Summary
Preneoplastik hücre ilerlemesi ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim erken olayları incelenmesi anlamak ve kanser tedavisinde çok önemlidir. Burada şartlı epitel hücre dönüşümleri ve HRAS G12V zebra balığı larvası deri hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşiminin daha sonra canlı görüntüleme uyarılması için bir yöntem tarif eder.
Introduction
Aksi takdirde normal epitel tabakasının içinde bir preneoplastik hücre döl büyümesi şiddetle mikroçevresinin bir etkileşime bağlıdır. kendi ana dokusu ile etkileşim bir preneoplastik hücre daha tam şişmiş kansere dönüşebilir bir klonal niş kurmak mümkün olup olmadığı önemli belirleyicisi olması muhtemeldir. Gelişiminde önemine rağmen, kanser gelişimi, bu ilk aşama, in vivo olarak, en yaygın olarak kullanılan model sistemlerinde de erişilemez.
zebra balığı Danio rerio çünkü gelişimi boyunca saydamlığı, suda çözünür ilaçlar için genetik manipülasyonu için olasılık ve erişilebilirlik canlı görüntüleme çalışmaları için iyi bilinen bir örnek bir organizmadır. Epitel hücreleri dönüştürmek için aşırı ifade, insan onkojenini HRAS G12V bir larva Zebra balığı model kullanılarak Son zamanlarda yapılan çalışmalar, konak hücre özellikle H 2 O 2 kurşun için, sinyalleri türetilmiş olduğunu gösterdiDoğuştan gelen bağışıklık hücreleri işe. İlginç bir şekilde, işe bağışıklık hücreleri, nötrofiller ve makrofajlar, preneoplastik hücre çoğalmasını 2,3 destekleyen bir trofik bir role sahip olduğu gösterilmiştir.
Tümör başlaması ve ilerlemesi erken olayları olarak enflamatuar yanıtın bir katkı anlamak için, tek bir itibaren en erken zaman noktası, bu olayların görüntüye mümkün olmalıdır. Bu nedenle, geçici ve dokuya özgü bir şekilde, hücre dönüşümü, kontrol edilmesi gerekir. Başarıyla şartlı cilt özel yükseltici keratin 4 (krt4) kontrolü altında insan onkojenini HRAS G12V ifade Drosophila 4 adapte edilmiş Gal4 / UAS sistemi 5 kullanmaktadır. transkripsiyonel aktivatör yani Gal4, KalTA4 6 değiştirilmiş versiyonu, Memba Aktive Sıra kontrolü (UAS altında HRAS G12V ifadesini sağlar). Şartlı transkripsiyonel aktivatör ekspresyonunu teşvik etmek için, KalTA4 özellikle 4-hidroksitamoksifen bağlanan insan estrojen reseptörü α mutant ligant bağlama sahası (ER T2) 7 kaynaştırılmış olduğu (4-OHT) 1. 4-OHT yokluğunda ER T2 ısı-şok proteinleri ile sitoplazma içerisinde bağlanır. 4-OHT üzerine çıkar 8 geni kontrol UAS, bir KalTA4 ER T2 çekirdek translokasyonunu ve sonraki aktivasyonuna izin veren proteinleri ayırmak ısı şok bağlanması (Şekil 1 C, b). Bu ekspresyon sistemi 4-OHT varlığına bağlı olarak, ilgi konusu bir genin KalTA4 kontrollü ekspresyonu tersine çevrilebilir. Geri dönüşü olmayan bir rekombinasyon olgusu neden Kre-ER T2 / lox sistemi, aksine, KalTA4 ER T2 transkripsiyonel aktivasyon indüksiyon ilave ya da 4-OHT çıkarılmasıyla geri dönüşümlüdür.
Aşağıdaki protokol, allo zebra balığı larvası deri hücrelerinin şartlı dönüşüm ve floresan protein ekspresyonu ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile etkileşiminin bir sonraki denetim ws. 13 - Bu protokolde kullanılan temel yöntemler Zebra balığı topluluk 9 içindeki bazı sık kullanılan teknikler benzer.
üretim ve birlikte transgen yapıları mikroenjeksiyon transgenik kombinasyonel kullanımı, sadece bir mozaik şekilde tek hücrelerini dönüştürmek için geçici bir yaklaşım sağlar. Embriyonik ve larva Zebra balığı cilt oksijen geçirgenliği gün saat yüksek çözünürlüklü mikroskopi zaman atlamalı canlı görüntüleme çalışmaları için olasılığını yükseltir. Ayrıca, suda çözünür ilaçlara erişilebilirlik gelecek mekanik çalışmalar ve kanser gelişiminin erken evrelerinde daha iyi anlaşılmasına yol açabilir in vivo hücre biyolojik olayların izlenmesini sağlayacak.
_content "> Bu protokol, mozaik şekilde, zebra balığı larvası daki herhangi bir dokuda koşullu gen ekspresyonunu gerçekleştirmek için adapte edilebilir. Bir de deri dışındaki resim derin dokulara yaşamak için ayar mikroskop optimize edebilir.Protocol
Aşağıdaki deney prosedürleri Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ile sıkı göre yapılmıştır.
Mikroenjeksiyon için plazmid DNA hazırlanması 1.
- EGFP, üreticinin talimatlarına göre bir ticari plazmid DNA saflaştırma kiti ile 100 ng / ml'lik bir son stok çözeltisi konsantrasyonuna plazmid DNA sulandırmak cmlc2; KalTA4 ER T2: Plazmid pTol2-krt4 saflaştırılır.
- Üretici protokolü takip BamHI kısıtlama sindirimi ile plazmid pT3TS / Tol2 14 ihtiva eden transposaz, linearize. Bu adım, bir gece boyunca uzatılabilir. Standart bir protokol izlenerek, bir fenol / kloroform ekstraksiyonu ile doğrusallaştırılmış DNA'nın çökeltilmesi.
- İn vitro olarak, üreticinin talimatlarına uygun başlıklı, büyük RNA miktarları için ticari bir transkripsiyon kiti ile doğrusallaştırılmış plazmidden transposaz mRNA transkripsiyonu için seyreltik ve tümbölennükleaz içermeyen su içinde 100 ng / ml'lik bir son stok çözeltisi konsantrasyonu. Yerel bir% 1-2 TAE (40 mM Tris, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) içinde agaroz jeli elektroforezi (80-120 V) saflaştırılmış RNA kalitesi sağlanması. -80 ° C'de RNA saklayın.
Geçici Gen Sentezlemesi için plazmid DNA 2. Mikroenjeksiyon
- Enjeksiyon sırasında döllenmiş yumurta tutmak için bir agaroz enjeksiyon plaka hazırlayın. Bir 90 mm Petri kabı içine sıvı% 3 agaroz dökün. 40-50 ° C agaroz soğuması ve sıvı agaroz üstüne sıkışmış şeklinde mikroenjeksiyon kalıp TU-1 ekleyin. Oda sıcaklığında sertleştirme sonra, kalıp çıkarmadan önce 30 dakika süre ile 4 ° C 'de agaroz dinlendirin. 4 ° C ve yeniden Mağaza mikroenjeksiyon kalıplar.
- Enjeksiyon çözeltisi bir kısım hazırlayın. Buz üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. Pipet plasmid DNA (10 ng nihai konsantrasyon / ul), transposaz mRNA 2 ul (nihai konsantrasyon 20 ng / | il), 2 1 ulBir 10 mg ul / ml Rhodamine B izotiyosiyanat-Dekstran, 5x Danieau çözeltisi 2 ul (290 mM NaCI, 3.5 mM KCI, 2 mM MgSO 4, 3 mM Ca (NO 3) 2, 25 mM HEPES, pH 7.6) nükleaz içermeyen su içinde 10 ul nihai hacim.
- Bir Mikropipet Çektirme zıt yönlerde kılcal çekme ile bir iç filaman ihtiva eden 1 mm çaplı borosilikat cam kılcal iğneleri hazırlayın. Aşağıdaki programı kullanın: 530 ısı, 200, hız 80 ve saati 150 çekin.
- Enjeksiyon çözeltisi 2 ul bir iğne doldurun (buz üzerinde tutulur). Kılcal içine çözüm bırakırken dikkatli Microloader ucu çekerek kabarcıkları kaçının. Dikkatlice forseps ile iğne ucu kırmak.
- Pnömatik pico pompası ile damla boyutunu düzenler. Damla çapı / hacmini ölçmek (V = 4/3 πr 3) ve dimetilpolisiloksan bir Stereoskop altında bir oküler mikrometre ile damla boyutunu ayarlamak. Biz tavsiye0.5 nl tekabül eden 100 um. Bu, her bir enjekte embriyo başına tek tip ve yeniden üretilebilir konsantrasyonları sağlar. Enjekte konsantrasyonu titre ve her bir yapı ve plazmid hazırlanması için ayarlanır.
- 3 mi pastette kullanımı ile enjeksiyon plaka kalıplar içine nz50Tg 16 (: EGFP-HRAS G12V UAS) Tg (dsRed2 lysC) ile io006 15 Tg çapraz elde zigotların (Şekil 1A) yerleştirin. Bu arada, kuruyor ve pıhtılaşma gelen çözüm önlemek için dimetilpolisiloksan öncesi hazırlanan enjeksiyon iğne ucu tutun.
- Blastodisc 17, ilk kesimden önce (Şekil 1A) içine koryon Stereoskop altında önceden ölçülmüş bir damla (100 um, 0.5 nl karşılık gelir) enjekte edilir. Tek hücreli aşamaya enjeksiyon plazmid DNA ve RNA gelişen hücre kitlesi ve tohum çizgisi aktarımı için olasılık muntazam bir dağılımının potansiyelini artırır. Öylekonstruktların sentezlenmesi daha sık mozaik olma eğiliminde olduğunu da dikkate değer.
4-hidroksitamoksifen 3. Koşullu Cilt Hücre Dönüşüm (4-OHT)
- 0.3x Danieau solüsyonu enjekte embriyolar transfer ve bir kuluçka 28.5 ° C'de saklayın. Küre aşamasında 17 de çanak döllenmemiş yumurta çıkarın. birlikte enjekte Rhodamine B izotiyosiyanat-Dekstran bir flüoresan Stereoskop altında bir enjeksiyon kontrol olarak kullanılabilir.
- EGFP kalp ifadesi için 24 hpf (saat sonra döllenme) ile ekran embriyolar. CMLC yükseltmeye devam: eGFP pozitif zebrabalıkları embriyolar 72 hpf kadar. Dikkatle (Danieau 0.3x) su kalitesini izlemek.
- 72 hpf forseps ile yumurtadan değil bu embriyoların koryon çıkarın. Dikkatle 1 forseps ile koryon karıştırmak ve diğer kullanarak bunu ayrı çekin. Bir floresan Stereoskop kullanarak dsRed2 ifade: lvsC için seçin embriyolar.
- 10 mM, 10 ul ekle0.3x Danieau çözeltisi, 20 ml (Z) -4-OH (5 uM nihai konsantrasyon) stok. 40-60 embriyo toplu üzerinde bir standart Petri kabı (90 mm) 4-OHT indüksiyon-çözümü kullanın.
- Taze indüksiyon-çözeltisinin 20 ml'lik yeni bir Petri çanağı içine embriyo transferi. 4-OHT depolanır ve karanlıkta ele alınmalıdır. İfade ilk işaretleri 2 saat sonrası indüksiyon başladığını tespit edilebilir. preneoplastik hücre etkileşimleri zaten tedaviden sonra bir kaç saat oluşabilir: indüksiyon adım ilk konak hücre akılda tutarak, gecede uzatılabilir.
4. Montaj ve Zebra balığı Larva Canlı Görüntüleme
- 18-20 mm'lik bir çapa sahip bir delik zerk edilmesi ile bir 60 mm Petri kabı hazırlanır. Kapak ve 25 mm kapak cam (Şekil 1B) ile Petri kabı dış altındaki delik mühür yüksek vakum silikon gres kullanın.
- % 1 düşük erime noktalı (LMP) agaroz hazırlayın. Bir 1.5 ml tüp tutunbir ısıtma bloğu içinde 37 ° C'de LMP agaroz.
- Bir floresan Stereoskop altında yeşil floresan cilt hücresi ve dsRed2 pozitif doğuştan gelen bağışıklık hücre ifadesi için larva, ön seçim Tg (dsRed2 krt4: KalTA4-ER T2;:; UAS lvsC eGFP-HRAS G12V). 20 mi indüksiyon çözeltisine% 0.4 tricaine 18, 1 ml ilave edilerek larvaları anestezisi.
- Sıvı LMP agaroz bir pastette ile önceden seçilmiş larvaları aktarın. Larvalar agaroz LMP gömülmek edelim ve kapak cam (Şekil 1B) üzerine aktarabilirsiniz. Bir Stereoskop altında embriyolar yönlendirmek. Larvalar (6 larva kadar) çalışma mesafesi azaltmak için cam üzerine yerleştirilmesi gerekir.
- O (Şekil 1B ok) sertleşmiş sonra indüksiyon çözeltisi içeren tricaine ile LMP agaroz örtün.
- Görüntü ters floresan, lazer-tarama veya eğirme disk konfokal mikroskop kullanılarak gömülü larva. 40x veya 63x kullanınuzun çalışma mesafeleri hedefleri gibi objektif tüm larva ile odaklama etkinleştirin.
Representative Results
Io006, Tg (lysC: dsRed2): Tg (EGFP-HRAS G12V UAS) arasında çapraz zigot nz50Tg 1 hücre aşamasında embriyoların elde edilmesi için 10-15 dakika sonrası fertilizasyon (Şekil 1A) toplanmıştır. Enjeksiyondan sonra embriyolar 4-OHT indüksiyon ve canlı görüntüleme (Şekil 1B) montajından önce, 3 dpf'e kadar yükseltilmiştir. 2-6 monte embriyolar bir ters flüoresan mikroskop altında ya da yerleştirilmiştir saat sonra indüksiyon (Şekil 2A) ya da bir ters çevrilmiş konfokal mikroskobu (Şekil 2B-C) ve 1.5 dakika aralıklarla 2-3 saat boyunca görüntüsü alınmıştır. Preneoplastik yüzeysel deri hücrelerinin normal keratinositler gibi EGFP-HRAS G12V lokalize membran yeşil floresan emisyonu ile karşılaştırıldığında daha yuvarlak morfoloji ile tespit edilebilir. Görüntüleme alanları preneoplastik deri hücreleri ve immün hücreleri (Şekil 2A ok başı) eş-lokalizasyonu için seçildi. Nedeniyle hızlı MIGzaman atlamalı aralıkları seçilen nötrofil oranı işlemi maksimum yoğunluk çıkıntılar (Şekil 2, video 1) elde etmek üzere 0,7-1,7 um Z yığın aşama boyutunda, 1-1.5 dakika arasında olması. Canlı görüntüleme sırasında görülebilir davranışları geniş bir yelpazesi vardır: nötrofiller, ve preneoplastik hücreler (Şekil 2C, Video 1) altında yanındaki göç hücreleri (Şekil 2B ve C) doğrudan temas oluşturur, tabi preneoplastik hücrelerin kalıntıları çıkarmak apoptoz (Video 1), ya da aktif preneoplastik hücrelerin parçaları yutmak (gösterilmemiştir). Etkileşimlerin tam spektrum yakalamak için, zaman atlamalı canlı görüntüleme ile onların davranışlarını takip etmek önerilir.
Şekil 1: Zebra balığı larvaları koşullu cilt hücre dönüşüm için şematik. (A) Tg (UAS bir zigot bir görüntü: eGFP-HRAS G12V; LvsC: 10 dk sonrası döllenme (MPF de dsRed2) Zebra balığı). döllenmiş yumurta koryon (ok başı) ile çevrilidir. Enjeksiyon için site embriyo hayvan kutup tanımlayan sarısı (ok) sitoplazmik derelerin oluşturduğu blastodisc (yıldız), olduğunu. Zebra balığı larvalarının (B) montajı. 25 mm kapak cam ile kapatılmış bir 18-20 mm delik (ok) ile 60 mm Petri. Zebra balığı larvaları hareketsiz ve% 1 LMP agaroz ile cam kapak üzerine monte edilir. 5 uM 4-OHT içeren 0.3x Danieau çözeltisi (ok) LMP agaroz kapsayacak şekilde kullanılmıştır. (C), 4-OHT yüzeysel deri hücrelerinin dönüşümü. Larva deri (a) şematik enine kesit profilini uyardı. embriyonik ve larva cilt iki epitel hücre katmanları, yüzeysel hücre tabakası ve alttaki taban membran (BM) bağlı olan keratinositlerin bir bazal hücre tabakası oluşmaktadır., (b), geçici ekspresyon sistemi to yüzeysel cilt hücreleri arasında bir preneoplastik hücre klonu neden. KalTA4 ER T2 özel krt4 promoteri (sarı) tarafından tahrik edilen, en dış deri tabakası olarak ifade edilir. KalTA4-ER, T2 mozaik ifadesi, preneoplastik hücreler (yeşil) içindeki bir klonuna gelen yüzeysel hücre kontrol (mavi) EGFP-HRAS G12V sentezleme UAS aktive eder. Geçici ekspresyon sistemi (D) şematik gösterimi. (A) Tol2 kaseti pTol2-krt4: KalTA4 ER T2; cmlc2: geçici olarak kullanılan EGFP ifade vektörü, transkripsiyonel aktivatör ekspresyonu (b) Koşullu indüksiyon.. KalTA4 insan estrojen reseptörü α özellikle 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) bağlanmaktadır (ER T2), mutant ligand bağlama sahasına kaynaştırılmıştır. 4-OHT yokluğunda ER T2 ısı şok proteinleri (Hsp90) tarafından sitoplazmada bağlıdır. 4-OHT bağlanması üzerine Hsp90 KalTA4-ER'in nükleer translokasyonu sağlayan ayırırT2 ve EGFP-HRAS G12V ifadesi kontrollü UAS sonraki aktivasyonu. Ölçek çubuğu A = 500 mikron. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2: preneoplastik ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim Canlı görüntüleme. (AC) bir 4 Tg dpf görüntüleri (UAS: EGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2);: bir hücre aşamasında EGFP transposaz mRNA pTol2-krt4 enjekte edilmiş olan embriyo cmlc2 KalTA4 ER T2. DsRed2 + nötrofiller (ok başı). Çıkan 6 saat sonra tailfin bölge (A) yanal görünüşüdür deri hücreleri (ok) ifade EGFP-HRAS G12V lekeleri yok, tedaviden sonra 4-OHT indüksiyon 6 saat sonra alınmış ve lysC edildi. (BC) Temsilcisi görüntüleri takonfokal zaman atlamalı film ken, nötrofil gösteren (kırmızı) eGFP-HRAS G12V ifade cilt hücreleri (yeşil) ile etkileşimleri. (B) preneoplastik hücre temas nötrofil (ok) ile kısa filopodial uzantısını oluşturmaktadır. (C) Nötrofiller (kırmızı), preneoplastik deri hücreleri (yeşil) içindeki bir klon yakın temas halindedir. A Ölçek çubuğu = 100 mikron; B / C = 50 mm. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Video 1 : preneoplastik ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim Time-lapse canlı görüntüleme. Bir hücre aşamasında eGFP ve transposaz mRNA:;: embriyo, pTol2-krt4 enjekte cmlc2 KalTA4-ER T2:;: 4 Tg dpflik (dsRed2 lvsC eGFP-HRAS G12V UAS) Time-lapse. Ho 6-9 Konfokal time-lapse filmdsRed2 + nötrofil (kırmızı) eGFP-HRAS G12V ifade cilt hücreleri (yeşil) ile etkileşimleri: Urs lvsC gösteren 4-OHT indüksiyon sonrası. Nötrofiller ve preneoplastik hücrelerin altında yanında göç ve apoptoz uğrar bir preneoplastik hücrenin kalıntıları çıkarmak. 1.3 mikron Z yığını adımı boyutları ile 1.5 dakika saat üzerinde 3 Time-lapse aralıkları.
Discussion
Embriyojenez ve larva gelişimi sırasında, embriyonik zebra balığı derisi, iki epitel tabakadan oluşur yüzeysel katman adı periderm ve alttaki taban membran 19 bağlı olan baz keratinositlerde tabakası (Şekil 1C, a). Burada sunulan protokol koşullu zebra balığı larvası yüzeysel deri tabakası içinde preneoplastik hücre dönüşümünün uyarılması için basit bir yöntem tarif eder, ve canlı görüntüleme ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile sonraki etkileşim analizi sağlar. Bizim protokolde temel metodolojileri köklü Zebra balığı teknikleri 9 takip - 13, ve bizim protokol kolayca adapte ve modifiye edilebilir.
Burada kullanılan krt4 promoteri 5 (Şekil 1C, b) en dış deri tabakası içinde özellikle KalTA4 ER T2 ekspresyonunu tahrik eder. Bununla birlikte, modüler MultiSite Ağ Geçidikrt4 oluşturmak için kullanılan bir strateji, klonlama: KalTA4 ER T2 yapısı (Şekil 1D, a) tek bir klonlama adımında KalTA4-ER, T2 önünde söz konusu herhangi bir promotör klonlamak imkanı sağlar. Burada sunulan yöntemin bir adaptasyonu embriyojenez ve larva aşamalarında en dokular için mümkündür. promotör dizilerinin mevcudiyeti burada sınırlayıcı faktördür. Bundan başka, bir UAS arkasına klonlanmıs hemen her gen şartlı mekansal ve zamansal olarak kontrol KalTA4 ER T2 ifadesinin kullanılmasıyla farklı gelişim safhalarında ifade edilebilir. Bu nedenle, protokol mozaik şekilde, zebra balığı larvası daki herhangi bir dokuda koşullu gen ekspresyonunu gerçekleştirmek için adapte edilebilir. Bir de karaciğer veya pankreas gibi görüntü derin dokulara yaşamak için ayarını mikroskop optimize edebilirsiniz.
Biz protokolü o kullanan bir uygulama tarif varbenzer, bir, inflamatuar yanıtların düzenlenmesi incelemek için bu protokolü kullanarak diğer inflamasyon modülatörlerini aşırı ifade edebilir yeniden kolayca canlı görüntü nötrofil ve aday inflamatuar modülatör ifadesinde indüksiyon ve tutuklanmasının ardından makrofaj davranış değişiklikleri yapabilirsiniz. Ayrıca, adapte protokol doku morfolojilerinden ve organ oluşumu ve farklı aşamalarında hücre hareketi ve davranış değişikliği izlemek isteyenler için faydalı olacağını, nihayet canlı görüntü diğer özel hücre soyları ile doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşimleri etkileşim hedeflenen edilebilir uyarılabilir KalTA4-ER T2 / UAS ifade sistemi ile.
Biz Zebra balığı Tol2kit 20 pDestTol2CG vektör kullanılan - Bir cmlc2 içeren 23: eGFP-pA kaseti (Şekil 1D, a) se yeşil floresan pozitif kalplerin tarafından embriyoların sonraki seçim sağlayanF0 tarama işlemini basitleştiren tasdik ediniz işaretleyici 20. Genomuna ilgi transpozon çevrili genin stabil bir ekleme transposaz mRNA ile birlikte plazmid DNA ko-enjeksiyon ile kolaylaştırılır. Mikroenjeksiyon için plazmid DNA hazırlanması transposaz mRNA standart protokoller takip edilir. Bununla birlikte, genomu ıçınde yapının başarılı entegrasyon Tol2 tabanlı aktarılması 14 bağlıdır. Bu özel dikkat RNases ve DNase'lann tarafından kirletmesini ve bozulmaları önlemek için steril koşullar altında buz üzerinde çalışmak için ödenecek vurgulamaktadır. Tek hücreli aşamada embriyolara mikroenjeksiyon Zebra balığı 9,10 olarak kazanç ve fonksiyon çalışmaları kaybı için sağlam ve köklü bir tekniktir. Iyi eğitimli kişi kolaylıkla 1 saat içinde 1000'den fazla embriyoların sarısı içine enjekte rağmen, blastodisc (Şekil 1A, yıldız) içine enjeksiyon daha fazla deneyim ve eğitim gerektirir. Bu işlem sırasında Kritik iiğne taşıma s. İğne zarar vermeden hücre nüfuz çok ince olması gereken ve bu nedenle sadece çok uç kırık olması gerekir. Düzenli olarak kontrol etmek ve her bir embriyonun içine düzgün bir enjeksiyon garanti altına almak için, enjeksiyon sırasında damla boyutunu ölçmek için önemlidir. Dikkatle iğne embriyo döndürmek için kullanılabilir, ele alınmıştır. Bu genellikle blastodisc ve optimal penetrasyon açısını bulmak için gereklidir.
hemen hemen kesinlikle enjeksiyon için kullanılan DNA transposaz mRNA konsantrasyonu, sentezleme etkinliğini etkiler. Daha yüksek dozlar transgen ifade eden hücrelerin oranında artış ancak DNA (> 50 ng / | il), daha yüksek konsantrasyonları ile yönlendirir ve bu da enjekte edilen embriyolar arasında toksik etkiler için potansiyel doğar mRNA (> 100 ng / | il), transposaz olabilir. Bu plazmid DNA, 50 ug ve enjekte emb başına RNA, 100 ug tekabül eden 10 ng / | il DNA ve 20 ng enjeksiyon / ml transposaz mRNA kullanımını kolaylaştırmakryo. Bu konsantrasyonlarda enjekte embriyoların% 100 tek hücreye enjeksiyon verimliliğine bağlı, 4-OHT indüksiyon sonrası, normal geliştirmek ve 40-70 arasında% gösterisi eGFP-HRAS G12V ifadesi yoktur. Pozitif embriyoların arasında biz normalde 1-10 klon var yaklaşık% 30, 10-50 klon ve 50'den fazla klon olan% 30 var 40% bulmak. Nedeniyle bizim araştırma amaçları için, biz eGFP-HRAS G12V ifade daha az klonları ile embriyoların kullanımı lehine. Biz geçici deneyler için 10-50 klonları ile embriyolar seçin. Transgenik kurucusu balık üretimi için, biz sadece eGFP pozitif kardiyak belirteç ve epidermis eGFP-HRAS G12V pozitif klonların çok sayıda hem embriyolar seçmek için tavsiye ederiz.
Işık 24 maruz kaldığı zaman (Z) -4-OH, bir sis-trans (EZ), aralarında dönüşümlerini maruz kalır. Cis-izomer (E) trans muadili 25,26 daha 100x az bir anti-östrojenik olduğu bulunmuştur. Exposurışığa E bu nedenle kaçınılmalıdır. Etanol içinde çözülmüş 4-OHT stok çözeltisi, uzun bir süre boyunca karanlıkta -20 ° C'de saklanabilir. Biz kuvöz ve ulaşım içindeki hedef gen indüksiyonu sırasında ışıktan Petri kapları korumak için bir kutu kullanılmasını tavsiye ederiz. Görüntüleme alanı çok küçük ve UV ışığına 4-OHT maruz olmasına rağmen uzun süreler boyunca görüntüleme maksimum ekspresyon seviyelerini korumak için tavsiye edilirken, en az, indüksiyon çözeltisi sabit bir değişimi için her 2 saatte bir azaltılır. 4-OHT etkin kullanılmış, çok hızlı bir şekilde gen ifadesini endükleyebilen, koryon ve zebra balığı embriyojenez sırasında dış deri tabakaları ile permeabilizes. Bu hali hazırda indüksiyon 2 saat sonra, EGFP emisyonu gözlemlemek ve bu hedef gen ekspresyonunun ilk belirtileri tedavi 8 3 saat sonra, 1 saat ve plato fark edilebilir olduğu bildirilmiştir. farklılıklar bizim çalışmamızda kullanılan farklı promotör nedeniyle olabilir. Hiç pr vardır gibieviously 4-OHT tedavisi bağımlı 8,27 doz olduğunu bildirdi, biz geçici bir yaklaşım sağlam ve tekrarlanabilir ifade seviyelerini elde etmek için 5 mcM en yüksek bildirilen konsantrasyonunu kullanmayı seçti. Bu transgen taşıyan tüm hücreler hedef gen ifadesini endükleyebilen garanti edilmelidir.
Nedeniyle çok sayıda ve rasgele genom ekleme olayların olasılığı Burada sunulan geçici bir yaklaşım değişen ifade seviyeleri yol açabileceği dikkate alınmalıdır. Ayrıca, Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) olarak Tol2 transgenik arka transposaz mRNA 'nın kullanılması io006 gen susturma veya bozulmasına neden olabilir UAS transgen potansiyel transpozisyonundaki yol açabilir. Burada yer alan yöntem, geçici bir yaklaşımı temsil eder, ancak, enjeksiyondan sonraki embriyo ön seçim zorunludur. Birçok laboratuarları UAS dizileri dolayısıyla içinde, transgenik yavrularda susturulur eğiliminde olduğunu buldukpTol2-krt4 tabi tutulması: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) içine inşa io006 embriyolar UAS Tg (krt4 içine inşa enjekte kadar etkili olmayabilir: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embriyolar. istikrarlı transgenik hat Tg kullanımı zaman doz bağımlı 4-OHT gen aktivasyonu açık / kapalı kinetik kesin izleme sağlayacak io006 (krt4: KalTA4-ER T2) Tg (EGFP-HRAS G12V UAS) ile geçti .
Larvaların montajı sırasında kritik bir adım LMP agaroz içine ve kapak cam (Şekil 1B) üzerine transferidir. Her iki ısı şoku ile balık zarar veya jel sertleşme olmadan önceden larvaların güvenli aktarımını ve yönünü tanır sıvı LMP agaroz sıcaklık kısa zaman dilimi sadece vardır. Larvalar sonraki mikroskobik analı için çalışma mesafesini azaltmak için cam kapak üzerine doğrudan odaklı olmalıdırsis. Bu mikroskopi sırasında bir sınırlayıcı faktör olabilir gibi uygun hedeflerin seçimi zorunludur. Bir kez monte edilmiş larva gün saat arasında muhafaza edilebilir.
Burada sunulan model sisteminin koşula transgenin 4-OHT aktivasyonu ile tekrarlanan dönüşüme izin vermektedir. (Şekil 1D, b) ifade sistemi 4-OHT varlığına bağlıdır ve bu nedenle ilgi konusu bir genin KalTA4 kontrollü ekspresyonu tersine çevrilebilir. Geri dönüşü olmayan bir genomik yeniden birleştirme olayı 28 kolaylaştırır Kre-ER T2 / lox sistemi, aksine, KalTA4 ER T2 / UAS aktive edilebilir ve ek olarak ya da 4-OHT çıkarılması sırasında devre dışı kalır ve tekrar uyarılması için bu potansiyel bir avantajı, Kre-ER T2 / Lox sistemi üzerinden tekniği. Deneme hafta gün uzatılabilir vardır Ancak, 4-OHT'nin sabit seviyelerde gereksinimi bir kısıtlamadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
