de la incubación durante la noche) que será o bien una indicación de una técnica axenización pobre o el resultado de la contaminación.
La cría de nematodos Steinernema aposymbiotic es una técnica que también puede ser considerado en una amplia gama de procedimientos y experimentos. Los lectores deben tener en cuenta que el impacto de la crianza de los nematodos Steinernema sin simbiontes a través de múltiples generaciones puede tener un impacto en la aptitud de nematodos y la supervivencia en tiempos de generación. Algunos estudios sugieren la necesidad de su emparejamiento en los sistemas naturales 5,11,15-17. Sin embargo, estos estudios se han realizado en un número limitado de especies y se necesita una mayor exploración.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros anteriores de la Bolsa de laboratorio: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson y Sam-Kyu Kim por su contribución a la mejora de muchos de estos protocolos. Este trabajo fue financiado en parte por la subvención de la Fundación Nacional para la Ciencia IOS-0840932 y 0724978 para IOS-SP Stock
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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