Summary
Изучение ранних событий предраковых прогрессии клеток и врожденной взаимодействия иммунных клеток имеет решающее значение для понимания и лечения рака. Здесь мы опишем метод условно вызвать эпителиальные преобразования клеток и последующее живого изображения врожденной взаимодействия иммунных клеток с HRAS G12V выражения клетки кожи в данио личинок.
Introduction
Разрастание в предраковых потомства клеток в противном случае нормального эпителиального слоя сильно зависит от взаимодействия с ее микросреды. Взаимодействие с принимающей ткани, вероятно, будет основным фактором, определяющим предраковый клетка способна создать клонов нишу для дальнейшего развития в полномасштабную рака. Несмотря на важность в развитии, это начальная фаза прогрессирования рака недоступен в наиболее часто используемых модельных систем, в естественных условиях.
Данио, Danio rerio, является хорошо известной моделью организм для живых визуальных исследований из-за своей прозрачности через весь процесс разработки, возможность для генетической манипуляции, и доступности для водорастворимых препаратов. Последние исследования с использованием личинок данио модель, с гиперэкспрессией человека онкоген HRAS G12V превратить эпителиальные клетки, показал, что клетка-хозяин получены сигналы, в частности H 2 O 2 привести кнабор врожденных иммунных клеток. Интересно, что набранные иммунные клетки, нейтрофилы и макрофаги, как было показано, имеют трофический роль в поддержании пролиферации клеток предраковый 2,3.
Для того чтобы понять ранние события инициации и прогрессировании опухоли, а также вклад воспалительной реакции, нужно, чтобы иметь возможность изображения эти события из раннего момента времени года. Поэтому необходимо контролировать клеточные преобразования во временной и ткани специфическим образом. Мы используем / UAS системы Gal4, который был успешно адаптирован на Drosophila 4 условно выразить человеческую онкоген HRAS G12V под контролем кожи промотор кератина 4 (krt4) 5. Модифицированная версия активатора транскрипции Gal4, а именно KalTA4 6, позволяет выражение HRAS G12V под контролем Upstream Активация последовательности (UAS). Условно индуцируют экспрессию активатора транскрипции, KalTA4 был слит с мутантным лиганд-связывающим доменом человеческой α-рецепторов эстрогена (ER) T2 7, который специфически связывается 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) 1. При отсутствии 4-ОНТ ER Т2 связан в цитоплазме путем белков теплового шока. По 4-ОНТ связывания белков теплового шока диссоциации, позволяя ядерную транслокацию KalTA4-ER T2 и последующей активации UAS регулируемых интерес ген 8 (рис 1С, б). Так как эта система экспрессии зависит от наличия 4-ОНТ, KalTA4 контролируемой экспрессии интересующего гена обратимо. В отличие от Cre-ER T2 / LOX системы, что приводит к необратимому рекомбинации, индукция активации транскрипции с помощью KalTA4-ER T2 обратимо путем добавления или удаления 4-ОНТ.
Следующий протокол алло WS условное преобразование клеток кожи в данио личинок и последующего контроля за взаимодействия с врожденными иммунными клетками экспрессией флуоресцентного белка. Основные методики, используемые в настоящем протоколе похожи на некоторые часто используемые методов в данио сообщества 9 - 13.
Генерация и комбинаторной использование трансгенных линий вместе с микроинъекции трансгенных конструкций обеспечивает временное подход к преобразованию только отдельные клетки в мозаичном порядке. Проницаемость для кислорода эмбрионального и личиночного кожи рыбок данио вызывает возможность для покадровой исследований живого изображения по микроскопии высокого разрешения от нескольких часов до нескольких дней. Кроме того, его доступность для водорастворимых препаратов позволит будущим механистические исследования и мониторинг биологических событий клеток в естественных условиях, которые могут привести к лучшему пониманию ранних стадий развития рака.
_content "> Этот протокол может быть выполнен с возможностью осуществления экспрессии гена в условной любой интересующей ткани в данио личинок, в мозаичном порядке. Можно также оптимизировать микроскопа настройки для того, чтобы живое изображение более глубокие, чем другие кожи ткани.Protocol
Следующие экспериментальные процедуры проводились в строгом соответствии с Законом 1986 животных (научные процедуры).
1. Получение плазмидной ДНК для микроинъекции
- Очищают плазмиду pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP с коммерческой ДНК плазмиды комплект очистки в соответствии с инструкциями изготовителя и разбавить ДНК плазмиды до конечной концентрации исходного раствора 100 нг / мкл.
- Линеаризуем транспозазу содержащей плазмиды pT3TS / Tol2 14 по BamHI рестрикцией, в соответствии с протоколом производителя. Этот шаг может быть увеличен в течение ночи. Осаждения линеаризованной ДНК с помощью экстракции фенолом / хлороформом, после стандартного протокола.
- В пробирке транскрипции транспозаза мРНК из линеаризованной плазмиды с коммерческой комплект транскрипции для большого количества ограничен РНК в соответствии с инструкциями изготовителя, развести и кратныКонечная концентрация исходного раствора 100 нг / мкл в нуклеазы без воды. Обеспечить качество очищенной РНК с носителем 1-2% ТАЕ (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА) электрофорезом в агарозном геле (80-120 В). Хранить РНК при -80 ° С.
2. Микроинъекция ДНК плазмиды для переходных экспрессии генов
- Подготовка агарозном впрыска пластину для проведения оплодотворенные яйца во время инъекции. Залейте жидкое 3% агарозы в 90 мм чашки Петри. Пусть агарозном остыть до 40-50 ° С и добавляют зажатый-образную форму микроинъекции ТУ-1 в верхней части жидкой агарозы. После затвердевания при комнатной температуре, пусть агарозном остальное при 4 ° С в течение 30 мин перед удалением формы. Магазин микроинъекции формы при 4 ° С и повторного использования.
- Подготовка аликвоты раствора для инъекций. Выполните следующие шаги на льду. Пипетка 1 мкл плазмидной ДНК (конечной концентрации 10 нг / мкл), 2 мкл мРНК транспозазы (конечная концентрация 20 нг / мкл), 2мкл 10 мг / мкл родамина B изотиоцианат-декстрана, 2 мкл раствора 5x Danieau (290 мМ NaCl, 3,5 мМ KCl, 2 мМ MgSO 4, 3 мМ Са (NO 3) 2, 25 мМ HEPES, рН 7,6), чтобы Конечный объем в 10 мкл нуклеазы без воды.
- Подготовка иглы из боросиликатного стекла капилляров диаметром 1 мм, содержащих внутреннюю нить, потянув за капилляр в противоположных направлениях микропипеткой съемника. Используйте следующую программу: жара 530, тянуть 200, скорость 80 и время 150.
- Заполните один иглу с 2 мкл раствора для инъекций (держали на льду). Избегайте пузырей, тщательно снятия наконечника microloader при освобождении раствор в капилляр. Осторожно разбить кончик иглы с пинцетом.
- Регулировать размер капли с пневматическим пико насоса. Измерьте диаметр капель / объем (V = 4/3 πr 3) и отрегулируйте размер капли с окулярного микрометра под стереоскоп в диметилполисилоксана. Мы рекомендуем100 мкм, что соответствует 0,5 нл. Это гарантирует равномерное и воспроизводимые концентрации на каждый введенного эмбриона. Титруйте вводят концентрацию и настроить для каждого построить и плазмиды подготовки.
- Поместите зиготы (рис 1a), полученное от скрещивания ТГ (БАС: EGFP-HRAS G12V) io006 15 с Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 в формы инъекционной пластины путем использования 3 мл pastette. В то же время, сохранить кончик предварительно подготовленной инъекционной иглы в диметилполисилоксан, чтобы избежать решение от высыхания и свертывания.
- Вводите предварительно отмеренных каплю (100 мкм, соответствующей 0,5 NL) под стереоскоп через хориона в бластодиска 17, до первого деления дробления (рис 1А). Инъекции в стадии один-клеток увеличивает потенциал равномерным распределением плазмидной ДНК и РНК в развивающихся клеточной массы, а также возможность для передачи зародышевой линии. ЗдесьПримечательно, что экспрессия конструкций чаще всего, как правило, мозаики.
3. Условная трансформации клеток кожи, 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ)
- Передача инъекционные эмбрионов в раствор 0.3x Danieau и держать их на 28,5 ° С в термостате. Удалить неоплодотворенные яйца из чашки на стадии сферы 17. Совместно вводили родамин В изотиоцианат-декстрана могут быть использованы в качестве литьевого контроля под флуоресцентным стереоскопе.
- Эмбрионы экране в 24 часов после оплодотворения (ч после оплодотворения) для остановки выражения EGFP. Продолжайте поднимать cmlc: EGFP положительных эмбрионов данио до 72 часов после оплодотворения. Тщательно следить за водно-качество (0.3x Danieau).
- Удалить хориона этих эмбрионов, которые не вылупились щипцами при 72 часов после оплодотворения. Тщательно совать хориона с 1 пинцетом и вытащить его на части с помощью друга. Выберите эмбрионы для lysC: выражение DsRed2 с помощью флуоресцентного стереоскоп.
- Добавить 10 мкл 10 мМзапас (Z) -4-гидрокситамоксифен к 20 мл раствора 0.3x Danieau (конечная концентрация 5 мкМ). Используйте 4-OHT индукционной решение для одной стандартной чашке Петри (90 мм) на партию 40-60 эмбрионов.
- Передача эмбрионов в новую чашку Петри, содержащую 20 мл свежеприготовленного раствора индукции. 4-OHT должен храниться и транспортироваться в темноте. Первые признаки экспрессии могут быть обнаружены 2 ч после индукции начало. Индукции шаг может быть продлен на ночь, имея в виду, что начальная клетка-хозяин: предраковых клеток взаимодействия может произойти уже через несколько часов после обработки.
4. Монтаж и Живая съемка данио рерио Личинки
- Подготовка 60 мм чашки Петри, вводя отверстие диаметром 18-20 мм. Используйте высокого вакуума силиконовой смазкой, чтобы покрыть и запечатать отверстие на внешней нижней части чашки Петри с 25 мм покровным стеклом (рис 1б).
- Подготовка 1% низкой температурой плавления (LMP) агарозы. Храните одну 1,5 мл трубкииз LMP агарозы при 37 ° С в нагревательном блоке.
- Предварительный выбор Tg (krt4: KalTA4-ER T2; UAS: EGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) личинки для зеленого флуоресцентного клетки кожи и DsRed2 положительного выражения врожденной иммунной клетки, под флуоресцентным стереоскоп. Обезболить личинок добавлением 1 мл 0,4% Tricaine 18 к индукции раствора 20 мл.
- Передача предварительно выбранного личинок с pastette в жидкой LMP агарозы. Пусть личинки погружаются в LMP агарозы и перенести их на покровного стекла (рис 1б). Ориентировать эмбрионов под стереоскоп. Личинки должны быть размещены непосредственно на стекло, чтобы уменьшить рабочее расстояние (до 6 личинок).
- Обложка агарозы LMP с Tricaine, содержащей индукции решение после того, как затвердеет (рисунок 1b стрелка).
- Image встроенный личинки использованием инвертированного флуоресцентной, лазерного сканирования или вращающийся диск конфокальной микроскопии. Используйте 40X или 63XЦель, как цели с длительным рабочим расстояния позволяют фокусировки по всей личинок.
Representative Results
Зиготы среднее между Tg (БАС: EGFP-HRAS G12V) io006 и ТГ (lysC: DsRed2) nz50Tg были собраны 10-15 мин после оплодотворения (рис 1А), чтобы получить 1 клеток стадии эмбрионов. После инъекции эмбрионы не были подняты до 3 денье, перед индукцией с 4-ОНТ и крепление для живого изображения (рис 1б). 2-6 часов после индукции, установленные эмбрионы помещали либо под инвертированным флуоресцентным микроскопом (2А) или перевернутой конфокальной микроскопии (фиг.2В-С) и отображены в течение 2-3 ч с 1,5-минутными интервалами. Предраковых поверхностные клетки кожи можно определить по их более округлой морфологии по сравнению с нормальными кератиноцитами, а также зеленого флуоресцентного излучения мембраны локализованного EGFP-HRAS G12V. Были выбраны районы изображений для совместной локализации предраковых клеток кожи и врожденных иммунных клеток (2А стрелки). Из-за быстрого МиГРацион процесс нейтрофилов были выбраны интервалы ЗАМЕДЛЕННАЯ быть 1-1,5 мин с Z стека шагом размеров 0.7-1.7 мкм, чтобы получить максимальные прогнозы интенсивности (рис 2, Video 1). Существует широкий спектр видов поведения, которые можно наблюдать в то время как живого изображения: нейтрофилы мигрируют рядом с и под предраковых клеток (рис 2С, видео 1), образуют прямые контакты с клетками (рис 2B и С), удалите остатки предраковых клеток, которые подвергаются апоптоза (Видео 1), или активно поглощают части предраковых клеток (не показано). Чтобы захватить полный спектр взаимодействий, желательно, чтобы следить за их поведением с помощью покадровой живого изображения.
Рисунок 1: Схема условного трансформации клеток кожи в данио личинок. () Изображение зиготы ТГ (БАС: EGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) данио на 10 мин после оплодотворения (ССПМ). Оплодотворенная яйцеклетка окружена хориона (стрелки). Сайт для инъекций бластодиск (звездочка), образован потоками цитоплазматических от желтка (стрелки), который определяет анимальной эмбриона. (Б) Монтаж данио личинок. 60 мм чашки Петри с 18-20 мм отверстие (стрелки), которые герметизируют с помощью 25 мм покровным стеклом. Данио личинки обездвижены и установлен на покровного стекла на 1% LMP агарозы. Решение 0.3x Danieau (стрелка), содержащий 5 мкМ 4-OHT используется для покрытия агарозы LMP. (C) 4-OHT индуцированной трансформации поверхностных клеток кожи. (А) Схема поперечного сечения профиля личинок кожи. Эмбриональных и личиночной кожи состоит из двух слоев эпителиальных клеток, в поверхностном слое клеток и клеток базального слоя кератиноцитов, которые подключены к основной базальной мембраны (БМ). (Б) от переходных Выражение Система тО вызывают предраковых клон клеток, среди поверхностных клеток кожи. KalTA4-ER T2 экспрессируется исключительно во внешнем слое кожи, приводимого в действие krt4 промотора (желтый). Мозаика выражение KalTA4-ER T2 включает UAS контролируется (синий) EGFP-HRAS выражение G12V в поверхностных клеток, что приводит к клона предраковых клеток (зеленые). (Г) Схематическое переходного системе экспрессии. (С) Tol2 кассету pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP вектор экспрессии используется временно (б) Условное индукция экспрессии транскрипционного активатора.. KalTA4 слит с мутантным лиганд-связывающий домен рецептора α человеческого эстрогена (ER T2), которое специфически связывается 4-гидрокситамоксифен (4-OHT). При отсутствии 4-ОНТ ER Т2 связан в цитоплазме путем белков теплового шока (Hsp90). По 4-OHT связывания Hsp90 диссоциирует, позволяя ядерную транслокацию KalTA4-ERT2 и последующей активации UAS контролируемая экспрессия EGFP-HRAS G12V. Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 2: Живая съемка предраковых и врожденной взаимодействия иммунных клеток. (AC) Изображения 4 DPF TG (БАС: EGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) эмбрион, который был введен с pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP и транспозаза мРНК на одном этапе клеток. Изображения были приняты после 6 часов индукции 4-OHT (А) Боковой вид области tailfin на 6 часов после обработки, показывающий участки EGFP-HRAS G12V, экспрессирующие клетки кожи (стрелка), и lysC:. DsRed2 + нейтрофилы (Arrowhead). (BC) Типичные изображения таКен из конфокальной покадровой фильма, показывая нейтрофилов (красный) взаимодействия с EGFP-HRAS G12V, выражающих клеток кожи (зеленый). (B) предраковый клетки образуют короткую filopodial расширение с контактирующей нейтрофилов (стрелки). (C) Нейтрофилы (красный) в тесном контакте с клоном предраковых клеток кожи (зеленый). Бар масштаба в = 100 мкм; B / C = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Видео 1 : Покадровый Живая съемка предраковых и врожденной взаимодействия иммунных клеток. Покадровой 4 DPF TG (БАС: EGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) эмбриона, введенного с pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP и транспозазы мРНК на одном клеточной стадии. Конфокальной покадровой фильм из 6-9 хоУрс после 4-OHT индукции, показывая lysC: DsRed2 + нейтрофилов (красный) Взаимодействие с EGFP-HRAS G12V, выражающих клеток кожи (зеленый). Нейтрофилы мигрируют рядом с и под предраковых клеток и удаления остатки предраковых клеток, которые претерпевает апоптоз. ЗАМЕДЛЕННАЯ интервалы 1,5 мин в 3 ч с Z стека шагом размеров 1,3 мкм.
Discussion
В процессе эмбриогенеза и развитие личинок, эмбриональная данио кожи состоит из двух эпителиальных слоев, поверхностный слой называют перидермы и слой базальных кератиноцитов, которые прикреплены к основной базальной мембраны 19 (фиг 1С,). Протокол, представленные здесь описывает простой метод условно индуцировать трансформацию предраковый-клеток в поверхностном слое кожи данио личинок, и позволяет для последующего анализа взаимодействия с врожденных иммунных клеток живой визуализации. Основные методики в нашем протоколе следовать хорошо апробированных методов рыбок данио 9 - 13, и наш протокол может быть легко адаптирован и изменен.
Krt4 промоутер 5 используется здесь запускает экспрессию T2 KalTA4-ER частности, в наружном слое кожи (рис 1С, б). Тем не менее, модульная MultiSite шлюзклонирования стратегию, используемую для генерации krt4: KalTA4-ER T2 конструкцию (рис 1D,), обеспечивает возможность клонирования любой промотор интереса перед KalTA4-ER T2 в одном шаге клонирования. Адаптация метода, изложенного в настоящем документе, поэтому возможно для большинства тканей во время эмбриогенеза и в личиночной стадии. Наличие промоторных последовательностей является самым ограничивающим фактором. Кроме того, почти любой ген интерес клонированный за UAS можно условно избыточно экспрессируется на разных стадиях развития с использованием выражения пространственной и временной контролируемой KalTA4-ER T2. Таким образом, наш протокол может быть выполнен с возможностью осуществления экспрессии гена в условной любой интересующей ткани в данио личинок, в мозаичном порядке. Можно также оптимизировать микроскоп настройки для того, чтобы жить изображения глубокие ткани, такие как печень или поджелудочная железа.
Мы описали одну заявку, используя протокол онРе, аналогично, можно сверхэкспрессировать другие воспалительные модуляторы, используя этот протокол для изучения регуляции воспалительных реакций, как легко жить нейтрофилов изображения и макрофагов изменения в поведении следующие индукции и ареста в экспрессии кандидата воспалительного модулятора. Кроме того, адаптирован протокол также будет полезным для тех, кто хочет проследить движение клеток и изменение поведения на различных этапах ткани морфогенеза и формирования органов и, наконец, живое изображение взаимодействия врожденных межклеточных взаимодействий иммунных с другими специфическими клеточными линий, которые могут быть направлены индуцируемой KalTA4-ER системы экспрессии T2 / UAS.
Мы использовали вектор pDestTol2CG от рыбок данио Tol2kit 20 - 23, который содержит cmlc2: EGFP-PA кассеты (рис 1D,), которая позволяет последующим отбором эмбрионов зелеными флуоресцентными положительных сердцах как таковойЛекция Маркер 20, что упрощает процесс отбора F0. Стабильная вставка транспозона бокам интересующего гена в геном облегчается при совместной инъекции плазмидной ДНК вместе с транспозазы мРНК. Получение плазмидной ДНК и транспозаза мРНК микроинъекции следующим стандартных протоколов. Тем не менее, успешной интеграции конструкции в геном зависит от Tol2 основе транспозиции 14. Это подчеркивает особое внимание будет уделено работе на льду в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения и ухудшения по РНКаз и ДНКаз. Микроинъекции в эмбрионы одноклеточных этапе является надежным и хорошо разработанный метод усиления и потери функциональных исследований в данио 9,10. Хотя хорошо обученный человек может легко вводить в желток более 1000 эмбрионов в 1 час, введение в бластодиска (рис 1а, звездочка) требует больше опыта и подготовки. Критический во время этой процедуры ях годов обработки иглы. Иглы должен быть очень тонким, чтобы проникнуть в клетку без повреждений и, следовательно, должен быть разбит только на самом ее конце. Важно, чтобы регулярно контролировать и измерять размер капли во время инъекции, чтобы гарантировать равномерное инъекции в каждого эмбриона. Тщательно обработаны, игла может быть использована, чтобы повернуть эмбриона. Это часто необходимо найти бластодиск и оптимальный угол проникновения.
Концентрация ДНК и транспозаза мРНК использовали для инъекций наверняка влияет на эффективность экспрессии. Более высокие дозы могут привести к увеличению доли клеток, экспрессирующих трансген, но с более высокими концентрациями ДНК (> 50 нг / мкл) и транспозаза мРНК (> 100 нг / мкл) также не возникнет потенциал для токсических эффектов среди вводимых эмбрионов. Мы за использование 10 нг / мкл ДНК и 20 нг / мкл мРНК транспозаза для инъекции, что соответствует 50 мкг плазмидной ДНК и 100 мкг РНК на впрыскиваемого набРио. 100% эмбрионов, инъецированных этих концентраций у нормально развиваться, а также между 40-70% показать EGFP-HRAS выражение G12V, после индукции 4-OHT, в зависимости от эффективности инъекции в одной ячейке. Среди положительных эмбрионов мы обычно находим приблизительно 30%, которые имеют 1-10 клонов, 40%, которые имеют 10-50 клонов и 30% Имея более чем 50 клонов. Благодаря нашим научно-исследовательских целей, мы выступаем за использование эмбрионов с меньшим количеством клонов, выражающих EGFP-HRAS G12V. Мы выбираем эмбрионов 10-50 клонов для наших переходных экспериментов. Для получения трансгенных основателя рыбы, мы рекомендуем выбрать только эмбрионов как с EGFP положительной сердечной маркера и большого количества EGFP-HRAS G12V положительных клонов в своих эпидермиса.
(Z) -4-гидрокситамоксифен претерпевает цис-транс (EZ) взаимопревращение при воздействии света 24. Было обнаружено, что цис-изомер (Е) 100x менее анти-эстрогенным, чем его аналог транс 25,26. Exposurе света, поэтому следует избегать. Исходный раствор 4-ОНТ растворяют в этаноле можно хранить при -20 ° С в темноте в течение длительного периода времени. Мы рекомендуем использовать коробку для защиты чашки Петри от света гена-мишени индукции внутри инкубатора и транспорта. Хотя область визуализации очень мал и воздействие 4-ОНТ в УФ-свете сводится к минимуму, постоянного обмена индукции раствора каждые 2 часа, пока изображения в течение длительного периода времени, рекомендуется, чтобы поддерживать максимальные уровни экспрессии. 4-ОНТ эффективно permeabilizes через хориона и наружных слоев кожи во время данио эмбриогенеза, поэтому он может индуцировать экспрессию гена очень быстро. Мы можем легко наблюдать излучение EGFP после 2 часов индукции и сообщалось, что первые признаки экспрессии гена-мишени можно наблюдать через 1 час и плато, после 3 часов лечения 8. Различия могут быть из-за различных промотора, используемого в нашем исследовании. Как уже прeviously сообщил, что 4-OHT лечение зависит от дозы 8,27, мы решили использовать Максимальные концентрации 5 мкМ для достижения надежных и воспроизводимых уровни экспрессии в нашем переходном подхода. Это должно гарантировать, что все клетки, несущие трансген будет индуцировать экспрессию гена-мишени.
Это должно быть принято во внимание, что переходный подход, представленный здесь, может привести к разным уровнем экспрессии в связи с возможностью нескольких случайных событий и вставки генома. Кроме того, использование транспозазы мРНК в Tol2 трансгенных фоне ТГ (БАС: EGFP-HRAS G12V) io006 может привести к потенциальным перестановок трансгена UAS, что может привести к сайленсинга или нарушения. Однако, как метод, представленный здесь, представляет собой переходный подход, предварительный отбор эмбрионов последующих до инъекции является обязательным. Многие лаборатории было обнаружено, что последовательности UAS, как правило, быть подавлен в трансгенных потомков, следовательно, вjecting в pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP построить в TG (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 эмбрионов может быть не так эффективно, как потребители инъекционных UAS конструкции в TG (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) эмбрионов. Использование стабильной трансгенной линии Tg (krt4: KalTA4-ER T2) пересекается с Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 позволит точно контролировать ON / OFF кинетики времени дозировки зависит активации гена 4-OHT ,
Важным шагом при монтаже личинок перевод на агарозы LMP и на покровного стекла (рис 1б). Существует только короткие сроки, для жидкого LMP агарозном температуры, которая позволяет безопасную передачу и ориентацию на предварительно выбранный личинок без ущерба для рыбы, либо теплового шока или затвердевания геля. Личинки должны быть ориентированы непосредственно на покровное стекло, чтобы уменьшить рабочее расстояние для последующего микроскопического анаSiS. Как это может быть ограничивающим фактором при микроскопии выбор соответствующих целей является обязательным. После подключения личинка может поддерживаться от нескольких часов до нескольких дней.
Обусловленность модельной системе, представленной в настоящем документе даёт для повторяющихся преобразований по 4-OHT активации трансгена. Система экспрессии зависит от наличия 4-ОНТ и, следовательно, KalTA4 контролируемой экспрессии интересующего гена обратимо (рис 1D, б). В отличие от Cre-ER T2 / LOX системы, что облегчает необратимый геномной событие рекомбинации 28, KalTA4-ER Т2 / UAS может быть включается и выключается при добавлении или удалении 4-ОНТ и этот потенциал для повторного индукции является преимуществом Техника по Cre-ER T2 системы / LOX. Тем не менее, потребность в постоянном уровне 4-ОНТ является ограничением, если эксперимент должен быть продлен от нескольких дней до недель.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
