En guide till Modern Kvantitativ Fluorescerande Western blotting med Felsökning Strategier

Abstract

Det sena 1970-talet såg den första offentligt rapporterade användning av Western-blot, en teknik för att undersöka förekomsten och relativ förekomst av specifika proteiner i komplexa biologiska prover. Sedan dess har western blotting metoden blivit ett vanligt inslag i den molekylärbiologer experimentell repertoar. En snabb sökning på PubMed använda termen "western blot" antyder att över 220.000 publicerade manuskript har utnyttjat denna teknik fram till år 2014. Det är viktigt att ha de senaste tio åren sett tekniska avbildnings framsteg i kombination med utvecklingen av känsliga fluorescerande markörer som har förbättrad känslighet och gav ännu större sortiment av linjära upptäckt. Resultatet är en nu verkligen Kvantifierbart Fluorescens baserade Western Blot (QFWB) som låter biologer att utföra jämförande expressionsanalys med större känslighet och precision än någonsin tidigare. Många "optimerade" western blottingmetoder finns och utnyttjas i olika laboratorier. Dessa visar ofta svåra att genomföra på grund av kravet på subtila men odokumenterade ändringar i förfarandet. Detta protokoll ger en omfattande beskrivning av en etablerad och robust QFWB metod, komplett med felsökningsstrategier.

Introduction

Western blotting (WB) är en analytisk teknik som ursprungligen utvecklades i slutet av 1970 för att bestämma närvaron eller frånvaron av ett protein av intresse i ett komplext biologiskt prov, såsom ett vävnadshomogenat ^1. Vanligtvis kallas protein immunoblot, på grund av att nyckeln antikropp-antigen-interaktion, vilken metod består av fem distinkta steg: 1) elektroforetisk separation av proteiner genom deras isoelektriska punkt; 2) överföring till ett nitrocellulosa eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran; 3) märkning med hjälp av en primär antikropp specifik för proteinet av intresse; 4) inkubering med en sekundär antikropp som är riktad mot den primära antikroppen; och 5) visualisering.

Visualisering metodik har utvecklats med tiden för att förbättra säkerheten och känslighet. Några av de första WBS utfördes med användning av radiomärkta etiketter, som kommit till kolorimetriska och sedan de mer allmänt används chemilluminescent (ECL) metoder. Radioactivity var direkt märkt på prober för specifika antigener medan kolorimetriska och ECL metoder använder en indirekt märkningsteknik med en enzymreporter såsom alkaliskt fosfatas eller streptavidin pepparrot (HRP) ^2. Intensiteten av märkning av den kromagen eller luminiscerande produkt mäts med användning av densitometri varigenom den signalstyrka, stark eller svag, visar mer eller mindre av närvaron av proteinet av intresse i provet. ECL är känsligare och därför gynnade metod ^2, men alla 3 metoder ursprungligen utvecklades på röntgenfilm med mer avancerade digitala avbildningstekniker senare etablerade ^3. Befordran av digital bildbehandling av WB inte bara tillåts en forskare för att bestämma närvaron eller frånvaron av deras protein av intresse, utan också tillät en slutledning till nivån av uttryck av ett utvalt protein i jämförelse mot andra prover och kan därför hänvisas till som "semi-kvantitativ & #8221 ;. Nyligen har en verkligt kvantitativ och känsligare western blotting-teknik utvecklats varigenom nivån av fluorescens mätt är direkt relaterad till mängden och uttryck av ett enda protein i ett prov: kvantitativ fluorescerande western blotting (QFWB).

När man jämför QFWB med ECL-märkning, användningen av en fluorescerande sekundär antikropp genererar en linjär profil detekterings ^4. Detta står i kontrast till ECL-tekniker där signal linearitet förekommer oftast med låg proteinbelastningar under 5 mikrogram och signalmättnad direkt relaterade till proteinuttryck, det vill säga, med överallt uttryckta hushållningsgener ^5,6. Denna skillnad beror sannolikt av ett större antal bindningsställen för en avidin ECL substrat för att binda till en biotinylerad sekundär, vilket resulterar i en högre risk för potentiell signal mättnad. Detta är en av de främsta orsakerna till ECL base immunoblottning hänvisas till som only "semi-kvantitativ" ^7. Mättnadspunkten för signalen är av kritisk betydelse vid mätning av subtila skillnader i expressionsnivåer och kan leda till felaktiga mätningar. Under senare år har tillkomsten av utbredda proteomik tekniker detailing allt större känslighet och identifiering av subtila uttrycksskillnader har lett till ett allt större beroende av verkligt kvantitativ western blotting för valideringsexperiment ^8,9. Tillämpningen av känslig, robust och verkligen kvantitativ metodik är därför avgörande.

Många "optimerade" Western blotting metoder har använts av oberoende laboratorier, som ofta visar sig vara svårt att upprätta eller replikera på grund av subtila metodologiska justeringar som kanske inte är uppenbara i formella dokumenterade protokoll. Detta är en etablerad och robust protokoll för QFWB och dessutom ger värdefulla strategier för felsökning av vanliga tha problemt kan uppstå under genomförandet.

Detta protokoll ursprungligen optimerad för användning med murina hjärnhomogenater, men har sedan dess använts effektivt över ett brett spektrum av vävnadsprover och arter ^4,9,10. Potentiella protokollvariationer som krävs för specifika felsökningsfrågor ingår.

Protocol

Detta protokoll har optimerats med hjälp av kommersiellt producerade buffertar, geler och överföringstackar för att minska variationen och förbättra konsistens. Se Materiallista för en fullständig lista över förbruknings krävs.

Fluorescerande WB protokoll använder I-Blot snabb överföring och LI-COR Odyssey avbildningssystem

1. Framställning av prov

1. Buffert val / preparatet
   1. Välj en lämplig extraktionsbuffert för prov homogenisering och se till att bufferten är kompatibel med alla nedströms teknik som ska användas. Bered en extraktionsbuffert: RIPA-buffert (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS) innehållande 5% proteasinhibitorcocktail före prov isolering.
      OBS: Det finns många olika typer av extraktionsmetoder buffertar tillgängliga och är valda i beroende av placeringen av proteinet av intresse i cellen. Dessa innefattar men är intebegränsad till RIPA buffert (hel cell, mitokondrie och nukleära komponenter), NP-40 lyseringsbuffert (hel cell eller membranbundna) och Tris-Triton (cytoplasmatisk skelett bundet). Dock kan vissa kemiska rengöringsmedel inom utvinningsbuffertar bidra till att lösa eller ens stänga ett protein, men kan störa proteinbestämning vid användning av ett specifikt protein bestämningsanalys, dvs bicinkoninsyra (BCA) analys. Kontrollera tillverkarens riktlinjer för kemisk kompatibilitet med analysen.
2. Proteinextraktion / solubilisering
   1. Blöta upp vävnadsprovet manuellt med användning av sax och / eller skalpell, följt av homogenisering med användning av antingen en Dounce eller en handhållen elektrisk sator med en polypropen spetsen i den förberedda extraktionsbuffert vid ungefär 01:10 vikt / volym (vävnadsvikt / buffertvolym) tills en smidig / konsekvent homogenisatet produceras.
      OBS: För mindre värdefulla / svårt att få prover, tvättmedel baserade extraktioner can fortfarande vara effektiva ned till 1: 5.
   2. Publicera en homogenisering, Centrifugera proverna vid 20.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten innehållande de solubiliserade proteinerna och förvara vid -80 ° C tills de behövdes. Behåll olösliga pellets för att möjliggöra ytterligare strängare utvinning vid behov senare. Gå vidare till proteinbestämning steg 1.3.
3. Proteinbestämning
   1. Bestämma koncentrationen av protein i varje extraherat prov genom användning av antingen en BCA, Bradford eller liknande analys. Vid beräkning av standardkurvan, se till att förklaringsgraden förhållande, R-kvadrat värde är större än eller lika med 0,99, som speglar den mest noggrann bestämning av protein överflöd i proverna ^15.
      OBS: Alla prover jämförs med QFWB måste analyseras mot samma standardkurvan.
4. Beredning av provet
   1. Planera och spela in laddningsordning stegar och prover för 2 identiska gels: gel 1 för överföring och gel 2 som laststyrning. Fyll på kontrollen och "behandlade" prover i följd för att undvika partiskhet som skulle kunna uppstå med dålig eller entydiga överföring.
   2. Beräkna proteinvolymen som krävs för varje prov. En vanlig proteinladdning för att upptäcka proteiner i neuronala isolat är 15 mikrogram. Gör varje prov upp till 10 l volym med dH ₂ O. Lägg 5 ul av laddningsbuffert, vortexa och värm vid 98 ° C under 2 min.
   3. Inkludera en positiv kontrollprov, såsom ett rekombinant protein för att hjälpa till med identifieringen av rätt band av intresse. Men förbereda positiva kontrollprovet korrekt enligt tillverkarens riktlinjer för att undvika val av fel band. Se Figur 1.

Figur 1. Positive kontroll val. Tillsatsen av positiva kontroller till ett experiment bekräftar märkningen detekterats är verklig. Dock måste försiktighet vidtas för att säkerställa din kontroll fungerar korrekt innan du använder experimentella prover. A) Fusionsprotein TREM 2 laddades på tillverkarens riktlinjer från 1 mikrogram / ​​ml, men märkning observerades vid 110 konflikter med databladet kDa förutsagda molekyl vikt av B 60-70 kDa.) Efter tillsats och inkubation med det reducerande medlet, var fusionsproteinet märkning detekteras vid den förutsagda molekylvikten. Emellertid innebar detta en högre proteinbelastning krävdes eftersom reduktionsprocessen minskade signalen av proteinet.

2. Elektro Separation av proteiner

1. Beredning av 4-12% Bis / tris gel (1,0 mm)
   Anmärkning gradientgeler används för att producera större proteinseparation över ett brett molekylviktsintervall.
   1. Välj och förbereda MESeller MOPS kömingsbuffert (1 L per tank) genom att späda med dH ₂ O. MES-buffert ger bättre upplösning av proteiner inom 3,5 till 160 kDa, medan Moppar löpbuffert är föredraget att detektera högmolekylära proteiner ovanför 200 kDa emellertid kommer att ha sämre upplösning av lågmolekylära proteiner nedan 15 kDa.
   2. Avlägsna kam och tejpremsa som täcker foten av gelén. Tvätta försiktigt brunnarna med rinnande buffert med hjälp av en 1 ml pipett. Fyll brunnarna med rinnande buffert och garantera att inga bubblor kvar i gelén.
2. Gelpreparat och lastning
   1. Sätt i geler till tanken och fylla bland gelkammaren med rinnande buffert för att säkerställa att alla tätningar fungerar effektivt.
   2. Lägg 3 pl av molekylviktsstandard i den första brunnen i gel 1 och gelén 2. Ladda 10 | il av varje prov in i efterföljande brunnar.
      OBSERVERA: Med undantag av stegarna, måste gel 1 & gel 2 vara identiska. Det är absolut nödvändigt thpå förhand färgade molekylvikt standard som används för gel 2 är blå och syns när man använder en total protein fläck för att synas i 700 kanal för Odyssey kameran.
   3. När båda geler är laddade, fylla tanken med den återstående löpande buffert och säkra locket.
3. Elektrofores
   1. "Kör" gelén vid 80 V under 4 min för att säkerställa att provet kommer in i polyakrylamidgel matrisen på ett enhetligt sätt. Därefter öka spänningen och tiden till 180 V under 50 minuter respektive eller tills provet färgämnet kan ses vid foten av gelen.
      OBS: Högre spänningar kan tillämpas för att åstadkomma kortare körtider. Detta kan dock leda till "smiley" geler där de mellersta prover av gelerna kör snabbare än de yttre lane prover orsakade av en temperaturökning ^14.

3. Total Protein Stain av Läser kontroll Gel

1. Release gel 2 från kassetten med hjälp aven gel kniv. Avlägsna de brunnar och foten av gelén. Markera gelen för att underlätta orienteringen.
2. Häll cirka 30 ml av den protein fläck i en fyrkantig petriskål (ungefärlig storlek 12 x 12 cm). Placera gelén 2 i proteinet fläck, vilket säkerställer att lösningen täcker hela gelén, då agitera gelén för en hr minimum vid rumstemperatur för att ge fläckar.
3. Häll av protein fläcken och tvätta gel 3x i destillerat vatten före visualisering. Gå vidare till steg 6,3 för att visualisera.

4. I-Blot Semi Dry Snabb Proteinöverföring

NOTERA: Alla reagens som behövs för proteinöverföring med användning av I-Blot-maskin är kommersiella produkter som är särskilt utformade för den I-Blot metodik och kan hittas i den lista över material.

1. Förbered "botten" transfer stack. Ta bort folie och pre-vått med rinnande buffert direkt från gelen tanken. Pre-vått filterpapper med destillerat vatten.
2. Upprepa steg 3,1 och plats gel 1 påden förberedda "botten" transfer stack.
3. Lay pre-vått filterpapper över gelén. Rulla filterpapper och gel för att inga bubblor är fångade mellan skikten.
4. Ta bort folielocket uppifrån överföra stapeln och lägga den övre stapeln på toppen av filterpapper och bottenbunten. Rulla överförings stack "sandwich" för att eliminera eventuella luftbubblor.
5. Sätt svampen från överförings stacken satsen på locket på I-Blot maskin. Placera överföringsstacken smörgås på särskild plats på I-Blot maskin stäng sedan locket ordentligt. Starta I-Blot och överför under 8,5 min på program 3.
6. Om det finns en låg proteinsignal eller ojämna hög: låg molekylvikt proteinförhållanden, testa tillverkarens överföringstider vid användning av en semi torr "snabb" överföringsmetod. Kör en enkel optimeringsprotokoll använda urvals upprepningar av samma belastning för att bestämma den ideala överföringsspänningen / tidskombination som visas i figur 2 .

Figur 2. Optimering av överföring med hjälp av I-Blot. A) En enda gel laddad med stege och 15 pg av murina hel hjämhomogenat i tre tandemupprepningar skars i tre delar. En del fördes inte, var man överfördes under 7,5 min (enligt tillverkarens anvisningar) och en för 8,5 minuter. Gelen sektionerna färgades sedan med Instant Blue protein fläck, skanning på en infraröd värmekameran i 680 kanaler och kvantifieras. B) Grafisk representation av kvantifiering värden som visar skillnaden i restproteinhalten i varje gel efter 0, 7,5, och 8,5 min överföring. Observera att en extra minut av överföringstiden ledde till ytterligare protein överföring av cirka 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Antikropp detektion av proteiner

1. Membran förberedelse och blockering
   1. Ta bort överföringen bunten från I-Blot maskin. Ta bort det översta och filterpappersskiktet utsätta gel på botten överföringsstacken.
   2. Skär runt gel med en skalpell och se till att en triangulär snitt för orienteringsändamål representeras på membranet. Efter membran putsning, protein färga gelen för att kontrollera överföringseffektiviteten och / eller kasta.
   3. Snabbt flytta membranet i ett rent 50 ml rör (eller motsvarande kärl) innehållande 5 ml av 1 x PBS och placera på en mekanisk vals (eller orbital plattform) för konstant omrörning.
      OBS: Det är viktigt att membranet inte får torka ut. Under halvtorr överföring membranet blir heta. Vänta 2 min innan du öppnar överförings stacken eftersom detta gör jagt svalna och långsam torktid under stacken dekonstruktion. Användning av en rulle och rör för agitation under tvättar och inkubationer möjliggör betydande minskning av volymerna av lösningar som krävs.
   4. Tvätta membranet 3 x 5 min i 1 x PBS. Kassera 1x PBS och blockera membranet med outspädd blockerande buffert under minst 30 min vid rumstemperatur.
2. Beredning primära antikroppen.
   1. Förbered den primära antikroppen enligt tillverkarens anvisningar i 5 ml blockerande buffert med 0,1% Tween20. Inkubera membranet med den förberedda primär antikropp över natten vid 4 ° C med konstant omrörning.
      OBSERVERA: Blockeringsbuffert är vanligtvis används outspädd, men kan spädas upp till 1: 4 med PBS, om den primära antikroppen har tillräckligt hög specificitet.
   2. Kassera den primära antikroppen och tvätta membranet 6 gånger under 5 minuter vardera med 1 x PBS.
3. Sekundär val & antikroppspreparation
   1. För secondary bara märka bedömning för kontrolländamål, hoppa över steg 5.2.1 och 5.2.2 ovan och gå vidare till steg 5,3 för att fastställa prov specifika sekundära bandmönster. Se figur 3.

Figur 3. Optimering av sekundära antikroppar. A) En jämförelse med flera arter av sekundär endast icke-specifik märkning mot 15 pg av murina (M), Får (O) och Equine (E) nervvävnadshomogen med olika fluorescerande taggade sekundära antikroppar . L är den molekylvikt stege. Får vävnadshomogenatet var det enda provet korsreagera med den sekundära märkning vid användning av åsna anti-get 800 antikropp. B) Det är också viktigt att ta reda på om det icke-specifik märkning uppstår när du använder ett annat vävnadsprov, det vill säga, mus gastrocnemiusmuskeln (15 _6; g belastning). Detta prov kors reagerar med åsna anti-mus 680 sekundär antikropp, men detta inte ske när du använder musen hjämhomogenat.

2. Förbered fluorescerande märkta sekundära antikroppen 680 eller 800 (röd eller grön kanal) efter tillverkare rekommenderade halter i blockerande buffert med 0,1% Tween20. Inkubera membranet i mörker med den förberedda sekundär antikropp under 90 min vid rumstemperatur med konstant omröring.
3. Kassera den sekundära antikroppen och tvätta membranet 6 gånger under 5 minuter per tvätt med 1 x PBS. Gå vidare till steg 6 - visualisering.
   1. Om visualisering av markörer inte fungerar som förväntat, examen stegar med en rad sekundära antikroppar som en lämplig extra steg. Inte alla sekundära antikroppar tillåta visualisering av alla markeringsband i alla kommersiellt tillgängliga stegar.
   2. Om förväntad band syns inte, använda en alternativ sekundär värd, det vill säga, donkey anti kanin kontra get anti kanin representerar en lämplig protokoll modifikation. Se Figur 4. Värdart som används för att ta upp en sekundär antikropp kan ibland orsaka ett problem med visualisering på grund av brist på specificitet för specifika primära antikroppar.

Figur 4. Felsökning sekundär antikroppspecificitet Western blöt av ett intervall av vävnadsprover (15 | ig protein per bana) -. Fett, muskel, lever och ben - inkuberades med ERK primär antikropp och inkuberades med tre olika sekundära antikroppar. Övre panel: WB märkt med LI-COR get-anti-kanin 680 sekundär antikropp producerad svag märkning av fett och ben och ingen signal detekterades i lever och muskelprover. Mellersta panelen: Membrane (från övre panelen) revs och reprObed använder ECL metodik och get anti-kanin HRP kopplat sekundärt. Band är nu synliga i muskel- och leverprover och märkning verkar mer intensiv i fett och skelettprover. Bottenplatta: Membrane (uppifrån och mellersta panel) revs och reprobed använder LI-COR åsna anti-kanin 680 sekundär antikropp som har visat en större affinitet till ERK primära antikroppen. Märkning för muskel och lever syns nu med ökad signalintensitet från både fett och ben prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Visualisering

OBS: Alla bilder förvärvas med hjälp av LI-COR Odyssey Classic kameran och tillhörande Image Pro analysprogram (version 3.1.4).

1. Vänd och logga in på datorn och imager. Öppna bildbehandlingsprogram och skapa en ny fil. Se Figur 5.

Figur 5. Visualisering och kvantifiering av western blot. Skanna en western blot visar murina gastrocnemiusmuskeln (30 ug last) undersöktes med Annexin V primär antikropp (36 kDa) och get-anti-kanin 800 sekundär antikropp. Membranet skannas och visualiseras i 800-kanalen. För att kvantifiera protein (Annexin V), är en rektangulär låda dras runt bandet av intresse från prov 1. Detta sedan kopieras och klistras in under de återstående prov körfält för att säkerställa mätning av samma område. Bakgrund automatiskt stod för cirka formen dras, men detta kan ändras för att se till bakgrunden mätningen exakt definierad. Tabellen nedan visar de kvantifierade mätningar av varje form dras inklusive totala signalen erhålls, bakgrund och signal med bakgrund subtraheras. Denna information kan sedan exporteras till ettkalkylprogram för att beräkna uttryck förhållanden (bestämt med relativa fluorescensintensiteten) och tillåter efterföljande statistiska analyser som ska utföras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Öppna locket på kameran. Häll en liten mängd 1x PBS på glaset i det nedre vänstra hörnet och sedan placera membranet ovanpå PBS. Säkerställa att membranet är fyrkantig med axeln på den avbildare och en 1 cm gap lämnas mellan membranet och den galleraxeln.
   1. Rulla membranet för att garantera att inga bubblor är fångade mellan glaset och membranet.
   2. Räkna antalet fyrkanter membranet upptar på x- och y-axeln. Stäng locket på kameran. Ange antalet rutor membranet upptar på datorprogram.
   3. Välj lämplig kanal för att skanna membran som kommer att bero på den fluorescerande taggenav den sekundära antikroppen, dvs 700 kanal eller 800 kanal när en 680 eller 800 fluorescerande märkta antikroppar har använts respektive. När dubbla märkningen utförs, skanna i båda kanalerna.
      OBS: Optimera enda protein märkning innan man genomför dubbel märkning.
   4. Välj intensitet för att skanna membranet, om en hög förekomst protein använder en lågintensiv scan. Alternativt om den primära antikroppen har dålig affinitet för proteinet av intresse välja en högre intensitet scan, dvs nivå 5. Tryck på start för att starta skanningen. Gå vidare till steg 6,4.
3. Visualisering av laddningskontroll-gel (Figur 6).
   
   Figur 6. Totalt protein märkning och analys. A) Fotografera av en total protein märkt gel innehållande 20 pg av häst livmoderhalscancer ganglierna homogenatet per körfält. B) Gel från panel Askannas i 680-kanalen. C) Diagram kvantifierade mätningar från den totala protein färgade gel som erhållits med hjälp av bildbehandlingsprogram. En rad mätningar bestäms av molekylviktsmarkörer, dvs 30-110 kDa, vidtas för att åstadkomma ett histogram över mätningar för att säkerställa standardfel (SEM) är låg (i de grupperade proverna) indikerar att den totala proteinnivåer i varje prov är enhetliga över gelén. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
   1. Följ steg 6.1 och 6.2.
   2. Häll destillerat vatten på glaset i nedre hörnet av kameran där gallret axeln börjar.
   3. Placera gelén på toppen av vatten och manövrera så banorna är vinkelräta mot antingen x- eller y-axeln i rutnätet. Lämna en 1 cm mellanrum mellan y och x-axeln av nätet och gelen och räkna antalet rutor gelen upptar på nätet axeln. Stängalocket på kameran.
   4. Ange antalet rutor gelen upptar på datorprogram.
   5. Välj 700 kanal för att scanna det totala proteinet färgade gelén.
      OBS: Blå fluorescerar i det 700-kanal.
   6. Ställ in intensiteten till 5 och tryck på start.
4. Kvantifiering av skannad bild
   1. Justera ljusstyrka och kontrast knapparna för att producera den bästa bildkvaliteten. Om det inte tycks vara högt bakgrundsbrus, skanna om membranet vid en lägre intensitet och använda skanningsinställning hög kvalitet.
      OBS: Eventuella ändringar kommer inte att ändra de fluorescerande data som erhållits vid scanning.
   2. Rotera bilder 90 °, 180 ° och 270 ° för att visa i önskad riktning utan ändring av de uppgifter som erhållits. Men när du gör små justeringar av orientering i "fri rotation", med mer än 3 °, kan data som samlats in pixillationen värden blir förvrängda och därmed påverka kvantifieringen resultaten.
   3. Välj en form från former menyn - använd en rektangel i de flesta fall - och rita runt det intressanta bandet (WB) eller hela banan (totalt protein gel) i prov bana 1.
   4. Kopiera och klistra in formen över till prov bana 2 band av intresse eller hela körfältet. Upprepa över varje enskilt band av intresse för varje prov och varje körfält för total protein geler.
   5. Kontrollera att bakgrundsmätning inte införlivar en signal i nästa körfält. Bakgrunden kan dras automatiskt av programmet och omfatta hela kanten runt formen dras eller så kan specificeras för att vara uppe / nere eller till vänster och höger om formen. Alternativt, utse en användardefinierad bakgrundsrutan.
   6. Visa signalen för former tabell för varje form som dras i godtyckliga fluorescerande enheter. Bakgrunden kommer automatiskt att dras från signalen.
   7. Exportera bilden som en TIF-fil för att visa i olika programvaror. Inte exportera bilden och manipulera USIng icke image pro mjukvara eftersom detta kommer att ändra de ursprungliga uppgifterna som förvärvats av kameran genererar falska uppgifter.
   8. Upprepa steg 6.4.3-6.4.7 vid kvantifiering dubbel märkning eller utföra flera mätningar på lastkontroll geler för att skapa och sammanställa uppgifter standardfel.

7. Post Visualisering

1. Håll membran i 1x PBS eller torka ut för långtidslagring för framtida åter sondering och strippning av membran för andra proteiner av intresse.
2. Stripp och åter sondering av membran. Se figur 7.
   
   Figur 7. Membranstripp och reprobing. Representativa exempel på membran efter olika stripp steg skannade med en infraröd bildsystem. A. Den första immundetektering utfördes med CSP primära antikroppen (kanin) och scannas vid 700 kanal. B. Först strippar och reprobing med ROCK2 (kanin) med 800 kanaler. Orange pil indikerar återstående CSP primär antikropp närvarande efter bandet och åter sond. Detta påverkar inte mätningen av ROCK2 som bandet är närvarande vid en högre molekylvikt (vit pil). C. Andra strippning och reprobed med β-Spektrin antikropp (get) och visualiseras i 800-kanalen. D. Tredje stripp och reprobing med α-synuklein antikropp (kanin). E. Fjärde stripp och reprobing med ubiquitin antikropp (mus) med 800 kanaler. Det finns fortfarande kvar signal från den senaste antikropp (α-synuklein. Orange pil). F. Femte stripp och reprobing med CALB2 antikropp (kanin) avbildas i 700 kanaler. Sekundära antikroppar som användes var följande: get-anti-mus-800cw, get anti-kanin 680rd, get anti-kanin 800cw, åsna anti-get 800cw (se Material lista). Lane etiketter: L - stege, 1/260; - prov 1/2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
   1. Placera membran (er) i en fyrkantig petriskål som innehåller ungefär 30 ml av Revitablot stripp buffert och inkuberas mellan 5-20 min vid rumstemperatur med konstant omröring.
   2. Tvätta membranet (ar) 3 gånger i PBS scannas sedan på imager för att säkerställa fullständigt avlägsnande av fluorescens har inträffat - skall detta steg upprepas efter varje remsa.
   3. Inkubera membran (er) under längre perioder om fluorescens kvarstår. Scanna membranet efter varje remsa för att bekräfta att det inte finns kvar någon sekundär signalen.
      NOTERA: Membran (er) bör endast avskalade och reprobed högst tre gånger för att säkerställa att integriteten hos membranet inte har komprometterats vilket resulterar i oönskad hög bakgrund till signalförhållande.

Representative Results

Som QFWB känslighet och det linjära området för upptäckt är större än konventionella ECL upptäckt, finns det ett antal kontrollåtgärder som är avgörande för att säkerställa att korrekt data samlas in, och därmed medhjälp effektiv tolkning. För det första införandet av positiva kontrollprover som visas i figur 1. För det andra, att en optimering av överföring garanterar motsvarande rörelse av hög- och lågmolekylära proteiner från gelén till membranet såsom visats i fig 2. För det tredje, optimering av antikroppar, i synnerhet sekundär antikroppar vars optimering är ofta förbises, men som kan ge ospecifik bandning kan störa korrekt tolkning av protein (er) av intresse. Se figur 3. För det fjärde kan det också vara så att när ett protein verkar omöjlig att upptäcka, men förväntas vara närvarande, kan detta också vara en sekundär antikropp fråga som kan rättas till genom att bara använda en sekundär Raised i en annan art värd. Se Figur 4. För det femte är total protein märkning och analys en mycket mer robust och kvantifierbar metod jämfört med att använda traditionella enda protein (er) som överallt uttrycks för interna referensnormer ^3. Många av dessa enskilda proteiner har visat sig vara differentiellt uttryckta i modeller av neurodegenerativa sjukdomar samt mellan olika vävnadsprover och likformigheten i uttrycket kan förändra inom samma vävnad ^3. Därför kommer produktionen av en laddningskontroll gel bekräfta likformigheten av provlast när den kombineras med en total proteinanalys genom att jämföra och kvantifiera proteinbelastningen i varje spår vid olika molekylvikter intervall uppmätt mot varje prov för att indikera standardfel såsom demonstreras i fig 6 . Viktigt är samtliga av dessa felsökningstekniker och kontroller är bara så effektiv som känslighet och konsekvens av analysen terktyg tillämpas av verksamhetsutövaren (Figur 5). Slutligen denna teknik lämpar sig för strippning och åter sondering av membran med större flexibilitet än ECL grund av faktorer, inklusive men inte begränsat till ökad känslighet, minskad bakgrund, dubbel detektion färg och membranstabilitet under långvariga lagringsförhållanden. Se figur 7.

Discussion

Hänsyn och planering är nödvändig innan något experiment och kan slutligen avgöra framgången för den teknik som används. De framsteg inom proteindetektion med hjälp av WB kan presentera en uppsjö av potentiella stötestenar när man försöker välja lämpliga antikroppar, överföring och visualiseringsmetoder att använda. Lyckligtvis, med hjälp av en noggrann checklista och lämpliga kontrollåtgärder QFWB kan användas rutinmässigt för att bestämma protein närvaro och allt mer subtila uttryck skillnader mellan prover. Detta protokoll ger en heltäckande guide till fluorescerande kvantitativ western blotting liksom några felsöknings strategier för att undvika och / eller övervinna några av de många vanliga fallgropar som är förknippade med den.

De kritiska steg som används för att upprätthålla känslighet och få verkligt kvantifierbara och jämförbara mätningar inkluderar: 1) robusta protein extraktion från vävnadsprov; 2) provberedning; 3) noggrann protein loading bestäms av den totala proteinanalys; 4) optimal överföring av proteiner med hjälp av I-Blot; 5) beredning av primära och sekundära antikroppar i blockerande buffert innehållande 0,1% Tween 20, och 6) korrekt visualisering och analys med hjälp av en infraröd värmekameran och tillhörande programvara.

Infraröd fluorescerande upptäckt är verkligen kvantitativ och ger större känslighet jämfört med mer traditionella ECL detektionstekniker ^3,11. Detta detekteringssystem är mångfacetterad, och som sådan är inte begränsad till QFWB. Detta system är i stånd att avbildning av immunhistologisk märkning vid låg effekt tillåter visualisering och kvantifiering av hela vävnadssektioner ^12. Detta är ett område med potential för framtida utveckling vad gäller upplösning som kan se långt rött avbildning rivaling konventionell immunofluorescens fånga med konventionella mikroskop när det gäller kvantitativ bedömning.

Men med större känslighet för subtila förändringar i protein uttryck är det viktigt att se till variabilitet hålls till ett minimum och kontrollåtgärder är stränga med robusta protokoll. Detta börjar med rigorös proteinextraktion från vävnadsprovet följt av produktionen av den totala protein färgade geler för att ge garantier för att provbelastning är enhetlig, optimering av primära och sekundära antikroppar för att avgöra om upptäckt är verklig och testa tillverkarens riktlinjer vad gäller att överföra gånger för att få effektiv överföring protein.

Men även om förutsättningarna för WB är optimerade, kan det fortfarande problem i samband med rinnande westerns som kanske inte helt har undersökts här. Dessa innefattar men är inte begränsade till faktorer innefattande protein solubilisering och val av extraktionsbuffert. Vissa buffertar kan störa proteinkoncentrationsanalyser och vissa vävnader är särskilt svåra att lösa, som kräver mer robusta metoder såsom användning av automatiserad Macerating förseglade behållare såsom M-rör tillsammans med en Macs dissociator. Dessutom kan enkla kontrollåtgärder för förvaring av extraherat och icke-extraherade materialet vid -80 ° C vara skillnaden mellan att få optimal märkning direkt efter extraktion och som har dåliga resultat veckor senare.

Moderna QFWB metoder har visat sig vara mer känsliga för att fånga subtila skillnader i proteinuttryck och är mer mångsidig tillåter samtidig dubbel märkning ³ jämfört med äldre tekniker såsom ECL. Det är viktigt att västerländska blotting protokoll är robusta och enkelt reproducerbar för exakt kvantifiering och statistisk analys. Detta protokoll är känslig och tillräckligt robust för att användas rutinmässigt för detektion av proteiner inom en mängd olika vävnadsprover och arter ³ och tillåter kvantifiering av låga och höga förekomst proteiner inom samma QFWB vilket minskar förbrukningsanvändning samt tid per experiment ¹. 1 Dessutom ökade känsligheten för denna teknik möjliggör validering av allt populärare - miska studier ^9,14 noggrannhet men är avgörande och införandet av lämpliga kontrollåtgärder måste följas och därmed undvika felaktig datainsamling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA Buffer	Fisher Scientific UK Ltd	10230544
M Tubes	Miltenyi Biotec Inc.	130-093-236
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Life Technologies, UK	IB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)	Life Technologies, UK	LC5602	Use in gel 1 for Western blotting
SeeBlue Pre-stained protein standard	Life Technologies, UK	LC5625	Use in gel 2 Total protein stained gel
NuPAge LDS Sample buffer 4x	Life Technologies, UK	NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x)	Life Technologies, UK	NP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well	Life Technologies, UK	NP0322BOX
Phosphate buffered saline tablet	Sigma-Aldrich, UK	P4417-100TAB
Micro BCA, Protein Assay Kit	Fisher Scientific UK Ltd	10249133
Odyssey blocking buffer	Li-Cor Biosciences	P/N 927-40000
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg	Li-Cor Biosciences	926-68071
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg	Li-Cor Biosciences	926-68072
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg	Li-Cor Biosciences	926-32211
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg	Li-Cor Biosciences	926-32214
ODYSSEY CL Infra-red imager	Li-Cor Biosciences		Call for quotation
iBlot 7-Minute Blotting System	Life technologies, UK		This model is no longer in production
InstantBlue Protein stain	Expedeon, UK	ISB1L
Revitablot western blot stripping buffer	Rockland Immunochemicals Inc.	MB-085-0050