Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/52099
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3,4, 2, 1,4
1Division of Neurobiology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 2Division of Developmental Biology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 3Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh, 4Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

Abstract

סוף 1970s ראה השימוש דיווח בפומבי הראשון של הכתם המערבי, טכניקה להערכת הנוכחות ושפע יחסי של חלבונים ספציפיים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות. מאז, מתודולוגיה המערבית סופג הפכה למרכיב נפוץ ברפרטואר הניסיוני הביולוגים המולקולריים. חיפוש שטחי של PubMed שימוש במונח "כתם מערבי" עולה כי בעודף של 220,000 כתבי יד שפורסם עשו שימוש בטכניקה זו עד שנת 2014. חשוב לציין, בעשר השנים האחרונות ראו התקדמות הדמיה טכנית בשילוב עם הפיתוח תוויות ניאון של רגישות אשר שיפרו את הרגישות והניבה טווחים גדולים עוד יותר של גילוי ליניארי. התוצאה היא הקרינה עכשיו באמת לכימות מערבית כתם (QFWB) מבוססת המאפשרת לביולוגים לבצע ניתוח ביטוי השוואתי עם רגישות רבה יותר ודיוק מאשר אי פעם בעבר. מערבי סופג "אופטימיזציה" רבמתודולוגיות קיימות ונמצאות בשימוש במעבדות שונות. לעתים קרובות להוכיח אלה קשים ליישום בשל הדרישה של תיקונים פרוצדורליים עדינים אך מתועדים. פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של שיטת QFWB הוקמה וחזק, מלא באסטרטגיות לפתרון בעיות.

Introduction

מערבי סופג (WB) היא טכניקת ניתוח שפותחה במקור בסוף 1970s כדי לקבוע את נוכחותו או היעדריו של חלבון של עניין במדגם ביולוגי מורכב, כגון רקמת homogenate 1. המכונה גם immunoblot החלבון, כתוצאה מאינטראקצית הנוגדן-אנטיגן מפתח, המתודולוגיה כוללת 5 שלבים ברורים: 1) הפרדת electrophoretic של החלבונים על ידי נקודת isoelectric; העברה לdifluoride nitrocellulose או polyvinylidene (PVDF) קרום 2); 3) תיוג באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין; דגירה 4) עם נוגדנים משני המכוונים נגד הנוגדן הראשוני; ו -5) להדמיה.

המתודולוגיה הדמיה התפתחה עם זמן לשיפור בטיחות ורגישות. חלק מWBS הראשון בוצע באמצעות תגי כותרת רדיו אשר לאחר מכן התקדמו לcolorimetric ולאחר מכן chemilluminescent יותר בשימוש נרחב בשיטות (ECL). Radioactivity תויג ישירות על גבי בדיקות לאנטיגנים ספציפיים ואילו שיטות colorimetric וECL להשתמש בטכניקת תיוג עקיפה עם כתב אנזים כגון peroxidase אלקליין חזרת phosphatase או streptavidin (HRP) 2. העצמה של תיוג של מוצר כרומגן או זורח נמדדת באמצעות צפיפות לפי עוצמת האות, חזקה או חלשה, מציינת פחות או יותר את נוכחותו של החלבון של עניין במדגם. ECL הוא מתודולוגיה רגישה יותר ולכן העדיפה 2 אבל כל 3 השיטות בתחילה פותחו על סרט X-ray עם טכניקות הדמיה דיגיטלית מתוחכמות יותר הוקמו 3 לאחר מכן. הקידום של הדמיה הדיגיטלית של WB אפשר לא רק חוקר על מנת לקבוע את נוכחותו או היעדריו של חלבון עניין שלהם, אלא גם אפשר היקש לרמת ביטוי של חלבון שנבחר בהשוואה נגד דוגמאות אחרות, ולכן יכול להיות המכונה "חצי כמותית & #8221 ;. לאחרונה, טכנולוגיה מערבית סופג באמת כמותי ורגישה יותר פותחה לפי רמת הקרינה שנמדדה קשורה באופן ישיר לכמות ולביטוי של חלבון בודד בתוך מדגם: כמותיים ניאון מערבי סופג (QFWB).

כאשר משווה QFWB עם תיוג ECL, השימוש בנוגדנים משני ניאון יוצר פרופיל איתור ליניארי 4. זאת בניגוד לטכניקות ECL בי ליניאריות אות מתרחשת בדרך כלל עם המון חלבון נמוך מתחת מיקרוגרם 5 ואת הרוויה אות קשורה ישירות לביטוי חלבון, כלומר, עם גני המשק באו לידי ביטוי בכל המקום 5,6. פער זה בא ככל הנראה נגרם על ידי מספר גדול יותר של אתרי קישור זמינים עבור מצע ECL avidin להיקשר לbiotinylated משנית, וכתוצאה מכך סבירות גבוהה יותר של הרוויה אות פוטנציאלית. זה אחת הסיבות העיקריות לimmunoblotting בסיס ECL שהופנה לonl כ7 y "חצי כמותית". הנקודה של אות רוויה היא בעל חשיבות קריטית כאשר מודדים הבדלים דקים ברמות ביטוי ויכול להוביל למדידה לא מדויקת. בשנים האחרונות הכניסה של טכניקות proteomic נרחבות המפרטות את הרגישות והזדהות של הפרשי ביטוי עדינים הולכת וגוברת הביאה הסתמכות הולכת וגוברת על מערבי סופג באמת כמותי לניסויי אימות 8,9. היישום של מתודולוגיה רגישה, חזקה ובאמת כמותי ולכן, חשוב.

מתודולוגיות מערביות סופג "אופטימיזציה" רבות כבר מנוצלות על ידי מעבדות עצמאיות, אשר לעתים קרובות להוכיח קשה להגדיר או לשכפל בשל התאמות מתודולוגיים עדינות שלא יכול להיות ברור בפרוטוקולים מתועדים רשמיים. זהו פרוטוקול מבוסס וחזק לQFWB ובנוסף מספק אסטרטגיות חשובות לפתרון בעיות נפוצות thaלא יעלה במהלך ביצוע.

פרוטוקול זה היה מותאם במקור לשימוש עם homogenates המוח עכברית, אך מאז נעשה שימוש יעיל במגוון רחב של דוגמאות ומינים 4,9,10 רקמה. וריאציות פרוטוקול פוטנציאל הנדרשות לפתרון בעיות ספציפיות כלולות.

Protocol

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה באמצעות מאגרים מיוצרים באופן מסחרי, ג'לים וערימות העברה על מנת לצמצם שונות ולשפר את העקביות. עיין בחומרי רשימה לרשימה של מוצרים צריכים הדרושים שלמה.

פרוטוקול WB פלורסנט באמצעות מערכת ההדמיה LI-COR אודיסיאה העברה ומהירה I-כתם

1. הכנת לדוגמא

  1. בחירת חיץ / הכנה
    1. בחר חיץ חילוץ מתאים להומוגניזציה מדגם ולהבטיח שהמאגר תואם את כל הטכניקות במורד הזרם להיות מועסקות. הכן חיץ חילוץ: חיץ Ripa (25 מ"מ טריס HCl (pH 7.6), 150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate נתרן, 0.1% SDS) המכיל 5% מעכבי פרוטאז קוקטייל לפני לדגום בידוד.
      הערה: ישנם סוגים רבים ושונים של מאגרי חילוץ זמינים ונבחרו בהתאם למיקומו של החלבון של עניין בתוך התא. אלה כוללים, אך לאמוגבל למאגר ריפה (תא כולו, המיטוכונדריה ורכיבים גרעיניים), חיץ NP-40 תמוגה (כל תא או קרום כרוך) וטריס-טריטון (cytoplasmic שלד כפות). עם זאת, חלק מחומרי ניקוי כימי בתוך מאגרי חילוץ עשוי לעזור לsolubilize או אפילו לבטל את חלבון אבל יכולים להפריע לקביעת חלבון בעת שימוש assay נחישות חלבון מסוים, כלומר, חומצת Bicinchoninic assay (BCA). בדקו הנחיות היצרן לגבי תאימות כימית עם assay.
  2. הפקת חלבון / solubilization
    1. באופן ידני מרוך דגימת הרקמה באמצעות מספריים ו / או אזמל ואחריו הומוגניזציה או באמצעות dounce או homogenizer כף יד חשמלי עם קצה פוליפרופילן במאגר החילוץ מוכן בכ 1:10 w / v (משקל רקמה / חיץ נפח) עד homogenate חלק / עקבי מיוצר.
      הערה: לקטן יותר, יקר / קשה להשיג דגימות, עקירות חומר ניקוי המבוסס can עדיין להיות יעיל עד 1: 5.
    2. פרסם הומוגניזציה, דגימות צנטריפוגות ב XG 20,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant המכיל חלבונים וחנות solubilized ב -80 ° C עד לרגע שימוש. שמור כדורים מסיסים כדי לאפשר חילוץ נוסף מחמיר יותר במידת הצורך בהמשך. המשך לצעד נחישות חלבון 1.3.
  3. קביעת חלבון
    1. קבע את הריכוז של חלבון בתוך כל דגימה שחולצה על ידי או באמצעות BCA, ברדפורד או assay הדומה. בעת חישוב העקומה סטנדרטית, להבטיח כי המקדם של יחס נחישות, ערך R בריבוע, הוא גדול או שווה ל0.99 המשקף את הקביעה מדויקת ביותר של שפע חלבונים בתוך הדגימות 15.
      הערה: כל הדגימות מושוות על ידי QFWB חייבת להיות assayed נגד אותה עקומה סטנדרטית.
  4. הכנת המדגם
    1. לתכנן ולהקליט את סדר הטעינה של סולמות ודגימות עבור 2 גר 'זההאלס: ג'ל 1 להעברה וג'ל 2 כביקורת טעינה. טען את השליטה ודוגמאות "טיפלו" ברצף, כדי למנוע כל הטיה שעלולה להתעורר עם העברה עניה או חד-משמעית.
    2. לחשב את החלבון דרוש לכל נפח דגימה. עומס חלבון סטנדרטי כדי לזהות חלבונים שבבודד עצבי הוא 15 מיקרוגרם. הפוך כל דגימה עד 10 μl נפח עם DH 2 א ' הוסף 5 μl של חיץ טעינה, מערבולת וחום על 98 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    3. כולל מדגם שליטה חיובי כגון חלבון רקומביננטי כדי לסייע בזיהוי של הלהקה הנכונה של עניין. עם זאת להכין את מדגם בקרה החיובי בצורה נכונה בהנחיות של היצרן כדי להימנע מבחירה של הלהקות הלא נכונות. ראה איור 1.

איור 1
איור 1. Pבחירת שליטת ositive. התוספת של בקרות חיוביות לניסוי מאשרת את התיוג זוהה הוא אמיתי. עם זאת, יש לקחת בזהירות כדי להבטיח את השליטה שלך פועלת כראוי לפני שימוש דגימות ניסוי. חלבון היתוך) TREM 2 היה עמוסה בהנחיות של היצרן של 1 מיקרוגרם / מיליליטר, אולם התיוג נצפה ב110 סכסוכי kDa עם גיליון הנתונים חזה מולקולרי משקל של 60-70 kDa. ב) לאחר חיבור ודגירה עם סוכן צמצום, תיוג חלבון ההיתוך זוהה במשקל המולקולרי חזה. עם זאת, פירושו של הדבר גדול יותר עומס חלבון נדרש כתהליך הפחתת ירידת האות של החלבון.

2. הפרדת Electrophoretic של חלבונים

  1. הכנת 4-12% ג'ל Bis / טריס (1.0 מ"מ)
    הערה: ג'לי צבע משמש לייצור הפרדת חלבון גדול יותר על פני מגוון רחב משקל מולקולרי.
    1. בחר ולהכין MESאו מגבי חיץ פועלים (1 ליטר לכל טנק) על ידי דילול עם DH 2 א ' מאגר MES מייצר רזולוציה טובה יותר של חלבונים בתוך 3.5-160 kDa אילו מגבי חיץ פועל עדיף לגילוי חלבוני משקל מולקולריים גבוהים יותר מעל 200 kDa עם זאת יצטרך רזולוציה עניות יותר של חלבוני משקל מולקולריים נמוכים מתחת ל -15 kDa.
    2. הסר את המסרק ורצועה של סרט המכסה את הרגל של הג'ל. לשטוף בעדינות את הבארות עם חיץ פועל באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. מלא את הבארות עם חיץ פועל ולהבטיח שאין בועות תישאר בג'ל.
  2. הכנת ג'ל וטעינה
    1. הכנס את ג'לי לתוך הטנק ולמלא את תא ג'ל היתר עם הפעלת מאגר כדי להבטיח את כל החותמות פועלות ביעילות.
    2. הוסף 3 μl לסטנדרטים של משקל מולקולריים לתוך הבאר הראשונה בג'ל 1 וג'ל טען 2. 10 μl של כל דגימה לתוך בארות שלאחר מכן.
      הערה: פרט לסולמות, ג'ל 1 & 2 ג'ל חייב להיות זהה. זה ה הכרחיבתקן המשקל מולקולרי מראש צבעוני המשמש לג'ל 2 הוא כחול וגלוי בעת שימוש בסך הכל כתם חלבון כדי להיות גלוי בערוץ 700 של תרמי אודיסיאה.
    3. ברגע שהם נטענים גם ג'לים, למלא את המכל עם המאגר פועל נותר ולאבטח את המכסה.
  3. אלקטרופורזה
    1. "הפעלה" את הג'ל על 80 V למשך 4 דקות כדי להבטיח את המדגם נכנסה למטריצת ג'ל polyacrylamide באופן אחיד. לאחר מכן להגביר את המתח וזמן 180 V למשך 50 דקות בהתאמה, או עד שצבען המדגם ניתן לראות למרגלות ג'ל.
      יכולים להיות מיושמים במתחים גבוה יותר כדי להשיג פעמים ריצות קצרות יותר: הערה. עם זאת, זה עלול לגרום לג'לים "סמיילי" שבו דגימות אמצע ג'לי לרוץ מהר יותר מדגימות הנתיב החיצוניות הנגרמות על ידי עלייה בטמפרטורה 14.

3. כתם חלבון כולל של ג'ל בקרת הטעינה

  1. שחרור ג'ל 2 מהקלטת באמצעותסכין ג'ל. הסר את הבארות ואת הרגל של הג'ל. סמן את הג'ל כדי לסייע נטייה.
  2. למזוג כ 30 מיליליטר של כתם החלבון לתוך צלחת פטרי רבועה (גודל משוער 12 x 12 סנטימטרים). הנח ג'ל 2 לתוך כתם החלבון, כדי להבטיח את הפתרון מכסה את כל ג'ל, אז להתסיס את הג'ל למינימום שעה 1 בטמפרטורת חדר כדי להכתים.
  3. למזוג את כתם החלבון ולשטוף 3x ג'ל במים מזוקקים לפני ההדמיה. המשך לשלב 6.3 לדמיין.

העברת חלבון מהירה 4. אני-כתם חצי יבש

הערה: כל חומרים כימיים הנדרשים להעברת חלבונים באמצעות מכשיר I-הכתם הם מוצרים מסחריים שתוכננו במיוחד עבור מתודולוגיה I-הכתם, וניתן למצוא ברשימת חומרים.

  1. הכן את ערימת ההעברה "מלמטה". הסר לכסות בנייר כסף וטרום רטוב עם ההפעלה ישיר ממכל ג'ל חיץ. נייר סינון מראש רטוב במים מזוקקים.
  2. חזור על שלב 3.1 ומקום ג'ל 1 עלערימת ההעברה מוכנה "מלמטה".
  3. הנח את נייר הסינון מראש רטוב על ג'ל. גלגל את נייר הסינון וג'ל כדי להבטיח שאין בועות לכודים בין השכבות.
  4. הסר את מכסה האלומיניום מהערימה ההעברה העליונה ולהניח את המחסנית העליונה על גבי נייר הסינון וערימה תחתונה. גלגל את "הכריך" ערימת ההעברה לחסל את כל בועות אוויר.
  5. הכנס את הספוג מערכת ערימת העברה על המכסה של המכונה I-הכתם. הנח את כריך ערימת העברה על גבי השטח הייעודי במחשב I-הכתם אז סגור את המכסה באופן מאובטח. התחל לי-הכתם ולהעביר ל8.5 דקות על תכנית 3.
  6. אם יש אות חלבון נמוכה או גבוהים לא אחידים: יחסים מולקולריים נמוכים חלבון במשקל, לבדוק את זמני ההעברה של היצרן בעת ​​שימוש בשיטה חצי יבשה "מהירה" העברה. הפעל פרוטוקול אופטימיזציה פשוט באמצעות חזרות מדגם של עומס זהה כדי לקבוע את שילוב מתח / שעת העברה האידיאלית כפי שניתן לראות באיור 2 .

איור 2
איור 2. אופטימיזציה של העברה באמצעות I-כתם.) ג 'אחד עמוס בסולם ו -15 מיקרוגרם של homogenate המוח כולו העכברי בשלושה חוזר טנדם נחתכו לשלושה חלקים. סעיף אחד לא הועבר, אחד הועבר ל7.5 דקות (בהתאם להנחיות של יצרן) ואחד ל8.5 דקות. סעיפי ג 'אז היו מוכתמים בכתם כחול חלבון מיידי, סרוקים על תרמי אינפרא אדום בערוץ 680 ולכמת. ייצוג גרפי של ערכי הכימות מפגינים את ההבדל בתכולת חלבון שייר של כל ג'ל B) הבא 0, 7.5, ו -8.5 דקות של העברה. שים לב שדקה נוספת של זמן העברה הביאה להעברת חלבונים נוספת של כ -45%."Target =" e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. נוגדני זיהוי של חלבונים

  1. הכנת קרום וחסימה
    1. הסר ערימת העברה ממכשיר I-הכתם. להסיר את השכבה העליונה ונייר סינון חושפת את הג'ל במחסנית ההעברה התחתונה.
    2. חותך סביב ג'ל עם אזמל ולהבטיח שקיצוץ משולש למטרות נטייה מיוצג על הקרום. בעקבות זמירה קרום, חלבון כתם ג'ל כדי לבדוק את יעילות העברה ו / או למחוק.
    3. במהירות להזיז את הקרום לתוך צינור נקי 50 מיליליטר (או קיבול שווה ערך) המכיל 5 מיליליטר של 1X PBS ומניח על מכבש מכאני (או פלטפורמת מסלולית) לתסיסה מתמדת.
      הערה: זה קריטי, כי הקרום אינו מותר להתייבש. במהלך העברת חצי יבשה הקרום יתחמם. חכה 2 דקות לפני פתיחת ערימת ההעברה כמו זה יאפשר לילא להתקרר וזמן ייבוש איטי במהלך פירוק ערימה. שימוש ברולר וצינור לתסיסה במהלך שוטף וincubations מאפשר הפחתה משמעותית בכמויות של פתרונות הנדרשים.
    4. שטוף את דקות קרום 3 x 5 ב1x PBS. מחק את PBS 1x ולחסום את הקרום עם חיץ חסימה מושלם עבור מינימום של 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. הכנת נוגדן ראשונית.
    1. הכן את הנוגדן הראשוני על פי ההנחיות של היצרן ב 5 מיליליטר של חיץ חסימה עם 0.1% Tween20. דגירה הממברנה עם הנוגדן מוכן העיקרי הלילה ב 4 ° C עם תסיסה מתמדת.
      הערה: חסימת חיץ משמשת בדרך כלל חי, אך עשוי להיות מדוללת עד 1: 4 עם PBS אם הנוגדן הראשוני יש מספיק סגוליות גבוהה.
    2. מחק את הנוגדן הראשוני ולשטוף את הממברנה 6 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  3. בחירת נוגדנים משני והכנה
    1. לערוץndary תיוג רק הערכה למטרות בקרה, להשמיט צעדים 5.2.1 ו5.2.2 לעיל והמשך לשלב 5.3 כדי לקבוע מדגם דפוסי פסים משניים ספציפיים. ראה איור 3.

איור 3
איור 3. אופטימיזציה של נוגדנים משני.) השוואת מינים רב של תיוג שאינו ספציפי רק שתי כנגד 15 מיקרוגרם של עכברי (M), כבש (O) ו- (ה homogenates סוסים) עצבים רקמות עם מגוון רחב של ניאון מתויגים נוגדנים משני . L הוא סולם המשקל המולקולרי. homogenate רקמת כבש היה רק המדגם לחוצים מגיב עם התיוג המשני בעת שימוש באנטי-עז חמור 800 נוגדן. B) כמו כן, חשוב לבדוק אם תיוג שאינו ספציפי מתרחש בעת שימוש בדגימת רקמה שונה, כלומר, שריר הגסטרוקנמיוס עכברי (15 _6; ז עומס). צלב מדגם זה מגיב עם הנוגדנים משני החמור נגד עכבר 680, אולם זה לא קרה בעת שימוש homogenate מוח עכבר.

  1. הכן את הניאון מתויג נוגדנים משני 680 או 800 (אדום או מסלול ירוק) הבאים יצרן מומלץ ריכוזים בחסימת מאגר עם 0.1% Tween20. דגירה הממברנה בחושך עם שני הנוגדנים מוכנים למשך 90 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה מתמדת.
  2. מחק את הנוגדנים משני ולשטוף את הממברנה 6 פעמים במשך 5 דקות לכל לשטוף עם 1x PBS. המשך לשלב 6 - הדמיה.
    1. אם ההדמיה של סמנים אינה פועלת כצפוי סולמות בחינה, עם מגוון רחב של נוגדנים משני, כצעד נוסף מתאים. לא כל הנוגדנים משני מאפשרים הדמיה של כל להקות הסמן בכל הסולמות הזמינים מסחרי.
    2. אם להקות צפויות אינן נראות לעין, להשתמש מארח המשני חלופי, כלומר, donkארנב נגד EY לעומת ארנב נגד עז מייצג שינוי פרוטוקול מתאים. ראה איור 4. מיני מארח המשמשים להעלאת נוגדנים משני יכולים לגרום לעיתים בעיה עם הדמיה בשל חוסר ספציפי לנוגדנים ראשוניים ספציפיים.

איור 4
הספציפיות איור 4. פתרון נוגדנים משני כתם מערבי של מגוון רחב של דגימות רקמה (חלבון 15 מיקרוגרם לכל נתיב) -. שומן, שרירים, כבד ועצמות - הודגרו עם נוגדן ראשוני ERK וטופחו עם שלושה נוגדנים משני שונים. פנל עליון: WB שכותרתו עם עז LI-COR נגד ארנב 680 נוגדנים משני מיוצר תיוג חלש של שומן ועצמות ואין אות זוהתה בדגימות הכבד ובשרירים. פנל באמצע: ממברנה (מפנל העליון) הופשט וrepr עובד באמצעות המתודולוגיה ECL וHRP נגד הארנב עיזים קשורים משניים. להקות כעת ניתן לראות דוגמאות שרירים ובכבד והתיוג מופיע יותר אינטנסיבי בדגימות השומן ועצם. פנל תחתון: ממברנה (מפנל העליון ואמצעי) הופשט וreprobed באמצעות נגד ארנב LI-COR חמור 680 נוגדנים משני שהראה זיקה גדולה יותר לנוגדן הראשוני ERK. תיוג לשרירים ובכבד הוא גלוי כעת עם עוצמת אות מוגברת מדגימות גם שמן וגם עצם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

6. ויזואליזציה

הערה: כל התמונות נרכשות באמצעות תרמי LI-COR הקלאסי אודיסיאה ותוכנת תמונה הקשורים ניתוח Pro (גרסה 3.1.4).

  1. הפעל ולהיכנס למחשב ותרמי. פתח את תוכנת ההדמיה וליצור קובץ חדש. ראה איור 5.

"Jove_content" FO: לשמור על-together.within עמודים = "תמיד"> איור 5
איור ויזואליזציה 5. וכימות של כתם מערבי. סריקה של כתם מערבי מראה שריר הגסטרוקנמיוס עכברי (30 מיקרוגרם עומס) משש עם נוגדן Annexin V עיקרי (36 KDA) ועז נגד ארנב 800 נוגדנים משני. הקרום נסרק ומדמיין בערוץ 800. כדי לכמת את החלבון (V Annexin), קופסא מלבנית מצוירת מסביב הלהקה של ריבית מהמדגם 1. אז זה הוא להעתיק ולהדביק על פני מדגם הנתיבים שנותרו כדי להבטיח מדידה של אותו האזור. רקע המטופלת באופן אוטומטי לסביב הצורה המשוכה, אבל זה יכול להשתנות כדי להבטיח מדידת הרקע מוגדר בצורה מדויקת. הטבלה שלהלן מציגה את המדידות לכמת של כל צורה שכלל אות כוללת שהושגה, רקע ואות עם רקע המופחת. מידע זה ניתן לייצא לתכנית גיליון אלקטרוני כדי לחשב יחסי ביטוי (כפי שנקבע על ידי עוצמת הקרינה היחסית) ומאפשרת ניתוחים סטטיסטיים הבאים שיש לבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. פתח את המכסה של תרמי. יוצקים כמות קטנה של 1x PBS על הזכוכית בפינה השמאלית התחתונה ולאחר מכן למקם את הקרום על גבי PBS. ודא הקרום הוא מרובע עם הציר על תרמי ופער של 1 סנטימטר שנותר בין הקרום וציר הרשת.
    1. מרדדים את הקרום כדי להבטיח שאין בועות לכודות בין הזכוכית והקרום.
    2. לספור את מספר ריבועי הקרום תופס על ציר x ו- y. סגור את המכסה של תרמי. הזן את מספר ריבועי הקרום תופס על תוכנות מחשב.
    3. בחר את הערוץ המתאים לסריקת הקרום שיהיה תלוי בתג הניאוןשל נוגדנים משני, כלומר, 700 ערוצים או 800 ערוצים כאשר נוגדן מתויג ניאון 680 או 800 כבר בשימוש בהתאמה. כאשר התיוג כפול מתבצע, לסרוק בשני הערוצים.
      הערה: מטב תיוג חלבון יחיד לפני ביצוע תיוג כפול.
    4. בחר את עוצמת לסרוק את הקרום, אם חלבון שפע גבוה להשתמש סריקה בעצימות נמוכה. לחלופין, אם הנוגדן הראשוני יש זיקה עניה לחלבון של עניין לבחור סריקה בעוצמה גבוהה יותר, כלומר, רמת 5. לחץ על Start כדי להתחיל בסריקה. המשך לשלב 6.4.
  2. ויזואליזציה של ג'ל שליטת טעינה (איור 6).
    איור 6
    איור 6. תיוג סה"כ חלבון וניתוח.) תצלום של ג'ל חלבון כולל שכותרת המכיל 20 מיקרוגרם של homogenate גרעיני צוואר רחם סוסים לכל נתיב. B) ג'ל מלוחנסרק בגרף 680 ערוץ. ג) מדידות לכמת מן הג'ל החלבון הכולל המוכתם שהושג באמצעות תוכנת הדמיה. מגוון של מדידות שנקבע על ידי סמני משקל מולקולריים, כלומר, 30-110 kDa, נלקחים לספק היסטוגרמה של מדידות כדי להבטיח שגיאה סטנדרטית (SEM) הוא נמוך (של דגימות מקובץ) מצביע על כך שרמות חלבון הכוללת בכל דגימה אחידות פני ג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
    1. בצע את השלבים 6.1 ו -6.2.
    2. יוצקים מים מזוקקים על משטח הזכוכית בפינה התחתונה של תרמי שבו ציר הרשת מתחיל.
    3. מניחים את הג'ל על גבי המים ולתמרן כך הנתיבים בניצב לX או ציר Y של הרשת. השאירו מרווח של 1 סנטימטר בין ציר y ו- x של הרשת ואת הג'ל ולספור את מספר הריבועים ג'ל תופס על ציר הרשת. לסגורמכסה תרמי.
    4. הזן את מספר הריבועים ג'ל תופס על תוכנות מחשב.
    5. בחר את הערוץ 700 לסריקה הכולל ג'ל החלבון מוכתם.
      הערה: כחול מאיר בערוץ 700.
    6. הגדר את עוצמת 5 ולחצו להתחיל.
  3. כימות של תמונה סרוקה
    1. התאם את כפתורי הבהירות והניגודיות כדי להפיק את איכות התמונה הטובה ביותר. אם נראה שיש רעש רקע גבוה, לסרוק מחדש את הקרום בעוצמה נמוכה יותר ולהשתמש בהגדרת הסריקה באיכות גבוהה.
      הערה: כל התאמות לא ישנו את נתוני הניאון רכשו בעת הסריקה.
    2. לסובב תמונות 90 °, 180 ° 270 על מנת להציג בכיוון הרצוי ללא שינוי לנתונים שנרכשו. עם זאת, בעת ביצוע התאמות קטנות של התמצאות ב" סיבוב חופשי ", על ידי יותר מ 3 מעלות, נתונים שנרכשו בערכי pixilation עשויים להתעקם ובכך להשפיע על תוצאות כימות.
    3. בחר צורה מתפריט צורות - להשתמש במלבן ברוב המקרים - ולצייר סביב הלהקה של עניין (WB) או כל המסלול (סה"כ ג'ל חלבון) בנתיב מדגם 1.
    4. העתק והדבק את הצורה על פני לדוגמא מסלול 2 להקה של עניין או כל נתיב. חזור על פני כל להקה בודדת של ריבית חובה על כל מדגם ונתיב אחד לסך ג'לי חלבון.
    5. בדוק שמדידת הרקע אינה כוללת אות בנתיב הסמוך. הרקע ניתן לנכות באופן אוטומטי על ידי התוכנה ולהקיף כל קצה סביב הצורה המצוירת או יכול להיות מוגדר שזה יהיה עליון / תחתון או שמאל וימין של הצורה. לחלופין, לייעד תיבת רקע הגדרת משתמש.
    6. להציג את האות לשולחן צורות עבור כל צורה שצוירה ביחידות ניאון שרירותיות. הרקע באופן אוטומטי יופחת מהאות.
    7. לייצא את התמונה כקובץ TIF כדי להציג בתוכנות שונות. לא לייצא את התמונה ולטפל usiתוכנת Pro תמונה שאינה ng כמו זה תהיה לשנות את הנתונים המקוריים שנרכשו על ידי תרמי הפקת נתונים כוזבים.
    8. חזור על שלבי 6.4.3-6.4.7 כאשר כימותי תיוג כפול או ביצוע מדידות מרובות על ג'לי שליטת טעינה כדי ליצור ולאסוף נתונים שגיאה סטנדרטיים.

ויזואליזציה 7. הודעה

  1. שמור ממברנות ב1x PBS או להתייבש לאחסון לטווח ארוך לעתיד מחדש חיטוט והפשטה של ​​ממברנות לחלבונים אחרים בעלי עניין.
  2. הפשטה ומחדש חיטוט של קרומים. ראה איור 7.
    איור 7
    איור 7. ממברנה הפשטה וreprobing. דוגמאות מייצגות של קרומי ביצוע שלבי הפשטה שונים שנסרקו עם מערכת הדמיה תת-אדומה.. Immunodetection הראשון בוצע עם נוגדן CSP העיקרי (ארנב) ונסרק בשעה 700 ערוץ. B. הפשטה ראשונה וreprobing עם ROCK2 (ארנב) עם 800 ערוצים. חץ כתום מציין שנותר נוגדן ראשוני CSP נוכחי לאחר הרצועה מחדש בדיקה. זו אינה משפיעה על המדידה של ROCK2 כלהקה נמצאת במשקל מולקולרי גבוה יותר (חץ לבן). ג. שנית הפשטה וreprobed עם β-Spectrin נוגדן (עז) ודמיין ב800 הערוץ. D. שלישי הפשטה וreprobing עם נוגדן α-סינוקלאין (ארנב). E. רביעית הפשטה וreprobing עם נוגדן יוביקוויטין (עכבר) עם 800 ערוצים. יש עדיין אות שנותרה מהנוגדן שעבר (α-סינוקלאין. חץ כתום). F. חמישי הפשטה וreprobing עם נוגדן CALB2 (ארנב) צילם בערוץ 700. נוגדנים משני השתמשו היו: 800cw העז נגד עכבר, 680rd נגד ארנב העז, 800cw נגד ארנב העז, 800cw אנטי-העז החמור (ראה חומרי רשימה). תוויות ליין: L - סולם, 1/260; - מדגם 1/2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
    1. קרום מקום (ים) בצלחת פטרי רבועה המכילות כ 30 מיליליטר של חיץ הפשטת Revitablot ומודגרת בין 5-20 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה מתמדת.
    2. לשטוף את הממברנה (ים) 3 פעמים PBS אז לסרוק מחדש על תרמי על מנת להבטיח הסרה של הקרינה מלאה התרחש - יש לחזור על פעולה זו אחרי כל רצועה.
    3. דגירה קרום (ים) לתקופות ממושכות יותר הקרינה נשארת. לסרוק מחדש את הקרום אחרי כל רצועה כדי לוודא שאין אות משני שנותרה.
      הערה: ממברנה (ים) צריך רק להיות חשוף וreprobed מרבי של 3 פעמים על מנת להבטיח כי שלמות הקרום לא נפגעה כתוצאה מכך גבוה רקע לא רצוי לאותת יחס.

Representative Results

כרגישות QFWB והטווח ליניארי של גילוי גדול מזיהוי ECL קונבנציונלי, יש מספר אמצעי בקרה כי הם קריטיים כדי להבטיח שנתונים מדויקים שנאספו, ובכך מסייע לפרשנות יעילה. ראשית, הכללתו של דגימות בקרה חיוביות כפי שמוצגת באיור 1. שנית, אופטימיזציה של העברה כדי להבטיח תנועה שווה ערך של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים ונמוכים מן הג'ל על הקרום כהוצגה באיור 2. שלישית, אופטימיזציה של נוגדנים, משנית במיוחד נוגדנים שאופטימיזציה שהוא לעתים קרובות התעלם, אבל יכול לייצר שאינו ספציפי פסים מסוגלים להפריע לפרשנות נכונה של חלבון (ים) של עניין. ראה איור 3. רביעית, זה יכול להיות גם מקרה שכאשר חלבון מופיע בלתי ניתן לגילוי, אך הוא צפוי להיות נוכח, זה יכול להיות גם נושא נוגדנים משני שניתן לתקן על ידי שימוש פשוט הראיס המשניאד במארח מינים שונה. ראה איור 4. חמישית, תיוג חלבון כולל וניתוח הוא שיטה הרבה יותר חזקה וכמותיים בהשוואה לשימוש בחלבון מסורתי בודד (ים) שבאים לידי ביטוי בכל מקום להתייחסות לסטנדרטים פנימיים 3. רב של חלבונים בודדים אלה נמצאו להתבטא באופן דיפרנציאלי במודלים של מחלות ניווניות, כמו גם בין דגימות רקמה שונות והאחידות של ביטוי יכולה לשנות באותה הרקמה 3. לכן, ייצור של ג'ל שליטת טעינה יהיה לאשר את האחידות של עומס מדגם בשילוב עם כולל ניתוח חלבון על ידי השוואה וכימותי עומס החלבון בנתיב אחד בטווחי משקל מולקולרי שונים נמדדו כנגד כל דגימה כדי לציין שגיאה סטנדרטית כפי שהודגם באיור 6 . חשוב לציין, כל טכניקות לפתרון בעיות ובקרות הם רק יעילים כמו הרגישות והעקביות של t הניתוחools מיושם על ידי המפעיל (איור 5). לבסוף טכניקה זו משאילה את עצמו להפשטה ומחדש חיטוט של קרומים עם גמישות רבה יותר מאשר ECL בשל גורמים כוללים אך לא מוגבלים לרגישות מוגברת, רקע מופחת, זיהוי צבע כפול ויציבות הממברנה בתנאי אחסון לטווח ארוך. ראה איור 7.

Discussion

שיקול ותכנון בשל חיוני לפני כל ניסוי וסופו של דבר יכול לקבוע את ההצלחה של הטכניקה המשמשת. ההתקדמות בזיהוי חלבון באמצעות WB יכול להציג שפע של מכשולים פוטנציאליים כאשר מנסה לבחור את הנוגדנים, ששיטות העברה וההדמיה המתאימות לשימוש. למרבה המזל, באמצעות רשימת בדיקה זהירה ואמצעי בקרה מתאים QFWB ניתן להשתמש באופן שיגרתי כדי לקבוע נוכחות חלבון והבדלי ביטוי עדינים יותר ויותר בין דגימות. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לסופגים ניאון כמותיים מערבית, כמו גם כמה אסטרטגיות לפתרון בעיות, כדי למנוע ו / או להתגבר על חלק מהמכשולים נפוצים הרבים הקשורים אליו.

השלבים הקריטיים המועסקים כדי לשמור על רגישות ולקבל באמת מדידות לכימות והשוואה כוללות: 1) מיצוי חלבון חזק מדגימות רקמה; 2) הכנת מדגם; 3) loadin חלבון מדויקז שנקבע על ידי סך הכל ניתוח חלבון; 4) העברה אופטימלית של חלבונים באמצעות I-כתם; 5 הכנה) של נוגדנים ראשוניים ומשניים בחסימת מאגר המכיל 0.1% Tween20, ו -6) להדמיה נכונה וניתוח באמצעות תרמי אינפרא-אדום ותוכנה נלווית.

זיהוי ניאון אינפרא אדום הוא באמת כמותי ומספק רגישות רבה יותר בהשוואה לטכניקות מסורתיות יותר ECL זיהוי 3,11. מערכת זיהוי זה היא רב פנים, ובתור שכזו אינה מוגבלת לQFWB. מערכת זו היא מסוגלת הדמיה של תיוג immunohistological בהספק נמוך המאפשר הדמיה וכימות של חלקי רקמות שלמים 12. זה תחום אחד של פיתוח עתידי פוטנציאלי במונחים של רזולוציה שיכל לראות הדמיה רחוקה אדומה התחרתה לכידת immunofluorescence קונבנציונלי עם מיקרוסקופים קונבנציונליים במונחים של הערכה כמותית.

עם זאת, עם רגישות רבה יותר לשינויים עדינים בעמ 'rotein ביטוי הוא חיוני כדי להבטיח שונות נשמר לאמצעים מינימליים ושליטה הם מחמירים עם פרוטוקולים חזקים. זה מתחיל בהפקת חלבון מחמירה מדגימת הרקמה ואחריו ייצור כולל ג'לי חלבון מוכתם לספק ביטחון כי טעינת מדגם אחידה, אופטימיזציה של נוגדנים ראשוניים ומשניים, על מנת לקבוע אם זיהוי הוא אמיתי ובדיקת ההנחיות של היצרן בכל קשור להעברה פעמים כדי לקבל העברת חלבון יעילה.

עם זאת, גם כאשר תנאים לWB מותאמים, ייתכן שעדיין בעיות הקשורות לניהול מערבונים שאולי לא נחקרו במלואו כאן. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים לגורמים, כולל solubilization חלבון ובחירה של חיץ חילוץ. מאגרים מסוימים יכולים להפריע למבחני ריכוז חלבון, וכמה רקמות קשות במיוחד לsolubilize, הדורש טכניקות חזקות יותר כגון השימוש בmacera האוטומטיטינג אטום מכולות כגון צינורות יחד M עם Dissociator מקינטוש. בנוסף, אמצעי בקרה פשוט לאחסון של חומר שחולץ ולא חולץ ב -80 מעלות צלזיוס יכול להיות ההבדל בין קבלת תיוג אופטימלי מייד לאחר חילוץ ויש להם שבועות תוצאות עניים מאוחר יותר.

שיטות QFWB מודרניות הוכיחו להיות רגיש יותר ללכידת הבדלים דקים בביטוי חלבונים ויותר תכליתיים המאפשרות תיוג כפול בו זמנית 3 בהשוואה לטכניקות ישנות יותר כגון ECL. זה חיוני כי פרוטוקולים מערביים סופג הם חזקים וקלות שחזור לכימות מדויק וניתוח סטטיסטי. פרוטוקול זה הוא רגיש וחזק מספיק כדי לשמש באופן שגרתי לגילוי של חלבונים על פני מגוון רחב של דגימות רקמה שונות ומינים 3 ומאפשר כימות של חלבוני שפע נמוכים וגבוהים בתוך אותו QFWB לכן הפחתת שימוש מתכלה כמו גם זמן לניסוי 1. 1 בנוסף, הרגישות המוגברת של טכניקה זו מאפשרת אימות של יותר ויותר פופולרי - מחקרי omic 9,14 עם זאת דיוק הוא קריטי והכללת אמצעי בקרה המתאימה יש לדבוק בהימנעות רכישת נתונים שגויה כך.

Acknowledgments

אנו מודים לכל הבאים לתמיכה כספית: BBSRC המכון אסטרטגי תכנית מימון - CF וTMW; מימון BBSRC מזרח Bio DTP - LG; אמון דרווין של אדינבורו - MLH. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר בארי McColl רשות כוללת אופטימיזציה TREM2 בכתב היד הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA Buffer Fisher Scientific UK Ltd 10230544
M Tubes Miltenyi Biotec Inc. 130-093-236
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular Life Technologies, UK IB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) Life Technologies, UK LC5602 Use in gel 1 for Western blotting
SeeBlue Pre-stained protein standard Life Technologies, UK LC5625  Use in gel 2 Total protein stained gel
NuPAge LDS Sample buffer 4x Life Technologies, UK NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x) Life Technologies, UK NP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well Life Technologies, UK NP0322BOX
Phosphate buffered saline tablet Sigma-Aldrich, UK P4417-100TAB
Micro BCA, Protein Assay Kit Fisher Scientific UK Ltd 10249133
Odyssey blocking buffer Li-Cor Biosciences P/N 927-40000
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-68071
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg  Li-Cor Biosciences 926-68072
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-32211
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-32214
ODYSSEY CL Infra-red imager Li-Cor Biosciences Call for quotation
iBlot 7-Minute Blotting System Life technologies, UK This model is no longer in production
InstantBlue Protein stain Expedeon, UK ISB1L
Revitablot western blot stripping buffer  Rockland Immunochemicals Inc. MB-085-0050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
  2. Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
  3. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).
  5. Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
  6. Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
  7. Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
  8. Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
  9. Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95 (2013).
  10. Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.
  11. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  12. Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
  13. Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
  14. Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
  15. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).

Tags

פרוטוקולים בסיסיים גיליון 93 מערבי סופג LI-COR חלבון ניתוח כמותי שליטת ניאון טעינה
מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eaton, S. L., Hurtado, M. L.,… More

Eaton, S. L., Hurtado, M. L., Oldknow, K. J., Graham, L. C., Marchant, T. W., Gillingwater, T. H., Farquharson, C., Wishart, T. M. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. J. Vis. Exp. (93), e52099, doi:10.3791/52099 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter