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Developmental Biology

लार्वा zebrafish त्वचा में एक inducible Gal4 / यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए सहज प्रतिरक्षा और Preneoplastic सेल बातचीत का लाइव इमेजिंग

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/52107
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1MRC Centre for Inflammation Research, Queen's Medical Research Institute, The University of Edinburgh, 2Department of Cell & Developmental Biology, University College London

Summary

Preneoplastic सेल प्रगति और सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत का जल्द से जल्द घटनाओं का अध्ययन समझते हैं और कैंसर के इलाज के लिए निर्णायक है। यहाँ हम सशर्त उपकला कोशिका परिवर्तनों और HRAS G12V zebrafish लार्वा में त्वचा कोशिकाओं को व्यक्त करने के साथ सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत के बाद रहते इमेजिंग के लिए प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन।

Introduction

एक अन्यथा सामान्य उपकला चादर के भीतर एक preneoplastic सेल संतान की अतिवृद्धि दृढ़ता से अपने microenvironment के साथ एक बातचीत पर निर्भर करता है। अपने मेजबान ऊतक के साथ बातचीत के एक preneoplastic सेल आगे एक पूर्ण विकसित कैंसर में विकसित करने के लिए एक प्रतिरूप आला स्थापित करने में सक्षम है या नहीं की प्रमुख निर्धारक होने की संभावना है। विकास में इसके महत्व के बावजूद, कैंसर प्रगति के इस प्रारंभिक चरण विवो में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल प्रणाली में दुर्गम है।

zebrafish, देनियो rerio, क्योंकि विकास के दौरान इसकी पारदर्शिता, पानी में घुलनशील दवाओं के लिए आनुवंशिक हेरफेर के लिए संभावना है, और पहुंच के रहते इमेजिंग के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है। उपकला कोशिकाओं को बदलने के लिए overexpressing, मानव ओंकोजीन HRAS G12V एक लार्वा zebrafish मॉडल का उपयोग हाल के अध्ययनों से, मेजबान सेल विशेष एच 2 ओ 2 का नेतृत्व करने में, संकेतों व्युत्पन्न पता चला है किसहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती। दिलचस्प बात यह है की भर्ती की प्रतिरक्षा कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज, preneoplastic सेल प्रसार 2,3 के समर्थन में एक पौष्टिकता भूमिका है दिखाया गया।

ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के प्रारंभिक घटनाओं के रूप में अच्छी तरह से एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के योगदान को समझने के क्रम में, एक के बाद जल्द से जल्द समय बिंदु से इन घटनाओं छवि करने में सक्षम होने की जरूरत है। इसलिए यह एक लौकिक और ऊतक विशिष्ट ढंग से सेल परिवर्तनों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है। हम सफलतापूर्वक सशर्त त्वचा विशिष्ट प्रमोटर केरातिन 4 (krt4) के नियंत्रण के तहत मानव ओंकोजीन HRAS G12V व्यक्त करने के लिए ड्रोसोफिला 4 से अनुकूलित किया गया है कि Gal4 / यूएएस प्रणाली 5 का उपयोग। ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक अर्थात् Gal4, KalTA4 6 का संशोधित संस्करण, नदी के ऊपर सक्रिय अनुक्रम का नियंत्रण (यूएएस के तहत HRAS G12V की अभिव्यक्ति में सक्षम बनाता है)। सशर्त ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए, KalTA4 विशेष रूप से चार-Hydroxytamoxifen बांधता है जो मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर α की उत्परिवर्ती ligand बाध्यकारी डोमेन (ईआर टी 2) 7 के लिए जुड़े हुए किया गया है (4-OHT) 1। 4-OHT के अभाव में ईआर टी 2 गर्मी झटका प्रोटीन द्वारा कोशिका द्रव्य में ही है। 4-OHT पर ब्याज 8 के जीन से नियंत्रित यूएएस के KalTA4-ईआर टी 2 के परमाणु स्थानान्तरण और बाद के सक्रियण की इजाजत दी, प्रोटीन को अलग कर देना गर्मी सदमे बाध्यकारी (चित्रा 1C, ख)। इस अभिव्यक्ति प्रणाली 4-OHT की उपस्थिति पर निर्भर करता है, ब्याज की एक जीन की KalTA4 नियंत्रित अभिव्यक्ति प्रतिवर्ती है। एक अपरिवर्तनीय पुनर्संयोजन घटना की ओर जाता है जो रचनात्मक-ईआर टी 2 / Lox प्रणाली, के विपरीत, KalTA4-ईआर टी 2 से ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण के शामिल होने के अलावा या 4 OHT को हटाने के द्वारा प्रतिवर्ती है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल allo zebrafish लार्वा में त्वचा कोशिकाओं के एक सशर्त परिवर्तन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत के बाद में एक निगरानी था। 13 - इस प्रोटोकॉल में कार्यरत बुनियादी तरीके zebrafish समुदाय 9 के भीतर कुछ आमतौर पर इस्तेमाल तकनीक के समान हैं।

पीढ़ी और साथ में ट्रांसजेनिक निर्माणों के microinjection साथ ट्रांसजेनिक लाइनों के combinatory उपयोग केवल एक मोज़ेक ढंग से एकल कक्षों को बदलने के लिए एक क्षणिक दृष्टिकोण में सक्षम बनाता है। भ्रूण और लार्वा zebrafish त्वचा की ऑक्सीजन पारगम्यता दिनों घंटे से उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी द्वारा समय व्यतीत रहते इमेजिंग अध्ययन के लिए संभावना को जन्म देती है। इसके अलावा, पानी में घुलनशील दवाओं के लिए अपनी पहुंच भविष्य यंत्रवत अध्ययन और कैंसर के विकास के प्रारंभिक चरणों को बेहतर ढंग से समझने के लिए ले जा सकता है कि इन विवो में सेल जैविक घटनाओं की निगरानी की अनुमति देगा।

_content "> इस प्रोटोकॉल एक मोज़ेक ढंग से, zebrafish लार्वा में ब्याज की किसी भी ऊतक में सशर्त जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक भी त्वचा के अलावा अन्य छवि गहरे ऊतकों जीने के लिए सेटिंग माइक्रोस्कोप का अनुकूलन कर सकते हैं।

Protocol

निम्नलिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के साथ सख्त अनुसार आयोजित की गई।

Microinjection के लिए प्लास्मिड डीएनए के 1. तैयारी

  1. EGFP निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक प्लास्मिड डीएनए शुद्धि किट के साथ और 100 एनजी / μl के अंतिम शेयर समाधान एकाग्रता के लिए प्लास्मिड डीएनए पतला: cmlc2; KalTA4-ईआर टी 2: प्लाज्मिड pTol2-krt4 शुद्ध।
  2. निर्माता प्रोटोकॉल के बाद BamHI प्रतिबंध पाचन द्वारा प्लाज्मिड pT3TS / Tol2 14 युक्त transposase, linearize। यह कदम रातोंरात बढ़ाया जा सकता है। मानक प्रोटोकॉल के बाद, एक फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा linearized डीएनए वेग।
  3. इन विट्रो में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार छाया हुआ शाही सेना की बड़ी मात्रा के लिए एक वाणिज्यिक प्रतिलेखन किट के साथ linearized प्लाज्मिड से transposase mRNA के नक़ल पतला और विभाज्यNuclease मुक्त पानी में 100 एनजी / μl के अंतिम शेयर समाधान एकाग्रता। एक देशी 1-2% TAE (40 मिमी Tris, 20 मिमी एसिटिक एसिड, 1 मिमी EDTA) agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (80-120 वी) के साथ शुद्ध शाही सेना की गुणवत्ता सुनिश्चित करने। -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना स्टोर।

क्षणिक जीन एक्सप्रेशन के लिए प्लास्मिड डीएनए के 2. Microinjection

  1. इंजेक्शन के दौरान निषेचित अंडे पकड़ करने के लिए एक agarose इंजेक्शन थाली तैयार है। एक 90 मिमी पेट्री डिश में तरल 3% agarose डालो। 40-50 डिग्री सेल्सियस के agarose शांत करते हैं और तरल agarose के शीर्ष पर अंकित के आकार का microinjection के ढालना टीयू-एक जोड़ें। कमरे के तापमान पर सख्त करने के बाद, मिट्टी हटाने से पहले 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर agarose आराम करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस और पुन: उपयोग में स्टोर microinjection के नए नए साँचे।
  2. इंजेक्शन समाधान के एक विभाज्य तैयार करें। बर्फ पर निम्न चरणों का पालन। पिपेट प्लास्मिड डीएनए (10 एनजी के अंतिम एकाग्रता / μl), transposase mRNA की 2 μl (अंतिम एकाग्रता 20 एनजी / μl), 2 की 1 μlएक करने के लिए 10 मिलीग्राम की μl / μl Rhodamine बी आइसोथियोसाइनेट-dextran, 5x Danieau समाधान के 2 μl (290 मिमी NaCl, 3.5 मिमी KCl, 2 मिमी MgSO 4, 3 मिमी सीए (सं 3) 2, 25 मिमी HEPES, पीएच 7.6) Nuclease मुक्त पानी में 10 μl की अंतिम मात्रा।
  3. एक micropipette खींचने के साथ विपरीत दिशाओं में केशिका खींच कर एक आंतरिक रेशा युक्त एक मिमी व्यास की borosilicate ग्लास केशिकाओं से सुई तैयार करें। निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करें: 530 गर्मी, 200, वेग 80 और समय 150 खींच।
  4. इंजेक्शन समाधान के 2 μl के साथ एक सुई भरें (बर्फ पर रखा)। केशिका में समाधान जारी करने के दौरान सावधानी microloader टिप वापस लेने से बुलबुले से बचें। ध्यान से एक संदंश के साथ सुई की नोक टूट गया।
  5. एक साँस पिको पंप के साथ ड्रॉप आकार को विनियमित। बूंद व्यास / मात्रा को मापने (वी = 4/3 πr 3) और dimethylpolysiloxane में एक स्टिरियोस्कोप के तहत एक आंख का माइक्रोमीटर से ड्रॉप आकार को समायोजित। हम अनुशंसा करते हैं0.5 nl करने के लिए इसी 100 माइक्रोन। यह प्रत्येक इंजेक्ट भ्रूण प्रति वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सांद्रता का आश्वासन दिया। इंजेक्ट एकाग्रता टाइट्रेट और प्रत्येक निर्माण और प्लाज्मिड तैयारी के लिए समायोजित करें।
  6. एक 3 मिलीलीटर pastette के उपयोग के द्वारा इंजेक्शन थाली के सांचों में nz50Tg 16 (: EGFP-HRAS G12V यूएएस) टीजी (dsRed2 lysC) के साथ io006 15 टीजी के एक क्रॉस से प्राप्त युग्मनजों (चित्रा 1 ए) रखें। इस बीच, सूख और थक्के से समाधान से बचने के लिए dimethylpolysiloxane में पूर्व तैयार इंजेक्शन सुई की नोक रहते हैं।
  7. Blastodisc 17, पहली दरार करने से पहले (चित्रा 1 ए) में जरायु के माध्यम से एक स्टिरियोस्कोप के तहत premeasured ड्रॉप (100 माइक्रोन 0.5 nl करने के लिए इसी) इंजेक्षन। एक सेल चरण में इंजेक्शन प्लास्मिड डीएनए और आरएनए के विकास सेल मास में और germline संचरण के लिए संभावना का एक समान वितरण की क्षमता बढ़ जाती है। यह हैनिर्माणों की अभिव्यक्ति अधिक बार मोज़ेक हो जाता है कि उल्लेखनीय।

4-Hydroxytamoxifen द्वारा 3. सशर्त त्वचा कोशिका परिवर्तन (4-OHT)

  1. 0.3x Danieau समाधान में इंजेक्शन भ्रूण स्थानांतरण और एक मशीन में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए। क्षेत्र चरण 17 पर पकवान से unfertilized अंडे निकालें। सह इंजेक्शन Rhodamine बी आइसोथियोसाइनेट-dextran एक फ्लोरोसेंट स्टिरियोस्कोप के तहत एक इंजेक्शन-नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
  2. EGFP के हृदय की अभिव्यक्ति के लिए 24 HPF (एचआर के बाद निषेचन) में स्क्रीन भ्रूण। Cmlc बढ़ाने के लिए जारी: EGFP सकारात्मक zebrafish भ्रूण 72 HPF तक। ध्यान से (Danieau 0.3x) पानी की गुणवत्ता की निगरानी।
  3. 72 HPF पर संदंश के साथ रची नहीं है कि उन भ्रूणों की जरायु निकालें। ध्यान से एक संदंश के साथ जरायु प्रहार और अन्य का उपयोग करके यह अलग खींच। एक फ्लोरोसेंट स्टिरियोस्कोप का उपयोग कर dsRed2 अभिव्यक्ति: lysC के लिए चयन करें भ्रूण।
  4. एक 10 मिमी के 10 μl जोड़ें0.3x Danieau समाधान के 20 मिलीलीटर (जेड) -4-Hydroxytamoxifen (5 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) के शेयर। 40-60 भ्रूण के एक बैच पर एक मानक पेट्री डिश (90 मिमी) के लिए 4-OHT प्रेरण-समाधान का उपयोग करें।
  5. ताजा बना प्रेरण-समाधान के 20 मिलीग्राम से युक्त एक नया पेट्री डिश में भ्रूण स्थानांतरण। 4-OHT संग्रहीत और अंधेरे में संभाला जाना है। अभिव्यक्ति का पहला संकेत दो घंटे बाद प्रेरण प्रारंभ से पता लगाया जा सकता है। preneoplastic सेल बातचीत पहले से ही उपचार के बाद कुछ ही घंटों में हो सकता है: प्रेरण कदम प्रारंभिक मेजबान सेल कि ध्यान में रखते हुए, रातों-रात बढ़ाया जा सकता है।

4. बढ़ते और zebrafish लार्वा की लाइव इमेजिंग

  1. 18-20 मिमी की एक व्यास के साथ एक छेद को शुरू करने से एक 60 मिमी पेट्री डिश तैयार करें। कवर और एक 25 मिमी कवर गिलास (चित्रा 1 बी) के साथ पेट्री डिश के बाहरी तल पर छेद सील करने के लिए उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल का प्रयोग करें।
  2. 1% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose तैयार। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब रखेंएक हीटिंग ब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर एलएमपी agarose की।
  3. एक फ्लोरोसेंट स्टिरियोस्कोप के तहत हरी फ्लोरोसेंट त्वचा कोशिका और dsRed2 सकारात्मक सहज प्रतिरक्षा सेल अभिव्यक्ति के लिए लार्वा, preselect टीजी (dsRed2 krt4: KalTA4-ईआर टी 2;:; यूएएस lysC EGFP-HRAS G12V)। 20 मिलीलीटर प्रेरण समाधान के लिए 0.4% tricaine 18 के 1 मिलीलीटर के अलावा द्वारा लार्वा anesthetize।
  4. तरल एलएमपी agarose में एक pastette साथ preselected लार्वा स्थानांतरण। लार्वा agarose एलएमपी में डूब करते हैं और कवर गिलास (चित्रा 1 बी) पर उन्हें हस्तांतरण। एक स्टिरियोस्कोप के तहत भ्रूण मालूम। लार्वा (6 लार्वा तक) काम दूरी को कम करने के कांच पर सीधे रखा जाना है।
  5. यह (चित्रा 1 बी तीर) के कठोर होने के बाद प्रेरण समाधान युक्त tricaine साथ एलएमपी agarose कवर।
  6. छवि एक औंधा फ्लोरोसेंट, लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क confocal खुर्दबीन का उपयोग एम्बेडेड लार्वा। एक 40x या 63X का प्रयोग करेंलंबे समय तक काम दूरी के साथ उद्देश्यों के रूप उद्देश्य पूरे लार्वा के माध्यम से ध्यान केंद्रित कर सकें।

Representative Results

Io006 और टीजी (lysC: dsRed2): टीजी (EGFP-HRAS G12V यूएएस) के बीच एक क्रॉस की युग्मनजों nz50Tg एक सेल चरण भ्रूण प्राप्त करने के लिए 10-15 मिनट के बाद निषेचन (चित्रा 1 ए) एकत्र किए गए थे। इंजेक्शन के बाद भ्रूण 4-OHT साथ प्रेरण और लाइव इमेजिंग (चित्रा 1 बी) के लिए बढ़ते से पहले, 3 DPF तक उठाए गए थे। 2-6 घुड़सवार भ्रूण एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे या तो रखा गया था घंटा पद प्रेरण (2A चित्रा) या एक औंधा confocal खुर्दबीन (चित्रा 2B-सी) और 1.5 मिनट के अंतराल के साथ 2-3 घंटे के लिए imaged। Preneoplastic सतही त्वचा कोशिकाओं को सामान्य केरेटिनकोशिकाओं, साथ ही EGFP-HRAS G12V स्थानीयकृत झिल्ली की हरी फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की तुलना में उनकी अधिक गोल आकृति विज्ञान द्वारा की पहचान की जा सकती है। इमेजिंग के क्षेत्रों preneoplastic त्वचा कोशिकाओं और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं (2A चित्रा नोक) के सह-स्थानीयकरण के लिए चयन किया गया था। कारण तेजी से मिग करने के लिएसमय चूक के अंतराल चुना गया neutrophils के राशन प्रक्रिया अधिकतम तीव्रता के अनुमानों (चित्रा 2, 1 वीडियो) प्राप्त करने के लिए 0.7-1.7 माइक्रोन के Z स्टैक कदम आकार के साथ 1-1.5 मिनट के बीच किया जाना है। लाइव इमेजिंग जबकि मनाया जा सकता है कि व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला है: न्यूट्रोफिल, करने के लिए और preneoplastic कोशिकाओं (चित्रा -2, वीडियो 1) के तहत अगले विस्थापित कोशिकाओं (चित्रा 2B और सी) के लिए सीधे संपर्क फार्म, गुजरना कि preneoplastic कोशिकाओं के अवशेष को दूर apoptosis को (1 वीडियो), या सक्रिय रूप से preneoplastic कोशिकाओं के कुछ हिस्सों को अपनी चपेट में ले () नहीं दिखाया। बातचीत का पूरा स्पेक्ट्रम पर कब्जा करने के लिए, यह समय चूक रहते इमेजिंग द्वारा उनके व्यवहार का पालन करने की सलाह दी जाती है।

चित्र 1
चित्रा 1: zebrafish लार्वा में सशर्त त्वचा कोशिका परिवर्तन के लिए योजनाबद्ध। (ए) टीजी (यूएएस की एक युग्मनज की एक छवि: EGFP-HRAS G12V; LysC: 10 मिनट के बाद निषेचन (MPF पर dsRed2) zebrafish)। निषेचित अंडे जरायु (नोक) से घिरा हुआ है। इंजेक्शन के लिए साइट भ्रूण के पशु पोल को परिभाषित करता है कि जर्दी (तीर) से cytoplasmic धाराओं द्वारा गठित blastodisc (तारांकन), है। zebrafish लार्वा का (बी) के बढ़ते। एक 25 मिमी कवर कांच से सील है कि एक 18-20 मिमी छेद (नोक) के साथ 60 मिमी पेट्री डिश। zebrafish लार्वा स्थिर और 1% एलएमपी agarose द्वारा कवर कांच पर बढ़ रहे हैं। 5 माइक्रोन 4-OHT युक्त 0.3x Danieau समाधान (तीर) एलएमपी agarose कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (सी) 4-OHT सतही त्वचा कोशिकाओं के परिवर्तनों। लार्वा त्वचा (क) योजनाबद्ध पार अनुभागीय प्रोफाइल प्रेरित किया। भ्रूण और लार्वा त्वचा दो उपकला कोशिका परतों, एक सतही सेल परत और अंतर्निहित तहखाने झिल्ली (बीएम) से जुड़े हुए हैं कि केरेटिनकोशिकाओं के बेसल सेल परत से बना है। (ख) क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली टीओ सतही त्वचा कोशिकाओं के बीच एक preneoplastic सेल क्लोन प्रेरित। KalTA4-ईआर टी 2 विशेष रूप से krt4 प्रमोटर (पीला) के द्वारा संचालित सबसे बाहरी त्वचा की परत में व्यक्त किया है। KalTA4-ईआर टी 2 के मोज़ेक अभिव्यक्ति preneoplastic कोशिकाओं (हरा) का एक क्लोन करने के लिए अग्रणी, सतही कोशिकाओं में नियंत्रित (नीला) EGFP-HRAS G12V अभिव्यक्ति यूएएस सक्रिय हो जाता है। क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली (डी) योजनाबद्ध। (क) Tol2 कैसेट pTol2-krt4: KalTA4-ईआर टी 2; cmlc2: क्षणिक इस्तेमाल किया EGFP अभिव्यक्ति वेक्टर ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक अभिव्यक्ति की (ख) सशर्त प्रेरण।। KalTA4 मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर α विशेष रूप से चार-Hydroxytamoxifen (4-OHT) बांधता है जो (ईआर टी 2) के उत्परिवर्ती ligand बाध्यकारी डोमेन से जुड़े हुए है। 4-OHT के अभाव में ईआर टी 2 गर्मी झटका प्रोटीन (Hsp90) द्वारा कोशिका द्रव्य में ही है। 4-OHT बाध्यकारी होने पर Hsp90 KalTA4-ईआर के एक परमाणु स्थानान्तरण की इजाजत दी, विघटितटी 2 और EGFP-HRAS G12V अभिव्यक्ति नियंत्रित यूएएस के बाद के सक्रियण। स्केल बार एक = 500 माइक्रोन। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: preneoplastic और सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत का लाइव इमेजिंग। (एसी) एक चार टीजी DPF की छवियाँ (यूएएस: EGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2):;: एक सेल मंच पर EGFP और transposase mRNA के pTol2-krt4 इंजेक्शन के साथ किया गया है, जो भ्रूण, cmlc2 KalTA4-ईआर टी 2। DsRed2 + न्यूट्रोफिल (नोक):। छवियां 6 घंटे में टेलफिन क्षेत्र के (ए) के पार्श्व दृश्य त्वचा कोशिकाओं (तीर) को व्यक्त EGFP-HRAS G12V के धब्बे दिखा रहा है, इलाज के बाद चार-OHT प्रेरण के 6 घंटे के बाद लिया है, और lysC थे। (बीसी) प्रतिनिधि छवियों टाएक confocal समय व्यतीत फिल्म से केन, न्यूट्रोफिल दिखा रहा है (लाल) EGFP-HRAS G12V व्यक्त त्वचा कोशिकाओं (हरा) के साथ बातचीत। (बी) ए preneoplastic सेल से संपर्क न्युट्रोफिल (नोक) के साथ एक छोटी filopodial विस्तार रूपों। (सी) न्यूट्रोफिल (लाल) preneoplastic त्वचा कोशिकाओं (हरा) का एक क्लोन करने के लिए निकट संपर्क में है। एक में स्केल बार = 100 माइक्रोन; बी / सी = 50 माइक्रोन। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1 : preneoplastic और सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत का समय चूक रहते इमेजिंग। एक सेल मंच पर EGFP और transposase mRNA:;: भ्रूण, pTol2-krt4 इंजेक्शन के साथ cmlc2 KalTA4-ईआर टी 2:;: 4 टीजी DPF (dsRed2 lysC EGFP-HRAS G12V यूएएस) के समय व्यतीत हो। Ho 6-9 confocal समय व्यतीत फिल्मdsRed2 + न्युट्रोफिल (लाल) EGFP-HRAS G12V व्यक्त त्वचा कोशिकाओं (हरा) के साथ बातचीत: उर्स lysC दिखा 4-OHT प्रेरण के बाद। न्यूट्रोफिल करने और preneoplastic कोशिकाओं के तहत अगले विस्थापित और apoptosis से होकर गुजरती है कि एक preneoplastic सेल के अवशेष को हटा दें। 1.3 माइक्रोन के Z स्टैक कदम आकार के साथ 1.5 मिनट घंटा 3 से अधिक का समय व्यतीत हो जाने के अंतराल।

Discussion

Embryogenesis और लार्वा विकास के दौरान, भ्रूण zebrafish त्वचा, दो उपकला परतों से बना है सतही परत बुलाया periderm और अंतर्निहित तहखाने झिल्ली 19 से जुड़े होते हैं कि बेसल केरेटिनकोशिकाओं की एक परत (चित्रा 1C, एक)। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सशर्त zebrafish लार्वा की सतही त्वचा की परत में preneoplastic सेल परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है, और जीने इमेजिंग द्वारा सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बाद में बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। हमारे प्रोटोकॉल में बुनियादी तरीके अच्छी तरह से स्थापित zebrafish तकनीक 9 पालन - 13, और हमारे प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है।

यहां इस्तेमाल krt4 प्रमोटर 5 (चित्रा 1C, ख) सबसे बाहरी त्वचा की परत में विशेष रूप से KalTA4-ईआर टी 2 अभिव्यक्ति ड्राइव। हालांकि, मॉड्यूलर Multisite गेटवेkrt4 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया रणनीति, क्लोनिंग: KalTA4-ईआर टी 2 का निर्माण (चित्रा -1, क), एक एकल क्लोनिंग कदम में KalTA4-ईआर टी 2 के सामने हित के किसी भी प्रमोटर क्लोन करने के लिए संभावना प्रदान करता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि का एक रूपांतर embryogenesis और लार्वा चरणों के दौरान सबसे अधिक ऊतकों के लिए इसलिए संभव है। प्रमोटर दृश्यों की उपलब्धता इसके द्वारा सीमित कारक है। इसके अलावा, एक यूएएस के पीछे क्लोन ब्याज के लगभग किसी भी जीन सशर्त स्थानिक और अस्थायी नियंत्रित KalTA4-ईआर टी 2 अभिव्यक्ति का उपयोग करके विभिन्न विकास के चरणों में overexpressed जा सकता है। इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल एक मोज़ेक ढंग से, zebrafish लार्वा में ब्याज की किसी भी ऊतक में सशर्त जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक भी जिगर या अग्न्याशय के रूप में ऐसी छवि गहरे ऊतकों जीने के लिए सेटिंग माइक्रोस्कोप का अनुकूलन कर सकते हैं।

हम प्रोटोकॉल वह इस्तेमाल कर एक आवेदन का वर्णन किया हैइसी तरह, एक, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के नियमन का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य सूजन modulators के overexpress कर सकते हैं कर रहे हैं एक बड़ी आसानी से लाइव छवि न्युट्रोफिल और एक उम्मीदवार भड़काऊ न्यूनाधिक की अभिव्यक्ति में शामिल करने और गिरफ्तारी के बाद बृहतभक्षककोशिका व्यवहार में बदलाव कर सकते हैं। इसके अलावा, अनुकूलित प्रोटोकॉल भी ऊतक morphogenesis और अंग गठन और के विभिन्न चरणों के दौरान सेल आंदोलन और व्यवहार में बदलाव का पता लगाने के लिए चाहते हैं जो उन लोगों के लिए फायदेमंद होगा, आखिर लाइव छवि अन्य विशिष्ट सेल प्रजातियों के साथ सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत की बातचीत को निशाना बनाया जा सकता है inducible KalTA4-ईआर टी 2 / यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली द्वारा।

हम zebrafish Tol2kit 20 से pDestTol2CG वेक्टर इस्तेमाल किया - एक cmlc2 जिसमें 23: EGFP देहात कैसेट (चित्रा -1, क) एक एसई के रूप में हरी फ्लोरोसेंट सकारात्मक दिल से भ्रूण के बाद चयन की अनुमति देता हैF0 स्क्रीनिंग प्रक्रिया को सरल है कि रूपांतर मार्कर 20। जीनोम में ब्याज की transposon flanked जीन की एक स्थिर प्रविष्टि transposase mRNA के साथ मिलकर प्लास्मिड डीएनए के सह-इंजेक्शन से मदद की है। microinjection के लिए प्लास्मिड डीएनए की तैयारी और transposase mRNA के मानक प्रोटोकॉल निम्नानुसार है। हालांकि, जीनोम में निर्माण के लिए एक सफल एकीकरण Tol2 आधारित स्थानांतरण 14 पर निर्भर करता है। यह विशेष रूप से ध्यान RNases और DNases द्वारा संदूषण और degradations से बचने के लिए बाँझ शर्तों के तहत बर्फ पर काम करने के लिए भुगतान किया जाना है पर प्रकाश डाला गया। एक सेल चरण भ्रूण में microinjection zebrafish 9,10 में लाभ और समारोह के अध्ययन के नुकसान के लिए एक मजबूत और अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्ति को आसानी से एक घंटा में 1,000 से अधिक भ्रूण की जर्दी में इंजेक्षन कर सकते हैं, blastodisc (चित्रा 1 ए, तारांकन) में इंजेक्शन और अधिक अनुभव और प्रशिक्षण की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण मैंसुई की हैंडलिंग है। सुई क्षति के बिना सेल घुसना करने के लिए बहुत पतली हो गया है और इसलिए केवल इसकी बहुत नोक पर टूट जाना है। यह नियमित रूप से नियंत्रित करने और प्रत्येक भ्रूण में एक समान इंजेक्शन गारंटी करने के लिए इंजेक्शन के दौरान ड्रॉप आकार को मापने के लिए महत्वपूर्ण है। ध्यान से सुई भ्रूण बारी बारी से करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, संभाला। इस बार blastodisc और इष्टतम पैठ कोण खोजने की जरूरत है।

लगभग निश्चित रूप से इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया डीएनए और transposase mRNA की एकाग्रता अभिव्यक्ति दक्षता को प्रभावित करती है। अधिक मात्रा transgene व्यक्त कोशिकाओं का एक बढ़ा अनुपात के लिए, लेकिन डीएनए (> 50 एनजी / μl) की उच्च सांद्रता के साथ नेतृत्व और भी इंजेक्शन भ्रूण के बीच विषाक्त प्रभाव के लिए संभावित उठता है mRNA के (> 100 एनजी / μl) transposase कर सकते हैं। हम प्लास्मिड डीएनए के 50 पीजी और इंजेक्शन EMB प्रति शाही सेना के 100 पीजी से मेल खाती है, जो 10 एनजी / μl डीएनए और 20 एनजी इंजेक्शन के लिए / μl transposase mRNA के, के उपयोग के पक्ष मेंRyo। इन सांद्रता के साथ इंजेक्शन भ्रूण की 100% एकल कक्ष में इंजेक्शन क्षमता पर निर्भर करता है, चार-OHT प्रेरण के बाद, सामान्य रूप से विकसित करने, और 40-70% के बीच शो EGFP-HRAS G12V अभिव्यक्ति है। सकारात्मक भ्रूण के बीच हम आम तौर पर 1-10 क्लोन है कि लगभग 30%, 10-50 क्लोन और 50 से अधिक क्लोन होने के 30% है कि 40% लगता है। कारण हमारे अनुसंधान के उद्देश्य के लिए, हम EGFP-HRAS G12V व्यक्त कम क्लोन के साथ भ्रूण के उपयोग के पक्ष। हम अपने क्षणिक प्रयोगों के लिए 10-50 क्लोन के साथ भ्रूण का चयन करें। ट्रांसजेनिक संस्थापक मछली की पीढ़ी के लिए, हम केवल EGFP सकारात्मक कार्डियक मार्कर और उनके epidermis में EGFP-HRAS G12V सकारात्मक क्लोन की एक बड़ी संख्या के साथ दोनों भ्रूण का चयन करने की सलाह देते हैं।

प्रकाश 24 से अवगत कराया जब (जेड) -4-Hydroxytamoxifen एक सीआईएस-ट्रांस (ईज़ी) interconversion आए। यह सीआईएस isomer (ई) ने अपने ट्रांस समकक्ष 25,26 से 100x कम विरोधी estrogenic है कि पाया गया था। Exposurप्रकाश के लिए ई इसलिए टाला जा सकता है। इथेनॉल में भंग 4-OHT स्टॉक समाधान के लिए एक लंबे समय अवधि में अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है। हम इनक्यूबेटर और परिवहन के भीतर लक्ष्य जीन प्रेरण के दौरान प्रकाश से पेट्री डिश की रक्षा के लिए एक बॉक्स का उपयोग करें। इमेजिंग के क्षेत्र बहुत छोटा है और पराबैंगनी प्रकाश में चार-OHT के संपर्क में है हालांकि अब समय अवधि से अधिक इमेजिंग अधिकतम अभिव्यक्ति के स्तर को बनाए रखने की सिफारिश की है, जबकि एक न्यूनतम, प्रेरण समाधान की एक निरंतर आदान-प्रदान करने के लिए हर दो घंटे कम हो जाता है। 4-OHT प्रभावी रूप से इसलिए यह बहुत तेजी से जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं, जरायु और zebrafish embryogenesis दौरान सबसे बाहरी त्वचा की परतों के माध्यम से permeabilizes। हम आसानी से शामिल करने के दो घंटे के बाद EGFP उत्सर्जन निरीक्षण कर सकते हैं और यह लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का पहला लक्षण उपचार 8 के तीन घंटे के बाद एक घंटा और पठार के बाद देखा जा सकता है कि सूचना दी गई है। मतभेद हमारे अध्ययन में इस्तेमाल विभिन्न प्रमोटर की वजह से हो सकता है। गया जनसंपर्क किया गया है के रूप मेंeviously 4-OHT उपचार निर्भर 8,27 खुराक है कि सूचना दी, हम अपने क्षणिक दृष्टिकोण में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए 5 माइक्रोन के उच्चतम रिपोर्ट एकाग्रता का उपयोग करने के लिए चुना है। इस transgene ले जाने के सभी कोशिकाओं लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करेगा कि गारंटी चाहिए।

यह वजह से कई और यादृच्छिक जीनोम प्रविष्टि की घटनाओं की संभावना के लिए यहाँ प्रस्तुत क्षणिक दृष्टिकोण बदलती अभिव्यक्ति के स्तर को ले जा सकता है कि ध्यान में रखा जाना है। इसके अलावा, टीजी (यूएएस: EGFP-HRAS G12V) की Tol2 ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि में transposase mRNA की उपयोग io006 जीन मुंह बंद करने या विघटन में परिणाम सकता है कि यूएएस transgene की संभावित प्रतिस्थापन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक क्षणिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन, जैसा कि इंजेक्शन के बाद भ्रूण की पूर्व चयन अनिवार्य है। कई प्रयोगशालाओं यूएएस दृश्यों इसलिए में, ट्रांसजेनिक वंश में खामोश हो जाते हैं कि मिल गया हैpTol2-krt4 jecting: KalTA4-ईआर टी 2; cmlc2: EGFP टीजी (यूएएस: EGFP-HRAS G12V) में निर्माण io006 भ्रूण एक यूएएस टीजी (krt4 में निर्माण इंजेक्शन लगाने के रूप में कुशल नहीं हो सकता: KalTA4-ईआर टी 2; cmlc2: GFP ) भ्रूण। स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन टीजी का उपयोग समय-खुराक निर्भर 4-OHT जीन सक्रियण के पर / बंद कैनेटीक्स का एक सटीक निगरानी की अनुमति देगा io006 (krt4: KalTA4-ईआर टी 2) टीजी (EGFP-HRAS G12V यूएएस) के साथ पार ।

लार्वा के बढ़ते दौरान एक महत्वपूर्ण कदम एलएमपी agarose में और कवर गिलास (चित्रा 1 बी) पर हस्तांतरण है। या तो गर्मी के झटके से मछली को नुकसान पहुँचाने या जेल की सख्त बिना preselected लार्वा का एक सुरक्षित हस्तांतरण और अभिविन्यास की अनुमति देता है कि तरल एलएमपी agarose के तापमान के लिए एक छोटी समय सीमा ही नहीं है। लार्वा बाद सूक्ष्म analy के लिए काम दूरी को कम करने के लिए कांच कवर पर सीधे केंद्रित किया जाना चाहिएबहन। इस माइक्रोस्कोपी के दौरान एक सीमित कारक हो सकता है के रूप में उपयुक्त उद्देश्यों के चुनाव अनिवार्य है। एक बार घुड़सवार, लार्वा दिनों घंटे से बनाए रखा जा सकता है।

इस के साथ साथ प्रस्तुत मॉडल प्रणाली का सोपाधिकता transgene की चार-OHT सक्रियण द्वारा दोहराया परिवर्तन के लिए अनुमति देता है। (चित्रा -1, बी) अभिव्यक्ति प्रणाली 4-OHT की उपस्थिति पर निर्भर करता है और इसलिए ब्याज की एक जीन की KalTA4 नियंत्रित अभिव्यक्ति प्रतिवर्ती है। एक अपरिवर्तनीय जीनोमिक पुनर्संयोजन घटना 28 की सुविधा है, जो रचनात्मक-ईआर टी 2 / Lox प्रणाली, के विपरीत, KalTA4-ईआर टी 2 / यूएएस सक्रिय किया जा सकता है और इसके अलावा या 4 OHT के हटाने पर निष्क्रिय और दोहराया शामिल करने के लिए इस क्षमता का एक फायदा है Cre-ईआर टी 2 / Lox व्यवस्था पर तकनीक। प्रयोग सप्ताह के दिनों से लंबे समय तक किया जाना है हालांकि, अगर चार-OHT की लगातार स्तरों के लिए आवश्यकता के लिए एक सीमा है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen Sigma Aldrich H7904 dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C
20X Objective Zeiss 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Objective Zeiss 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Objective Zeiss 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17
BamHI New England Biolabs R0136S
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 META
Cover glass VWR 631-0171 Diameter 25 mm
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPSV
Dow Corning high-vacuum silicone grease  Sigma Aldrich MKBL4135V
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller Sutter Instruments Co. P-97 Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150
Fluorescent stereoscope  Leica M205 FA
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Microinjection mold TU-1 Adaptive Science Tools TU-1
Microloader tip Eppendorf 930001007
Microscope Zeiss Axiovert 200
mMESSAGE mMACHINE Kit Ambion AM1348
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Pneumatic pico pump World Precision Instruments  PV820 
Pneumatic pico pump Warner Instruments PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh
QIAprep Spin Miniprep Kit Quiagen 27106
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma Aldrich R8881 10 mg/μl in water
Stereoscope Leica M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaine/MS-222 Sigma Aldrich A5040
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-100
UltraPure Low Melting Point Agarose  Invitrogen 16520-050
UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol Invitrogen 15593-031 25:24:1, v/v

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Ramezani, T., Laux, D. W., Bravo, I. R., Tada, M., Feng, Y. Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin. J. Vis. Exp. (96), e52107, doi:10.3791/52107 (2015).

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