Abstract
في الممر الخلوي الغشائي هو حجرة خارج الخلية متميزة في الأنسجة النباتية التي تقع خارج غشاء البلازما ويتضمن جدار الخلية. مقصورة apoplastic من أوراق النبات هو موقع العديد من العمليات البيولوجية الهامة، بما في ذلك تشكيل جدار الخلية، والمغذيات الخلوية وامتصاص الماء والتصدير، والتفاعلات محطة نابوت داخلي والاستجابات الدفاع لمسببات الأمراض. وراسخة طريقة تسلل الطرد المركزي كأسلوب قوية لتحليل تركيبة الممر الخلوي الغشائي للذوبان من الأنواع النباتية المختلفة. السائل التي حصلت عليها هذه الطريقة هو المعروف باسم الممر الخلوي الغشائي سائل الغسيل (AWF). يصف بروتوكول بعد تسلل الفراغ والطرد المركزي الطريقة الأمثل لAWF الاستخراج من فاصيلوس الشائع (الفول الفرنسي) السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق. وتناقش القيود المفروضة على هذه الطريقة وتعظيم الاستفادة من بروتوكول للأنواع النباتية الأخرى. المستردة AWF يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التجربه المصبTS التي تسعى لتوصيف تركيبة الممر الخلوي الغشائي وكيف أنه يختلف ردا على الأنواع النباتية وراثى والتنمية النباتية والظروف البيئية، أو لتحديد كيفية نمو الكائنات الحية الدقيقة في الممر الخلوي الغشائي السوائل والاستجابة للتغيرات في تكوينها.
Introduction
في الممر الخلوي الغشائي المصنع هو الفضاء بين الخلايا التي تحيط الخلايا النباتية. هذا هو بيئة ديناميكية فيه العديد من عمليات الأيض والنقل تحدث. العنصر الهيكلي الرئيسي للالممر الخلوي الغشائي هو جدار الخلية، والتي يتم تجميعها وتعديلها من قبل الإنزيمات والبروتينات الهيكلية ونواتج الأيض التي تقع داخل الممر الخلوي الغشائي. في الخلايا النباتية صحية يتم الحفاظ على الممر الخلوي الغشائي عموما في حالة حمضية مما يسمح الأحماض الأمينية والسكريات والمواد المغذية الأخرى التي سيتم استيرادها من الممر الخلوي الغشائي إلى السيتوبلازم التي كتبها H + symport 1. أثناء النقل السكروز، والتحركات السكروز من مصادر الضوئي من خلال الممر الخلوي الغشائي والأوعية الدموية في اللحاء. ثم يتم نقل السكروز قبل إمكانية التناضحي التي تحتفظ بها invertases apoplastic الشق السكروز في أجهزة الحوض 2. ويمكن أيضا نقل السكريات والمواد المغذية الأخرى صعودا وتتراكم في تجاويف فوهي من خلال مجرى النتح 3.
"> والممر الخلوي الغشائي أيضا يمثل مكانة البيئية حيث تضع العديد من مسببات الأمراض الطفيلية نمط حياتهم. مسببات الأمراض النباتية البكتيرية لديها القدرة على مضاعفة لكثافة عالية في الممر الخلوي الغشائي، وهو ما الوصول إليها من خلال الفتحات الطبيعية مثل الثغور أو من خلال الجروح 4. إن تركيز الأمينية الأحماض والمركبات الآزوتية الأخرى في الطماطم الممر الخلوي الغشائي وقد ثبت أن تكون كافية لدعم الاحتياجات الغذائية من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية 5،6. الردود الدفاع الأولية نحو مسببات الأمراض الميكروبية كما يحدث في الممر الخلوي الغشائي، وهو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي بيروكسيديزات خارج الخلية . وoxidases وتعزيز جدار الخلية من خلال عبر ربط وcallose ترسب 7 جدار الخلية النباتية غنية في المركبات الثانوية مع الأنشطة المضادة للميكروبات، والطبيعة الكيميائية الحيوية لهذه المركبات الثانوية تختلف بين الأنواع 8.ونتيجة للذكر أعلاهالضعف الجنسي وغيرها من العمليات، ورقة السائل apoplastic يحتوي على مجموعة متنوعة من البروتينات والسكريات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والمركبات الثانوية، والمعادن والكاتيونات الأخرى (على سبيل المثال، والمغنيسيوم 2+، K +، الصوديوم، الكالسيوم 2+، الحديد 2/3 +). يتم التحكم تركيزات المذاب في الممر الخلوي الغشائي من يطلق النار إلى حد كبير على توازن عمليات النقل التي تحدث بين الممر الخلوي الغشائي والخشب، اللحاء والسيتوبلازم 9. ومع ذلك، التفاعلات الأيضية والنمو الميكروبي أيضا تستهلك أو تنتج المواد المذابة apoplastic. ومن المعروف أن تكوين الممر الخلوي الغشائي أن تختلف بين الأنواع النباتية والأنماط الجينية واستجابة لتغير الظروف البيئية بما في ذلك الضوء والتغذية والحيوية وغير الحيوية الضغوط 9. من خلال دراسة تكوين الممر الخلوي الغشائي وكيف يتغير، بما في ذلك خصائص مثل الأكسدة وإمكانات التناضحي، ودرجة الحموضة، المواد الغذائية / توافر الأيض والأنشطة الإنزيمية، يمكن للمرء الحصول على رؤى جديدة في كيفية إعادة النباتاتبشر تستجيب لبيئتها. فهم أو وصف التغيرات الجزيئية التي تحدث في حل الممر الخلوي الغشائي معقد لأنه حجرة منظم مكانيا والديناميكية التي الأيض و / أو أيونات قد تكون متقلبة، عابرة أو يرتبط مع جدار الخلية وغشاء البلازما. وعلاوة على ذلك، يطلب من التقنيات التحليلية المختلفة لتغطية واسعة من أنواع كيميائية مختلفة.
لدراسة تكوين الممر الخلوي الغشائي للذوبان، والسوائل يحتاج عادة إلى استخلاصها من الأنسجة. وتوجد عدة طرق لاستخراج الممر الخلوي الغشائي السوائل من الأنسجة المختلفة، بما في ذلك أسلوب شريط مرشح المقترحة حديثا 10، ولكن طريقة استخراج الأكثر رسوخا للأوراق هو تسلل الطرد المركزي. وقد تم تقييم هذه التقنية سابقا 11-13 وLohaus وآخرون 2001 14 توفير فحص شامل للعديد من المعايير الفنية طريقة ل. كما يدل الاسم، تسلل-centrifuتقنية gation هي طريقة من خطوتين التي ينطوي أساسا استبدال المجال الجوي apoplastic مع السائل تسلل مائي، والتي تختلط مع السائل apoplastic الأصلي، يليه انتعاش تسلل / apoplastic خليط السائل بواسطة الطرد المركزي لطيف من الأوراق. كما تضعف السائل تعافى ولا يحتوي على كافة المركبات الموجودة في الممر الخلوي الغشائي (أنظر أدناه)، وهذا السائل هو المعروف باسم الممر الخلوي الغشائي سائل الغسيل (AWF)، أو بين الخلايا أحيانا السائل غسل، بدلا من السائل apoplastic. تقنية تسلل الطرد المركزي هي قابلة للتطوير بسهولة تسمح عينات AWF واحدة أو مجمعة من حجم كاف لتوليد وتعرض لمجموعة واسعة من التقنيات الحيوية والتحليلية المصب (على سبيل المثال، الكهربي البروتين، وقياس نشاط انزيم، NMR، العديد من أنواع اللوني والكتلة الطيف). ورقة AWF مفيد أيضا باعتباره الممر الخلوي الغشائي محاكاة النمو المتوسطة لدراسة التفاعل بين النباتات استعمار الميكروبات الطرافةح بيئتهم 5.
في البروتوكولات التالية وصفنا كيفية تنفيذ تقنية تسلل الطرد المركزي باستخدام فاصيلوس الشائع السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق، وتقديم بعض الأمثلة من التحليلات المصب مع التركيز على الايض. الأهم من ذلك، أساليب لتقييم وتقدم نوعية AWF جنبا إلى جنب مع تقديم المشورة لتحسين الإجراء لأنواع أوراق مختلفة.
Protocol
ملاحظة: إن اختيار ابتداء المواد ورقة وتوحيد شروط نمو النبات أمر بالغ الأهمية لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية وتقلب والعائد من AWF (الشكل 1). وتظهر المعلمات للنظر في الجدول 1 وتناقش بمزيد من التفصيل في المناقشة.
| المعلمة | التوحيد القياسي سبيل المثال | ||
| فاصيلوس الشائع | مغد قوطة | نبات الأرابيدوبسيس thaliana | |
| نوع ورقة | الأوراق الحقيقية الأولى، وسعت بشكل كامل، وصحية | 2 الثانية والثالثة 3 أوراق بدءا من القاع، 4 أكبر منشورات اتخذت النشرة قمية لم تستخدم لاستخراج الممر الخلوي الغشائي | أوراق ريدة توسعت بشكل كامل |
| عمر النبات | 21 يوما | 7-9 أسابيع 7 أسابيع | |
| الوقت من اليوم | منتصف فترة الخفيفة (00:00) | منتصف فترة الخفيفة (00:00) | منتصف فترة الخفيفة (00:00) |
| إضافة الماء | جميع النباتات تسقى جيدا 1 ساعة قبل الحصاد | جميع النباتات تسقى جيدا 1 ساعة قبل الحصاد | جميع النباتات تسقى جيدا 1 ساعة قبل الحصاد |
| ضوء | ضوء 16 ساعة، و 400 ميكرومول م -2 ثانية -1 | ضوء 16 ساعة، و 400 ميكرومول م -2 ثانية -1 | 10 ساعة ضوء (يوم قصير) من الأسبوع 2، 400 ميكرومول م -2 ثانية -1 |
| رطوبة | 70٪ | 70٪ | 70٪ |
| درجة الحرارة | 22 ° C ضوء، 18 ° C الظلام | 22 ° C ضوء، 18 ° C الظلام | 21 ° C |
الجدول 1. أمثلة parame موحدالنسب للأوراق المستخدمة في الاستخراج AWF.
1. توليد الممر الخلوي الغشائي غسل السائل
ملاحظة: خلال هذا البروتوكول materila الخطرة السمن مسببات الأمراض الجرثومية من الأوراق المصابة لا ينبغي غسلها هباء. وينبغي استخدام إجراءات التخلص السليم نوعا ما.
- اختيار جهاز استنادا إلى حجم ورقة:
- التسلل أوراق صغيرة (على سبيل المثال، نبات الأرابيدوبسيس، الفول) باستخدام حقنة needleless. استخدام قارورة فراغ التسلل الأوراق التي تكون كبيرة جدا لاحتوائه في حقنة. استخدام الأسلوب قارورة فراغ التسلل أوراق متعددة في نفس الوقت.
- تقسيم الأوراق التي تكون كبيرة جدا بالنسبة للطريقة تسلل المتاحة إلى أقسام أصغر باستخدام شفرة حلاقة. أقسام رقة بدقة شطف قطع في الماء المقطر قبل تسلل لإزالة الملوثات حشوية أن تحلب من الخلايا التالفة.
- ورقة تسلل باستخدام حقنة 60 مل:
- فصل ورقة منمصنع في سويقات باستخدام شفرة حلاقة. للأوراق مركب مثل الطماطم، وفصل منشورات في petiolule.
- شطف ورقة رفعه حديثا من قبل الغطس في الماء المقطر لإزالة الملوثات سطح الورقة. تجفيف أوراق من قبل النشاف بلطف مع الأنسجة الماصة أو ورقة.
- قياس الوزن ورقة قبل التسلل.
- ولفة بعناية و/ أو أضعاف ورقة في حقنة 60 مل وملء المحاقن مع الماء المقطر (يمكن استخدام سوائل تسلل أخرى، انظر المناقشة). إخراج أي الهواء داخل الحقنة في حين خفض المكبس إلى ما يقرب من علامة 40 مل.
- تغطية طرف الحقنة إما مع إصبع القفاز أو قطعة من بارافيلم، ثم خلق ضغط سلبي داخل حقنة عن طريق سحب المكبس إلى الخارج إلى علامة 60 مل. الافراج عن ببطء الغطاس.
ملاحظة: الافراج بسرعة الضغط قد يؤدي إلى تحلل الخلايا وتلوث حشوية. - افصل طرف الحقنة وإخراج أي هواء، ثم replug طرف والصحافةمزيد من أسفل على المكبس لخلق قدرا متواضعا من ضغط إيجابي.
- كرر الخطوات من 1.2.5 - 1.2.6 حتى يتم تسلل ورقة تماما، كما يراها لون مظلمة من المناطق تسلل.
- إزالة ورقة من الحقنة. بلطف ولكن بدقة صمة عار على ورقة مع ورقة ماصة لإزالة السائل السطح.
- قياس وزن ورقة مخترقة. حساب الفرق في الوزن قبل وبعد التسلل الذي يقترب عن كثب حجم التسلل.
- ورقة تسلل قارورة فراغ:
- فصل ورقة من نبات في سويقات باستخدام شفرة حلاقة.
- شطف ورقة رفعه حديثا من قبل الغطس في الماء المقطر لإزالة الملوثات سطح الورقة. تجفيف أوراق من قبل النشاف بلطف مع ورقة ماصة.
- قياس الوزن ورقة قبل التسلل.
- وضع ورقة (أو يترك إذا التسلل أوراق متعددة) في 250 مل أو أكبر الجانب الذراع القارورة التعاونntaining الماء المقطر (يمكن استخدام سوائل تسلل أخرى، انظر مناقشة). تغطية كامل الأوراق مع السائل.
- تطبيق فراغ إلى القارورة. تستنهض الهمم بلطف للافراج عن فقاعات الهواء من الأوراق. بعناية وببطء الافراج عن فراغ.
ملاحظة: الافراج بسرعة الفراغ قد يؤدي إلى تحلل الخلايا وتلوث حشوية. - كرر الخطوة 1.3.5 حتى ورقة وتسلل بالكامل، كما يراها لون مظلمة من المناطق تسلل.
- إزالة ورقة من القارورة. بلطف ولكن بدقة صمة عار على ورقة مع ورقة ماصة لإزالة السائل السطح.
- قياس وزن ورقة مخترقة. حساب الفرق في الوزن قبل وبعد التسلل الذي يقترب عن كثب حجم التسلل.
- انتعاش AWF بواسطة الطرد المركزي:
- وضع ورقة على قطعة من 4 بوصة (10 سم) بارافيلم واسعة. باستخدام ماصة غيض 5 مل (أو كائن مماثل الحجم)،نشمر عن ورقة داخل بارافيلم.
- أدخل طوى ورقة ماصة مع طرف في حقنة 20 مل. ضع أي حواف قطع ورقة التي تواجه صعودا. إدراج الحقنة في نظيفة 50 مل البولي إثيلين أو البولي أنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي لحقنة داخل الأنبوب لمدة 10 دقيقة في 1،000 x ج في يتأرجح دلو الدوار عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الفحص البصري للأوراق التالية الطرد المركزي يجب أن تكشف أن غالبية السائل تسلل تم طرد. وتشير البقع الخضراء الداكنة التي لزم وقت إضافي الطرد المركزي. - ماصة AWF تعافى إلى الطازج 1.5 مل أنابيب.
ملاحظة: حجم AWF يجب أن يتطابق تقريبا حجم تسلل لذلك ورقة. وإذا كان حجم هو أقل ثم الوقت الإضافي الطرد المركزي أو مطلوب سرعة الطرد المركزي. - أجهزة الطرد المركزي العينات AWF في 15،000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة أي خلايا أو الجسيمات. بدلا من ذلك، تمرير AWF من خلال مرشح 0.22 ميكرون إلى remoلقد الخلايا والجسيمات.
- ماصة وطاف في أنبوب جديد. الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى التخزين.
- تخزين العينات AWF في -80 ° C.
2. فحوصات للحشوية التلوث
- الحفاظ على عينات AWF على الجليد للحد من التفاعلات الإنزيمية (على سبيل المثال، التحلل البروتيني) وإجراء فحوصات مباشرة بعد خطوات الطرد المركزي كاملة.
ملاحظة: للحصول على المقايسات الأيض، والعينات ويمكن تجميدها على الفور بعد استخراج وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. - لنازعة مالات القياسي (مليون درهم) بروتوكول فحص يرى 15؛ استخدام خلاف ذلك المتاحة تجاريا مليون درهم طقم الفحص.
- لنازعة القياسية الجلوكوز 6 فوسفات (G6PDH) بروتوكول فحص يرى 16؛ على خلاف ذلك استخدام المتاحة تجاريا G6PDH طقم الفحص.
- لالكمي لنواتج الأيض السيتوبلازمية مثل الجلوكوز 6 فوسفات (G-6-P) استخدام GC-MS كما هو موضح في الخطوة 5
3. حساب من الممر الخلوي الغشائي التخفيف عامل
- إعداد مجلدين من السائل تسلل المستخدمة أعلاه في الخطوة 1.2.4 أو 1.3.4 (على سبيل المثال، الماء المقطر). إضافة مسحوق اللون القرمزي نيلي إلى حل واحد لتركيز النهائي من 50 ميكرومتر، لا تضيف شيئا إلى أخرى.
- قياس الامتصاصية في 610 نانومتر (OD 610) من 200 ميكرولتر من الحل تسلل النيلي اللون القرمزي مع قارئ لوحة. تصحيح هذه القيمة من خلال طرح OD 610 من 200 ميكرولتر من حل التسلل دون نيلي اللون القرمزي. استبدال هذه القيمة تصحيح كما OD 610infiltrate في المعادلة أدناه.
- أداء لا يقل عن ثلاث عمليات التسلل ورقة تكرار النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2 أو 1.3) مع كل من حلول تسلل (مع وبدون النيلي اللون القرمزي).
- بعد تسلل، صINSE الأوراق في الماء المقطر لإزالة أي المتبقية النيلي اللون القرمزي موجودة على الأسطح الخارجية.
- المضي قدما الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.4).
- تحديد متوسط OD 610 من 200 ميكرولتر من الاستخراج AWF النيلي اللون القرمزي. تصحيح هذه القيمة من خلال طرح متوسط OD 610 قيمة 200 ميكرولتر من النيلي اللون القرمزي الحرة AWF. استبدال هذه القيمة تصحيح كما OD 610AWF في المعادلة أدناه.
- حساب عامل التخفيف (أي أضعاف التخفيف) من القيم الامتصاصية تصحيح النحو التالي:
الممر الخلوي الغشائي تخفيف عامل = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - تركيز أو نشاط القيم من ضرب AWF من قبل عامل تخفيف لتقدير تركيز / النشاط في السائل apoplastic في بلانتا.
4. تركيز AWF إلى كامل قوتها قبل تجميد التجفيف
- بدوره على تجميد أكثر جفافا وllow ذلك لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة والضغط.
- تجميع المبلغ المطلوب من عينات AWF جديدة أو تخزينها.
- توزيع العينات بالتساوي بين 2 مل أنابيب الطرد المركزي.
- تحديد حجم إعادة:
حجم إعادة = حجم قبل التجميد والتجفيف / الممر الخلوي الغشائي عامل التخفيف - مع الأغطية مغلقة، وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل.
- نقل أنابيب المجمدة إلى واحد أو أكثر المبردة السفن التجميد والتجفيف. في حين نقل الأنابيب، واستبدال الغطاء مع واحد الذي تم اخترقت بآلة حادة للسماح تبادل الغازات.
- إرفاق السفن إلى تجميد أكثر جفافا ويجفد العينات تماما.
- إزالة عينات من الجهاز وإعادة تشكيل AWF عن طريق إضافة كمية محسوبة من الماء المقطر.
- استبدال غطاء unpierced وتخزين العينات في -80 ° C.
5. تحليل المستقلب بواسطة اللوني للغاز الطيف الكتلي 17
<رأ>Representative Results
النتائج نموذجية لإخراج AWF أجريت على صحي P. 3 اسبوع الشائع السيرة الذاتية. وتظهر Tendergreen الأوراق، وذلك باستخدام الماء المقطر كما السائل تسلل في الجدول 2. يونغ P. أوراق الشائع قابلة للتسلل، وفي سرعة الطرد المركزي المستخدمة هنا (1،000 x ج) إزالة غالبية السائل تسلل بواسطة الطرد المركزي يمكن أن ينظر إليه مباشرة كما يترك تعود إلى اللون الأخضر الأصلي. P. كان ورقة الشائع الوزن الطازج في المتوسط 1.1 x ج قبل التسلل وأسفرت عن 0.5 مل من AWF لكل غرام الوزن الطازج. تم تحديد تركيز البروتين من AWF لتكون 0.18 ± 0.08 ملغ / مل باستخدام معيار برادفورد فحص البروتين. عامل تخفيف لهذه الأوراق، وتحسب عن طريق قياس النيلي اللون القرمزي التخفيف، وكان 2.3 ± 0.3 أضعاف. يمكن أن القيم المذكورة أعلاه تختلف بشكل كبير بين الأنواع والتجارب الرائدة مطلوبة لتحديد العائد من AWF لكل غرام ورقة نحن طازجةآيت، فضلا عن تركيز البروتين AWF وعامل التخفيف التي يمكن توقعها لنوع نبات معين.
يمكن أن تحدث ضررا على سلامة الخلايا سواء أثناء الخطوة تسلل، إذا كانت التغييرات في الضغط وسريعة جدا، وخلال خطوة الطرد المركزي إذا كانت قوة الطرد المركزي عالية جدا. ولذلك فمن الضروري لفحص عينات AWF لعلامات التلوث حشوية. من الناحية المثالية، يتم إجراء فحوصات مستقلة متعددة. هنا، يتم الإبلاغ عن النتائج من ثلاثة فحوصات المحتملة في الجدول 2. وفي الاستخراج أداء جيدا من P. الشائع AWF، كان G6PDH قابل للكشف بواسطة انزيم الفحص القياسية. وهذا يتفق مع تقارير أخرى حيث يصبح النشاط G6PDH كشفها فقط فوق عتبة قوة الطرد المركزي 12. في المقابل، كان مستوى خط الأساس من النشاط نازعة مالات (2.5 U / مل) كشف في كل P. عينات الشائع AWF باستخدام فحص التمثيل الغذائي العادي. زيادة الطرد المركزي لأدى م فوق عتبة 1،000 x ج في زيادة الأنشطة مليون درهم (النتائج لا تظهر). وكما هو معروف في الممر الخلوي الغشائي من الأنواع الأخرى لاحتواء النشاط مليون درهم الذاتية 18، ويعتبر مبلغ الكشف عن النشاط هنا apoplastic حقيقي وزيادات كبيرة فوق هذا المستوى خط الأساس تدل على التلوث. الأيضية التي يعتقد أن تكون في الغالب حشوية، مثل هيكسوز-6-فوسفات، ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم تلوث AWF. هنا، الكشف عن تحليل GC-MS صفر أو أثر مستويات G-6-P في الاستخراج AWF. على النقيض من ذلك، في أقسام الجذر قطع الذرة، G-6-P تم الكشف بعد استخراج AWF في جميع السرعات الطرد المركزي وزيادة في تركيز بسرعات أعلى، مشيرا إلى تلوث حشوية 10.
تحليل الأيض التي كتبها GC-MS من P. الشائع ورقة AWF عادة ينتج 40 - 60 الأيض تحديدها وعدد متساو تقريبا من المركبات هويته (الشكل 2). أوالأحماض غانيتش، السكريات البسيطة، والأحماض الأمينية وتمثل الجزء الأكبر من نواتج الأيض يمكن تحديدها، ولكن، كما تم الكشف عن المستقلبات النباتية الثانوية وكميا من AWF 11. وصفت سبيل المثال عدة قمم من هذه الفئات جزيء مختلفة في الشكل 2 مزيد من التقنيات التحليلية المصب هي التي تنطبق على هذه العينات AWF لقياس الجزيئات المختلفة، على سبيل المثال: ICP-MS، NMR، HPLC، التحليل الطيفي للامتصاص الذري، والبروتين مطياف الكتلة.
ويمثل عنصر البروتين من الممر الخلوي الغشائي أيضا في AWF كما هو مبين في Coomassie بريليانت الأزرق هلام الملون SDS-PAGE في الشكل (3). ومن بين الأدوار الأخرى، والإنزيمات apoplastic هي المسؤولة عن تركيب جدار الخلية وخلق خارج الخلية رد الفعل أنواع الاكسجين. وقد حددت الدراسات البروتين من AWF من مختلف الأنواع العشرات من البروتينات الفردية وأظهرت أن عنصر البروتين من الممر الخلوي الغشائي يستجيب لبيئىالإجهاد nmental 13،19. ومن الناحية المثالية ينبغي أن يكون استخراج AWF خالية من التلوث البروتينات السيتوبلازمية مثل Rubisco. ولكن في الواقع هذا من الصعب تحقيقه. وجود البروتين الفرقة Rubisco في ~ 53 كيلو دالتون التالية SDS-PAGE يوفر الفحص النوعي آخر لسلامة العينات AWF. على سبيل المثال، العينة التي تم تحميلها في حارة 2 في الشكل (3) تحتوي على كمية أكبر من التلوث Rubisco أن من حارة 1.
| فاصيلوس الشائع AWF | |
| حجم AWF (مل ز -1 ورقة FW) | 0.49 ± 0.09 |
| اضرب البروتين. (ملغ مل -1) | 0.18 ± 0.08 |
| عامل التخفيف | 2.3 ± 0.3 |
| النشاط G6PDH (U مل -1) | |
| GLC-6-P (ملغ مل -1) | أيا الكشف عن |
| النشاط مليون درهم (U مل -1) | 2.5 ± 0.9 |
الجدول 2. النتائج النموذجية لإخراج AWF من P. الشائع السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق.
الشكل 1. معيار سير العمل استخراج الممر الخلوي الغشائي. وتشير الأرقام إلى الخطوات في البروتوكول.
الشكل 2. مثال GC-MS اللوني من P. الشائع السيرة الذاتية. . Tendergreen AWF قمم سبيل المثال المستقلب مرقمة هي: 1-المالونات، 2-الفوسفات، 3-سكسينات، 4-مجهولة، 5-مالات، 6-الأسباراجين، 7-ريبيتول (الحادي الداخليandard)، 8-سيترات، 9-الجلوكوز، 10-اينوزيتول، وحامض 11 caffeic، 12-السكروز.
الشكل 3. مثال SDS-PAGE Coomassie الملون هلام من P. الشائع AWF مقتطفات ورقة. ويوفر هذا الجل مقارنة بين مكونات البروتين اثنين من الاستخراج AWF التي تختلف في كمية التلوث حشوية بواسطة انزيم plastidial فيرة Rubisco. وبعد استخراج AWF تعرض كل من عينات لبروتين الأسيتون هطول الأمطار في وجود فائض 4 أضعاف (ت / ت) من الأسيتون البارد وresolubilized في الماء في عشر حجم الأصلي. الممرات 1 و 2 تحتوي على 40 ميكروغرام من البروتين. الفرقة المقابلة لسلسلة Rubisco كبيرة (~ 53 كيلو دالتون) يدل على ذلك السهم. M ص: بروتين علامات الوزن الجزيئي.
Discussion
الاستفادة المثلى من مصدر الأنسجة النباتية
الاختلاف البيولوجي والتقني يمكن أن تكون كبيرة عند تنفيذ الممر الخلوي الغشائي الاستخراج، وبالتالي سير عمل موحد للغاية مفيد لزيادة الاستمرارية عبر التجارب (الشكل 1). الأهم من ذلك، مصدر الأنسجة النباتية يجب أن تكون موحدة، بما في ذلك نوع ورقة، ورقة السن، والنمو / الظروف البيئية والوقت من اليوم (الجدول 1). وتوجد اختلافات كبيرة في السهولة التي يتم تسلل أوراق مختلفة واستعاد AWF في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي. ترتبط هذه الاختلافات مع عدد الثغور، وحجم الفتحة والمقاومة ورقة 12،14. حتى بين أصناف مختلفة من P. الشائع هناك اختلافات كبيرة في سهولة والعائد من الإجراء استخراج AWF. على سبيل المثال أوراق متنوعة Tendergreen المستخدمة هنا هي أكثر قابلية لاستخراج AWF استخدام هذا الأسلوب من الصنف عجب الكندي. ضمنP. الشائع أول الأوراق الحقيقية هي أكبر وأسهل التسلل، مما يجعلها الخيار الواضح لإخراج apoplastic. وقد تبين الهواء والماء حجم apoplastic أن تختلف مع تقدم العمر ورقة في العديد من الأنواع مما يؤدي إلى اختلافات في AWF الاستخلاصية 12،14. في P. الشائع والأوراق القديمة أصبحت إلى حد كبير أكثر صعوبة للتسلل وتسفر أقل AWF على الطرد المركزي. لذا كانت تحصد أوراق عندما وصلوا التوسع الكامل. أوراق التي يصعب التسلل لاحقا تتطلب سرعات أعلى الطرد المركزي لاسترداد AWF. لذا ينبغي للمرء أن الشاشة بعناية عدة أنواع أوراق مختلفة وأصناف قبل البت مصدر الأنسجة لإخراج AWF نطاق واسع.
يجب أيضا الظروف نمو النبات تكون موحدة قدر الإمكان في سياق التجربة. استخدام خزانات النمو هو الأفضل لأنها تسمح الرطوبة ثابتة ودرجة الحرارة ومن lighأفواج ر كثافة ليتم المحافظة عليها. حصاد الأوراق يجب أن يحدث دائما في نفس الوقت من اليوم لأن تركيزات الأيض، والإنزيمات، الخ تختلف في جميع أنحاء دورة نهاري 14. وأخيرا، لضمان أن أوراق النبات جميعا ضغط الامتلاء مماثل، يجب أن تسقى النباتات قريبا من قبل (~ 1 ساعة) الحصاد.
تعظيم الاستفادة من تسلل ورقة والطرد المركزي
سوف تلوث هيولي غير مرغوب فيه من AWF بسبب تحلل الخلية الجزئي يؤدي إذا كان الضغط الميكانيكي من قبل خلايا اجه مرتفع جدا خلال تسلل أو الطرد المركزي الخطوات. ولذلك، ينبغي أن يكون الإجراء لنوع ورقة تعطى الأمثل مفاضلة بين تعظيم العائد وتقليل التلوث حشوية من AWF. في جميع الحالات، ينبغي للمرء أن استخدام أقل سرعة الطرد المركزي التي AWF يمكن استردادها لتجنب تعطل ميكانيكي ممكن من خلايا ورقة. تعظيم الاستفادة من centrifuوينبغي تحديد سرعة gation تجريبيا لكل نوع ورقة من خلال رصد حجم تعافى والممر الخلوي الغشائي التلوث على نطاق السرعات الطرد المركزي. وقد لوحظ أن الأنشطة انزيم علامة، مثل مليون درهم، G6PDH ومصاوغة الجلوكوز فوسفات، تظل منخفضة حتى يتم تجاوز عتبة قوة الطرد المركزي، أعلاه والتي تزيد من هذه الأنشطة بشكل سريع، ويفترض بسبب تسرب حشوية 9،12،14. استخدام بارافيلم للحصول على الدعم خلال خطوة الطرد المركزي، كما لاحظ بيكر وآخرون 2012 11، ويمكن تحسين كفاءة الاستخراج AWF وربما تقليل الأضرار الميكانيكية إلى ورقة شفرة الناجمة عن لطي المفرط والضغط. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بارافيلم يحسن التصور من ورقة بعد الطرد المركزي عند ينبغي للمرء أن دراسة ورقة عن الضرر واكتمال استخراج AWF.
Nouchi 12 وصف تعظيم الاستفادة من الانتعاش AWF من أقسام ورقة الأرز قطع، والتي هي دifficult التسلل وتتطلب سرعات أعلى الطرد المركزي لجمع AWF بسبب فتحات الثغور الصغيرة الخاصة بهم. تحسن ترطيب سطح ورقة الأرز، إما عن طريق PRESOAKING الأوراق في الماء المقطر أو إضافة السطحي إلى السائل تسلل، سهلت عملية تسلل. وأعلى سرعة الطرد المركزي (6،000 x ج) كان يستخدم أيضا في حين رصد تلوث apoplastic 12. عند استخدام أقسام قطع ورقة هناك دائما خطر أن التلوث حشوية سيكون أكثر انتشارا حتى مع الغسيل واسعة من المواقع الجرح. ولذلك ينبغي أن تستخدم قطع الأوراق عند الضرورة فقط.
بالنسبة للعديد من الدراسات ويستخدم الماء المقطر كما السائل تسلل 11. ومع ذلك، يمكن إضافة مركبات إلى السائل تسلل، مثل الأملاح أو مخازن، من أجل تحسين استخلاص مركبات apoplastic معينة، وخاصة البروتينات 13. Lohaus 14 تقييم تأثير القوة الأيونية والتناضحي سن تكوين AWF تعافى وجدت لها أن تكون ضئيلة. التغيرات في الرقم الهيدروجيني للتسلل المتوسطة، ومع ذلك، قد تؤثر على تكوين AWF 14.
التعامل السليم وتخزين السائل المستخرج apoplastic هو المهم. وقد تبين AWF لاحتواء وفرة من البروتياز والإنزيمات الأخرى 13،20، وكذلك المركبات العضوية المتطايرة. لذلك، للحد من تغييرات على تركيبة AWF بعد الشفاء من المستحسن الاحتفاظ بعينات على الجليد أو تخزينها على خلاف ذلك في -80 ° C. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء فحوصات الأنزيمية من AWF في أقرب وقت ممكن بعد استخراج للحد من تعطيل انزيم بسبب التحلل البروتيني، تخفيف لفترات طويلة أو تجميد لاذابة.
عملية تسلل يخفف السائل apoplastic وغالبا ما يكون من الضروري تحديد مدى هذا التخفيف. يجوز للخطوة الطرد المركزي أيضا يخفف من AWF مع المياه من المقصورات داخل الخلايا. وتحتاج عامل التخفيفإد تقدير في الجسم الحي التركيزات الكيميائية الممر الخلوي الغشائي عند إجراء القياسات على AWF. وهناك حاجة إلى عامل التخفيف أيضا على التركيز AWF إلى كامل قوتها عندما يتم استخدامها باعتبارها الممر الخلوي الغشائي محاكاة النمو المتوسطة للميكروبات - وبالتالي مطابقة في تركيزات المستقلب الجسم الحي بأكبر قدر ممكن. وتوجد العديد من الاختلافات في الطريقة الموضحة في الخطوة 4 لتحديد عامل التخفيف AWF عن طريق قياس التخفيف من مركب علامة تضاف إلى السائل التسلل. لجميع وسائل يفترض حساب التخفيف AWF أن السائل تسلل لا يمتص بشكل ملحوظ أو تخفيفه من قبل خلايا ورقة أثناء عملية الاسترداد AWF. هذا الافتراض تم التحقق سابقا للخطوة تسلل 14 ولكن غير مؤكدة للخطوة الطرد المركزي. أيضا يجب أن لا يتم امتصاص المركب علامة، نقل أو تعديل في حين أنه في الممر الخلوي الغشائي. هو يستخدم على نطاق واسع نيلي اللون القرمزي واختبارها بدقة من الأصباغ المستخدمةلإجراء العمليات الحسابية تخفيف AWF. يعرض نيلي اللون القرمزي على الامتصاصية منخفض لراتنج تبادل الأيونات الموجبة وجدران الخلايا المعزولة وأظهرت لتكون مناسبة لإجراء العمليات الحسابية AWF في الكرنب napus، Pisum بيسوم، مغد قوطة وماكس جليكاين 11،21،22. ومع ذلك، في بعض أنواع نبات، على سبيل المثال، والأرز، والخيار، والنيلي اللون القرمزي يبدو لا يمكن استردادها بالكامل بعد تسلل، التي من شأنها أن تؤدي إلى التقليل من التخفيف عامل AWF 12،21. عدم وجود انتعاش النيلي اللون القرمزي قد يكون راجعا إلى قابليته للانشقاق إلى سلفونات إيزاتين التي كتبها الفائق 23، والذي يعرف إلى أن يتم إنتاجها في الممر الخلوي الغشائي، خصوصا في ظل التوتر 24. سوف انشقاق النيلي اللون القرمزي إلى سلفونات إيزاتين يؤدي إلى فقدان الامتصاصية في 610 نانومتر وزيادة في 245 نانومتر. ما إذا كان يحدث هذا التفاعل إلى حد ملموس في الممر الخلوي الغشائي، أو ما إذا كان هذا رد فعل يمكن مستعمل بإضافة الزبالين الفائق لinfiltratلم يتم التحقيق السائل أيون حتى الآن. وقد استخدم اللون الأزرق ديكستران بدلا من النيلي اللون القرمزي لالكمي لعامل التخفيف AWF في الأرز يترك 12، على الرغم من استقرارها والانتعاش في AWF لم يتم الإبلاغ عنها. بدلا من ذلك، المركبات radiolabelled مثل [14 C] السوربيتول أو معايير قابلة للقياس الكمي الداخلية الأخرى يمكن استخدامها بدلا من الأصباغ وانخفاض في النشاط الإشعاعي أو تركيز قياس والمستخدمة لحساب عامل التخفيف بطريقة مماثلة 11،14،25.
القيود المفروضة على تقنية
وتوجد هناك بعض المحاذير للتسلل الطرد المركزي طريقة AWF العزلة. أولا، التخفيف من الممر الخلوي الغشائي خلال تسلل قد تثير ردا من النبات. إذا كانت الخلايا المحيطة بها ورقة كشف تركيز تقلص لمكونات معينة من السوائل apoplastic، فإنها قد الاستجابة من قبل التغوط المزيد من نواتج الأيض، أو تحريف تفسير تركيزات المستقلب. فيتقييم لهذه المشكلة لوحظ أن أيا من الوقت بين عمليات التسلل والطرد المركزي ولا الخلافات المعتدلة في القوة الأيونية من السائل تسلل أثرت على تكوين AWF استخراج 14،22. ولذلك، أي القطع الأثرية الناتجة عن الممر الخلوي الغشائي ويعتقد أن التخفيف ليكون ضئيلا للغاية.
والعيب المحتمل الثاني هو أن شطف من AWF بواسطة الطرد المركزي لا يعبر عن الجزيئات الموجودة في الممر الخلوي الغشائي لعدة أسباب. بعض المركبات، في الكاتيونات والبروتينات معينة قد تكون مرتبطة بشكل وثيق مع جدار الخلية سالبة الشحنة وليس أزل مع AWF 13. الجزيئات الأخرى مثل البروتينات قد تكون كبيرة جدا لأزل بكفاءة من الممر الخلوي الغشائي في سرعات الطرد المركزي المستخدمة 14. أنواع الاكسجين التفاعلية هي فئة هامة من مجمع المنتجة في الممر الخلوي الغشائي، ولكن نظرا لطبيعة قصيرة الأجل من هذه المركبات، ومتطلبات غير محددة لإنتاجها، والعلاقات العامة الخاصة بهمesence لا يتم التقاطها بشكل جيد من قبل استخراج AWF. ومن غير المعروف ما مدى دقة يمثل AWF تكوين في الجسم الحي من السائل الممر الخلوي الغشائي وهذا قد تختلف بين الأنواع.
وتوجد عدة فحوصات لتحديد التلوث حشوية، رغم أن أيا مقبولة عالميا. فحوصات الإنزيمات في الغالب حشوية (على سبيل المثال، G6PDH، مصاوغة هيكسوز الفوسفات، مليون درهم) لديها مصلحة كونها سهلة لأداء ولكن قد لا يتماشى بشكل جيد مع تسرب حشوية 14،18. تقييم نواتج الأيض حشوية (على سبيل المثال، والفوسفات هيكسوز، الكلوروفيل) هو ربما يكون أكثر دلالة ولكن أقل راسخة 11. ومع ذلك، أي نوع من الفحص يمكن أن تكون مفيدة لتقدير النسبي للتلوث apoplastic بين العينات. من الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم قياسات مستقلة متعددة للتحقق من صحة سلامة العينة AWF.
مع الاعتراف حدوده، تسلل-centrifugatiعلى تقنية الموضحة هنا لا تزال تقنية بسيطة وقوية في دراسة البروتينات apoplastic، مستقلبات الابتدائية والثانوية والأيونات غير العضوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
