Summary
Studere de tidligste hendelsene i preneoplastiske celle progresjon og medfødte immunceller samhandling er avgjørende for å forstå og behandle kreft. Her beskriver vi en metode for å betinget indusere epiteliale celletransformasjoner og den påfølgende levende avbildning av medfødte immunceller interaksjon med HRAS G12V uttrykker hudceller i sebrafisk larver.
Introduction
Overvekst av en preneoplastiske celle avkom innenfor en ellers normal epitel ark sterkt avhengig av et samspill med sin mikromiljøet. Interaksjonen med vertens vev er egnet til å være den viktigste faktor for hvorvidt en preneoplastiske celle er i stand til å etablere en klonal nisje å videreutvikle til en fullverdig kreft. Til tross for sin betydning i utvikling, er denne innledende fase av kreft progresjon utilgjengelige i de fleste vanlig anvendte modellsystemer, in vivo.
Sebrafisk, Danio rerio, er en veletablert modellorganisme for live imaging studier på grunn av sin åpenhet gjennom utvikling, muligheten for genetisk manipulasjon, og tilgjengelighet for vannløselige stoffer. Nyere studier ved hjelp av en larve sebrafisk modell, overekspresjon menneske onkogen HRAS G12V å forvandle epitelceller, viste at vertscelle avledet signaler, særlig H 2 O 2 ledelse tilrekruttering av medfødte immunceller. Interessant, rekruttert immunceller, nøytrofile granulocytter og makrofager, ble vist å ha en trofisk rolle i å støtte preneoplastiske celleproliferasjon 2,3.
For å forstå de tidlige hendelsene i startfasen og progresjon, samt bidrag av en betennelsesreaksjon, må man være i stand til bilde disse hendelsene fra den tidligste tidspunkt utover. Derfor er det nødvendig å kontrollere celletransformasjoner i et tidsmessig og vevsspesifikk måte. Vi benytter Gal4 / UAS system som har blitt tilpasset fra Drosophila 4 til betinget uttrykke det humane onkogen HRAS G12V under kontroll av huden promoter keratin 4 (krt4) 5. Den modifiserte versjonen av den transkripsjonelle aktivator Gal4, nemlig KalTA4 6, muliggjør ekspresjon av HRAS G12V under kontroll av den Upstream Activating Sequence (UAS). For å betinget indusere ekspresjon transkripsjonen aktivator, har KalTA4 blitt kondensert til den mutante ligand-bindende domene av human østrogenreseptor α (ER T2) 7 som binder spesifikt 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. I fravær av 4-OHT ER T2 er bundet i cytoplasma av varmesjokkproteiner. Ved 4-OHT binding av varmesjokk-proteiner dissosierer, noe som gir et atomtranslokasjon av KalTA4-ER T2 og påfølgende aktivering av UAS kontrollerte genet av interesse 8 (figur 1C, b). Ettersom dette ekspresjonssystem er avhengig av nærvær av 4-OHT, er KalTA4 kontrollert ekspresjon av et gen av interesse reversibel. I motsetning til den Cre-ER T2 / LOX-system, noe som fører til en irreversibel rekombinasjon, er dannelse av transkripsjonen aktivering av KalTA4-ER T2 reversibel ved tilsetning eller fjerning av 4-OHT.
Følgende protokoll allo ws en betinget transformasjon av hudceller på sebrafisk larver og en etterfølgende kontroll av samspillet med medfødte immunceller ved fluorescerende protein uttrykk. De grunnleggende metoder som benyttes i denne protokollen er lik noen brukte teknikker innenfor sebrafisk samfunnet 9-13.
Generering kombinatoriske bruk av transgene linjer sammen med mikroinjeksjon av transgene konstruksjoner gjør det mulig for en transient måte å omdanne bare enkeltceller i et mosaikk måte. Oksygenpermeabiliteten av embryonale og larvesebrafisk hud øker muligheten for intervall levende imaging studier av høy oppløsning mikroskopi fra timer til dager. Videre vil tilgjengeligheten til vannløselige legemidler tillate fremtidige mekanistiske studier og overvåking av cellebiologiske hendelser i vivo som kan føre til en bedre forståelse av de tidligste stadier av kreftutviklingen.
_content "> Denne protokollen kan tilpasses til å utføre betinget genuttrykk i noen vev av interesse i sebrafisk larver, i en mosaikk måte. Man kan også optimalisere mikroskop innstillingen for å leve bilde dypere enn huden vev.Protocol
Følgende eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført i henhold til de Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986.
1. Fremstilling av plasmid-DNA for Mikroinjeksjon
- Rense plasmid pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP med et kommersielt plasmid DNA rensesett ifølge fabrikantens instruksjoner, og fortynne plasmid-DNA til en endelig stamløsning konsentrasjon på 100 ng / mL.
- Linearisere transposase inneholder plasmid pT3TS / Tol2 14 av BamHI begrensning fordøyelsen, etter produsentens protokoll. Dette trinnet kan forlenges over natten. Utfelle det lineariserte DNA med en fenol / kloroform-ekstraksjon, etter standard protokoll.
- In vitro transkribere transposase mRNA fra den lineariserte plasmid med en kommersiell transkripsjon kit for store mengder avkortet RNA i henhold til produsentens anvisninger, fortynne og delmengde tilen endelig stamløsning konsentrasjon på 100 ng / mL i nuclease-fritt vann. Sikre kvaliteten av det rensede RNA med en innfødt 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre, 1 mM EDTA) agarose gel elektroforese (80-120 V). Oppbevar RNA ved -80 ° C.
2. Mikroinjeksjon av plasmid DNA for Transient Gene Expression
- Forberede en agarose injeksjon plate til å holde befruktede egg under injeksjon. Hell væsken 3% agarose inn en 90 mm petriskål. La agarose avkjøles til 40-50 ° C og tilsett kilt formede mikroinjeksjon formen TU-ett på toppen av det flytende agarose. Etter herding ved romtemperatur, la agarose hvile ved 4 ° C i 30 minutter før fjerning av støpeformen. Butikk mikroinjeksjon muggsopp ved 4 ° C og gjenbruk.
- Tilbered en delmengde av injeksjonsoppløsningen. Utfør følgende trinn på is. Pipetter en pl av plasmid-DNA (sluttkonsentrasjon på 10 ng / ul), 2 ul av transposase-mRNA (sluttkonsentrasjon 20 ng / ul), 2-ul av 10 mg / mL rhodamin B isotiocyanat-dekstran, 2 ul 5x Danieau-oppløsning (290 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 3 mM Ca (NO 3) 2, 25 mM HEPES, pH 7,6) til en sluttvolum på 10 ul i nuclease-fritt vann.
- Forbered nåler fra borsilikatglass kapillærene mm diameter en som inneholder en indre filament ved å trekke kapillær i motsatt retning med en Mikropipette Puller. Bruk følgende program: varme 530, trekke 200, hastighet 80 og tid 150.
- Fylle en nål med 2 mL av injeksjonsvæsken (holdt på is). Unngå bobler ved forsiktig å trekke microloader spissen mens slippe oppløsningen inn i kapillært. Knekk forsiktig tuppen av nålen med en tang.
- Reguler dråpestørrelse med en pneumatisk pico pumpe. Mål dråpe diameter / volum (V = 4/3 πr 3) og juster dråpestørrelse med en okulær mikrometer under et stereoskop i dimethylpolysiloxan. Vi anbefaler100 um, svarende til 0,5 nl. Dette sikrer ensartede og reproduserbare konsentrasjoner per hver injisert embryo. Titrere injisert konsentrasjon og justere for hver konstruere og plasmid forberedelse.
- Plasser zygoter (figur 1A) oppnådd fra en krysning av Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 15 med Tg (lysC: dsRed2) nz50Tg 16 inn i støpeformene av sprøyteplaten ved bruk av en 3 ml pastette. I mellomtiden, hold tuppen av pre utarbeidet kanyle i dimethylpolysiloxan å unngå løsningen tørker opp og blodpropp.
- Injiser forhånd målt dråpe (100 um svarende til 0,5 nl) under et stereoskop gjennom chorion inn i blastodisc 17, før den første spaltning (figur 1A). Injeksjon i en celle-stadiet øker potensialet for en jevn fordeling av plasmid DNA og RNA i den tredje cellemasse og muligheten for kimlinje-transmisjon. Det erkjent at ekspresjon av konstruksjonene har en tendens til å være mer ofte mosaikk.
3. Betinget Skin Cell Transformation av 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)
- Overfør de injiserte embryoer til 0.3x Danieau løsning og holde dem på 28.5 ° C i en inkubator. Fjern ubefruktede egg fra fatet ved sfære stadium 17. Co-injisert Rhodamine B isothiocyanat-dekstran kan benyttes som en injeksjon-kontroll i fluorescerende stereoskop.
- Skjerm embryoer ved 24 HPF (timer etter befruktning) for hjerte uttrykk for EGFP. Fortsette å heve cmlc: EGFP positive sebrafisk embryo før 72 HPF. Overvåke nøye vann-kvalitet (0.3x Danieau).
- Ta av chorion av disse embryoene som ikke har klekket med pinsett på 72 HPF. Rote nøye chorion med en pinsett og trekke det fra hverandre ved hjelp av den andre. Velg embryoer for lysC: dsRed2 uttrykk ved hjelp av et fluorescerende stereoskop.
- Tilsett 10 pl av en 10 mMlager av (Z) -4-Hydroxytamoxifen til 20 ml 0.3x Danieau oppløsning (sluttkonsentrasjon på 5 pM). Bruke 4-OHT induksjon-løsning for en standard petriskål (90 mm) på en gruppe med 40-60 embryoer.
- Overfør embryoene inn i en ny petriskål inneholder 20 ml nylaget induksjon-løsning. 4-OHT må lagres og håndteres i mørket. De første tegnene på uttrykk kan bli oppdaget to timer etter induksjon tiltredelse. Induksjon-trinnet kan bli utvidet over natten, husk at første vertscelle: preneoplastiske celle interaksjoner kan allerede skje noen timer etter behandling.
4. Montering og Live Imaging av Sebrafisk Larver
- Tilbered en 60 mm petriskål ved å innføre et hull med en diameter på 18-20 mm. Bruk høy-vakuum silikonfett til å dekke og forsegle hullet på den ytre bunnen av petriskål med en 25 mm dekkglass (figur 1B).
- Forbered 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose. Hold en 1,5 ml tubeav LMP-agarose ved 37 ° C i en varmeblokk.
- Prefix Tg (krt4: KalTA4-ER T2; UAS: EGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) larver for grønn fluorescerende hudcelle og dsRed2 positive medfødte immunceller uttrykk, under et fluorescerende stereoskop. Bedøve larver ved tilsetning av 1 ml 0,4% Tricaine 18 til 20 ml induksjons løsning.
- Overføre den forutvalgte larver med en pastette i væsken LMP-agarose. La larvene synke inn i LMP agarose og overføre dem til dekkglasset (figur 1B). Orientere embryoene under et stereoskop. Larvene må plasseres direkte på glass for å redusere arbeidsavstanden (opp til 6 larver).
- Dekk LMP-agarose med Tricaine inneholder induksjons løsning etter at den har herdet (figur 1B pil).
- Image den innebygde larver bruker en invertert fluorescerende, laserskanning eller en roterende disk konfokal mikroskop. Bruk en 40X eller 63XMålet som mål med lange arbeidsdager avstander muliggjør fokus gjennom hele larver.
Representative Results
Zygotes av en krysning mellom Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 og Tg (lysC: dsRed2) nz50Tg ble samlet 10-15 min etter befruktning (figur 1A) for å få en celle-trinns embryoer. Etter injeksjon embryoene ble reist inntil tre dpf, før induksjon med 4-OHT og montering for live imaging (Figur 1B). 2-6 timer etter induksjon de monterte embryoer ble plassert enten under et invertert fluorescerende mikroskop (figur 2A) eller et invertert konfokalt mikroskop (figur 2B-C) og avbildes i 2-3 timer med 1,5 minutters intervaller. Preneoplastiske overfladiske hudceller kan identifiseres ved deres mer avrundet morfologi sammenlignet med normale keratinocytter, så vel som den grønne fluorescerende emisjon av membranen lokalisert EGFP-HRAS G12V. Områder i bildebehandling ble valgt for samlokalisering av preneoplastiske hudceller og medfødte immunceller (Figur 2A pilspiss). På grunn av den raske migrasjon prosess av nøytrofile time-lapse intervallene ble valgt til å være mellom 1-1,5 min med Z stack vise størrelser på 0,7 til 1,7 mikrometer for å oppnå maksimal intensitet projeksjoner (figur 2, Video 1). Det er et bredt spekter av atferd som kan observeres mens levende avbildning: nøytrofile migrere ved siden av og under preneoplastiske celler (Figur 2C, Video 1), danner direkte kontakter til celler (figur 2B og C), fjerne rester av preneoplastiske celler som gjennomgår apoptose (Video 1), eller aktivt sluker deler av preneoplastiske celler (ikke vist). På å utnytte hele spekteret av interaksjoner, er det tilrådelig å følge deres atferd etter time-lapse levende avbildning.
Figur 1: Skjematisk for betinget hudcelle transformasjon i sebrafisk larver. (A) Et bilde av en zygote av Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V; LysC: dsRed2) sebrafisk på 10 min etter befruktning (MPF). Det befruktede egget er omgitt av chorion (pilspiss). Injeksjonsstedet er blastodisc (stjerne), dannet av cytoplasmatiske strømmer fra plommen (pil) som definerer dyret pol av embryoet. (B) Montering av sebrafisk larver. 60 mm petriskål med en 18-20 mm hull (pilspiss) som er forseglet med en 25 mm dekkglass. Sebrafisk larver er immobilisert og montert på frontglass med 1% LMP agarose. 0.3x Danieau løsning (pil) inneholdende 5 uM 4-OHT blir brukt til å dekke LMP-agarose. (C) 4-OHT indusert transformasjoner av overfladiske hudceller. (A) skjematisk tverrsnittprofil over larve hud. Den embryoniske og larve hud er sammensatt av to epiteliale cellelagene, en overfladisk cellelaget og et basalcellelaget av keratinocytter som er koblet til den underliggende grunnmembran (BM). (B) Transient ekspresjon systemet to indusere en preneoplastiske celleklon blant overfladiske hudceller. KalTA4-ER T2 er utelukkende uttrykt i det ytterste hudlaget drevet av krt4 promoter (gul). Mosaikk ekspresjon av KalTA4-ER T2 aktiverer UAS kontrollert (blå) EGFP-HRAS G12V ekspresjon i overfladiske celler, som fører til en klon av preneoplastiske celler (grønt). (D) Skjematisk av transient ekspresjonssystem. (A) Tol2 kassett av pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP uttrykk vektor brukes forbigående (b) Betinget induksjon av transkripsjons aktivator uttrykk.. KalTA4 er fusjonert til den mutante ligand-bindende domene av den humane østrogenreseptoren α (ER T2) som binder spesifikt 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). I fravær av 4-OHT ER T2 er bundet i cytoplasma av varmesjokkproteiner (HSP90). Ved 4-OHT bindende HSP90 distanserer, slik at en kjernefysisk translokasjon av KalTA4-ERT2 og påfølgende aktivering av UAS kontrollerte EGFP-HRAS G12V uttrykk. Skala bar A = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 2: Live-avbildning av preneoplastiske og medfødte immunceller interaksjon. (AC) Bilder av en fire dpf Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) embryo, som har blitt injisert med pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP og transposase mRNA på en celle stadiet. Bildene ble tatt etter 6 timer med 4-OHT induksjon (A) Lateral visning av halefinnen region 6 timer etter behandling, viser flekker av EGFP-HRAS G12V uttrykker hudceller (pil), og lysC:. DsRed2 + nøytrofile (pilspiss). (BC) Representative bilder TAken fra et konfokal time-lapse film, viser nøytrofile (rød) interaksjoner med EGFP-HRAS G12V uttrykker hudceller (grønt). (B) En preneoplastiske celle danner en kort filopodial forlengelse med å kontakte nøytrofile (pilspiss). (C) Nøytrofiler (rød) er i nær kontakt til en klone av preneoplastiske hudceller (grønt). Skala bar i A = 100 mikrometer; B / C = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Video 1 : Time-lapse levende avbildning av preneoplastiske og medfødte immunceller interaksjon. Time-lapse av en fire dpf Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) embryo, injisert med pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP og transposase mRNA på en celle stadiet. Konfokalmikroskoper time-lapse film fra 6-9 hours etter fire-OHT induksjon viser lysC: dsRed2 + nøytrofile (rød) interaksjoner med EGFP-HRAS G12V uttrykker hudceller (grønt). Nøytrofile migrere ved siden av og under preneoplastiske celler og fjerne restene av en preneoplastiske celle som gjennomgår apoptose. Time-lapse intervaller på 1,5 min løpet av 3 timer med Z stack trinnstørrelser på 1,3 mikrometer.
Discussion
I løpet av embryogenesen og larveutvikling, er den embryoniske sebrafisk hud sammensatt av to lag epitelceller, overfladiske lag som kalles periderm og et lag av basale keratinocytter som er festet til den underliggende grunnmembran 19 (figur 1C, a). Protokollen presenteres her beskriver en grei metode for å betinget indusere preneoplastiske-celle transformasjon i den overfladiske hud laget av sebrafisk larver, og gjør det mulig for påfølgende interaksjonsanalyse med medfødte immunceller ved levende avbildning. De grunnleggende metoder i vår protokoll følger veletablerte sebrafisk teknikker 9-13, og vår protokoll kan enkelt tilpasses og endres.
Den krt4 promoter 5 anvendes her driver KalTA4-ER T2 uttrykket spesifikt i det ytterste hudlaget (figur 1C, b). Men den modulære Multisite Gatewaykloningsstrategi, som brukes til å generere krt4: KalTA4-ER T2-konstruksjonen (figur 1D, a), gir mulighet for å klone en hvilken som helst promoter av interesse foran KalTA4-ER T2 i et enkelt kloningstrinn. En tilpasning av fremgangsmåten presentert heri er derfor mulig for de fleste vev under embryogenese og larvestadiet. Tilgjengeligheten av promotersekvenser er herved den begrensende faktor. Videre kan nesten en hvilken som helst gen av interesse klonet bak en UAS være betinget overuttrykt på forskjellige utviklingsstadier ved bruk av romlig og tidsmessig styrt KalTA4-ER T2 ekspresjon. Derfor kan vår protokollen bli tilpasset til å utføre betinget genekspresjon i ethvert vev av interesse for sebrafisk larver, i en mosaikk måte. Man kan også optimalisere mikroskop innstillingen for å leve bilde dypere vev slike som lever eller bukspyttkjertel.
Vi har beskrevet et program ved hjelp av protokollen hanre, på samme måte, kan man overuttrykke andre betennelses modulatorer bruke denne protokollen for å studere reguleringen av betennelsesreaksjoner, som man kan lett levende bilde nøytrofile og makroatferdsendringer etter induksjon og arrest i uttrykket av en kandidat inflammatorisk modulator. Videre vil tilpasset protokollen også være gunstig for de som ønsker å spore mobil bevegelse og atferdsendring under ulike stadier av vev morphogenesis og orgel dannelse og, endelig levende bilde samspillet av medfødte immuncelle interaksjoner med andre spesifikke celle linjene som kan være målrettet av induserbare KalTA4-ER T2 / UAS uttrykk system.
Vi brukte pDestTol2CG vektor fra sebrafisk Tol2kit 20-23 som inneholder en cmlc2: EGFP-pA kassett (figur 1D, a) som gjør det mulig påfølgende valg av embryoer av grønne fluorescerende positive hjerter som en selection markør 20 som forenkler F0 screening prosessen. En stabil innsetting av transposon flankert genet av interesse i genomet lettes ved ko-injeksjon av plasmid-DNA sammen med transposase mRNA. Utarbeidelse av plasmid DNA og transposase mRNA for mikroinjeksjon følger standardprotokoller. Men en vellykket integrering av konstruksjonen i genomet avhenger Tol2-baserte trans 14. Dette understreker særlig oppmerksomhet skal betales for å arbeide på is under sterile forhold for å unngå forurensing og ødeleggelse av RNases og DNaser. Mikroinjeksjon i én-celle scene embryo er et robust og godt etablert teknikk for gevinst og tap av funksjon studier i sebrafisk 9,10. Selv en godt trent person lett kan injisere i plommen av over 1000 embryoer i 1 time, injeksjon inn i blastodisc (figur 1A, stjerne) krever mer erfaring og trening. Kritisk under denne prosedyren is håndtering av nålen. Nålen må være meget tynt for å trenge inn i cellen uten å ta skade, og derfor må brytes bare på sin spiss. Det er viktig å kontrollere og regelmessig måle dråpestørrelsen under injeksjon for å garantere en ensartet injeksjon i hvert embryo. Omhyggelig behandlet, nålen kan brukes til å rotere embryo. Dette er ofte nødvendig for å finne den blastodisc og optimal penetrasjon vinkel.
Konsentrasjonen av DNA og transposase mRNA brukes for injeksjon nesten helt sikkert påvirker ekspresjonen effektivitet. Høyere doser kan føre til en øket andel av celler som uttrykker transgenet, men med høyere konsentrasjoner av DNA (> 50 ng / mL) og transposase mRNA (> 100 ng / mL) også potensialet for toksiske effekter blant injiserte embryoer ikke oppstår. Vi foretrekker å bruke 10 ng / pl DNA og 20 ng / mL transposase mRNA for injeksjon, noe som svarer til 50 pg av plasmid-DNA og 100 pg RNA pr injisert embRyo. 100% av embryoer injisert med disse konsentrasjoner ikke utvikle seg normalt, og mellom 40 til 70% viser EGFP-HRAS G12V ekspresjon, etter at 4-OHT induksjon, avhengig av injeksjonseffektiviteten inn i én celle. Blant positive embryoer vi vanligvis finner ca 30% som har 1-10 kloner, 40% som har 10-50 kloner og 30% har mer enn 50 kloner. På grunn av våre forsknings mål, vi favorisere bruk av embryoer med færre kloner uttrykker EGFP-HRAS G12V. Vi velger embryoer med 10-50 kloner for våre forbigående eksperimenter. For generering av transgen grunnleggeren fisk, anbefaler vi å bare velge embryoer med både EGFP positive hjerte markør og et stort antall EGFP-HRAS G12V positive kloner i sine epidermis.
(Z) -4-Hydroxytamoxifen gjennomgår en cis-trans (EZ) omdannelse når de utsettes for lys 24. Det ble funnet at cis-isomeren (E) er 100x mindre anti-østrogenisk enn dens trans motstykke 25,26. Exposure til lys må derfor unngås. Det 4-OHT stamløsning oppløst i etanol kan lagres ved -20 ° C i mørket over en lang tidsperiode. Vi anbefaler bruk av en boks for å beskytte petriskåler fra lys under målgen induksjon i kuvøse og transport. Selv om området for avbildning er svært liten, og eksponering av 4-OHT for UV-lys reduseres til et minimum, en konstant utveksling av induksjonsløsning hver 2 timer mens avbildning over lengre tidsperioder er det anbefalt å opprettholde maksimale ekspresjonsnivåer. 4-OHT permeabilizes effektivt gjennom chorion og de ytterste hudlagene under sebrafisk embryogenese, derfor kan det indusere genuttrykk svært raskt. Vi kan lett observere EGFP utslipp etter 2 timer for induksjon, og det har blitt rapportert at de første tegn på target-genekspresjon kan observeres etter 1 time og platå etter 3 timers behandling 8. Forskjellene kan være på grunn av den forskjellige promoter anvendt i vårt studium. Som har vært previously rapportert at fire-OHT behandling er doseavhengig 8,27, valgte vi å bruke den høyeste rapporterte konsentrasjonen av fem mikrometer for å oppnå robuste og reproduserbare uttrykk nivåer i vår forbigående tilnærming. Dette skal sikre at alle celler som bærer transgenet, vil indusere target-genekspresjon.
Det må tas hensyn til at den transiente tilnærming presentert her kan føre til varierende ekspresjonsnivåer på grunn av muligheten av flere og tilfeldige genom innsetting hendelser. Videre er bruken av transposase-mRNA i Tol2 transgen bakgrunn av Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 kan føre til mulige transponering av UAS transgenet som kunne resultere i genet Slå eller avbrudd. Men som den metoden som presenteres her representerer en forbigående tilnærming, er den forhåndsvalg av embryoer påfølgende til injeksjon obligatorisk. Mange laboratorier har funnet ut at UAS sekvenser tendens til å bli brakt til taushet i den transgene avkom, derav irager den pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP konstruere inn Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 embryoer kan ikke være så effektiv som å injisere en UAS konstruere inn Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embryoer. Bruken av den stabile transgen linje Tg (krt4: KalTA4-ER T2) krysset med Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 vil tillate en nøyaktig måling av på / av kinetikk tids dosering avhengig 4-OHT genaktivering .
Et kritisk trinn under monteringen av larver er overføringen inn i LMP-agarose og inn på dekkglasset (figur 1B). Det er bare en kort tidsramme for flytende LMP agarose temperatur som muliggjør en sikker overføring og orientering av den forhåndsvalgte larver uten å skade fisken enten ved varmesjokk eller herding av gel. Larvene bør orienteres direkte på dekkglass for å redusere arbeidsavstanden for den påfølgende mikroskopisk analysis. Da dette kan være en begrensende faktor ved mikros valg av passende mål er obligatorisk. Når den er montert, kan larven opprettholdes fra timer til dager.
Kondisjonalitet av modellsystemet som presenteres her gir mulighet for gjentatt transformasjon av 4-OHT aktivering av transgenet. Uttrykket system avhenger av nærvær av 4-OHT og derfor KalTA4 kontrollert ekspresjon av et gen av interesse er reversibel (figur 1D, b). I motsetning til den Cre-ER T2 / LOX-system, som muliggjør en irreversibel genomisk rekombinasjon 28, kan KalTA4-ER T2 / UAS aktiveres og deaktiveres ved tilsetning eller fjerning av 4-OHT og dette potensialet for gjentatt induksjon er en fordel teknikken over Cre-ER T2 / Lox system. Imidlertid er kravet til konstante nivåer av 4-OHT en begrensning dersom forsøket har til å bli forlenget fra dager til uker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
