Summary
Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.
Introduction
De begroeiing van een pre-neoplastische cel nageslacht binnen een overigens normale epitheliale blad is sterk afhankelijk van een interactie met de micro-omgeving. De interactie met gastheerweefsel is waarschijnlijk de belangrijkste determinant of een pre-neoplastische cel kan een klonale niche verder ontwikkelen tot een volledige geblazen kanker vast te stellen. Ondanks het belang in ontwikkeling, deze eerste fase van kanker progressie ontoegankelijk meest gebruikte modelsystemen in vivo.
De zebravis, Danio rerio, is een gevestigde modelorganisme voor live-imaging studies vanwege de transparantie in de ontwikkeling, de mogelijkheid tot genetische manipulatie, en toegankelijkheid voor wateroplosbare geneesmiddelen. Recente studies met een larvale zebravis model overexpressie menselijke oncogen HRAS G12V epitheelcellen transformeren bleek dat gastheercel afgeleide signalen, met name H 2 O 2 voorsprongde werving van aangeboren immuunsysteem cellen. Interessant is dat de aangeworven immuuncellen, neutrofielen en macrofagen, werden naar een trofische rol in de ondersteuning preneoplastische celproliferatie 2,3 hebben.
Om de vroege gebeurtenissen van tumor initiatie en progressie en de bijdrage van een ontstekingsreactie begrijpen, moet men kunnen beeld deze gebeurtenissen vanaf het vroegste tijdstip vanaf. Daarom is het noodzakelijk om de cel transformaties regelen in een tijdelijke en weefsel specifieke manier. Wij gebruiken de Gal4 / UAS systeem met succes aangepast van Drosophila 4 voorwaardelijk drukken de menselijke oncogen HRAS G12V onder controle van de huid specifieke promotor keratine 4 (krt4) 5. De gewijzigde versie van de transcriptionele activator GAL4 namelijk KalTA4 6, maakt expressie van HRAS G12V onder de controle van de Upstream Activating Sequence (UAS). De transcriptionele activator uitdrukking voorwaardelijk induceren, is KalTA4 gefuseerd aan het mutante ligand bindende domein van de humane oestrogeen receptor α (ER T2) 7 die specifiek 4-hydroxytamoxifen bindt (4-OHT) 1. Aangezien 4-OHT het ER T2 is gebonden in het cytoplasma door warmte-shock eiwitten. Bij 4-OHT binding warmte-shock eiwitten dissociëren, waardoor een nucleaire translocatie van KalTA4-ER T2 en daaropvolgende activatie van de UAS gecontroleerde gen van belang 8 (figuur 1C, b). Aangezien dit expressiesysteem afhankelijk van de aanwezigheid van 4-OHT, de KalTA4 gecontroleerde expressie van een gen van belang is omkeerbaar. In tegenstelling tot de Cre-ER T2 / Lox-systeem, hetgeen leidt tot een onomkeerbare recombinatie gebeurtenis, de inductie van transcriptionele activatie door KalTA4-ER T2 is omkeerbaar door toevoeging of verwijdering van 4-OHT.
Het volgende protocol allo ws een voorwaardelijke transformatie van de huidcellen in de zebravis larven en een daaropvolgende controle van de interactie met aangeboren immuunsysteem cellen door fluorescerend eiwit expressie. Basistechnieken voor het werkzaam zijn in dit protocol zijn vergelijkbaar met een aantal veel gebruikte technieken binnen de zebravis gemeenschap 9-13.
De opwekking en combinatorische gebruik van transgene lijnen met de micro-injectie van transgene constructen kan een voorbijgaande benadering slechts enkele cellen te transformeren in een mozaïek wijze. De zuurstofdoorlaatbaarheid van de embryonale en larvale zebravis huid verhoogt de mogelijkheid voor time-lapse live beeldvorming studies van hoge-resolutie microscopie van uren tot dagen. Voorts zal de toegankelijkheid tot wateroplosbare geneesmiddelen toekomstige mechanistische studies en de controle cel biologische gebeurtenissen die in vivo kan leiden tot een beter begrip van de beginfase van de kanker mogelijk.
_content "> Dit protocol kan worden aangepast aan conditionele genexpressie verrichten in alle weefsels van interesse zebravis larven in een mozaïek wijze. Men kan ook optimaliseren microscoop instelling om beeld uitzondering skin diepere weefsels leven.Protocol
De volgende experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986.
1. Bereiding van plasmide DNA voor Microinjection
- Zuiver het plasmide pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP met een commercieel plasmide-DNA zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant en verdun het plasmide DNA aan een uiteindelijke voorraadoplossing concentratie van 100 ng / ul.
- Lineariseren de transposase met plasmide pT3TS / Tol2 14 door BamHI restrictievertering, naar aanleiding van de fabrikant protocol. Deze stap kan 's nachts worden verlengd. Neerslag het gelineariseerde DNA door een fenol / chloroform extractie, na het standaardprotocol.
- In vitro transcriptie van het transposase mRNA van het gelineariseerde plasmide met een commerciële transcriptie kit voor grote hoeveelheden capped RNA volgens de instructies van de fabrikant, verdunnen en hoeveelheid Meteen laatste voorraad oplossing concentratie van 100 ng / ul in nuclease-vrij water. Zorgen kwaliteit van het gezuiverde RNA met een native 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA) agarose gelelektroforese (80-120 V). Bewaar het RNA bij -80 ° C.
2. Micro-injectie van plasmide DNA voor Transient Gene Expression
- Bereid een agarose injectie plaat om de bevruchte eieren te houden tijdens de injectie. Giet vloeibaar 3% agarose in een 90 mm petrischaal. Laat de agarose afkoelen tot 40-50 ° C en voeg het wigvormig micro-injectie schimmel TU-1 boven de vloeistof agarose. Na het uitharden bij kamertemperatuur, laat het agarose rust bij 4 ° C gedurende 30 min voor het verwijderen van de mal. WINKEL microinjectie schimmels bij 4 ° C en hergebruik.
- Bereid een aliquot van de injectieoplossing. Voer de volgende stappen op het ijs. Pipetteer 1 pi plasmide-DNA (eindconcentratie van 10 ng / ul), 2 ui transposase mRNA (eindconcentratie 20 ng / ul), 2ui 10 mg / gl Rhodamine B-isothiocyanaat-dextran, 2 pl 5x Danieau oplossing (290 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 3 mM Ca (NO3) 2, 25 mM HEPES, pH 7,6) tot een eindvolume van 10 ul in nuclease-vrij water.
- Bereid naalden van borosilicaatglas capillairen van 1 mm diameter met een gloeidraad door aan het capillair in tegengestelde richtingen met een Micropipet trekker. Gebruik het volgende programma: Verwarm 530, trek 200, snelheid 80 en tijd 150.
- Vul een naald met 2 pl van de injectie-oplossing (op ijs bewaard). Voorkom luchtbellen door voorzichtig terugtrekken van de microloader tip terwijl het vrijgeven van de oplossing in het capillair. Breken de punt van de naald met een tang voorzichtig.
- Reguleren van de druppelgrootte met een pneumatische pico pomp. Meet de druppel diameter / volume (V = 4/3 πr 3) en stel de druppelgrootte met een oculair micrometer onder een stereoscoop in dimethylpolysiloxan. Wij raden aan100 urn, overeenkomend met 0,5 nl. Dit verzekert uniforme en reproduceerbare concentraties per elke geïnjecteerde embryo. Titreer de geïnjecteerde concentratie en passen voor elk construct en plasmidepreparaat.
- Plaats de zygoten (figuur 1A) verkregen uit een kruising van Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 met Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 in de mallen van de injectieplaat met behulp van een 3 ml pastette. Ondertussen houdt de punt van de vooraf bereide injectienaald in dimethylpolysiloxaan de oplossing uitdroogt en stolling te voorkomen.
- Injecteer de vooraf gemeten druppel (100 urn overeenkomend met 0,5 nl) onder een stereoscoop door het chorion in de blastodiscus 17 vóór de eerste splitsing (Figuur 1A). Injectie in de één-cel fase vergroot de mogelijkheid van een gelijkmatige verdeling van het plasmide DNA en RNA in de ontwikkelende celmassa en de mogelijkheid kiembaantransmissie. Het isopvallend dat de expressie van constructen neigt vaker mozaïek zijn.
3. Voorwaardelijke huidcel Transformatie door 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)
- Breng de geïnjecteerde embryo's in 0.3x Danieau oplossing en houd ze bij 28,5 ° C in een incubator. Verwijder onbevruchte eieren van de schotel op bol stadium 17. De co-geïnjecteerde Rhodamine B-isothiocyanaat-dextran kan worden gebruikt als een injectie-controles onder een fluorescerende stereoscoop.
- Scherm embryo's bij 24 HPF (uur na de bevruchting) voor cardiale expressie van eGFP. Blijven cmlc verhogen: eGFP positieve zebravis embryo's tot 72 HPF. Nauwlettend toezien op de waterkwaliteit (0.3x Danieau).
- Verwijder de chorion van die embryo's die niet zijn uitgekomen met een pincet op 72 HPF. Porren voorzichtig het chorion met 1 tang en trek hem uit elkaar met behulp van de andere. Selecteer embryo's voor IvsC: DsRed2 expressie met behulp van een fluorescerende stereoscoop.
- Voeg 10 ul van 10 mMstock (Z) -4-hydroxytamoxifen 20 ml 0.3x Danieau oplossing (eindconcentratie 5 uM). Gebruik de 4-OHT inductie-oplossing voor een standaard petrischaal (90 mm) op een batch 40-60 embryo.
- Breng de embryo's in een nieuwe petrischaal met 20 ml vers gemaakte inductie-oplossing. 4-OHT moet worden opgeslagen en behandeld in het donker. De eerste tekenen van expressie kan worden gedetecteerd 2 uur na inductie aanvang. De inductie-stap kan 's nachts worden verlengd, in gedachten houden dat de eerste gastheercel: kan preneoplastische cel interacties al optreden een paar uur na de behandeling.
4. Montage en Live-Imaging van zebravis Larven
- Bereid een 60 mm petrischaal door introductie van een gat met een diameter van 18-20 mm. Gebruik hoog vacuüm siliconenvet om af te dichten het gat op de buitenste onderkant van de petrischaal met een 25 mm dekking van glas (Figuur 1B).
- Bereid 1% laag smeltpunt (LMP) agarose. Houd een 1,5 ml tubeLMP agarose bij 37 ° C in een verwarmingsblok.
- Preselect Tg (krt4: KalTA4-ER T2; UAS: eGFP-HRAS G12V; IvsC: DsRed2) larven voor groen fluorescerend huidcel en DsRed2 positieve aangeboren immuunsysteem cel uitdrukking, onder een tl-stereoscoop. Verdoven larven door toevoeging van 1 ml 0,4% tricaïne 18 tot 20 ml inductie oplossing.
- Breng de voorgeselecteerde larven met een pastette in de vloeistof LMP agarose. Zodat de larven zich wegzakken in de LMP agarose en over te brengen naar de dekking van glas (Figuur 1B). Oriënteren de embryo's onder een stereoscoop. De larven moeten direct op het glas (tot 6 larven) geplaatst om de werkafstand verminderen.
- Bedek de LMP agarose met tricaïne bevattende inductie oplossing na uitharding (Figuur 1B pijl).
- Afbeelding de embedded larven met behulp van een omgekeerde fluorescerende, laser-scanning of draaiende schijf confocale microscoop. Gebruik een 40X of 63Xobjectieve als doelstellingen met lange werkafstanden maken het mogelijk gericht door de hele larven.
Representative Results
Zygoten van een kruising tussen Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 en Tg (IvsC: DsRed2) nz50Tg werden verzameld 10-15 minuten na de bevruchting (Figuur 1A) tot 1 cel-stadium embryo's te verkrijgen. Na injectie van de embryo's werden verhoogd tot 3 dpf, voordat inductie met 4-OHT en montage voor live beeldvorming (Figuur 1B). 2-6 uur na inductie de gemonteerde embryo's werden geplaatst hetzij onder een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop (figuur 2A) of een omgekeerde confocale microscoop (Figuur 2B-C) en afgebeeld 2-3 uur 1,5 min intervallen. Preneoplastische oppervlakkige huidcellen kunnen worden geïdentificeerd door de meer afgeronde morfologie vergelijking met normale keratinocyten, alsmede de groene fluorescente emissie van de gelokaliseerde eGFP-HRAS G12V. Gebieden van beeldvorming werden geselecteerd voor co-lokalisatie van preneoplastische huidcellen en aangeboren immuunsysteem cellen (Figuur 2A pijlpunt). Door de snelle migrantsoen werkwijze van de neutrofielen de time-lapse tussenpozen werden gekozen tussen 1-1.5 min met Z stapel stap groottes van 0,7-1,7 urn maximale intensiteit uitsteeksels (figuur 2 Video 1) te verkrijgen. Er is een breed scala van gedragingen die kunnen worden waargenomen tijdens live beeldvorming: neutrofielen migreren naast en onder preneoplastische cellen (figuur 2C, Video 1), vormen directe contacten cellen (Figuur 2B en C), verwijder restanten van preneoplastische cellen ondergaan apoptose (Video 1), of actief overspoelen delen preneoplastische cellen (niet getoond). Om het volledige spectrum van interacties vast te leggen, is het raadzaam om hun gedrag te volgen door time-lapse live beeldvorming.
Figuur 1: Schematische voor voorwaardelijke huidcel transformatie in de zebravis larven. (A) Een beeld van een zygote van Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; IvsC: DsRed2) zebravis op 10 min na de bevruchting (MPF). De bevruchte eicel wordt omringd door het chorion (pijlpunt). De plaats voor injectie is de blastodiscus (sterretje), gevormd door cytoplasmatische streams van de dooier (pijl) dat het dier paal van het embryo definieert. (B) Montage van de zebravis larven. 60 mm petrischaal met een 18-20 mm gat (pijlpunt), die wordt afgesloten door een 25 mm dekglas. De zebravis larven worden geïmmobiliseerd en gemonteerd op de dekking van glas met 1% LMP agarose. 0.3x Danieau oplossing (pijl) bevattende 5 uM 4-OHT wordt gebruikt om de LMP agarose selectie. (C) 4-OHT geïnduceerde transformatie van oppervlakkige huidcellen. (A) Schematische dwarsdoorsnede profiel van larvehuid. De embryonale en larvale huid bestaat uit twee lagen epitheelcel, een oppervlakkige cellaag en een basale cellaag van keratinocyten die zijn verbonden met de onderliggende basale membraan (BM). (B) Tijdelijke expressie systeo leiden tot een pre-neoplastische cel kloon onder oppervlakkige huidcellen. KalTA4-ER T2 is uitsluitend uitgedrukt in de buitenste laag huid gedreven door de krt4 promotor (geel). Mozaïek expressie van KalTA4-ER T2 activeert UAS gecontroleerde (blauw) eGFP-HRAS G12V expressie in oppervlakkige cellen leidt tot een kloon van preneoplastische cellen (groen). (D) Schematische voorstelling van het tijdelijke expressiesysteem. (A) Tol2 cassette van de pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP expressievector kortstondig gebruikt (b) Voorwaardelijke inductie van de transcriptionele activator expressie.. KalTA4 gefuseerd aan het mutante ligand bindende domein van de humane oestrogeen receptor α (ER T2) die specifiek 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) bindt. Aangezien 4-OHT het ER T2 is gebonden in het cytoplasma door warmte-shock eiwitten (Hsp90). Bij 4-OHT bindend Hsp90 distantieert, waardoor een nucleaire translocatie van KalTA4-ERT2 en daaropvolgende activatie van de UAS gecontroleerde eGFP-HRAS G12V expressie. Schaalbalk A = 500 micrometer. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Live-beeldvorming van preneoplastische en aangeboren immuunsysteem interactie cel. (AC) Foto van een 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embryo, die is geïnjecteerd met pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP en transposase mRNA in een cel stadium. Beelden werden genomen na 6 uur van 4-OHT inductie (A) Zijaanzicht van de staartvin gebied aan 6 uur na behandeling, met stukken eGFP-HRAS G12V expressie huidcellen (pijl), en lysC. DsRed2 + neutrofielen (pijlpunt). (BC) Vertegenwoordiger beelden taken van een confocale time-lapse film, het tonen van neutrofielen (rood) interacties met eGFP-HRAS G12V uiten van huidcellen (groen). (B) Een pre-neoplastische cel vormt een korte filopodial uitbreiding met het contact neutrofielen (pijlpunt). (C) neutrofielen (rood) in nauw contact staat met een kloon van preneoplastische huidcellen (groen). Schaalbalk in A = 100 pm; B / C = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Video 1 : Time-lapse live beeldvorming van preneoplastische en aangeboren immuunsysteem interactie cel. Time-lapse van een 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; IvsC: DsRed2) embryo, geïnjecteerd met pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP en transposase mRNA in één cel stadium. Confocale time-lapse film 6-9 hours na 4-OHT inductie zien IvsC: DsRed2 + neutrofielen (rood) interacties met eGFP-HRAS G12V uiten van huidcellen (groen). Neutrofielen migreren naast en onder pre-neoplastische cellen en verwijder resten van een pre-neoplastische cel die apoptose ondergaat. Time-lapse intervallen van 1,5 min gedurende 3 uur met Z stapel stap maten van 1,3 micrometer.
Discussion
Tijdens embryogenese en larvale ontwikkeling, de embryonale zebravis huid uit twee epitheliale lagen, de oppervlakkige laag die periderm en een laag van basale keratinocyten die zijn bevestigd aan de onderliggende basaalmembraan 19 (figuur 1C, a). De hier gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige methode om voorwaardelijk induceren preneoplastische-cel transformatie in de oppervlakkige huidlaag van de zebravis larven, en zorgt voor verdere interactie-analyse met aangeboren immuunsysteem cellen door live beeldvorming. De basistechnieken in ons protocol volgen goed gevestigde technieken zebravis 9-13 en ons protocol kan gemakkelijk worden aangepast en gewijzigd.
De krt4 promotor 5 hier gebruikt drijft KalTA4-ER T2 expressie specifiek in de buitenste huidlaag (figuur 1C, b). Echter, de modulaire MultiSite Gatewayklonen strategie gebruikt voor het genereren krt4: KalTA4-ER T2 construct (Figuur 1D, a), verschaft de mogelijkheid om eventuele promotor van belang voor KalTA4-ER T2 klonen in één kloneringsstap. Een aanpassing van de hierin voorgestelde werkwijze Daarom kan de meeste weefsels tijdens de embryonale en larvale stadia. De beschikbaarheid van promotorsequenties wordt hierbij de beperkende factor. Bovendien kan vrijwel elk gen van interesse gekloneerd achter een UAS voorwaardelijk overexpressie in verschillende ontwikkelingsstadia door gebruik van de ruimtelijke en temporeel gereguleerde KalTA4-ER T2 expressie. Daarom kunnen ons protocol worden aangepast aan conditionele genexpressie verrichten in alle weefsels van interesse zebravis larven in een mozaïek wijze. Men kan ook het optimaliseren van de microscoop instelling in om het imago van diepere weefsels zoals de lever of alvleesklier leven.
We hebben een applicatie met behulp van het protocol hij beschreefopnieuw, op dezelfde wijze, kan men andere ontstekingsmodulatoren een overexpressie van het gebruik van dit protocol om de regulering van ontstekingsreacties te bestuderen, zo kan men gemakkelijk livebeeld neutrofielen en macrofagen gedragsveranderingen na de inductie en de arrestatie in de expressie van een kandidaat-inflammatoire modulator. Bovendien zou het aangepaste protocol ook gunstig voor degenen die willen naar cel beweging en gedragsverandering te sporen tijdens de verschillende fasen van weefsel morfogenese en orgel vorming en zijn, eindelijk live-beeld van de interactie van aangeboren immuunsysteem cel interacties met andere specifieke cellijnen die kunnen worden gericht de induceerbare KalTA4-ER T2 / UAS expressiesysteem.
We gebruikten de pDestTol2CG vector van de zebravis Tol2kit 20-23 dat een cmlc2 bevat: eGFP-pA cassette (figuur 1D, a), die de daaropvolgende selectie van embryo's mogelijk maakt door groen fluorescerend positieve harten als een selection marker 20 dat de F0 screening proces vereenvoudigt. Een stabiele insertie van het transposon geflankeerd gen van interesse in het genoom wordt vergemakkelijkt door co-injectie van plasmide-DNA met transposase mRNA. De bereiding van plasmide-DNA en het transposase mRNA microinjectie volgt standaardprotocollen. Echter, een succesvolle integratie van het construct in het genoom afhankelijk van de Tol2 gebaseerde omzetting 14. Dit wijst op de bijzondere aandacht te worden besteed aan het werk op het ijs onder steriele omstandigheden om verontreinigingen en degradaties vermijden door RNases en DNasen. Micro-injectie in een-cellig stadium embryo's is een robuuste en gevestigde techniek voor winst en verlies van functie studies in zebravis 9,10. Hoewel een goed opgeleide persoon gemakkelijk kan injecteren in de dooier van meer dan 1.000 embryo's in 1 uur, de injectie in de blastodiscus (Figuur 1A, sterretje) vereist meer ervaring en opleiding. Kritische tijdens deze procedure is de afhandeling van de naald. De naald heeft een zeer dun om de cel zonder schade door te dringen te zijn en daarom moet worden doorbroken alleen op zijn uiterste puntje. Het is belangrijk om regelmatig controleren en meten van de druppelgrootte tijdens de injectie om een uniforme injectie garanderen in elk embryo. Zorgvuldig behandeld, de naald kan worden gebruikt om de embryo draaien. Dit is vaak nodig om de blastodiscus en de optimale penetratie hoek vinden.
De concentratie van DNA en transposase mRNA gebruikt voor injectie vrijwel zeker beïnvloedt de expressie efficiency. Hogere doses kunnen leiden tot een verhoogde verhouding van cellen die het transgen maar met hogere concentraties DNA (> 50 ng / ul) en transposase mRNA (> 100 ng / ul) ook het potentieel voor toxische effecten bij geïnjecteerde embryo niet voordoet. We geven de voorkeur 10 ng / ul DNA en 20 ng / ul transposase mRNA voor injectie, overeenkomend met 50 pg van plasmide-DNA en 100 pg RNA per geïnjecteerde embryo. 100% van de embryo's geïnjecteerd met deze Concentraties normaal ontwikkelen en 40-70% vertonen eGFP-HRAS G12V expressie na 4-OHT inductie afhankelijk van de injectierendement in de cel. Onder positieve embryo we normaal voorbeeld ongeveer 30% die 1-10 klonen, 40% dat 10-50 klonen en 30% met meer dan 50 klonen. Door onze onderzoeksdoelen, geven wij de voorkeur het gebruik van embryo's met minder klonen die eGFP-HRAS G12V. Wij selecteren embryo's met 10-50 klonen voor onze voorbijgaande experimenten. Voor het genereren van transgene oprichter vis, raden we aan om alleen te selecteren embryo's met zowel de eGFP positieve cardiale marker en een groot aantal eGFP-HRAS G12V positieve klonen in hun opperhuid.
(Z) -4-hydroxytamoxifen ondergaat een cis-trans (EZ) interconversie bij blootstelling aan licht 24. Gevonden werd dat de cis-isomeer (E) 100x minder anti-oestrogene dan zijn tegenhanger trans 25,26. BELICHTIe licht moet derhalve worden vermeden. De 4-OHT voorraadoplossing opgelost in ethanol bij -20 ° C worden bewaard in het donker gedurende een lange periode. Wij raden het gebruik van een doos om de petrischaaltjes bescherming tegen licht tijdens doel geninductie binnen de incubator en transport. Hoewel het gebied van beeldvorming is zeer klein en blootstelling van 4-OHT UV licht tot een minimum, een voortdurende uitwisseling van inductie oplossing om de 2 uur onder beeldvorming over langere perioden wordt aanbevolen maximale expressieniveaus handhaven. 4-OHT effectief permeabilizes door het chorion en de buitenste huidlagen tijdens zebravis embryogenese, daarom kan het genexpressie zeer snel te induceren. We kunnen gemakkelijk waarnemen eGFP emissie na 2 uur van inductie en er is gemeld dat eerste tekenen van target-genexpressie kan worden waargenomen na 1 uur en plateau na 3 uur behandeling 8. De verschillen kunnen het gevolg zijn van de verschillende promoter gebruikt in onze studie. Zoals reeds previously gemeld dat 4-OHT behandeling is afhankelijk van de dosis 8,27, hebben we ervoor gekozen om de hoogste gemelde concentratie van 5 uM gebruiken om robuuste en reproduceerbare expressie niveaus in onze voorbijgaande aanpak. Dit moet waarborgen dat alle cellen die het transgen doelwitgen expressie induceren.
Het heeft het feit dat de tijdelijke benadering hier gepresenteerde kan leiden tot variërende expressieniveaus worden genomen door de mogelijkheid van meervoudige genoom en willekeurige insertie gebeurtenissen. Bovendien is het gebruik van het transposase mRNA in de Tol2 transgene achtergrond van Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kan leiden tot mogelijke omzetting van de UAS transgen die kunnen resulteren in gen-silencing of verstoring. Aangezien de hier gepresenteerde methode vertegenwoordigt een voorbijgaande benadering de voorselectie van embryo na injectie verplicht. Veel laboratoria hebben ontdekt dat UAS sequenties hebben de neiging om worden uitgezet in de transgene nakomelingen, vandaar injecting de pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP construct in Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryo's misschien niet zo efficiënt als het injecteren van een UAS-construct in Tg (krt4 zijn: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embryo's. Het gebruik van de stabiele transgene lijn Tg (krt4: KalTA4-ER T2) gekruist met Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 zal een nauwkeurige controle van de aan / uit-kinetiek van de time-dosering afhankelijk 4-OHT genactivatie toestaan .
Een cruciale stap tijdens de montage van de larven is de overdracht in de LMP agarose en op de dekking van glas (Figuur 1B). Er is slechts een kort tijdsbestek voor vloeibare LMP agarose temperatuur die een veilige overdracht en oriëntatie van de voorgeselecteerde larven toelaat zonder nadelige gevolgen voor de vissen door een heat shock of verharding van de gel. De larven moeten direct worden gericht op de dekking van glas om de werkafstand te verminderen voor de daarop volgende microscopisch analysis. Aangezien dit een beperkende factor kan zijn tijdens microscopie de keuze van passende doelstellingen verplicht. Eenmaal gemonteerd, kan de larve worden gehandhaafd van uren tot dagen.
De voorwaarden van het modelsysteem hierin gepresenteerd zorgt voor herhaalde transformatie door 4-OHT activering van het transgen. Het expressiesysteem afhankelijk van de aanwezigheid van 4-OHT en daarom KalTA4 gereguleerde expressie van een gen van belang is omkeerbaar (figuur 1D, b). In tegenstelling tot de Cre-ER T2 / Lox-systeem, dat een onomkeerbare genomische recombinatie 28 vergemakkelijkt, kan KalTA4-ER T2 / UAS wordt geactiveerd en gedeactiveerd na toevoeging of verwijdering van 4-OHT en dit potentieel voor herhaalde inductie is een voordeel van de techniek via Cre-ER T2 / Lox systeem. De eis voor een constant niveau 4-OHT een beperking wanneer de proef moet worden verlengd van dagen tot weken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
