Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Inhibitorisk synapsedannelse i en Co-kultur model, som indeholder GABAerge Medium Langustre neuroner og HEK293-celler stabilt udtrykker GABA Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52115
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1UCL School of Pharmacy, University College London

Summary

De molekylære mekanismer, der koordinere dannelsen af ​​hæmmende GABAerge synapser under ontogeni er stort set ukendte. For at undersøge disse processer, har vi udviklet en co-kultur model, som indbefatter embryonale medium spiny GABAerge neuroner dyrket sammen med stabilt transficerede humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler, der udtrykker funktionelle GABAA-receptorer.

Introduction

GABA er en af de tidligste neurotransmittere findes i embryonale hjerne forud for den mest rigelige excitatoriske neurotransmitter glutamat 1. Under udviklingen, GABA depolariserer og ophidser umodne neuroner, spiller en central rolle i reguleringen af ​​celleproliferation, migration og dannelsen af ​​neurale netværk uden at inducere excitotoksicitet. I den voksne hjerne er det reversible potentiale for GABAA-receptor-kanaler flyttet til mere negative potentialer på grund af et fald i den intracellulære koncentration af chlorid. Dette skift skyldes opregulering af kalium-klorid co-transporter (KCC2), som transporterer klorid ud af cellen, og parallelt hermed nedregulering af natrium-kalium-chlorid transporteren (NKCC1), som har den modsatte effekt 2.

I hjernen, GABA primært binder til enten GABAA eller GABAB receptorer medierer hurtig eller langsom synaptisk hæmning, respektively. GABA A Rs er en klasse af receptorer, også kendt som heteropentameric ionotropiske eller ligandstyrede Cys-loop ionkanaler. To molekyler af GABA er nødvendige for aktivering af receptoren, som er gennemtrængelig for chloridioner og i mindre grad, bicarbonationer. Stigningen i klorid ledningsevne nedsætter effektiviteten af depolariserende, excitatoriske begivenheder i aktivering af postsynaptiske neuron 3.

Strukturel diversitet af GABA A Rs har længe været anerkendt som en afgørende faktor i fastlæggelsen af deres brede vifte af funktionelle og farmakologiske egenskaber. Native GABAA-R'er er hetero-pentamerer sammensat af underenheder med flere isoformer klassificeret som: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π og θ 3, med en fælles transmembrantopologi omfatter et stort N-terminal ekstracellulært domæne, fire transmembrane domæner (TMS), og en større intracellulære domæne mellem TM'er 3 og 4 4. Denβ3 og γ2 underenheder er afgørende for synaptisk hæmning og organisme overlevelse, fordi mus med genetisk sletning af disse underenheder dør efter fødslen 5,6. I modsætning hertil individuelle isoformer af α-underenhed er vigtige for funktionen af specifikke synaptiske forbindelser i hjernen forbundet med forskellige adfærd, såsom angst, sedation, ophidselse, og andre, men er ikke individuelt afgørende for liv 7-9. GABA A Rs er de vigtigste steder i aktion for en række lægemidler med potente beroligende, hypnotisk, anxiolytisk og antikonvulsive effekter, såsom benzodiazepiner, barbiturater, neurosteroider og bedøvelsesmidler 7,10,11.

Synaptic GABAA Rs indeholder typisk et γ2 subunit to β underenheder (mest almindeligt β2 eller β3) og to α subunits (α1, α2, α3 eller α5) 12,13. Den fremherskende klasse af ekstra-synaptiske receptorer indeholder δ underenhed i kombinationmed to α underenheder (α4 eller α6), og to β underenheder (β2 eller β3) 14. Subcellulære lokalisering af GABAA-R'er til axoner, dendritter eller soma og insertion i plasmamembranen er afhængig af tilstedeværelsen af β-underenheder 15,16. Men selektiv inkorporering af forskellige GABA A R undertyper i forskellige typer af synapser korrelerer godt med tilstedeværelsen af specifikke α underenheder (α1, α2, α3 eller α5) 7,17,18. Vigtigere, sletning af α1 eller α2 underenhed i mus forårsager ultrastrukturelle ændringer på hæmmende synapser 19. Dette tyder på, at GABA A Rs selv kan spille en direkte rolle i reguleringen synapse formation.

Beviser tyder på, at GABAergic synapse udvikling er et præcist koordineret sekvens af hændelser, hvor både neuronale mål kontaktet af forskellige typer af hæmmende axoner og de receptorer, der er grupperet påhver klasse af hæmmende synapse er selektiv og funktionelt afstemt 17,20-22. Dette grundlæggende princip for specificitet på GABAerge synapser rejser spørgsmålet om, hvordan præ- og postsynaptiske partnere genkender hinanden under indledningen af ​​synaptiske kontakter.

In vitro co-kultur assays er blevet anvendt med succes til at undersøge nogle af de mekanismer, synapsedannelse og at teste rollen af individuelle synaptiske kløft spænder over proteiner i denne proces. Et af de fælles trans-synaptiske interagerende kombinationer protein, der fungerer bidirektionalt at mægle synapsedannelse og modning, er den Neurexins (Nrxns) og Neuroligins (NLS). Nrxns er præsynaptiske proteiner, der udviser alternativ splejsning inden for deres laminin-neurexin køn hormon-bindende protein domæner, hvilket giver anledning til mange forskellige isoformer 23. Mens Nrxns også interagere med andre proteiner, der NLS menes at være deres allestedsnærværende postsynaptiske partners 24. Sammen disse proteiner bidrager til at holde præsynaptiske og postsynaptiske membraner i et tæt og stiv apposition 25. De to hyppigst forekommende isoformer er NL-1 og NL-2, som er til stede ved excitatoriske og hæmmende synapser, henholdsvis 26. En af de tidligste co-kultur modelsystemer, der er designet til at undersøge trans-synaptiske protein-interaktioner, anvendes forskellige typer af ikke-neuronale celler, mest almindeligt udødelige cellelinjer, såsom humane embryonale nyre (HEK) 293-celler, til over-express NL- 2. Når disse celler blev dyrket med pontinske neuroner blev en ophobning af præsynaptiske proteiner i tæt nærhed til overfladen af ​​HEK-celler observeret, hvilket indikerer dannelsen af ​​synapse-lignende kontakter. Tilsætning af opløselig β-neurexin disse co-kulturer hæmmede dannelsen af kontakter, hvilket tyder på, at trans-synaptiske interaktioner mellem Nrxns og NLS er nødvendige for synaptisk kontakt formation 27. Desuden forbigående ekspressionaf β-neurexin i COS (C V-1 (abe) i O rigin og bærer S V40 genetisk materiale) celler co-dyrket med dissocieret hippocampale glutamaterge og GABAerge neuroner induceret ekspression af den postsynaptiske protein gephryin og GABA A R underenheder γ2 og α2 ved berøringspunkter mellem disse to celletyper 28. Et andet eksempel på en co-kultur model, der anvendes til at studere synapsedannelse involveret HEK293-celler, transient transfekterede med GABA A R subunits α2 / β3 / γ2 og NL-2 og en blandet population af hypothalamus neuroner 29. Undersøgelsen konkluderede, at ekspressionen af ​​NL-2 er et absolut krav for dannelse af hæmmende synapser.

Men i den seneste co-kultur undersøgelse stabilt transficeret α1 / β2 / γ2 GABA A R'er i HEK293-celler blev fundet at være tilstrækkelig til at inducere funktionelle synapser når co-dyrket med GABAerge withium piggede neuroner, uden behov for yderligere trans-synaptiske eller postsynaptiske adhæsionsproteiner. Imidlertid blev en fremtrædende stigning i synapsedannelse og styrke observeret, når NL-2 blev co-udtrykkes med GABA A Rs 30. Dette indikerer, at denne co-kultur model system har fordele i forhold til tidligere beskrevne modelsystemer, mest åbenbart en øget følsomhed og pålidelighed af synaptisk kontakt detektion. To vigtige faktorer, der bidrager til den samlede forbedring i detektering af synaptiske kontakter er: i) brugen af stabilt transficerede HEK293 cellelinier med høj og ensartet udtryk af GABA A R underenheder på overfladen af de enkelte celler. Denne sammenhæng letter kvantitative sammenligninger mellem forskellige co-dyrkningsbetingelser. ii) anvendelse af en ren population af GABAerge medium piggede neuroner dyrket fra embryonale striatum 31 fjerner komplikationer og tvetydigheder som følge af brugen af blandede neuronale populationer og alloWS, for eksempel, udvælgelse af de mest hensigtsmæssige postsynaptiske GABA A R typer, der kan sammenlignes med hinanden under synapsedannelse.

Dannelse af synapser menes at involvere mange trans-synaptiske signaler i præ- og postsynaptiske celleadhæsionsprocesser komplekser. På grund af den tovejs karakter af synaptisk signalering og de nøgne tal for celleadhæsionsmolekyler, er det vanskeligt at identificere de vigtigste komponenter, der medvirker i synapsedannelse. Således, transfektion af en enkelt celleadhæsionsprotein i en ikke-neuronal celle (i dette tilfælde de to mest anvendte postsynaptiske mål for GABAerge medium piggede neuroner in vivo, α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) i høj grad reducerer kompleksiteten af ​​trans-synaptisk signaler til rådighed på den postsynaptiske overflade og giver præcis kvantitativ analyse af effekten af ​​dette protein til at fremme synapsedannelse.

Protocol

Sprague-Dawley rotter eller BAB / c indavlede mus (Harlan, UK, antallet af drægtige hunner brugte var 30) blev huset og aflivet i henhold til britiske indenrigsministerium [og Europæiske Fællesskaber Rådets direktiv af 24. november 1986 (86/609 / EØF) ] retningslinjer. Projektet blev formelt godkendt af UCL School of Pharmacy Ethics Committee.

1. Fremstilling af instrumenter, næringssubstrat og skåle

  1. Tænde og rengør laminær strømning med 70% ethanol for at arbejde under sterile betingelser på alle tidspunkter.
  2. Forbered HEK293 cellekulturmedium indeholdende Dulbeccos Modified Eagle Medium pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutamin (2 mM), penicillin (50 enheder / ml), streptomycin (50 ug / ml) og føtalt bovint serum (10 %).
    BEMÆRK: penicillin og streptomycin er irriterende.
  3. Forbered serumfrit neuronal dyrkningsmedium indeholdende Neurobasal medium pH 7,4 (500 ml), B27 supplement (25 ml), L-glutamin (2 mM), penicillin(50 enheder / ml), streptomycin (50 ug / ml) og glucose (6 mM).
  4. Forbered 500 ml HEPES-pufret saltopløsning (HBSS), der indeholder HBSS 10x lager (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) og vand (445 ml), pH 7,4.
  5. Autoklave phosphatpufret saltopløsning (PBS, pH 7,4; 1 L), vand (1 L), dækglas (13 mm i diameter) og glas Pasteur-pipetter at sterilisere dem.

2. Fremstilling af HEK293 Stabil cellelinie, der udtrykker α1 / β3 / γ2-GABA A Rs

  1. Plade 2x10 6 HEK293-celler i en 10 cm steril vævskulturplade og inkuberes ved 37 ° С i en befugtet 5% carbondioxid (CO 2) atmosfære (CO 2-inkubator) med henblik på at nå 70-90% konfluens natten over.
  2. Den følgende dag transficere HEK293-celler med GABA A R α1 underenhed cDNA i pcDN 3.1 (+) ekspressionsvektor inkorporerer G418 disulfat (tabel 1) resistensgen,og GABA A R β3 underenhed cDNA i ekspressionsvektoren inkorporerer phleomycin D1 (tabel 1) resistensgen (begge under regulering af en human cytomegalovirus immediate-early (CMV) -promotor), ved anvendelse af en kationisk liposomformulering, som danner komplekser med negativt ladede nukleinsyremolekyler (tabel 1) i henhold til fabrikantens protokol.
  3. Kort fortalt tilsættes 500 pi reduceret serum medium (pH 7,4; tabel 1) og 7,5 ug af hver cDNA-konstruktion til et sterilt 15 ml centrifugerør, efterfulgt af 15 pi liposomal transfektion buffering reagens og bland forsigtigt før de forlader ved stuetemperatur 5 min.
  4. Til denne blanding tilsættes 8,75 pi liposomalt transfektionsreagens og bland forsigtigt før de forlader ved stuetemperatur i 30 min. Herefter tilsættes 3 ml HEK293 cellekulturmedium (uden antibiotika) afpipettér indholdet af centrifugerøret op og ned to gange, overfr dråbevis på de celler, der vokser i en 10 cm vævskulturskål, og inkuberes i 48 timer ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  5. Vask HEK293-celler forsigtigt med sterilt PBS, pH 7,4 og fortyndes de transficerede HEK293-celler i nye 10 cm vævskulturskåle, i følgende forhold: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 01:10, 01:15 og 1:20. Dette sikrer, at cellerne ikke bliver overdrevent sammenflydende.
  6. Start udvælgelse af HEK293-celler, der udtrykker begge GABA A R underenheder ved tilsætning af 800 ug / ml af hvert antibiotikum selektionsmarkør, G418, og Phleomycin D1, til dyrkningsmediet. Inkubere cellerne ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) og erstatte antibiotika-holdige medium (10 ml) hver 2 dage.
  7. Når små hvide kolonier begynder at danne (sædvanligvis efter ca. 7 dage), omhyggeligt vælge en enkelt koloni fra hver af retterne og indsamle det ved hjælp af en steril P1000pipettespids. Overføre den til en brønd af en 24-brønds vævskulturplade indeholdende 500 pi medium og forsigtigt resuspender ved pipettering af mediet op og ned. Sikre, at nøjagtigt en koloni overføres til hver brønd (i alt 5-20 kolonier tilrådes). Inkubere cellerne ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) og erstatte antibiotika-holdige medium hver 2 dage.
  8. Når kolonier bliver 70-80% sammenflydende, pipettér forsigtigt mediet op og ned for at løsne cellerne fra bunden af ​​24-brønds vævskulturplade. Overføre og opdele suspension af celler mellem to brønde i en 6-brønds plade til vævsdyrkning. Inkubere cellerne ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) og erstatte antibiotika-holdige medium hver 2 dage.
  9. Når 70-80% sammenflydende, opsamle cellerne fra en af ​​de 2 brønde, der indeholder celler, der stammer fra den samme enkelt kolony og forberede proteinlysater. Kort fortalt vaskes cellerne 2 gange med PBS, pH 7,4, og der tilsættes 200 pi 2% natriumdodecylsulfat (SDS) i PBS, pH 7,4. Saml lysatet og overføre det til mikrocentrifugerør. Måle proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA protein reagens (se tabel 1) i henhold til fabrikantens protokol. Analysere ekspressionen af α1 og β3-underenhederne af GABAA-receptorer ved hjælp af SDS / PAGE og immunoblotting under anvendelse af subunit-specifikke antistoffer (kanin-anti-α1-specifikke og kanin-anti-β3-specifikke GABA A R antistoffer, se tabel 1 for information om disse antistoffer).
  10. Løsne og overføre kun positive kloner fra de resterende brønde til større 6 cm vævskulturskåle. Inkubere cellerne ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) og erstatte antibiotika-holdige medium hver 2 dage.
  11. Gradvist udvide kolonier af celler under den antibiotisk selektion ved at overføre dem til 10 cm vævskulturskåle og endelig til vævskulturkolber (T-75 kolber). Inkubere cellerne ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) og erstatte antibiotika-holdige medium hver 2 dage.
  12. Plate 70.000 celler fra hver koloni på dækglas (13 mm i diameter) og fikseres cellerne at analysere celleoverfladeekspression og co-lokalisering af GABA A R underenheder ved immunofluorescens.
  13. Vælge den positive klon af HEK293-celler udtrykker høje niveauer af både α1 og β3-underenhederne af GABAA-receptorer, plade 2 x 10 6 celler i en 10 cm steril vævskulturskål og inkuberes ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære ( CO2-inkubator) natten over. Sikre, at cellerne inkuberes i antibiotika-holdige (G418 og Phleomycin D1) medium på alle tidspunkter.
  14. Den følgende dag, transficere HEK293 celler med GABA A R γ2s underenhed cDNA i pcDNA ™ 3.1 (+) ekspressionsvektor inkorporerer Hygromycin B resistensgenet ved hjælp af en ikke-liposomal lipid transfektionsreagens (tabel 1).
    BEMÆRK: Denne transfektion metode giver en bedre overlevelse og højere ekspression effektiviteten af fremmede proteiner i langsomtvoksende stabile cellelinjer, som er under konstant markering med antibiotika.
  15. I et sterilt 15 ml centrifugerør, tilsættes 250 pi Enhancer og DNA kondensation puffer (tabel 1) og 1,4 ug af γ2s GABAA-receptor-subunit cDNA. Tilføj 11.2 pi Enhancer og vortex i 1 sek før de forlader ved stuetemperatur i 5 min.
  16. Tilføje 35 pi ikke-liposomale lipid transfektionsreagens og vortex for 10 sec før de forlader ved stuetemperatur i 10 min. Tilsæt 3 ml G418 / Phleomycin D1-holdige medium og pipetteres indholdet af centrifugerøret op og ned to gange BEFmalm overføre den dråbevis på de celler, der vokser i en 10 cm vævskulturplade. Inkubér cellerne i 48 timer ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  17. Vask cellerne forsigtigt med sterilt PBS og fortynde dem til nye 10 cm vævskulturskåle, i følgende forhold: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 og 1:20.
  18. Start udvalg af α1 / β3-HEK293 celler, der udtrykker γ2s subunit ved tilsætning af 800 ug / ml antibiotikum selektionsmarkør hygromycin B til G418 / Phleomycin D1-holdigt medium. Erstatte den gamle medium med frisk G418 / Phleomycin D1 / hygromycin B-holdigt medium (10 ml) hver 2 dage.
  19. Gentag trin 2,7-2,12, under kontinuerlig selektion i G418 / Phleomycin D1 / Hygromycin B-holdigt cellekulturmedium.
  20. Opbevar de positive kloner ved -140 ° C i antibiotikum-frit celledyrkningsmedium og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) til fremtidig brug.
  21. Test niveauaf ekspression af α1, β3 og γ2s GABA A R underenheder ved immunoblotting og immunofluorescens i hver klon efter optøning, fordi udtrykket kan ændres som følge af nedsat overlevelse af celler under antibiotisk selektion.

3. Vedligeholdelse af HEK293-cellelinier

  1. Optø et hætteglas med kontrol HEK293-celler eller dem, der udtrykker enten α1 / β2 / γ2-GABAA Rs (tabel 1) eller α1 / β3 / γ2-GABAA R'er (beskrevet ovenfor) i 10 ml cellekulturmedium i en 15 ml steril centrifugerør. Centrifugeres ved 440 xg i 5 minutter for at fjerne overskydende DMSO.
  2. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml frisk celledyrkningsmedium.
  3. Først tilsættes 9 ml frisk celledyrkningsmedium til en 10 cm vævskulturskål coatet med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) og derefter 1 ml resuspenderede celler. Agitere forsigtigt fra side til side, for at dispergere cellerne og inkuberes ved 37 ° С i en befugtet5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  4. Den følgende dag, aspireres medium for at fjerne eventuelle cellerester og erstatte med 10 ml frisk HEK293 cellekulturmedium.
  5. Vælg stabile cellelinier med antibiotika for at fjerne eventuelle celler, der ikke udtrykker GABA A R-underenheder, og derfor også mangler ekspressionen af antibiotikaresistensmarkører. For α1 / β2 / γ2 stabil cellelinie, erstatter normal medium med frisk celledyrkningsmedium indeholdende G418 (800 ug / ml). For α1 / β3 / γ2 cellelinie udskifte med frisk celledyrkningsmedium indeholdende G418 (800 ug / ml), Phleomycin D1 (800 ug / ml) og hygromycin B (800 ug / ml). ADVARSEL! G418 er en irriterende og Hygromycin B er ætsende, giftige og irriterende.
  6. Passage af cellerne i et nyt vævskulturskål ved podning ved en lavere densitet, når de opnår> 70% konfluens. Aspirer 10 ml cellekultur medium og to gange kortvarigt med vaskPBS, pH 7,4. Tilsæt 1 ml trypsin-EDTA-opløsning, en opløsning af proteasen trypsin (0,05% trypsin) og en Ca2 + chelator EDTA (0,02%) i PBS, pH 7,4, for at frigøre cellerne fra skålen. ADVARSEL! Trypsin-EDTA løsning er et irritationsmoment.
  7. Der tilsættes 10 ml cellekulturmedium indeholdende de korrekte antibiotika, til fadet og aspirere cellerne. Centrifugeres cellerne ved 440 x g i 5 min og resuspenderes dem i 5 ml af celledyrkningsmediet.
  8. Passage cellerne under anvendelse af en 1:10 fortynding i en ny vævskulturkolbe (T-75-kolbe) indeholdende frisk celledyrkningsmedium og de korrekte antibiotika. Inkubere cellerne ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) og erstatte mediet hver to dage. Passage af de celler, når> 70% sammenflydende (se trin 2.8).

4. Fremstilling af GABAerg Medium Spiny neuronkultur

  1. Under sterile betingelser forberede en 24-vill plade med poly-L-lysin (0,1 mg / ml) belagte dækglas (13 mm i diameter) og inkuberes ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  2. Den følgende dag, aspirat med en pipette overskydende poly-L-lysin og vaskes dækglas med to korte 10 sek og to 5 min lange vaske med sterilt vand. Tilføj laminin (0,01 mg / ml) natten over, og der inkuberes ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  3. Rense dissektion med 70% ethanol og samle en række dissekere værktøjer såsom buede og lige væv pincet, saks og pincet, og anbringes i 70% ethanol til fuldt ud at sterilisere dissektionsinstrumenter.
  4. Placer den gravide rotte / mus aflivet med CO 2 på ryggen og rengør huden på sin mave med 70% ethanol. Klem huden med en pincet og skæres omkring maven gennem hud, muskler og bughinden, for at afsløre de indre organer og livmodermed embryoner klart. Uddrag embryoner (E16-17) fra livmoderen og placere dem i en petriskål med kølet PBS.
  5. Placer embryoner i laminar flow hætte og halshugge dem, indsamle hovederne i en ny petriskål med kølet HBSS.
  6. Under et dissektionsmikroskop, dissekere hjernerne ud ved hjælp af buede og lige pincet. Placer hjerner til en ny petriskål indeholdende kølet HBSS.
  7. Adskille de to hjernehalvdele og fjern forsigtigt meninges. Skåret langs linien af ​​hippocampus og skrælle cortex at afsløre striatum. Overhold striatum som en stribet hvid struktur ved den forreste af halvkugle.
  8. Dissekere striatum og skæres i meget små stykker (1 - 2 mm i diameter) og bruge en flammepoleret Pasteur pipette til at samle materialet i en steril 15 ml centrifugerør med en samlet volumen på 1 ml. Fire-polering sikrer materialet opsamles uden at blive beskadiget.
  9. Brug af brand-poleret tip af Pasteur-pipette, opsug cellerne og frigive dem 8-10 gange. Under en ny pipette med en brand-polsk spids på ca. 30% af sin oprindelige diameter (1 mm), udriv løsningen yderligere 4 - 6 gange, indtil den vises homogen.
  10. Filtrere celler under anvendelse af en 100 um nylon cellefilter i et frisk sterilt centrifugerør.
  11. Tæl cellerne med et hæmocytometer og pladen 70.000 celler i 500 pi neuronal dyrkningsmedium per brønd i en 24-brønds vævskulturplade. Agitere brøndene venstre mod højre og inkuberes ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) i 14 dage in vitro (DIV).
  12. Efter 7 dage kontrollere renheden af ​​neuronale kulturer, og hvis gliaceller er til stede, tilsættes cytosin β-D-arabinosid (Ara-C, 5 uM) til brøndene for at standse deres proliferation. For at gøre dette, skal du fjerne 250 pi neuronal dyrkningsmedium (pH 7,4) fra hver brønd og tilsættes 250 pi frisk medium indeholderING Ara-C. ADVARSEL! Ara-C er et irritationsmoment.

5. Co-kultur Forberedelse

  1. På dag 11 af neuronal kultur, frakke en 6-brønds plade med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) under sterile betingelser og inkuberes natten over ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  2. Den følgende dag (dag 12 af neuronal kultur) udsuge overskydende poly-D-lysin og vaskes brøndene 2x kort og 2x for 5 min med sterilt vand før tilsætning af frisk celledyrkningsmedium (uden antibiotika) til at coate brøndene med en lille mængde af serum fra mediet.
  3. Aspirere dyrkningsmediet fra vævsdyrkningskolben (T-75). Skyl cellerne to gange med PBS før tilsætning af 1 ml Ca 2+ / Mg 2+ -chelating middel EDTA (0,48 mM), som blidt og ikke-enzymatisk dissocierer celler. Agitere cellerne for at frigøre dem fra bunden af ​​vævet kolbe.
  4. Der tilsættes 10 ml cellekultur medium (uden antibiotika, da dette kan interferere med transfektion), aspireres cellerne og sted i et sterilt centrifugerør. Pelletere cellerne ved 440 x g i 5 min under anvendelse af en lav hastighed bordcentrifuge.
  5. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml frisk celledyrkningsmedium. Anvendelse af et hæmocytometer, tælle cellerne og plade med en tæthed på 3 x 10 5 celler per brønd i en 6-brønds plade. Agitere forsigtigt og inkuberes i 24 timer ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  6. Den følgende dag (dag 13 af neuronal kultur) forbigående transficere HEK293 celler med mCherry cDNA i pcDNA3 ekspressionskonstruktion hjælp liposomal transfektionsreagens. Kort fortalt i et sterilt mikrocentrifugerør, tilsættes 500 pi reduceret serum medium og 5 ug mCherry cDNA. Tilsæt 5 pi liposomal buffering reagens og bland forsigtigt før de forlader ved stuetemperatur i 5 min.
  7. Tilføj 8,75 pi liposomal transfektion reagent og bland forsigtigt før de forlader ved stuetemperatur i 30 min. Pipettere indholdet af mikrocentrifugerør op og ned to gange, overførsel dråbevis til hver brønd på 6-brønds vævskulturplade og inkuberes ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  8. Den følgende dag (dag 14 af neuronal kultur), aspireres HEK293 celledyrkningsmediet fra hver af de 6 brønde, og hver brønd to gange kort vask med PBS (pH 7,4). Tilsæt 300 pi af Ca2 + / Mg2 + -chelating middel EDTA (0,48 mM) og 200 pi af trypsin-EDTA (0,02 til 0,48 mM) til hver brønd og inkuberes ved 37 ° С for 5 min.
  9. Der tilsættes 1 ml frisk HEK293 cellekulturmedium per brønd (dette quencher trypsin) og indsuges løsnede celler i en steril 15 ml centrifugerør. Centrifuger cellerne ved 440 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes. Pellet resuspenderes i 500 pi neuronal dyrkningsmedium (pH 7,4). </ Li>
  10. Anvendelse af et hæmocytometer, tælle cellerne og frø ved en densitet på 30.000 celler per brønd i en 24-brønds vævskulturplade indeholdende neuroner. Agitere pladen for at dispergere cellerne og inkuberes co-kulturer ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator) i 24 timer.

6. Analyse af synaptiske kontakter og deres aktivitet

  1. Efter 23 timer i co-kultur, undersøge dannelsen af »aktive« kontakter mellem GABAerge medium piggede neuroner og HEK293 celler ved hjælp af aktivitet-afhængig optagelse af anti-synaptotagmin luminale domæne-specifikt antistof konjugeret med et fluorescerende farvestof (Cy5, se tabel 1) .
    BEMÆRK: Antistoffet vil kun få adgang til den luminale domæne synaptotagmin, hvortil det binder, når der er kontinuitet mellem de synaptiske vesikel lumen og ekstracellulære rum. Dette sker specielt under neurotransmitterfrigivelse, hvilket gør denne Antibody en fremragende markør af de aktive præsynaptiske terminaler.
  2. Først skylles co-kulturer med neuronal medium (Neurobasal Et medium, pH 7,4; se tabel 1) og tilsæt Cy5-mærket muse-anti-synaptotagmin antistof, fortyndet 1:50 i neuronal medium (Neurobasal Et medium, pH 7,4), til kulturer, for 30 min. Inkubér cellerne i løbet af denne tid ved 37 ° С i en befugtet 5% CO2-atmosfære (CO 2 inkubator).
  3. For at fjerne adgangen af ​​antistoffet, vaske co-kulturer kortvarigt tre gange: først med koldt normal PBS (pH 7,4), andet med kold PBS (pH 7,4) indeholdende 200 mM NaCl, og tredje med kold normal PBS (pH 7,4)
  4. Fikseres cellerne med 300 pi 4% paraformaldehyd / 4% saccharose i PBS (PFA, pH 7,4) i 10 minutter under omrøring. Vask cellerne kortvarigt to gange med PBS (pH 7,4) og derefter med to længere 10 minutters vaske.
  5. Tilføj glycin (0,3 M) til hver brønd i 10 min med omrøring for at standse PFA.
  6. Vask cellerne briefly to gange med PBS (pH 7,4) og derefter med to længere 10 minutters vaske før tilsætning af 300 pi blokeringsopløsning (1% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4) for at reducere ikke-specifik binding af antistoffer.
  7. Sug blokerende opløsning og tilføje marsvin anti-GABA A R-γ2 antistof rettet mod det γ2 N-terminale domæne 33 (1: 3.000 i PBS, pH 7,4) natten over ved 4 ° С.
  8. Den følgende dag, aspireres det primære antistof fra brøndene og vask cellerne kortvarigt to gange med PBS og derefter med to længere 10 minutters vaske.
  9. Permeabilisere cellerne under anvendelse af Triton X-100 (0,1%) i blokerende opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.
  10. Vask cellerne kortvarigt to gange med PBS (pH 7,4) og derefter med to længere 10 minutters vaske før tilsætning af enten muse-anti-glutaminsyre decarboxylase (GAD) 65-antistof (1: 4.000, tabel 1) eller muse-anti-synapsin I-antistof ( 1: 1,000, tabel 1) i 120 minutter ved stuetemperatur temperatur.
  11. Vask cellerne kortvarigt to gange med PBS (pH 7,4) og derefter med to længere 10 minutters vaske og derefter tilføje blokerende opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.
  12. Centrifuger passende sekundære antistoffer (typisk gede-anti-marsvine-IgG konjugeret til Cy5, ged anti-mus IgG konjugeret til Alexa Fluor 488 eller ged anti-mus IgG Alexa Fluor 405, alle på 2 ug / ml) til fjernelse af aggregater af antistoffer ved 21.910 xg i 10 minutter, og tilføj antistoffer (1: 750) til blokerende opløsning. Anvend til passende brønde i 1 time og dæk med alufolie for at beskytte fluoroforerne fra lys eksponering og deraf følgende fotoblegning.
  13. Endelig vaskes cellerne kortvarigt to gange med PBS (pH 7,4) og derefter med to længere 10 minutters vaske for at fjerne eventuelt ubundet sekundært antistof og montere dækglas under anvendelse monterings reagens (Prolong Gold, tabel 1) ca. 10 pi pr dækglas. Tillad 24 timer til at indstille ved stuetemperatur, mens beskyttet mod lys før overførsel til 4° С til langtidsopbevaring.
  14. Analysere prøver ved hjælp af en laser scanning konfokal mikroskop med et 63X olieimmersionsobjektiv. Sørg for, lysniveauer og detektor gevinst er justeret for at undgå mætning.
  15. Overhold potentielle synapse-lignende kontakter som regioner af co-lokalisering mellem de præsynaptiske terminaler positive for GAD65, synapsin jeg eller Cy5-mærket anti-synaptotagmin og postsynaptiske HEK293-celler visualiseret ved DIC eller af mCherry fluorescerende indikatoren.
  16. Tæl potentielle synapse-lignende kontakter ved hjælp af Z-stack serie af optiske sektioner (8-10) gennem en dybde af 4 - 5 um per celle ved hjælp af imaging software.

Representative Results

Protokollen for denne neuron-HEK293 celle co-kultur model er blevet fintunet til at tillade optimal celleoverlevelse. I dette system, dannelse af synapse-lignende kontakter og deres analyse er baseret på en stabil og ensartet ekspression af alle tre GABA A R underenheder, der samles til en funktionel receptor. Det er derfor vigtigt at bruge immunocytokemisk analyse til test for underenhedsekspression på overfladen af ​​HEK293 celle, før du tilføjer dem til neuronale kulturer. I disse eksperimenter blev celleoverfladeekspression af α1, β2 og γ2-underenheder (figur 1A) eller α1, β3 og γ2 underenheder (figur 1B), detekteres ved anvendelse af subunit-specifikke antistoffer, som binder til de ekstracellulære epitoper af disse underenheder. En høj grad af co-lokalisering mellem disse underenheder på HEK293 overflade blev demonstreret.

Efter bekræftelse af overfladeekspression og co-lokalisering af GABA AR subunits i HEK293-celler, co-kulturer blev fremstillet ved anvendelse af HEK293 celler, der udtrykker α1 / β2 / γ2 GABA A R underenheder og medium piggede neuroner dyrket i 14 dage (14 dage in vitro (DIV)). Celler i co-kultur blev inkuberet i 24 timer, fikseret og analyseret under anvendelse af immunocytokemi og konfokal mikroskopi. Analyse af kontakter indikerede, at GAD65-positive GABAerge axonterminaler dannet kun sporadiske kontakter med kontrol HEK293-celler (figur 2A, 2B). Antallet af kontakter opdaget ved 4 timer var 7,3 ± 0,9 pr HEK293- celle, og dette antal blev reduceret til 5,5 ± 0,5 forbindelser (gennemsnit ± SEM) pr HEK293 celle ved 24 timer efter tilsætning af HEK293 celler til de dyrkede neuroner. I modsætning hertil GAD65-positive GABAerge axonterminaler dannet talrige synapse-lignende kontakt med HEK293-celler der udtrykker GABAA-Rs. Antallet af kontakter, der er opnået på 4 timer efter tilsætning af HEK293-celler var 28,3 ± 4,7 pr HEK293- celle, og dette tal blev yderligere stigningd til 52,1 ± 6,3 (middelværdi ± SEM) pr HEK293 celle ved 24 h i co-kultur (figur 2A, 2B).

At afgøre, om disse synapse-lignende kontakter var "aktiv", dvs. støttede vesikulær transmitter frigivelse blev en vesikel-luminale domæne-specifikke anti-synaptotagmin Cy5 antistof tilsættes til codyrkningsmediet efter 23 timers inkubation. Dette antistof er kun inkorporeret i præsynaptiske nerveender, når en pore former mellem de synaptiske vesikel lumen og den ekstracellulære væske i den synaptiske kløft i neurotransmitterfrigivelse. Efter udgivelse, pore lukker, forlader synaptotagmin Cy5-konjugeret fluorescerende antistof bundet til synaptotagmin inde i vesikel. På denne måde er det kun de vesikler aktivt engageret i neurotransmitterfrigivelse mærket med antistoffet. I disse eksperimenter nogle eventuelle kontakter mellem den kontrol HEK293 celler og medium piggede nerveender de var "aktiv & #8217; som det fremgår af den manglende co-lokalisering mellem den præsynaptiske GAD65 / synaptotagmin fluorescens og mCherry fluorescens i HEK293-celler (figur 3A). I modsætning hertil var der mange »aktive« kontakter dannet mellem de mellemstore spiny neuron terminaler og α1 / β2 / γ2-udtrykkende HEK293-celler, som afsløret ved en høj grad af co-lokalisering mellem GAD65 / synaptotagmin og mCherry udtrykt specifikt i HEK293 celler ( Figur 3B).

For at teste, om en anden undertype af GABA A R også kan fremme synapse-lignende formation in vitro har vi samdyrkes α1 / β3 / γ2 udtrykkende HEK293-celler med medium piggede neuroner. Igen, kontrol HEK293-celler sjældent modtaget kontakter med synapsin-positive præsynaptiske terminaler nåede 10,8 ± 0,48 (gennemsnit ± SEM) kontakter pr HEK293 celler efter 24 timer i co-kultur (figur 4A venstre, 4B). Men HEK293-celler der udtrykkerα1 / β3 / γ2 GABA A Rs formular betydeligt mere synapse-lignende kontakter med synapsin-positive præsynaptiske terminaler mellemstore spiny neuroner nåede 25,3 ± 0,27 (gennemsnit ± SEM) kontakter pr HEK293 celle efter 24 timer i co-kultur (figur 4A ret, 4B). Dette indikerer, at α1 / β3 / γ2 GABA A Rs udtrykt i HEK293-celler er også i stand til at fremme synaptisk kontakt formation, omend deres styrke er mindre end styrken af α1 / β2 / γ2-indeholdende GABA A Rs.

Disse eksperimenter viser, at co-kultur model udviklet i vores laboratorium tillader kvantitativ analyse af synaptisk kontakt dannelse in vitro såvel som evaluering af effektiviteten af forskellige undertyper af GABAA-R'er i denne proces. Disse eksperimenter viser yderligere, at GABAA-R, ud over at være kritiske funktionelle komponenter i GABAerge synapser, kan spille en central rollei processen for anerkendelse og dannelse af synaptiske kontakter mellem hæmmende neuroner og de relevante neuronale målceller, uafhængigt af andre synaptiske adhæsionsproteiner.

Figur 1
Figur 1. Immuncytokemisk analyse af ekspression af GABA A R α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 i stabile HEK293 cellelinjer. Antistoffer, der genkender ekstracellulære domæner af GABA A R underenheder blev anvendt til mærkning af receptorer udtrykt på celleoverfladen. ( A) HEK293 cellelinie, der udtrykker α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) og γ2 (Cy5) ved høje niveauer. (B) HEK293 cellelinie, der udtrykker α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) og γ2 (Cy5)underenheder på høje niveauer. Scale bar:. 10 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. GABAerge medium piggede neuroner danner synapse-lignende kontakter med α1 / β2 / γ2- udtrykker HEK293-celler i co-kultur. (A) Fluorescerende mærkning af præsynaptiske terminaler med anti-GAD65 antistoffer (i grønt) og HEK293 celler med mCherry (i rød, venstre) eller GABA A R γ2 subunit (i blå, højre), afslørede punkter af co-lokalisering mellem disse markører indikerer dannelsen af ​​synapse-lignende kontakter efter 4 eller 24 timer i co-kultur. Scale bar:. 10 um (B) Kvantitativ analyse af synapse-lignende co ntacts. HEK293-celler blev identificeret på grundlag af deres form som afsløret ved DIC billedbehandling og / eller mCherry udtryk, og antallet af kontakter mellem GAD-65 positive puncta (i grønt) og overfladen af ​​HEK293-celler blev talt ved øje i hver optisk afsnit af en Z-stack serien (8-10) per celle ved hjælp af imaging-softwaren, og udtrykt som antallet af kontakter / celle. Grafen viser antallet af kontakter mellem mellemstore spiny neuroner og kontrol HEK293 celler (lysegrå) eller α1 / β2 / γ2-HEK293-celler (sorte) efter 4 og 24 timer i co-kultur (middel ± SEM, n = 8 i hver betingelse fra to uafhængige forsøg). Dette tal er blevet ændret fra Fuchs et al. (2013) 30. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

annonce / 52115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3. GABA A Rs fremme dannelsen af aktive synaptiske kontakter. Immunolabeling af synapse-lignende kontakter dannet efter 24 timer i co-kultur mellem medium piggede nerveender positive for GAD65 (Alexa Fluor 405 cyan) og (a) Kontrollen HEK293 celler eller (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 celler, både transient transficeret med mCherry konstruere (rød). Aktive kontakter identificeres ved co-lokalisering mellem vesikel luminale domæne-specifikke anti-synaptotagmin antistof (Cy5) og GAD65-specifikt antistof, både i præsynaptiske terminaler, og mCherry udtrykt i HEK293-celler. Scale bar:. 10 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.

igur 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4. GABAerge medium piggede neuroner danner synapse-lignende kontakter med α1 / β3 / γ2- subunit udtrykker HEK293 celler i co-kultur. (A) Fluorescerende mærkning af præsynaptiske terminaler med anti-synapsin I-antistoffer (i grønt), og kontrol HEK293-celler (til venstre), eller α1 / β3 / γ2 udtrykkende HEK293-celler, både forbigående transficeret med mCherry (i rødt), afslørede punkter co-lokalisering mellem disse markører indikerer dannelsen af ​​synapse-lignende kontakter efter 24 timer i co-kultur. Scale bar: 10 pm (B). Kvantitativ analyse af synapse-lignende kontakter. HEK293-celler blev identificeret ved mCherry ekspression, og antallet af kontakter mellem synapsin I-positive puncta (med grønt) og overfladen af ​​HEK293-celler blev talt med det blotte øje i hver optisk del af en Z-stack serien (8-10) per celle ved hjælp af imaging software, og udtrykt som antallet af kontakter / celle. Grafen viser antallet af kontakter mellem mellemstore spiny neuroner og kontrol HEK293 celler (lysegrå) eller α1 / β3 / γ2-HEK293-celler (sorte) efter 24 timer i co-kultur (middel ± SEM, n = 8-12 celler i hver betingelse, fra to uafhængige forsøg). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Selv om denne protokol ikke er teknisk vanskeligt at udføre, er der flere vigtige skridt, der skal følges for at opnå de mest nøjagtige og repeterbare co-kultur assays. For det første skal dyrkede medium piggede neuroner podes ved en optimal tæthed. Hvis podet for tyndt, neuroner tendens til at udvikle meget langsomt og overlevelse er stærkt reduceret. På den anden side, hvis podet for tæt neuroner tendens til at aggregere som bringer analyse af kontakter med HEK293-celler. For det andet, anbefales det at transient udtrykker en fluorescerende reporter, GFP eller mCherry i HEK293-celler, der stabilt udtrykker GABAA-R'er, før platting dem i co-kultur. Dette tillader pålidelig anerkendelse af HEK293-celler, som kan være kompromitteret af lighed i form og størrelse mellem disse celler og sjældne overlevende glia celle i neuronale kulturer. For at opnå en effektiv transfektion med GFP eller mCherry cDNA, HEK293 cellelinjer være i den eksponentielle vækstfase ogpodes på et passende tæthed i 6-brønds plader. Sparse podning efterfulgt af transfektion vil forårsage celler til at vokse dårligt, mens over-seeding vil forhindre cellerne i at optage cDNA. Ideelt bør celler podes således, at de er mellem 70 til 90% konfluente på dagen for transfektion. For det tredje skal transfektion optimeres for hver cellelinie anvendes, da nogle cellelinier er mere følsomme end de andre. Dette skyldes, at konstitutiv GABA A R-ekspression i HEK293-celler reducerer celleoverlevelse og cellernes evne til at komme sig efter transfektion. Desuden overlevelse afhænger af GABA A Rs udtrykt i HEK293-celler, med nogle cellelinjer er væsentligt mere følsom end de andre. Transfektion hjælp liposomal reagens er en optimal metode til at udtrykke fremmede proteiner i hurtigt voksende cellelinier, der giver både den høje transfektionseffektivitet og niveauet for ekspression. Men dette reagens forårsager for meget skade på langsomt voksende cellelinier, forsom vi jævnligt bruger en ikke-liposomal transfektionsreagens. Dette virker på en lignende måde til den liposomale reagenset, men mængden af ​​DNA, der kræves til effektiv transfektion bliver væsentligt reduceret. Dette tillader en større celle overlevelse (ca. 80 til 90% sammenlignet med 60% ved anvendelse af liposomal-reagens), men med lavere transfektionseffektivitet (60%). Endelig er antallet af kontrol HEK293 eller α1 / β2 / γ2 HEK293 udtrykkende celler tilsættes til neuronale kulturer skal optimeres. Tilføjelse for få celler kompromitterer vellykket analyse af kontakter mellem HEK293 celler og neuroner, fordi de bliver meget sjældent. Omvendt, tilføjer alt for mange HEK293-celler forårsager neuronal celledød inden for få timer.

Embryonale medium spiny neuron kulturer ideelt set bør udarbejdes ved hjælp af striatum dissekeret fra embryonale alder 15 - 17. Imidlertid sker det ofte, at fostre er lidt yngre eller ældre end den optimale alder. I dette tilfælde er antallet af neuroner podet i kultur vilskal varieres. Væv, der er yngre end E15 kan være nødvendigt at podes på et lidt lavere densitet, mens væv, der er ældre end E17 muligvis skal podes ved en højere tæthed, for at tillade optimal celleoverlevelse. Endvidere kan cytosinarabinosid (Ara-C) skal tilføjes til ældre kulturer for at forhindre vækst af glia, som er mere rigelige i ældre væv.

Ved oprettelse af co-kulturer, er det vigtigt at plettere optimeret antal transficerede HEK293 eller α1 / β2 / γ2 HEK293 udtrykkende celler, som nævnt ovenfor. Dog kan det være nødvendigt at afgøre dette for hver enkelt celle linie på grund af forskelle i deres overlevelse. Typisk 30.000 celler i et maksimalt volumen på 50 pi bør tilsættes til hver brønd af en 24-brønds skål, der allerede indeholder 500 pi neuronal dyrkningsmedium, da dette sikrer, at det konditionerede medium neuronal ikke fortyndes for meget, og at de betingelser, inden for hver godt være nogenlunde konstant, fx

En af de store ulemper ved co-kultur teknik er, at neuronkulturer er skabt ud fra dissocierede celler dyrket som et monolag, hvilket betyder, at de neuroner er blevet fjernet fra deres normale mikromiljø og er ude af stand til at etablere deres normale anatomiske organisation. Mangler de derfor det rette forbindelser, input og udskilte molekyler fra andre celler, der kan påvirke de indledende faser af synapse udvikling. For eksempel in vivo medium piggede neuroner er tæt innerverede af glutamaterge input fra cortex, thalamus og andre hjerneområder 34, men i vores neuronkulturer glutamaterge synapser ikke danner fordi disse indgange er beskadiget under dissektion af striatale væv. Hvor fraværet af funktionelle glutamaterge synapser i dyrkede medium piggede neuroner AFFects deres evne til at danne GABAerge synapser med hinanden og / eller HEK293 celler, der udtrykker GABA A Rs stadig et åbent spørgsmål. Dette spørgsmål kan nemt behandles ved dyrkning af medium piggede neuroner sammen med corticale glutamaterge neuroner således at de kan danne funktionelle synapser 35 før tilsætning af HEK293-celler. En alternativ fremgangsmåde ville være at designe en co-kultur model baseret på organotypiske skive kulturer, der opretholder nogle af cytoarchitecture der kan være vigtig for modning og synapse formation. Men organotypiske skive kulturer har tætte og heterogen neuropil som kan kompromittere analyse udført her. En anden vigtig ulempe ved anvendelse af co-kultur assays er, at GABA A Rs udtrykt på overfladen af HEK293-celler ikke klynger, som de er i neuroner, skønt dette ikke synes at være nødvendig for synapsedannelse givet en tilstrækkelig høj overflade-ekspression 30. For eksempel i rodent hjerne og i hippocampuskulturer er α1 GABA A R-subunit findes i de fleste GABAerge synapser på alle postsynaptiske domæner af pyramideformede celler. Imidlertid er α2 specifikt placeret i en delmængde af synapser på somata og dendritter, men er stærkt beriget i Axon indledende segment, som vist ved immunofluorescens og elektronmikroskopi 36. Da synapsedannelse i co-kulturer stadig kan detekteres pålideligt og analyseret 30, antyder dette, at tætheden af GABA A Rs på celleoverfladen af HEK293-celler kan svare til eller endog er højere end densiteten af disse receptorer i synaptisk klynger i neuroner. Dette kan forklare, i det mindste delvis, hvorfor synaptiske adhæsionsproteiner, såsom neuroligin og postsynaptiske densitet proteiner, såsom gephyrin, ikke er nødvendige for synapsedannelse i co-kulturer, hvis de passende samlet GABAA Rs er til stede i tilstrækkelig densitet.

Det er veldokumenteret, at GABAA-R'er er strukturelt og funktionelt heterogent, og at receptorunderenhed sammensætning bestemmer deres subcellulære lokalisering og farmakologiske egenskaber. For eksempel er inkorporering af de to underenheder kendt for at være en forudsætning for den synaptiske lokalisering af GABAA Rs mens subunit er næsten udelukkende til stede i ekstrasynaptiske GABAA-Rs. De receptorer, der inkorporerer kun αβ kombinationer menes også at være overvejende lokaliseret til ekstrasynaptiske domæner 12- 14. Hvorvidt denne specificitet opretholdes i vores co-kultur-systemet kan nemt testes ved forbigående transfektion 2 eller subunit cDNA'er i HEK293 cellelinjer stabilt udtrykker α og β subunits, før du tilføjer dem til neuronale kulturer. Vores foreløbige eksperimenter under anvendelse af denne fremgangsmåde har foreslået, at synaptiske kontakter let dannes kun i nærvær af 2-underenheden, hvilket indikerer, at det specifikkeficity observeret in vivo forventes at blive bevaret in vitro (data ikke vist).

Desuden er GABA A Rs inkorporerer forskellige α subunits selektivt lokaliseret til synaptiske kontakter dannet med specifikke typer af præsynaptiske neuroner. For eksempel i globus pallidus, de α1-GABAA Rs er generelt findes på striatopallidale (str-GP) og palliopallidal (GP-GP) synapser, som er placeret på dendritter og somatiske områder af medium piggede neuroner, hhv. De α3-GABA A Rs er placeret i perisomatic regioner af mellemstore spiny neuroner og bliver kontaktet af lokale GP Axon soeskende, mens α2-GABA A R'er er placeret på distale dendritter af disse neuroner og kontaktet primært ved input fra striatum 32. Ekspression af specifikke α-underenheder i forskellige typer af synapser og i forskellige neuronale rum er også blevet påvist i andre områder af hjernen, såsom Hippocampus 21 og neocortex 18,20. Disse resultater rejser spørgsmålet om, hvordan de specifikke inhibitoriske synapser dannes i hjernen. Har vedhæftning af en bestemt type præsynaptiske terminal fremkalde indsættelse af specifikke GABA A R undertyper i kontaktpunkterne? Receptorerne smugles til specifikke subcellulære lokaliteter i henhold til deres subunit sammensætning, hvor deres plasmamembran indsættelse er en forudsætning for vedhæftning af axonale terminaler bestemt oprindelse? Til dato, forbliver disse spørgsmål ubesvarede. Anvendelse af reducerede modelsystemer såsom co-kultur model system giver os mulighed for at begynde at besvare dette komplekse spørgsmål, fordi systemet er let modtagelig for transfektion af DNA-konstruktioner og anvendelse af reagenser og vigtigere, er det velegnet til levende celler analyse 30. Således bruger denne model system, vi kan begynde at teste den rolle, de enkelte molekyler, herunder forskellige typer af GABA A R'er, kendern at være til stede ved synaptiske kontakter. En anden fordel er, at synapser i dette modelsystem formular hurtigt, inden for få minutter til timer, reducere varigheden af forsøgene. Lignende co-kultur modelsystemer positive resultater blev anvendt i fortiden for at screene for de hidtil ukendte synaptogenic molekyler 27,37,38.

Forstå, hvordan det centrale nervesystem udvikler, modnes og formularer forbindelser mellem neuroner så intrikate til kontrol, for eksempel, adfærd eller kognition, er af fundamental betydning. Denne fjernt mål kan kun nås ved at afgrænse de molekylære mekanismer, der styrer de enkelte trin for indregning og celle-til-celle kommunikation under udvikling. Grundet sheer kompleksitet, kan de molekylære detaljer i disse mange cellulære vekselvirkninger i øjeblikket studeres med præcision kun i reducerede systemer. Imidlertid evnen til at øge kompleksiteten af ​​disse systemer ved at udtrykke flere kombinationer af proteiner, og at undersøge, hvordande interagerer har nogle fordele i sammenligning med for eksempel genetiske sletning tilgange. Dette er fordi den nøjagtige fortolkning af virkningerne af en enkelt gendeletion ofte er kompromitteret af ændringer i forbindelse med kompenserende mekanismer maskeringer virkningerne af oprindelige læsioner, især i hjernens udvikling. Den enkle men informativ co-kultur her beskrevne teknik har muliggjort en opdagelse af den strukturelle rolle GABA A Rs i synapsedannelse og åbnet mulighed for at undersøge, hvordan GABAA Rs og andre celleadhæsionsmolekyler og / eller synaptiske matrixproteiner interagerer med hinanden under synaptogenese. Synaptiske matrixproteiner er af særlig interesse, da de for nylig har vist sig at spille en central rolle i glutamaterge synapse formation 39. Videreudvikling af co-kultur modellerne er vigtige, fordi de har potentiale til at fremme vores viden om de molekylære mekanismer, der styrer den "normale &# 8217; hjernens udvikling og dermed øge vores forståelse af, hvordan disse mekanismer er ændret i mange neurologiske sygdomme, såsom epilepsi, skizofreni, autisme spektrum forstyrrelser og mange andre.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende finansiel støtte fra MRC UK (G0800498). Vi vil også gerne takke professor JM Fritschy, Zürich Universitet, for tilvejebringelse af GABA A -R subunitspecifik γ2 antistof og professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, for tilvejebringelse af pcDNA 3.1 (+) ekspressionsvektorer indeholdende antibiotikaresistens gener til fremstilling af stabilt transficerede HEK293-cellelinier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Life Technologies 11960-044 Warm in water bath at 37 °C before use
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10106-169
Neuralbasal Life Technologies 21103-049 Warm in water bath at 37 °C before use
B27 Supplement Life Technologies 17504-044
Glucose Sigma-Aldrich G8769
HBSS (10X) Life Technologies 14180-046
HEPES (1M) Life Technologies 15630-056
PBS (1X) Life Technologies 10010-031
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) Life Technologies V790-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) Life Technologies V860-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) Life Technologies V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1149
G418 disulfate salt (Geneticin) Sigma-Aldrich G5013 Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin) Life Technologies R25001
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 Warm in water bath at 37 °C before use. Danger: irritant.
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Laminin Sigma-Aldrich L2020
100 μm Nylon Cell Strainer VWR 734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich C1768 Danger: Irritant
Chelating agent (Versene) Life Technologies 15040-033
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). Life Technologies 15338-100 Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) Qiagen 301425
Reduced serum medium (Opti-MEM) Life Technologies 11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 Synaptic Systems 105311C5
Neurobasal A Life Technologies 10888-022
Sodium Chloride (NaCl) VWR 27810.364
Glycine Sigma-Aldrich G1726
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody Prof. Jean Marc Fritschy N/A (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100 Promega H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody Merck Millipore MAB351
Mouse anti-synapsin antibody Synaptic Systems 106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) Merck Millipore MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody Professor Anne Stephenson N/A (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody Merck Millipore AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Merck Millipore AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody Life Technologies A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody Life Technologies A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies A11008
Mounting reagent (Prolong Gold) Life Technologies P36930 Use at room temperature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

Tags

Neuroscience Developmental neurovidenskab synaptogenese synaptisk hæmning co-kultur stabile cellelinier GABAergic medium piggede neuroner HEK 293 cellelinje
Inhibitorisk synapsedannelse i en Co-kultur model, som indeholder GABAerge Medium Langustre neuroner og HEK293-celler stabilt udtrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson,… More

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson, M. W., Stephenson, F. A., Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors. J. Vis. Exp. (93), e52115, doi:10.3791/52115 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter