Protocol
Animal bruke protokollene ble godkjent av helsevitenskap Animal Care og bruk komité ved University of Alberta.
1. Utarbeidelse av instrumenter, Dyr og Operativ Setup
- Late dyr til et nytt, rent bur fraværende av all fast føde 24 timer før prosedyren. De kan ha fri tilgang til vann, og flytende diett ad lib til tidspunktet for inngrepet.
- Autoklaver alle instrumenter som kreves for prosedyren. Rent drifts overflate og bedøvende nesekonus med 70% etanol.
- Sett opp brukerflate med operasjonsmikroskop, Anestesiapparat og forsyninger på en måte som er behagelig for drifts kirurg. Albuene av kirurgen bør få lov til å hvile komfortabelt på operasjonsbordet, med hender og armer uhindret av utstyr. Instrumenter, sting, bomullspinner, og en 10 ml sprøyte bør plasseres på et sted som tillater enkel tilgang under prosedyren.
- Sett oppoverhead-varmelamper for å tilveiebringe både varme for dyret i løpet av prosedyren og lys for drifts overflate.
- Fyll en 50 ml konisk rør med 0,9% saltvann, og en 1,5 ml tube med vaselin og sted i nærheten av brukerflate.
MERK: Steriliser alle instrumenter og kirurgiske forsyninger. På grunn av at tarmen er transektert, er fremgangsmåten i seg selv ikke er sterile. Det er ansett som ren-forurenset. Ta forholdsregler for å unngå innføring av eksogene smittekilder.
2. Ileocolic Reseksjon med Anastomose
- Indusere anestesi ved administrering av 4% isofluran med en oksygenstrømningshastighet på 2 l / min via nesekonusen fra isofluran fordamper inntil dyrene respirasjonsfrekvens bremser til omtrent 30-40 åndedrag / min. Påfør moderat press på bakfot av musen å sikre at det ikke smerterespons før start prosedyren. På dette punktet, skru ned til 2% isofluran og oksygenstrømmen til 0,5 l / min. Periodisksjekk smerterespons under prosedyren og justere isofluran flow rate tilsvarende.
- Påfør vaselin på øynene for å hindre uttørking under operasjonen, og immobilisere musen i liggende stilling med lemmer sikret ved hjelp av gjennomsiktig tape.
- Rengjør magen med povodine / jod-løsning, og endre til nye sterile hansker.
- Gjør en 1,5 cm hud snitt i øvre midtlinjen av magen ved hjelp skarp spiss dissekere saks for å eksponere fascia og bukhinnen. Åpne cielle / peritoneal sjikt på en lignende måte gjennom linea alba å eksponere de peritoneale innholdet.
- I motsetning til mennesker, er musen cecum vanligvis finnes i venstre øvre kvadrant av magen. Når identifisert, forsiktig tak cecum med pinsett og levere den gjennom snittet. Bruk fuktede vattpinner til fan ut ca 3 cm av terminal ileum strekker seg fra cecum over en steril kompress drapert på bukhinnen (figur 1A).Sikre den eksponerte tarm holdes fuktig med 0,9% saltvann under hele prosedyren.
- Identifiser ileocøkale arterie avgrening av den store mesenteriske arterie langs kolon (figur 1A) ved hjelp av operasjonsmikroskop. Dissekere ut avaskulære vev ved siden av ileocøkal arterie, omringe og ligate arterien med en 5-0 silkeslips. Deretter finner den regionale blodtilførselen til terminal ileum og velger en tranpunkt 1,5-2 cm proksimalt for ileocøkal veikryss. Ligate grenene til denne delen av ileum som ovenfor. Fordel arteriene med micro dissekere saks.
- Del iskemiske partier av ileum og kolon sikre det er tilstrekkelig blodtilførsel til de transektert ender (figur 1B). Det er ofte nyttig å spatulate ileum ved å dele den i en 30 graders vinkel for å øke diameteren av hulrommet slik at det mer tett opp til den tykktarmen. Når ileocøkal delen av tarmen er fjernet, må du justeretransektert ender av ileum og kolon på gasbind, sikre mesenteriske grenser hver er på linje.
- Konstruer anastomosen ved tilnærmes transektert slutten av ileum til transektert slutten av tykktarmen ved hjelp avbrutt 8-0 polypropylen sting (figur 1C). Den første masken er plassert på mesenteriske grensen, med påfølgende sting plassert hver 0,5 mm til Ileocolic anastomose er vanntett. Når passerer sutur nålen gjennom ileum og kolon, sikre at klippekanten ikke kastes, og nål biter er 0,5 mm fra kuttet kantene av tarmen. En typisk anastomose vil kreve 14 til 16 avbrutte suturer. Teste integriteten og åpenheten til det anastomose ved gjennomføring ved å rulle en bomullspinne proksimale å distalt over ileum å tvinge innholdet gjennom anastomose. Små tarminnholdet bør fritt passere inn i tykktarmen uten anastomotic lekkasje.
- Skyll eksponert tarmen med 3-4 ml 0,9% saltvann fra 10 ml sprøytefor å vaske bort avføring fra overflaten av tarmen, og levere tarm tilbake inn i bukhulen. Ved hjelp av 2 ml av 0,9% saltvann spyle bukhulen, og deretter renne denne væsken ved å påføre forsiktig trykk til bukveggen sideveis.
- Lukk snittet med en 3-0 silke kjører sutur, og avbryte flyten av isofluran. Administrer 0,1 mg / kg av det langtidsvirkende opiat -buprenorphine- subkutant for postoperativ smerte kontroll.
- Observer dyrene under varmelampe til de er mobile og deretter overføre dem til en kontinuerlig varmet buret.
3. Postoperativ omsorg og oppfølging
- Monitor dyr i et bur for kontinuerlig oppvarmet tegn til stress for resten av dagen. Overfør dyr tilbake til anlegget for dyrehold i en ny steril bur med tilgang til flytende diett og vann ad lib. Dyr kan være plassert i grupper på 3-4.
- Utfør en sjekk på postoperative dyr påfølgende morgen,sikre dyrene vises ikke i nød. Bare mate flytende diett. Hvis de vises ubehagelig (dvs. krum holdning eller minimal aktivitet) administrere en ekstra dose av underhudsfett buprenorfin. Sjekk på dyrene en gang til i ettermiddag på postoperativ dag 1.
- Om morgenen den postoperative dag 2 dyrene skal vises fullt restituert. Bevis på matinntak og stooling er positive tegn til oppgang. Nå gjenoppta en solid chow diett for dyrene.
MERK: Tegn på distress inkluderer krum holdning, dårlig stell, og minimal aktivitet. Hvis tegn på stress er fremtredende dyrene skal avlives. - Avlive dyrene ved å indusere dyp anestesi med isofluran 4% ved en O to strømningshastighet på 2 l / min inntil dyr responderer ikke på trykkfoten. Utfør halsdislokasjon, og observere etter tegn på riktig euthanization.
- Retningslinjene varierer, så referere til institusjonene anbefalinger om indikasjonerfor og hensiktsmessige metoder for euthanization hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dødelighet og vektendring post-op.
Dødelighet følgende ICR i 129S1 villtype mus er generelt ~ 5%. Den vanligste årsaken til moral er tarmobstruksjon ved anastomosen. Andre årsaker til dødelighet inkluderer anastomotisk lekkasje og intern brokk som fører til forstoppelse.
Vekttap kan bli sett opp til 14 dager etter operasjonen, men er vanligvis ikke-signifikant. Mus har en tendens til å fullstendig gjenvinne preoperativ vekt ved post-operative dag 28 (figur 2).
Overførbarheten av teknikk
En ny graduate student (BM) ble lært opp til å utføre ICR prosedyre for å avgjøre om en operatør uten tidligere kirurgisk trening kan lære teknikken. Trening begynte med å lære å utføre enkle avbrutte suturer analoge til de som brukes i anastomosen bruker 8-0 nylon sutur. Stingene ble utført for å lukke et snitt gjort over en latex glove. Etter BM var i stand til effektivt å plassere sting gjennom hansken uten å rive, observerte de tre komplette prosedyrer før du prøver en. Etter den første prosedyren ble fullført, deretter observerte de en annen prosedyre og forsøkte to til. Av de tre dyrene fullført, de to siste gikk på å overleve og trives. Det første dyret ble avlivet på grunn av komplikasjoner ved anastomosen.
Figur 1. stadier av ileocolic reseksjon og anastomose. (A) ileocøkal regionen i tarmen levert ut av magen. Svarte piler indikerer fartøyene skal ligerte, stiplede linjene indikerer tran poeng for tykktarm og terminal ileum. (B) ileocøkale region fjernet, kuttes endene av tarmen på linje, gjenværende blodtilførselen er demonstrert av sorte piler. (C) Fullført ileocolic anastomosis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Animal vekter ved baseline, postoperativ dag 14 og postoperativ dag 28. Ingen vesentlige endringer i vekter ble observert etter prosedyren som bestemmes av Mann-Whitney U statistisk test. ICR (Ileocolic reseksjon gruppe), kontroll (Non-operative kontroller).
Figur 3. Representant banen sting gjennom intestinal vev. H & E farget histologiske snitt av ileum (til høyre) og tykktarm (til venstre) er stilt opp for å demonstrere banen til sutur neEdle gjennom vev (stiplet linje) starter på punkt (a) gjennom til punkt (b). Knuten bør knyttes ved punkt (c). Merk at mindre slimhinne er inkludert i anastomose enn andre vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murine ICR er en kraftig modell som kan brukes for å studere effektene av kirurgi i tarmsykdommer. Denne artikkelen beskriver en metode for å utføre ICR i mus med en suksessrate på 95% og ingen problemer med mistrivsel som reflekteres av stabile vekter opp til 28 dager etter prosedyren. De mest betydelige utfordringer for vellykket ICR inkluderer å unngå tarm hindringer på anastomosen og anastomotisk lekkasjer.
Tekniske elementer til kirurgi for å forhindre obstruksjon er rettet mot å maksimere lumendiameter på anastomose. Spatulation av ileum ved transeksjon punktet øker diameteren lumen ved å dividere tarmen i en 30 graders vinkel som vist i figur 1A. Når man tar biter av tarmvevet med sutur nålen, er det viktig å rulle langs kantene av tarmen og passerer nålen omtrent 0,5 mm fra kuttekanten. For store biter av vev vil begrense lumen. Et alternativ til AVOID luminal innsnevring ved konstruksjon anastomosen er å anvende bruk av et fordøyelig stent som beskrevet av Kiernan et al., 15. Ikke-tekniske aspekter å unngå hindringer inkluderer valg en tilstrekkelig liten sutur fire og unngå store luminale innholdet ved å mate dyrene en flytende diett én dag før operasjonen og 2 dager etter operasjonen.
Den nest vanligste årsaken til postoperativ mortalitet er anastomotic lekkasje. Unngå denne komplikasjonen krever streng overholdelse av prinsippene for intestinal anastomose. Den første er adekvat blodtilførsel. Etter fartøyene som leverer blod til regionen av tarmen blir resected har blitt ligert, bør tarmen undersøkes visuelt før tran. Den iskemisk del av tarmen vil vises mørke; dette bør fjernes helt forlate sunn kanter. Det er viktig å visualisere en liten mengde av blødning fra de skårne kanter av den gjenværende tarmen. En vanntett anastomosis er også viktig å unngå søl av luminale innholdet fører til sepsis. Dette oppnås ved å unngå store gap mellom suturer, og å sikre at alle lag av tarmen er inkludert i sømmen (figur 3). Viklet styrke er sterkt redusert i de to første postoperative dager, og dermed korrekt plasserte suturer er avgjørende for å tilveiebringe styrke 16,17. En potensiell fallgruve er utilsiktet bare inkludert på mukosa som mukosa kan rynke seg ut av hulrommet i tykktarmen transektert. Dette kan unngås ved å visualisere klippekanten av serosa og forsiktig reduksjon prolaps mukosa tilbake inn i hulrommet med pinsett.
Sham kirurgiske kontroller bør vurderes i den eksperimentelle studiedesign ved hjelp av ICR modell for å kontrollere for mulige konfunderende effekter av kirurgisk stress, tarm manipulasjon, og / eller tap av ileocecal ventil. Valget av narrefremgangsmåten vil avhenge av den primære spørsmål blir stilt istudien. For eksempel, dersom forskningen målet er å evaluere verts respons etter å ha mistet ileocecal ventil, så det ville være klokt å inkludere en humbug kirurgi gruppe hvor en intestinal anastomose utføres samtidig la ileocecal ventilen på plass. Dette blir vanligvis gjort ved å transecting tynntarmen uten reseksjon deretter utføre en liten tarm-anastomose på samme måte som den ileocolic anastomose 7,11. Dette ville tillate etterforskere å kommentere spesifikt på effekter av ileocøkal ventil tap ved å kontrollere for effekten av tarm anastomose. Alternativt, hvis målet er bare å studere effekter av tarm reseksjon og anastomose uten kommenterer spesifikt på tap av ileocecal ventil, deretter en humbug kirurgi bør inneholde en laparotomi, og tarmen bør behandles som det skulle for ICR, men uten tran og anastomose. Dette vil kontrollere for kirurgisk stress og tarm manipulasjon. De teknikker som er beskrevet iprotokollen ovenfor kan enkelt tilpasses for å utføre humbug prosedyrer.
Denne protokollen beskriver en ileocolic reseksjon, som fjerner 1,5-2 cm av terminal ileum og helheten av cecum, og etterligner en operasjon ofte utført hos pasienter med ileocolic Crohns sykdom. Lignende fremgangsmåter er blitt anvendt i det IL-10 - / - kolitt-modell, hvoretter musene utviklet spontan inflammasjon og fibrose i tynntarmen som er analog med Crohns sykdom tilbakefall 7,11. Prinsippene i denne prosedyren kan også gjelde for andre modeller av sykdom. Ved å fjerne 50% av tynntarmen med ileocolic anastomose, musemodeller har blitt brukt til å undersøke den adaptive tarmvekstrespons i kort tarmsyndrom 4-6. I fremtiden kan dette også bli en nyttig modell for å studere de systemiske og lokale effekter av kirurgi i tykk- og endetarmskreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
