Summary
Studera de tidigaste händelserna preneoplastisk cell progression och medfödda immunceller interaktion är avgörande för att förstå och behandla cancer. Här beskriver vi en metod för att villkor framkalla epitelceller transformationer och den efterföljande live-avbildning av medfödda immunceller interaktion med HRAS G12V uttrycker hudceller i zebrafisk larver.
Introduction
Överväxt av en preneoplastisk cell avkomma inom en annars normal epitelark beror mycket på en interaktion med sin mikromiljö. Interaktionen med sin värd vävnaden kommer sannolikt att vara den avgörande faktorn för huruvida ett preneoplastisk cell har möjlighet att upprätta en klonal nisch att ytterligare utvecklas till ett fullskaligt cancer. Trots dess betydelse vid utveckling, är denna inledande fas av cancer progression otillgängliga i de flesta vanligen använda modellsystem in vivo.
Den zebrafisk, Danio rerio, är en väletablerad modellorganism för levande imaging studier på grund av dess öppenhet i hela utvecklingen, möjligheten för genetisk manipulation och tillgänglighet för vattenlösliga läkemedel. Nya studier med hjälp av en larvzebrafisk modell, som överuttrycker det mänskliga onkogen HRAS G12V att omvandla epitelceller, visade att värdcellen härstammar signaler, särskilt H2O 2 leder tillrekrytering av medfödda immunceller. Intressant, rekryterade immunceller, neutrofiler och makrofager, visade sig ha en trofisk roll för att stödja preneoplastisk celltillväxt 2,3.
För att förstå de tidiga händelserna i tumör initiering och progression samt bidrag ett inflammatoriskt svar, måste man kunna bilden dessa händelser från den tidigaste tidpunkten och framåt. Därför är det nödvändigt att kontrollera celltransformationer i en temporal och vävnadsspecifikt sätt. Vi utnyttjar Gal4 / UAS-system som har framgångsrikt anpassat från Drosophila 4 till villkor uttrycka människans onkogen HRAS G12V under kontroll av huden specifika promotorn keratin 4 (krt4) 5. Den modifierade versionen av den transkriptionella aktiva Gal4, nämligen KalTA4 6, möjliggör uttryck av HRAS G12V under kontroll av utvinningsaktiverande sekvensen (UAS). Att villkor inducera transkriptionsaktivator uttrycket har KalTA4 varit smält till mutant ligand-bindande domänen av humana östrogenreceptor α (ER T2) 7, som binder specifikt 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) 1. I avsaknad av 4-OHT ER T2 är bunden i cytoplasman genom värmechockproteiner. Vid 4-OHT bindning av värmechocksproteiner dissociera, vilket tillåter en nukleär translokation av KalTA4-ER T2 och efterföljande aktivering av de UAS kontrollerade gen av intresse 8 (Figur 1C, b). Eftersom detta expressionssystem beror på närvaron av 4-OHT är KalTA4 kontrollerade uttrycket av en gen av intresse reversibel. I motsats till den Cre-ER T2 / Lox-systemet, vilket leder till en irreversibel rekombinationshändelse, är induktionen av transkriptionell aktivering genom KalTA4-ER T2 reversibel genom tillsats eller borttagande av 4-OHT.
Följande protokoll allo ws ett villkor transformation av hudceller i zebrafisk larver och en efterföljande övervakning av interaktionen med medfödda immunceller genom fluorescerande protein uttryck. De grundläggande metoder som används i detta protokoll liknar några vanliga tekniker inom zebrafisk samfundet 9-13.
Den generation och kombinato användning av transgena linjer tillsammans med mikroinjektion av transgena konstruktioner möjliggör en övergående inställning till endast omvandla enstaka celler i en mosaik sätt. Syrepermeabiliteten hos embryonala och larvzebrafisk huden ökar möjligheten för time-lapse levande imaging studier av högupplösande mikroskopi från timmar till dagar. Dessutom kommer tillgängligheten till vattenlösliga läkemedel att framtida mekanistiska studier och övervakning av cellbiologiska händelser in vivo som kan leda till en bättre förståelse av de tidigaste stadierna av cancerutveckling.
_content "> Detta protokoll kan anpassas för att utföra villkor genuttryck i alla vävnader av intresse för zebrafisk larver i en mosaik sätt. Man kan också optimera mikroskopet inställningen för att leva bild andra än huden djupare vävnader.Protocol
Följande experimentella procedurer utfördes i strikt överensstämmelse med de djur (vetenskapliga procedurer) Act 1986.
1. Framställning av plasmid-DNA för mikroinjektion
- Rena plasmiden pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP med en kommersiell plasmid-DNA reningskit enligt tillverkarens instruktioner och späd plasmid-DNA till en slutlig stamlösning koncentration av 100 ng / ul.
- Linjärisera transposas innehållande plasmid pT3TS / Tol2 14 genom BamHI-restriktionsdigerering, genom att följa tillverkarens protokoll. Detta steg kan förlängas över natten. Fälla ut lineariserad DNA genom en fenol / kloroform-extraktion, enligt standardprotokoll.
- In vitro transkribera transposaset mRNA från ariserade plasmiden med ett kommersiellt transkription kit för stora mängder utjämnade RNA enligt tillverkarens anvisningar, späd och alikvot tillen slutlig förrådslösning koncentration av 100 ng / pl i nukleasfritt vatten. Säkerställa kvaliteten av den renade RNA med en nativ 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra, 1 mM EDTA) agarosgelelektrofores (80-120 V). Förvara RNA vid -80 ° C.
2. Mikroinjektion av plasmid DNA för Transient Gene Expression
- Förbered en agaros injektion platta för att hålla de befruktade äggen under injektion. Häll vätskan 3% agaros i en 90 mm petriskål. Låt agarosen svalna till 40-50 ° C och tillsätt den kilas formade mikroinjektion mögel TU-1 ovanpå den flytande agaros. Efter härdning vid rumstemperatur, låt agarosen vila vid 4 ° C under 30 min innan avlägsnande av formen. Butiksmikroinjektion formar vid 4 ° C och återanvändning.
- Förbered en alikvot av injektionslösningen. Utför följande steg på is. Pipettera 1 il plasmid-DNA (slutkoncentration av 10 ng / ul), 2 ul av transposas-mRNA (slutkoncentration 20 ng / ul), 2il av 10 mg / ul rodamin B-isotiocyanat-Dextran, 2 pl av 5x Danieau-lösning (290 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 3 mM Ca (NO3) 2, 25 mM HEPES, pH 7,6) till en slutlig volym av 10 ul i nukleasfritt vatten.
- Förbered nålar av borsilikatglas kapillärer i ett mm diameter innehållande en inre filamentet genom att dra i kapillären i motsatta riktningar med en mikropipett avdragare. Använd följande program: värma 530, drar 200, hastighet 80 och tid 150.
- Fyll en nål med 2 pl av injektionslösningen (hålls på is). Undvik bubblor genom att försiktigt dra tillbaka microspetsen samtidigt släppa lösningen i kapillär. Försiktigt bryta nålspetsen med en pincett.
- Reglera droppstorleken med en pneumatisk pico pump. Mät droppdiametern / volym (V = 4/3 πr 3) och justera droppstorleken med en okulär mikrometer under ett stereoskop i dimetylpolysiloxan. Vi rekommenderar100 ^ m, vilket motsvarar 0,5 nl. Detta försäkrar enhetliga och reproducerbara halter per varje injicerade embryo. Titrera den injicerade koncentration och justera för varje konstruktion och plasmidberedning.
- Placera zygotes (Figur 1A) som erhållits från en korsning av Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 med Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 i formarna efter injektionen platta genom användning av en 3 ml pastette. Samtidigt håller spetsen på förhand förberedda injektionsnålen i dimetylpolysiloxan att undvika lösningen från uttorkning och koagulering.
- Injicera förväg uppmätt droppe (100 | j, m motsvarar 0,5 nl) under ett stereoskop genom chorion in i blastocysten 17, före den första klyvningen (Figur 1A). Injektion i en-cellstadiet ökar potentialen av en likformig fördelning av plasmid-DNA och RNA i framkallningscellmassan och möjligheten för embryolinjetransmission. Det äranmärkningsvärt att uttrycket av konstruktioner tenderar oftare att vara mosaik.
3. Villkorlig hudcell Omvandling av 4-hydroxitamoxifen (4-OHT)
- Överför de injicerade embryona in 0.3x Danieau lösning och hålla dem vid 28,5 ° C i en inkubator. Ta bort obefruktade ägg från skålen på sfären stadiet 17. Sam-injicerade rodamin B isotiocyanat-dextran kan utnyttjas som en injektion-kontroll enligt en fluorescerande stereoskop.
- Skärm embryon vid 24 HPF (timmar efter befruktning) för hjärt uttryck av eGFP. Fortsätt att höja cmlc: EGFP positiva zebrafisk embryon fram 72 HPF. Noggrant övervaka vatten kvalitet (0.3x Danieau).
- Ta chorion av dessa embryon som inte har kläckts med pincett vid 72 HPF. Försiktigt peta chorion med en pincett och dra isär den med hjälp av andra. Välj embryon för lysC: DsRed2 uttryck med hjälp av en fluorescerande stereoskop.
- Lägg 10 ul av en 10 mMlager av (Z) -4-hydroxitamoxifen till 20 ml av 0.3x Danieau-lösning (slutlig koncentration av 5 pM). Använd 4-OHT induktions lösning för en standard petriskål (90 mm) på en sats av 40-60 embryon.
- Överför embryon till en ny petriskål med 20 ml nybakade induktionslösning. 4-OHT måste lagras och hanteras i mörker. De första tecknen på uttryck kan detekteras 2 timmar efter induktion påbörjas. Induktions steg kan förlängas över en natt, med tanke på att första värdcell: preneoplastiska cell interaktioner redan kan uppstå några timmar efter behandlingen.
4. Montering och Live avbildning av Zebrafish Larver
- Bered en 60 mm petriskål genom att införa ett hål med en diameter på 18-20 mm. Använd högvakuum silikonfett för att täcka och täta hålet på den yttre botten av petriskål med en 25 mm täckglas (Figur 1B).
- Bered en% låg smältpunkt (LMP) agaros. Håll en 1,5 ml rörav LMP agaros vid 37 ° C i ett värmeblock.
- Förval Tg (krt4: KalTA4-ER T2, UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) larver för grönt fluorescerande hudcell och DsRed2 positiva medfödda immunceller uttryck, i lysrörsstereoskop. Bedöva larver genom tillsats av 1 ml av 0,4% tricaine 18 till 20 ml induktionslösning.
- Överför förvalda larver med ett pastette i vätskan LMP agarosen. Låt larverna sjunka ner i LMP agaros och överföra dem på täckglaset (Figur 1B). Orientera embryona under ett stereoskop. Larverna måste placeras direkt på glaset för att minska arbetsavståndet (upp till 6 larver).
- Täck LMP agarosen med tricaine innehåller induktionslösning efter att den har härdat (figur 1B pil).
- Bild den inbäddade larver med hjälp av en inverterad fluorescerande, laserskanning eller snurrande skiva konfokalmikroskop. Använd ett 40X eller 63XMålet som mål med långa arbetsdagar avstånd möjliggör fokusering genom hela larver.
Representative Results
Zygotes av en korsning mellan Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 och Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg saml 10-15 min efter befruktning (Figur 1A) för att erhålla en cellscen embryon. Efter injektion embryona höjdes till 3 dpf, före induktion med 4-OHT och montering för live imaging (Figur 1B). 2-6 h efter induktion de monterade embryona placerades antingen under ett inverterat fluorescensmikroskop (figur 2A) eller ett inverterat konfokalmikroskop (Figur 2B-C) och avbildas för 2-3 h med 1,5 minuters intervall. Preneoplastiska ytliga hudceller kan identifieras genom deras mer rundad morfologi jämfört med normala keratinocyter, liksom den gröna fluorescerande emission av membranet lokaliserade eGFP-HRAS G12V. Områden av avbildning valdes för samlokalisering av preneoplastiska hudceller och medfödda immunceller (Figur 2A pilspets). På grund av den snabba migranson process neutrofilerna de tidsförlopp intervall valdes till mellan 1-1,5 min med Z bunt stegstorlekar av 0,7-1,7 um för att erhålla maximal intensitet projektioner (Figur 2, Video 1). Det finns ett brett spektrum av beteenden som kan observeras medan levande avbildning: neutrofiler migrerar bredvid och under preneoplastiska celler (figur 2C, Video 1), bildar direkta kontakter till celler (Figur 2B och C), ta bort rester av preneoplastiska celler som genomgår apoptos (Video 1), eller aktivt uppsluka delar av preneoplastiska celler (visas ej). För att fånga hela spektrat av interaktioner, är det lämpligt att följa sina beteenden genom time-lapse levande avbildning.
Figur 1: Schematisk för villkorlig hudcell omvandling i zebrafisk larver. (A) En bild av en zygot av Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) zebrafisk vid 10 min efter befruktning (MPF). Det befruktade ägget är omgiven av chorion (pilspets). Webbplatsen för injektion är blastocysten (asterisk), som bildas av cytoplasma strömmar från gulan (pilen) som definierar djuret polen av embryot. (B) Montering av zebrafisk larver. 60 mm petriskål med ett 18-20 mm hål (pilspets) som är förseglad genom en 25 mm täckglas. Den zebrafisk larver är immobiliserade och monteras på täckglaset med 1% LMP agaros. 0.3x Danieau lösning (pil) innehållande 5 iM 4-OHT används för att täcka LMP agaros. (C) 4-OHT inducerade omvandlingar av ytliga hudceller. (A) Schematisk tvärsnittsprofil av larver hud. Den embryonala och larver hud är sammansatt av två epiteliala cellskikt, en ytlig cellskikt och ett basalcellskikt av keratinocyter som är anslutna till det underliggande basalmembranet (BM). (B) Övergående expressionssystem to framkalla en preneoplastisk cellklon bland ytliga hudceller. KalTA4-ER T2 uteslutande uttrycks i det yttersta hudlagret driven av krt4 promotorn (gul). Mosaik expression av KalTA4-ER T2 aktiverar UAS kontrollerad (blå) EGFP-HRAS G12V uttryck i ytliga celler, vilket leder till en klon av preneoplastiska celler (gröna). (D) Schematisk ritning av transienta expressionssystem. (A) Tol2 kassett av pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP expressionsvektor används transient (b) Villkorlig induktion av transkriptionsaktivator uttryck.. KalTA4 fuseras till den mutanta ligandbindande domänen av den humana östrogenreceptorn α (ER T2) som binder specifikt 4-hydroxitamoxifen (4-OHT). I avsaknad av 4-OHT ER T2 är bunden i cytoplasman genom värmechockproteiner (Hsp90). Vid 4-OHT bindande Hsp90 dissocierar, vilket gör en nukleär translokation av KalTA4-ERT2 och efterföljande aktivering av UAS kontrollerade eGFP-HRAS G12V uttryck. Skala bar A = 500 nm. klicka gärna här för att se en större version av bilden.
Figur 2: Live avbildning av preneoplastisk och medfödda immunceller interaktion. (AC) Bilder av ett 4 dpf Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embryo, som har injicerats med pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP och transposas mRNA vid en cellstadiet. Bilder togs efter 6 timmar av 4-OHT-induktion (A) sidovy av tailfin regionen vid 6 timmar efter behandling, som visar fläckar av EGFP-HRAS G12V uttrycker hudceller (pil), och LysC:. DsRed2 + neutrofiler (pilspets). (BC) Bilderna taken från en konfokal time-lapse film, visar neutrofil (röd) interaktioner med eGFP-HRAS G12V uttrycker hudceller (grön). (B) En preneoplastisk cell bildar en kort filopodial förlängning med kontakt neutrofila (pilspets). (C) neutrofiler (röd) är i nära kontakt med en klon av preneoplastiska hudceller (grön). Skalstreck i A = 100 pm; B / C = 50 pm. Klicka här för att se en större version av bilden.
Video 1 : Time-lapse Live avbildning av preneoplastisk och medfödda immunceller interaktion. Time-lapse av en 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embryo, injiceras med pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP och transposas mRNA vid ett cellstadiet. Confocal tidsförlopp film 6-9 hoUrs efter 4-OHT induktion visar lysC: DsRed2 + neutrofil (röd) interaktioner med eGFP-HRAS G12V uttrycker hudceller (grön). Neutrofiler migrerar bredvid och under preneoplastiska celler och ta bort resterna av en preneoplastisk cell som genomgår apoptos. Time-lapse intervaller om 1,5 min under 3 timmar med Z stack stegstorlekar av 1,3 um.
Discussion
Under embryogenes och larvutveckling, är den embryonala zebrafisk hud sammansatt av två epiteliala skikt, det ytliga skiktet kallas periderm och ett skikt av basala keratinocyter som är fästa till det underliggande basalmembranet 19 (Figur 1C, a). Protokollet presenteras här beskriver en enkel metod för att villkor framkalla preneoplastisk-celltransformation i ytliga hudlagret av zebrafisk larver, och möjliggör efterföljande interaktionsanalys med medfödda immunceller genom levande avbildning. De grundläggande metoder inom våra protokoll följer väletablerade zebrafisk tekniker 9-13, och våra protokoll kan enkelt anpassas och modifieras.
Den krt4 promotorn 5 används här driver KalTA4-ER T2 uttryck specifikt i det yttersta hudlagret (Figur 1C, b). Emellertid, det modulära Multisite Gatewaykloning strategi, som används för att generera krt4: KalTA4-ER T2 konstruktion (Figur 1D, a), ger möjlighet att klona någon promotor av intresse framför KalTA4-ER T2 i ett enda kloningssteg. En anpassning av metoden som presenteras häri är därför möjligt för de flesta vävnader under embryogenes och larvstadier. Tillgängligheten av promotorsekvenser är härmed den begränsande faktorn. Dessutom kan nästan alla gen av intresse klonad bakom en UAS vara villkoröveruttryckt i olika utvecklingsstadier genom användning av den rumsliga och tidsmässigt styrd KalTA4-ER T2 uttryck. Därför kan våra protokoll anpassas för att utföra villkor genuttryck i alla vävnader av intresse för zebrafisk larver i en mosaik sätt. Man kan också optimera mikroskopet inställningen för att leva bild djupare vävnader såsom lever eller bukspottkörtel.
Vi har beskrivit ett program med hjälp av protokollet hanre, på samma sätt kan man överuttrycker andra inflammations modulatorer använder detta protokoll för att studera regleringen av inflammatoriska svar, som man kan lätt sökarbilden neutrofila och makrofag beteendeförändringar efter induktion och gripandet i uttrycket av en kandidat inflammatorisk modulator. Dessutom skulle anpassat protokollet också vara till nytta för dem som vill spåra cellrörelse och beteendeförändringar under olika stadier av vävnadsmorfogenes och organbildning och slutligen sökarbilden interaktionen av medfödda immunceller interaktioner med andra specifika cellinjer som kan riktas av det inducerbara KalTA4-ER T2 / UAS expressionssystem.
Vi använde pDestTol2CG vektorn från zebrafisk Tol2kit 20-23 som innehåller en cmlc2: eGFP-pA kassetten (figur 1D, a) som möjliggör efterföljande val av embryon av gröna fluorescerande positiva hjärtan som a seling markör 20 som förenklar F0 screening process. En stabil insättning av transposonen flanke genen av intresse i genomet underlättas av sam-injektion av plasmid-DNA tillsammans med transposas mRNA. Beredningen av plasmid-DNA och transposaset mRNA för mikroinjektion följer standardprotokoll. Men en framgångsrik integration av konstruktionen i genomet beror på Tol2 Baserade införlivande 14. Detta belyser särskild uppmärksamhet ägnas åt att arbeta på is under sterila förhållanden för att undvika föroreningar och försämringar av RNaser och DNaser. Mikroinjektion i en cell skede embryon är en robust och väletablerad teknik för vinst och förlust av funktionsstudier i zebrafisk 9,10. Även om en vältränad person lätt kan injicera i gulan av över 1.000 embryon i 1 timme, den injektion i blastocysten (Figur 1A, asterisk) kräver mer erfarenhet och utbildning. Kritisk under denna procedur is hantering av nålen. Nålen måste vara mycket tunn för att penetrera cellen utan skador och måste brytas endast på mycket dess spets därför. Det är viktigt att regelbundet kontrollera och mäta droppstorleken under insprutningen för att garantera en enhetlig injektion i varje embryo. Försiktigt hanteras, nålen kan användas för att rotera embryot. Detta behövs ofta för att hitta blastocysten och optimal penetrationsvinkeln.
Koncentrationen av DNA och transposas mRNA används för injektion nästan säkert påverkar uttrycket effektiviteten. Högre doser kan leda till en ökad andel av celler som uttrycker transgenen men med högre koncentrationer av DNA (> 50 ng / ul) och transposas-mRNA (> 100 ng / ul) även är aktuell potentialen för toxiska effekter bland injicerade embryon. Vi föredrar användning av 10 ng / ul DNA och 20 ng / ul transposas mRNA för injektion, vilket motsvarar 50 pg av plasmid-DNA och 100 pg av RNA per injicerad embryo. 100% av embryon som injicerats med dessa koncentrationer inte utvecklas normalt, och mellan 40-70% show eGFP-HRAS G12V uttryck, efter 4-OHT induktion, beroende på injektionseffektiviteten i en enda cell. Bland positiva embryon vi normalt hittar ca 30% som har 1-10 kloner, 40% som har 10-50 kloner och 30% har mer än 50 kloner. Tack vare våra forsknings mål, gynnar vi användning av embryon med färre kloner som uttrycker EGFP-HRAS G12V. Vi väljer embryon med 10-50 kloner för våra transienta experiment. För generering av transgena grundare fisk, rekommenderar vi att bara välja embryon med både eGFP positiva hjärtmarkör och ett stort antal eGFP-HRAS G12V positiva kloner i deras epidermis.
(Z) -4-hydroxitamoxifen undergår en cis-trans (EZ) interomvandling när den utsätts för ljus 24. Det visade sig att cis-isomeren (E) är 100x mindre anti-östrogena än sin trans motsvarighet 25,26. Exposure för ljus måste därför undvikas. Den 4-OHT stamlösning löst i etanol kan lagras vid -20 ° C i mörker under en lång tidsperiod. Vi rekommenderar användning av en låda för att skydda petriskålar från ljus under målet geninduktion inom inkubatorn och transport. Även området imaging är mycket liten och exponering av 4-OHT för UV-ljus reduceras till ett minimum, ett ständigt utbyte av induktionslösning varje 2 timmar medan avbildning över längre tidsperioder rekommenderas för att bibehålla högsta uttrycksnivåer. 4-OHT permeabilizes effektivt genom chorion och de yttersta hudlagren under zebrafisk embryogenes, därför kan inducera genuttryck mycket snabbt. Vi kan lätt konstatera eGFP utsläpp efter 2 h av induktion och det har rapporterats att första tecknen på mål-genuttryck kan observeras efter 1 timme och platå efter 3 tim behandling 8. Skillnaderna kan bero på den annan promotor som används i vår studie. Som har previously rapporterade att 4-OHT behandling är dosberoende 8,27, valde vi att använda den högsta rapporterade koncentrationen av 5 iM att uppnå robusta och reproducerbara uttrycksnivåer i vår gående strategi. Detta bör garantera att alla celler som bär transgenen kommer att inducera målgenuttryck.
Det måste beaktas att den transienta synsätt som presenteras här kan leda till varierande uttrycksnivåer på grund av risken för flera och slumpmässiga genomet insättningshändelser. Vidare användning av transposaset mRNA i Tol2 transgen bakgrund av Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kan leda till potentiella införlivanden av UAS transgen som kan resultera i geners uttryck eller störningar. Men eftersom metoden presenteras här representerar en övergående strategi, är det första urvalet av embryon efter den injektion obligatoriskt. Många laboratorier har funnit att UAS sekvenser tenderar att tystas i den transgena avkomman, alltså ijecting den pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP bygga in Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryon kanske inte vara så effektiv som att injicera en UAS konstruera in Tg (krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: GFP ) embryon. Användningen av den stabila transgena linjen Tg (krt4: KalTA4-ER T2) korsas med Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kommer att möjliggöra en noggrann övervakning av on / off kinetik tids doseringen beroende 4-OHT genaktivering .
Ett kritiskt steg under monteringen av larver är överföringen till LMP agaros och på täckglaset (Figur 1B). Det är bara en kort tidsram för flytande LMP agaros temperatur som möjliggör en säker överföring och orientering förvalda larver utan att skada fisken antingen värmechock eller härdning av gelén. Larverna ska orient direkt på täckglaset för att minska arbetsavståndet för den efterföljande mikroskopisk analysis. Eftersom detta kan vara en begränsande faktor under mikroskopi valet av lämpliga mål är obligatoriskt. När monterade, kan larven hållas från timmar till dagar.
Villkorlighet systemmodell som presenteras häri möjliggör upprepad omvandling av 4-OHT aktivering av transgenen. Uttrycket system beror på närvaron av 4-OHT och därför KalTA4 kontrollerade uttrycket av en gen av intresse är reversibel (Figur 1D, b). I motsats till den Cre-ER T2 / Lox-systemet, vilket underlättar en irreversibel genomisk rekombinationshändelse 28, kan KalTA4-ER T2 / UAS aktiveras och avaktiveras vid tillsats eller avlägsnande av 4-OHT och denna potential för upprepad induktion är en fördel med tekniken över Cre-ER T2 / Lox-systemet. Dock är kravet på konstanta nivåer av 4-OHT en begränsning om experimentet måste förlängas från dagar till veckor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
