Summary
前新生物細胞進行及び先天性免疫細胞相互作用の最も初期の事象を研究することは理解して癌を治療するために極めて重要である。ここでは、条件付きで上皮細胞の変換とHRAS G12Vは 、ゼブラフィッシュの幼虫に皮膚細胞を発現する、自然免疫細胞の相互作用のその後のライブイメージングを誘導する方法を説明します。
Introduction
そうでなければ、正常な上皮シート内新生物発生前の細胞子孫の異常増殖が強く、その微小環境との相互作用に依存します。その宿主組織との相互作用は、前新生物細胞は、さらに本格癌に発展するクローンニッチを確立することができるかどうかの主要な決定因子である可能性が高い。開発におけるその重要性にもかかわらず、癌の進行のこの初期段階では、生体内で 、最も一般的に使用されるモデル系でアクセスできない。
ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、理由の開発を通じてその透明性、水溶性薬物のための遺伝子操作の可能性、およびアクセシビリティのライブイメージング研究のための十分に確立モデル生物である。上皮細胞を形質転換するために過剰発現する、ヒト癌遺伝子HRAS G12Vを幼虫のゼブラフィッシュモデルを用いた最近の研究では、宿主細胞は、特定のH 2 O 2のリードには、信号を導出することを示した先天性免疫細胞の動員。興味深いことに、動員された免疫細胞、好中球およびマクロファージは、前新生物細胞増殖2,3を支える栄養の役割を有することが示された。
腫瘍の開始と進行の初期の事象、ならびに炎症反応の寄与を理解するためには、以降最も早い時点から、これらのイベントの画像にできる必要がある。したがって、時間的および組織特異的な様式で細胞の変換を制御する必要がある。我々は成功して条件付きで皮膚特異的プロモーターケラチン4（krt4）の制御下にヒト癌遺伝子HRAS G12Vを表現するために、ショウジョウバエ 4から適応されたGAL4 / UASシステムを5利用する。転写活性化因子Gal4の修正バージョン、すなわちKalTA4 6は 、上流活性化配列（UASの制御下HRAS G12Vの発現を可能）。条件付き転写活性化因子の発現を誘導するために、KalTA4は特に4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）1に結合するヒトエストロゲン受容体α（ERのT2）7の変異体のリガンド結合ドメインに融合されている。 4-OHTの非存在下でのER T2は、熱ショックタンパク質により細胞質に結合される。 4-OHTの際に関心8の遺伝子を制御するUASのKalTA4-ER T2の核移行およびその後の活性化を可能にするタンパク質は、解離熱ショックを結合（ 図1Cを、b）のこの発現系は、4-OHTの存在に依存するので、関心対象の遺伝子のKalTA4制御された発現は可逆的である。不可逆的組換え事象をもたらすのCre-ER T2 / Lox系とは対照的に、KalTA4-ER T2による転写活性化の誘導は、追加又は4-OHTの除去により可逆的である。
以下のプロトコルアロゼブラフィッシュ幼生における皮膚細胞の条件付き転換と蛍光タンパク質発現による自然免疫細胞との相互作用のその後のモニタリングWS。 13 -このプロトコルで用いられる基本的な方法論は、ゼブラフィッシュコミュニティ9内のいくつかの一般的に使用される技術と類似している。
世代と一緒にトランスジェニックコンストラクトのマイクロインジェクションによるトランスジェニック系統のコンビナトリアル使用は、モザイク的に単一の細胞を形質転換するための過渡的なアプローチを可能にします。胚および幼生ゼブラフィッシュの皮膚の酸素透過性は、数時間から数日から高解像度の顕微鏡によるタイムラプスライブイメージング研究のための可能性を高める。さらに、水溶性薬物へのアクセスは、将来の機構研究と癌発生の初期段階のより良い理解につながる可能性があり、生体内での細胞の生物学的事象のモニタリングが可能になります。
_content ">このプロトコルは、モザイク状に、ゼブラフィッシュの幼生において任意の目的の組織における遺伝子発現の条件を実行するように適合させることができる。一つは、皮膚以外の画像より深い組織を生きるための設定顕微鏡を最適化することができる。Protocol
以下の実験手順は、動物（科学的処置）法1986年に厳密に従って実施された。
マイクロインジェクションのためのプラスミドDNAの調製
- 製造業者の説明書に従って市販のプラスミドDNA精製キットのeGFPおよび100 ngの/μlの最終原液濃度にプラスミドDNAを希釈：cmlc2; KalTA4-ERのT2：プラスミドpTol2-krt4を精製する。
- メーカーのプロトコルに従って、BamHI制限消化によって、プラスミドpT3TS / Tol2の14を含むトランスポザーゼを、線形化。このステップは、一晩に拡張することができる。標準的なプロトコルに従って、フェノール/クロロホルム抽出により線状化DNAを沈殿させる。
- インビトロでは 、メーカーの指示に従ってキャップされた大量のRNAのための商業転写キットと線状プラスミドからトランスポゼースmRNAを転写するように希釈し、アリコートヌクレアーゼフリー水で100 ng /μLでの最終原液濃度。ネイティブ1から2パーセントTAE（40 mMトリス、20 mMの酢酸、1mMのEDTA）アガロースゲル電気泳動（80〜120 V）で精製されたRNAの品質を確保する。 -80℃でRNAを保管してください。
一過性の遺伝子発現のためのプラスミドDNAの2マイクロインジェクション
- 注入中に受精卵を保持するためにアガロース注入プレートを準備します。 90ミリメートルペトリ皿に液3％アガロースを注ぐ。 40〜50℃にアガロースクールをしましょうと、液体アガロースの上にくさび形のマイクロインジェクション金型TU-1を追加します。室温で硬化させた後、金型を削除する前に、30分間、4℃でアガロース残りをしましょう。 4℃、再利用での店舗マイクロインジェクション金型。
- 注射液の一定量を準備します。氷の上で、次の手順を実行します。ピペットプラスミドDNA（最終濃度10ng /μL）、トランスポザーゼmRNAの2μL（最終濃度20 ng /μLで）、2の1μLへの10mgのμL/μlのローダミンBイソチオシアネート-デキストラン、5×Danieau溶液2μL（290のNaCl、3.5のKCl、2mMのMgSO 4を、3のCa（NO 3）2、25 mMのHEPES、pHは7.6）ヌクレアーゼフリー水で10μlの最終容量。
- マイクロピペットプラーと反対方向にキャピラリーを引っ張って内側のフィラメントを含む直径1mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーから針を準備します。次のプログラムを使用してください：530を加熱し、200、速度80、時間150を引っ張る。
- （氷上で維持）注射液の2μlの1針を埋める。キャピラリー内に溶液を放出しながら慎重にmicroloader先端を引き出すことによって、気泡を避けてください。慎重にピンセットで針の先端を破る。
- 空気圧ピコポンプで液滴サイズを調節する。ドロップ直径/容積（V = 4/3πR3）を測定し、ジメチルポリシロキサンでステレオスコープの下接眼マイクロメータを用いて液滴サイズを調整します。お勧め100ミクロン、0.5 NLに対応する。これは、各注入された胚あたりの均一かつ再現可能な濃度を保証します。注入された濃度を滴定し、各構築物およびプラスミド調製のために調整します。
- 3ミリリットルpastetteを使用することにより、射出プレートの型の中にnz50Tg 16（：のeGFP-HRAS G12V UAS）のTg（DsRed2のlysCを）とio006 15 のTgのクロスから得た接合体（ 図1A）を配置します。一方、枯渇及び凝固からソリューションを避けるために、ジメチルポリシロキサンで事前調製された注射針の先端を保つ。
- 事前の最初の切断（ 図1A）の胚盤17内に絨毛膜を通してステレオスコープの下で予め測定された降下（0.5 NLに対応した100μm）を、注入します。 1細胞期への注入は、プラスミドDNAとRNA現像細胞塊および生殖系列伝達の可能性の均一な分布の可能性を増加させる。それはある構築物の発現は、より頻繁にモザイク状になる傾向があることは注目に値する。
4-ヒドロキシ3.条件付皮膚細胞の形質転換（4-OHT）
- 0.3X Danieau溶液中に注入した胚を移し、インキュベーター中で28.5℃で保管してください。球ステージ17で皿から未受精卵を削除します。同時注射ローダミンBイソチオシアネートデキストランを蛍光ステレオスコープの下で注入制御として利用することができる。
- eGFPの心臓の表現のための24 HPF（時間後に受精）の画面の胚。 72 HPFまでEGFP陽性ゼブラフィッシュ胚：cmlcを上げ続けます。慎重に（Danieau 0.3X）の水質を監視する。
- 72 HPFで鉗子で孵化していないものの胚の絨毛膜を除去します。慎重に1鉗子で絨毛膜を突くと、他を使用して、それを引き離す。 のlysCのための胚を選択：蛍光ステレオスコープを使用してDsRed2の式 。
- 10 mMの10μlのを追加します。0.3X Danieau溶液20mlに（Z）-4-ヒドロキシタモキシフェン（5μMの最終濃度）の株式。 40-60胚のバッチに1標準ペトリ皿（90ミリメートル）のための4-OHT誘導-ソリューションを使用してください。
- 作りたての誘導溶液20mlを含む新しいペトリ皿に胚を移す。 4-OHTは暗所に保存して処理する必要がある。発現の最初の徴候は、2時間後の誘導開始を検出してもよい。前腫瘍細胞の相互作用は、すでに治療後数時間を発生する可能性があります誘導ステップは、最初の宿主細胞があることを念頭に置いて、一晩拡張することができます。
4.取付け·ゼブラフィッシュ幼虫のライブイメージング
- 18〜20ミリメートルの直径を有する穴を導入することにより、60ミリメートルペトリ皿を準備します。 25mmのカバーガラス（ 図1B）を有するペトリ皿の外側の底に穴を覆って密封するために高真空シリコーングリースを使用する。
- 1％低融点（LMP）アガロースを準備します。 1 1.5mlチューブにしてください加熱ブロック中で37℃でLMPアガロース。
- 蛍光ステレオスコープの下の緑色蛍光皮膚細胞とDsRed2の正の先天性免疫細胞発現のための幼虫、事前選択のTg（DsRed2のkrt4：KalTA4-ERのT2;; UASのlysCのeGFP-HRAS G12V）。 20mlの誘導溶液に0.4％トリカイン18を1mlの添加により幼虫麻酔。
- 液体LMPアガロースにpastetteで事前に選択された幼虫を転送します。幼虫はアガロースLMPに沈むましょうとカバーガラス（ 図1B）にそれらを転送する。ステレオスコープの下で胚を方向付ける。幼虫（6幼虫まで）作動距離を減少させるためにガラス上に直接配置されなければならない。
- それは（ 図1Bの矢印）を硬化した後に誘導溶液を含むトリカインとLMPアガロースをカバーしています。
- 画像倒立蛍光、レーザースキャニングまたはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して埋め込まれた幼虫。 40Xや63Xを使用してください長作動距離の目標としての目的は全体の幼虫を通して焦点有効。
Representative Results
io006及びTg（lysCを：DsRed2の）のTg（eGFPを-HRAS G12V UAS）との間の相互の接合体nz50Tgは 1細胞期胚を得るために、10〜15分後に受精（ 図1A）を回収した。注入後、胚を4-OHTと誘導し、ライブイメージング（ 図1B）のためにマウントする前に、3 DPFまで提起された。 2-6取り付けられた胚は、倒立蛍光顕微鏡下でのどちらかに置かれた時間の誘導後（ 図2A）または倒立共焦点顕微鏡（ 図2B-C）、1.5分間隔で2〜3時間に結像。新生物発生前の表皮細胞は、正常ケラチノサイト、同様のeGFP-HRAS G12V局在化膜の緑色蛍光発光と比較して、それらのより丸みを帯びた形態学によって同定することができる。イメージングの領域は新生物発生前の皮膚細胞と自然免疫細胞（ 図2Aの矢印）の共局在のために選択した。速いMIGによるタイムラプス間隔は最大強度投影（ 図2、ビデオ1）を得るために0.7から1.7ミクロンのZスタックステップサイズで1.5分の間であるように選択された好中球の比プロセス。ライブイメージングしながら観察することができる行動の広い範囲があります：好中球は、次の前腫瘍細胞（ 図2C、ビデオ1）にし、下移動する細胞（ 図2BおよびC）への直接接触を形成する、受ける前腫瘍細胞の残留物を除去アポトーシス（ビデオ1）、または積極的に前新生物細胞（図示せず）の一部を巻き込む。相互作用の完全なスペクトルをキャプチャするためには、タイムラプスライブイメージングによって彼らの行動に従うことをお勧めします。
図1：ゼブラフィッシュ幼生の条件皮膚細胞の形質転換のための回路図。 （A） のTg（UASの受精卵の画像：eGFPを-HRAS G12V;のlysC：10分後に受精（MPF）でDsRed2の）ゼブラフィッシュ。受精卵は、絨毛膜（矢印）に囲まれています。注射のためのサイトでは、胚の動物極を定義卵黄（矢印）から細胞質ストリームによって形成され、胚盤（アスタリスク）です。ゼブラフィッシュ幼生の（B）取付。 25mmのカバーガラスで封止されている18〜20ミリメートル穴（矢印）と60ミリメートルのペトリ皿。ゼブラフィッシュの幼生を固定し、1％LMPアガロースによってカバーガラス上に搭載されている。 5μM4-OHTを含む0.3X Danieau溶液（矢印）は、LMPアガロースをカバーするために使用されている。（C）4-OHT表皮細胞の変換。幼虫皮膚の（a）は概略断面プロファイルを誘導した。胚および幼虫皮膚二つの上皮細胞層、表面細胞層および下層の基底膜（BM）に接続されたケラチノサイトの基底細胞層から構成されている。（b）は、一過性発現系トンO表皮細胞間の新生物発生前の細胞クローンを誘導する。 KalTA4-ER T2はもっぱらkrt4プロモーター （黄色）により駆動される最も外側の皮膚層で発現される。一過性発現系のKalTA4-ER T2は前腫瘍細胞（緑）のクローンにつながる、制御UAS（青）表層細胞におけるEGFP-HRAS G12V発現を活性化する。（D）回路図のモザイク表現。の（a）の Tol2のカセットpTol2-krt4：KalTA4-ERのT2; cmlc2：一過使用eGFP発現ベクターの転写活性化因子の発現の（b）の条件付き誘導。 KalTA4は、特に4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）に結合するヒトエストロゲン受容体α（ERのT2）の変異体のリガンド結合ドメインに融合される。 4-OHTの非存在下でのER T2は、熱ショックタンパク質（Hsp90の）によって細胞質に結合される。 4-OHTが結合するとHsp90はKalTA4-ERの核移行を可能に解離するT2とのeGFP-HRAS G12V発現制御UASのその後の活性化。スケールバーのA = 500程度である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：生物発生前と、自然免疫細胞の相互作用のライブイメージング。 （AC）4 Tgが DPFの画像（UAS：eGFPを-HRAS G12V;のlysC：DsRed2の）：; 1細胞期のEGFPおよびトランスポザーゼmRNAのpTol2-krt4を注射されている胚、cmlc2 KalTA4-ER T2を 。画像は、4-OHT誘導の6時間後に採取した6時間後の尾翼地域の（A）側面図皮膚細胞（矢印）を発現するのeGFP-HRAS G12Vのパッチを示す、治療後、及びlysC：。DsRed2の+好中球（矢印）。 （BC）代表的な画像TA皮膚細胞（緑）を発現するのeGFP-HRAS G12Vと好中球（赤）の相互作用を示す共焦点タイムラプス映画、から県。（B）前新生物細胞を接触させ、好中球（矢印）との短い糸状仮足の拡張を形成している。（C）好中球（赤）は、新生物発生前の皮膚細胞（緑色）のクローンに密着している。 Aのスケールバー=100μmの。 B / C =50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ビデオ1 ： 生物発生前と、自然免疫細胞の相互作用のタイムラプスライブイメージング 。 1細胞期のEGFPおよびトランスポザーゼmRNAの：;胚、pTol2-krt4を注入しcmlc2 KalTA4-ERのT2：;：4 TgはDPF（DsRed2のlysCのeGFPを-HRAS G12V UAS）のタイムラプス。 HO 6から9の共焦点タイムラプスムービーDsRed2の+の好中球（赤）のeGFP-HRASのG12Vを発現する皮膚細胞（緑）との相互作用：URSのlysCを示す4-OHT誘導後。好中球は、次の前腫瘍細胞へと下に移動して、アポトーシスを受ける前腫瘍細胞の残骸を削除します。 1.3ミクロンのZスタックステップ·サイズで3時間かけて1.5分のタイムラプス間隔。
Discussion
胚及び幼虫の発育中に、ゼブラフィッシュ胚の皮膚は2つの上皮層からなる表面層と呼ばれる周皮とその下の基底膜19に取り付けられている基底ケラチノサイトの層（ 図1C、a）である 。ここに提示されたプロトコルは、条件付きゼブラフィッシュ幼虫の表皮層における前新生物細胞の形質転換を誘導するための簡単な方法を記載し、ライブイメージングによる自然免疫細胞とのその後の相互作用の分析を可能にする。私たちのプロトコルの基本的な方法論は、十分に確立されたゼブラフィッシュのテクニック9従う- 13、そして私たちのプロトコルが容易に適合し、変更することができます。
ここで使用krt4プロモーター 5が最も外側の表皮層（ 図1C、B）で特異的にKalTA4-ER T2が発現を駆動する。しかし、モジュラーマルチサイトゲートウェイkrt4を生成するために使用されるクローニング戦略：KalTA4-ER T2の構築物（ 図1D、a）が 、単一のクローニング工程でKalTA4-ER T2の前に興味のある任意のプロモーターをクローン化する可能性を提供する。ここに提示された方法の適応は、胚形成および幼虫の段階でほとんどの組織のためのことが可能である。プロモーター配列の利用可能性は、本明細書制限要因である。さらに、UASの後ろにクローン化された興味のあるほとんどすべての遺伝子は、条件付きで、空間と時間的に制御KalTA4-ER T2の表現を使用することによって異なる発生段階で過剰発現させることができる。したがって、我々のプロトコルは、モザイク状に、ゼブラフィッシュの幼生において任意の目的の組織における遺伝子発現の条件を実行するように適合させることができる。一つは、また、肝臓や膵臓などの画像より深い組織を生きるために、設定を顕微鏡を最適化することができます。
我々は、彼プロトコルを使用して一つのアプリケーションを記載している再、同様に、1は1つが、画像中球と候補炎症調節因子の発現の誘導と逮捕、次のマクロファージ行動の変化を簡単に生きることができるように、炎症反応の調節を研究するためにこのプロトコルを使用して他の炎症調節因子を過剰発現することができます。さらに、適合したプロトコルも標的とすることができる他の特定の細胞系統と、自然免疫細胞の相互作用の相互作用、組織の形態形成や器官形成の異なる段階の間、細胞運動や行動変化をトレースしたい人と、最終的には、ライブ画像のために有益であろう誘導性KalTA4-ER T2 / UAS発現系による。
SEとして緑色蛍光陽性の心によって胚のその後の選択を可能にする（A、図1D） のeGFP-PAカセット：cmlc2が含まれている23 -私たちは、ゼブラフィッシュTol2kit 20からpDestTol2CGベクトルを使用F0スクリーニングプロセスを簡素化lectionマーカ20。ゲノムへの関心のトランスポゾン隣接した遺伝子の安定な挿入は、トランスポザーゼmRNAと一緒に、プラスミドDNAの共注射により促進される。マイクロインジェクションのためのプラスミドDNAとトランスポザーゼmRNAの調製は、標準的なプロトコールに従う。しかし、ゲノムへの構築物の統合の成功はTol2のベースの転置14に依存します。これはRNアーゼおよびDNアーゼによる汚染や劣化を避けるために、無菌条件下で氷の上で動作するように支払われる特別の注意を強調しています。 1細胞期胚へのマイクロインジェクションは、ゼブラフィッシュ9,10における機能研究のゲインと損失のための堅牢で十分に確立された技術である。よく訓練された人は簡単に1時間で1,000人以上の胚の卵黄に注入することができますが、胚盤（ 図1A、アスタリスク）への注入は、より多くの経験と訓練が必要です。この手順の間に重要な私針の取り扱いがね。針が損傷することなく細胞に浸透することが非常に薄くなければならないので、唯一の非常にチップを破壊する必要がある。これは、定期的に制御し、各胚に均一な注入を保証するために、注入中に液滴サイズを測定することが重要である。慎重に処理、針が胚を回転させるために使用することができる。これは、多くの場合、胚盤と最適普及角度を見つけるために必要とされる。
ほぼ確実に注射のために使用したDNAとトランスポザーゼmRNAの濃度は、発現効率に影響する。より高用量は、導入遺伝子を発現する細胞の割合が増加するが、DNAのより高い濃度（> 50 ng /μLで）でリードしたmRNA（> 100 ng /μLで）また、注入した胚の中で毒性作用の可能性が発生しないがトランスポザーゼができます。私たちは、10 ng /μLでDNAとプラスミドDNAの50 PGと注入されたEMBあたりのRNAの100 PGに対応して注入するための20 ng /μLでトランスポゼースmRNAの使用を好む亮。これらの濃度を注入した胚の100％が、単一の細胞内への注入効率に応じて、4-OHTの誘導後、正常に発達し、40〜70％の間ショーのeGFP-HRASのG12V式でください。正の胚の中で、我々は、通常、1〜10個のクローンを有し、約30％、10〜50個のクローンと、50以上のクローンを有する30％、40％を見つける。起因する我々の研究の目的のために、我々はeGFPの-HRAS G12Vを発現している少数のクローンと胚の使用を好む。私たちは、一過性の実験のために10〜50個のクローンを持つ胚を選択します。トランスジェニック創始魚の世代のために、我々は唯一のEGFP陽性心臓マーカーとその表皮におけるEGFP-HRAS G12V陽性クローン多数の両方を持つ胚を選択することをお勧めします。
光24にさらされると（Z）-4-ヒドロキシタモキシフェンは、シス-トランス（EZ）の相互変換を受ける。これは、シス異性体（E）は、そのトランス対応25,26より100倍少ない抗エストロゲンであることが見出された。 Exposurしたがって、点灯する電子は避けなければならない。エタノールに溶解した4-OHTのストック溶液は、長い時間にわたって暗所に-20℃で保存することができる。私たちは、インキュベーターや輸送中の標的遺伝子誘導の間に光からペトリ皿を保護するためのボックスを使用することをお勧めします。イメージングの領域であるが、より長い期間にわたって撮影が最大発現レベルを維持することが推奨されている間2時間毎に非常に小さく、UV光に4-OHTの露出は最小限に抑えられ、誘導溶液の為替。 4-OHTを効果的にゼブラフィッシュ胚発生の間に絨毛膜および最も外側の皮膚層を介して透過性に、したがって、それは非常に迅速に遺伝子発現を誘導することができる。我々は容易に誘 導の2時間後のeGFP発光を観察することができ、標的遺伝子発現の最初の兆候は、治療8の3時間後、1時間後にプラトーに観察することができることが報告されている。違いは、私たちの研究で用いた異なるプロモーターによるものである可能性があります。き広報を有するものeviously 4-OHT処理は用量依存8,27であることを報告し、私たちは、過渡的なアプローチで、堅牢で再現性の発現レベルを達成するために5μmの最高報告濃度を使用することにしました。これは、導入遺伝子を保有する全ての細胞が、標的遺伝子の発現を誘導することを保証すべきである。
それにより、複数のランダムなゲノム挿入事象の可能性をここに提示過渡的なアプローチは、様々な発現レベルにつながる可能性があることを考慮に入れなければならない。また、Tgは（UAS：eGFPを-HRAS G12V）のTol2のトランスジェニックバックグラウンドでトランスポゼースmRNAの使用がio006は、遺伝子サイレンシングまたは混乱の原因となりUAS導入遺伝子の潜在的な転位につながることができます。ここで紹介する方法は、過渡的なアプローチを表ししかし、注入後の胚の事前選択は必須です。多くのラボでは、UAS配列が故にで、トランスジェニック子孫に沈黙される傾向があることを見出したcmlc2は、KalTA4-ERのT2：：eGFPをは（UAS：eGFPを-HRAS G12V）のTgに構築io006胚はTgのへの構築UASを注入するほど効率的ではないかもしれません（krt4：KalTA4-ER T2は 、cmlc2：pTol2-krt4をjecting GFP ）の胚。安定したトランスジェニック線 TGの使用時間に用量依存4-OHTの遺伝子活性化のオン/オフ反応速度の正確なモニタリングが可能になりますio006（krt4：KalTA4-ER T2が ）のTg（EGFP-HRAS G12V UAS）と交配。
幼虫の実装時の重要なステップは、LMPアガロースへとカバーガラス（ 図1B）に転写される。いずれかの熱ショックによって魚を傷つけるまたはゲルが硬化することなく、予め選択された幼虫の安全な転送および配向を可能にする液体LMPアガロース温度短期間のみ存在する。幼虫は、その後顕微鏡ANALYための作動距離を減少させるためにカバーガラス上に直接配向されるべきであるSIS。これは、顕微鏡の間に制限する要因となり得るように、適切な目標の選択が必須です。一度マウントされ、幼虫は数時間から数日を維持することができる。
本明細書で提示モデル系のコンディショナリティは、導入遺伝子の4-OHTの活性化によって繰り返し変換することができます。発現系は、4-OHTの存在に依存するため、目的とする遺伝子のKalTA4制御された発現（ 図1D、b）は、可逆的である。不可逆的なゲノム組換え事象28を容易にCre-ER T2 / Lox系とは対照的に、KalTA4-ER T2 / UASは、活性化非アクティブ4-OHTの追加または除去の際に繰り返し誘導のためのこの可能性は、利点であることができるのCre-ER T2 / Lox系オーバー技法。実験は、数日から数週間から延長する必要がある場合は、4-OHTの一定のレベルの要件は制限がある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
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