Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Inhibitory Synapse Формирование в совместной культуре модель, включающая ГАМКергические средний Колючие нейронов и клеток НЕК293, стабильно экспрессирующих GABA Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52115
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1UCL School of Pharmacy, University College London

Summary

Молекулярные механизмы, которые координируют формирование тормозящих синапсов GABAergic в онтогенезе в значительной степени неизвестны. Для изучения этих процессов, мы разработали систему модели со-культуры, которая включает эмбриональные среднего колючий ГАМКергических нейронов культивировать совместно с стабильно трансфицированных человеческой эмбриональной почки 293 (HEK293) клеток, экспрессирующих функциональные рецепторы GABA A.

Introduction

ГАМК является одним из самых ранних нейромедиаторов, найденных в эмбрионального мозга, предшествующий самый распространенный возбуждающий нейротрансмиттер глутамат 1. В процессе разработки, ГАМК деполяризует и возбуждает незрелых нейронов, играет ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации, миграции и формирование нейронных сетей, не вызывая эксайтотоксичность. В головном мозге взрослых, обратный потенциал для ГАМК А рецептора каналов смещается в более отрицательных потенциалах из-за уменьшения внутриклеточной концентрации хлорида. Этот сдвиг обусловлен повышающей регуляции в калий-хлорида со-переносчика (KCC2), который транспортирует хлорид из клетки, и, параллельно, понижающей регуляции в натрий-калий-хлорида транспортера (NKCC1), который имеет 2 противоположный эффект.

В головном мозге, ГАМК, прежде всего, связывается с ГАМК либо A или B ГАМК-рецепторов опосредовать быстро или медленно синаптическую ингибирование, соответствующаялы. ГАМК А Rs представляют собой класс рецепторов, также известных как heteropentameric ионотропные или воротами лиганд Cys-петлевых ионных каналов. Две молекулы ГАМК требуются для активации рецептора, который является проницаемой для ионов хлора и, в меньшей степени, ионов бикарбоната. Увеличение в хлоридной проводимости, снижает эффективность деполяризующих, возбуждающих событий в активации постсинаптического нейрона 3.

Структурное разнообразие ГАМК A рупий уже давно признана в качестве ключевого фактора в определении их широкий спектр функциональных и фармакологических свойств. Родной ГАМК А Rs являются гетероатомами, пентамеры, состоящие из субъединиц с нескольких изоформ, классифицированных как: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π и θ 3, с общим трансмембранный топология, содержащий большое N-концевой внеклеточный домен, четыре трансмембранных доменов (ТМС), а также большую внутриклеточный домен между ТМ 3 и 4 4.β3 и γ2 субъединицы необходимы для синаптической торможения и выживания организма, потому что мышей с генетической удаление этих субъединиц умереть после рождения 5,6. В отличие от этого, индивидуальные изоформы α-субъединицы важны для функции специфических синаптических соединений в мозге, связанных с различными поведения, такие как беспокойство, седативный эффект, возбуждение и другие, но не по отдельности, существенным для жизни 7-9. GABA A рупий являются основными местами действия для различных препаратов с мощным седативным, гипнотическим, успокаивающих и противосудорожных эффектов, таких как бензодиазепины, барбитураты, нейростероидов и анестетиков 7,10,11.

Synaptic ГАМК A рупий обычно содержат γ2 субъединицы, два β субъединиц (чаще всего β2 или β3) и две α субъединицы (α1, α2, α3 или α5) 12,13. Преобладающий класс экстра-синаптических рецепторов содержит δ-субъединицы в сочетаниис двумя α субъединиц (α4 или α6), и двух β субъединиц (β2 или β3) 14. Субклеточная локализация ГАМК A рупий до аксонов, дендритов или сомы, и вставки в мембране зависят от наличия β-субъединиц 15,16. Тем не менее, селективный включение отличается ГАМК A R подтипов в различных типах синапсов хорошо коррелирует с наличием специфических α субъединиц (α1, α2, α3 или α5) 7,17,18. Важно отметить, что удаление α1 или α2 субъединицы у мышей вызывает ультраструктурные изменения в тормозных синапсов 19. Это говорит о том, что ГАМК Rs себя может играть непосредственную роль в регуляции образования синапсов.

Практика показывает, что развитие ГАМКергической Синапс точно координируется последовательность событий, в которых оба нейронные мишени связаться по различным типам тормозных аксонов и рецепторов, которые сгруппированы вкаждый класс ингибиторной синапса являются селективными и функционально приспособлены 17,20-22. Это фундаментальный принцип специфичности в GABAergic синапсов возникает вопрос относительно того, как до и постсинаптические партнеры узнают друг друга во время посвящения синаптических контактов.

В пробирке со-культуры анализы были успешно применены для изучения некоторых из механизмов формирования синапсов и протестировать роль отдельных синаптической щели охватывающей белков в этом процессе. Один из распространенных транс-синаптических взаимодействующих комбинаций белковых, которые функционируют в двух направлениях, чтобы посредничать образование синапсов и созревание, являются Neurexins (Nrxns) и Neuroligins (NLS). Nrxns являются пресинаптические белки, которые обладают альтернативный сплайсинг в своих ламинином-нейрексина-половых гормонов связывающий белковых доменов, что приводит к различным изоформ 23. В то время как Nrxns также взаимодействовать с другими белками, NLs, как считается, их повсеместное постсинаптическая годовыхrtners 24. Вместе эти белки способствуют проведению пресинаптические и постсинаптические мембраны в тесном и жесткой аппозиции 25. Два наиболее обильные изоформы NL-1 и NL-2, которые присутствуют в возбуждающих и тормозных синапсов, соответственно 26. Одна из самых ранних моделей совместно культуры систем, предназначенных для расследования транс-синаптических взаимодействий белков, занятых различными типами не-нервных клеток, наиболее часто бессмертные клеточные линии, такие как человеческих эмбриональных почек (НЕК) 293 клеток, в более-экспресс NL- 2. Когда эти клетки культивировали с мостовой нейронов, накопление пресинаптических белков в непосредственной близости к поверхности клеток НЕК наблюдалось, что указывает на образование синапсов, как контакты. Добавление растворимого β-нейрексина этих совместных культурах ингибирует образование контактов, предполагая, что транс-синаптических взаимодействий между Nrxns и NLS необходимы для формирования синаптических контактов 27. Кроме того, переходный выражениеиз β-нейрексина в COS клетках (C V-1 (обезьяний) в O Rigin, и проведение генетического материала S V40) совместно культивируемых с диссоциированном гиппокампа глутаматэргическую и ГАМКергических нейронов индуцированной экспрессии постсинаптической gephryin белка и ГАМК R субъединиц γ2 и α2 в точках контакта между этими двумя клетками типов 28. Другой пример модели сокультуры используется для изучения формирования синапсов участие НЕК293 клетки, временно трансфицированным ГАМК A R субъединицы α2 / β3 / γ2 и NL-2, и смешанную популяцию нейронов гипоталамуса 29. Это исследование показало, что экспрессия NL-2 является абсолютным требованием для формирования ингибирующих синапсов.

Тем не менее, в недавнем исследовании сокультуры, стабильно трансфицированных α1 / β2 / γ2 ГАМК рупий в НЕК293 оказались достаточно, чтобы вызвать функциональные синапсы при совместном культивировании с GABAergic медНМУ колючих нейронов, без необходимости в дополнительных транс-синаптических или постсинаптических белков адгезии. Тем не менее, заметным увеличение формирования синапсов и прочности наблюдали при ко-экспрессировали NL-2 с GABA A Rs 30. Это указывает на то, что это совместное культивирование система модель имеет преимущества по сравнению с ранее описанными системами модельных, наиболее очевидно, повышенной чувствительности и надежности синаптической обнаружения контакта. Два важных факторов, влияющих на общее улучшение выявления синаптических контактов: я) Использование стабильно трансфицированных НЕК293 клеточных линий с высокой и последовательной экспрессии ГАМК R подразделений на поверхности отдельных клеток. Эта согласованность способствует количественные сравнения между различными условиями совместного культивирования. б) Использование чистой популяции GABAergic среднего колючих нейронов, культивируемых из эмбрионального стриатуме 31 удаляет осложнений и неясности в результате использования смешанных популяций нейронов и аллоWS, например, выбор наиболее подходящих постсинаптических типов ГАМК R, которые можно сравнить друг с другом в процессе формирования синапсов.

Формирование синапсов, как полагают, связаны многие транс-синаптических сигналов в пределах до и постсинаптических клеточной адгезии комплексов. В связи с двунаправленной природе синаптической передачи сигналов и только количество молекул клеточной адгезии, трудно идентифицировать ключевые компоненты, участвующие в формировании синапсов. Таким образом, трансфекции одного белка клеточной адгезии в не-нейрональной клетки (в данном случае, два самых распространенных постсинаптические мишени для ГАМКергических нейронов среднего колючих в естественных условиях, α1 / β2 / γ2 или α1 / β3 / γ2 ГАМК Rs 32) значительно уменьшает сложность транс-синаптических сигналов, доступных на постсинаптической поверхности и позволяет точно количественный анализ эффективности этого белка в способствуя образованию синапсов.

Protocol

Спрэг Dawley крысы или BAB / с инбредной мыши (Харлан, Великобритания; количество беременных самок использовали 30) были размещены и в жертву согласно внутренних дел Великобритании [и директивы Европейского Совета Сообщества от 24 ноября 1986 года (86/609 / EEC) ] руководящие принципы. Проект был официально утвержден UCL школы Комитета фармации этики.

1. Подготовка инструментов, культуральной среды, и блюда

  1. Включите и очистить ламинаре с 70% этанола, чтобы работать в стерильных условиях в любое время.
  2. Подготовьте HEK293 клеточную культуральную среду, содержащий Игла в модификации Дульбекко среде рН 7,4 (DMEM, 500 мл), L-глютамин (2 мМ), пенициллином (50 единиц / мл), стрептомицин (50 мкг / мл), и фетальной бычьей сывороткой (10 %).
    ПРИМЕЧАНИЕ: пенициллин и стрептомицин являются раздражителями.
  3. Подготовьте бессывороточной культуральной среды нейронов, содержащий Neurobasal среды рН 7,4 (500 мл), добавку B27 (25 мл), L-глютамин (2 мМ), пенициллин(50 ед / мл), стрептомицин (50 мкг / мл), и глюкозы (6 мм).
  4. Приготовления 500 мл HEPES-солевом буферном растворе (HBSS), содержащий HBSS 10x складе (50 мл), HEPES (1 М) (5 мл) и воды (445 мл), рН 7,4.
  5. Автоклав фосфатный буферный солевой раствор (PBS, рН 7,4; 1 л), водой (1 л), покровные стекла (13 мм в диаметре) и стекло пипетки Пастера, чтобы стерилизовать их.

2. Подготовка HEK293 стабильной клеточной линии выражая α1 / β3 / γ2-ГАМК рупий А

  1. Пластинчатые 2x10 6 клеток НЕК293 в 10 см стерильной планшет для тканевых культур и инкубируют при 37 ° С в увлажненной 5% диоксида углерода (СО 2) атмосфера (CO 2 инкубаторе), чтобы достичь 70-90% слияния в течение ночи.
  2. На следующий день, трансфекции клеток НЕК293 с ГАМК R α1 субъединицы кДНК в pcDN 3,1 (+) вектора экспрессии, включающего G418 дисульфатом (Таблица 1) гена устойчивости,и ГАМК R β3 субъединицы кДНК в вектор экспрессии, включающий в флеомицина D1 (таблица 1) ген устойчивости (оба под регулирования цитомегаловируса человека-начале (CMV) промотора), с использованием катионного липосомной композиции, который образует комплекс с отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот (таблица 1) в соответствии с протоколом производителя.
  3. Вкратце, добавить 500 мкл сыворотки снижается среде (рН 7,4; таблица 1) и 7,5 мкг каждого кДНК построить в стерильную 15 мл центрифужную пробирку, а затем 15 мкл липосомальной трансфекции буферизации реагента, и осторожно перемешать перед выходом при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. К этой смеси, добавьте 8,75 мкл липосомальной трансфекции реагента и аккуратно перемешать перед отъездом при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого добавляют 3 мл HEK293 клеточной культуральной среде (без антибиотиков), пипеткой содержимое в центрифужную пробирку вверх и вниз в два раза, transfeR каплям на клетках, растущих в 10 см чашки для культивирования тканей, и инкубируют в течение 48 ч при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе).
  5. Вымойте клеток НЕК293 мягко стерильным PBS, рН 7,4, и разбавить трансфектированных HEK293 клетки в новые 10 см ткани чашек для культивирования, в следующих соотношениях: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 и 1:20. Это гарантирует, что клетки не станут чрезмерно вырожденная.
  6. Начало выбор клеток НЕК293, экспрессирующих обе ГАМК R субъединицы добавлением 800 мкг / мл каждого антибиотика селективного маркера, G418, и флеомицина D1, в культуральную среду. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) и заменить среду, содержащую антибиотик (10 мл) каждые 2 дня.
  7. Когда мелкие белые колонии начинают формировать (как правило, примерно через 7 дней), тщательно выбрать одну колонию от каждого из блюд и собирать его, используя стерильный P1000пипетки. Перенести его на одну лунку планшета для культуры ткани 24-луночный, содержащего 500 мкл среды и осторожно ресуспендируют с помощью пипетки среды вверх и вниз. Убедитесь, что именно одна колония передается в каждую лунку (в общей сложности 5-20 колоний рекомендуется). Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) и замените среду, содержащую антибиотик каждые 2 дня.
  8. После того, как колонии станут 70-80% сплошности, осторожно пипеткой среду вверх и вниз, чтобы сместить клетки от нижней части планшета для культуры ткани 24-луночного. Трансфер и разделить суспензию клеток между 2 скважин в культуре ткани пластины 6-а. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) и замените среду, содержащую антибиотик каждые 2 дня.
  9. После 70 - 80% сплошности, сбора клеток из 1 из 2 лунки, содержащие клетки, происходящие из одной и той же одной толстой кишкиу и подготовить белковые лизаты. Вкратце, промыть клетки 2x с PBS, рН 7,4, и добавить 200 мкл 2% додецилсульфата натрия (SDS) в PBS, рН 7,4. Соберите лизат и перенести его в пробирку микроцентрифуги. Измерение концентрации белка с помощью ВСА реагент белка (таблица 1) в соответствии с протоколом производителя. Анализ экспрессии α1 и β3 субъединиц рецепторов ГАМК А по SDS / PAGE и иммуноблоттинга использованием субъединиц-специфические антитела (кролик анти-α1 конкретных и кролик анти-β3 конкретных ГАМК R антитела, см таблицу 1 за информацию о них антитела).
  10. Выбить и передавать только положительные клоны от остальных скважин на больших 6 см чашках для тканевых культур. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) и замените среду, содержащую антибиотик каждые 2 дня.
  11. Постепенно расширять колонии клеток Under выборе антибиотика путем перечисления их на 10 см чашках для тканевых культур и, наконец, флаконах для культуры ткани (Т-75 колбы). Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) и замените среду, содержащую антибиотик каждые 2 дня.
  12. Пластина 70000 клеток из каждой колонии на покровные стекла (13 мм в диаметре) и фиксации клеток для анализа экспрессии на клеточной поверхности и совместной локализации ГАМК R субъединиц иммунофлуоресценцией.
  13. Выберите положительный клон НЕК293 выражающее высокий уровень обеих α1 и β3 субъединиц рецепторов ГАМК А, пластины 2 х 10 6 клеток в 10 см культуры стерильной ткани блюдо и инкубировать при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы ( CO 2 инкубатор) в течение ночи. Убедитесь, что клетки инкубируют в содержащей антибиотик G418 (и флеомицина D1) среде в любое время.
  14. На следующий день, трансфекции НЕК293 клеток с ГАМК А Р γ2s субъединицы кДНК в pcDNA ™ 3.1 (+) вектора экспрессии, содержащего ген устойчивости к гигромицину B с использованием не-липосомальной липидный реагента для трансфекции (таблица 1).
    Примечание: Этот метод трансфекции позволяет лучшую выживаемость и более высокую эффективность экспрессии чужеродных белков в медленно растущих стабильных клеточных линий, которые находятся под непрерывной селекции антибиотиками.
  15. В стерильную 15 мл центрифужную пробирку, добавляют 250 мкл Enhancer и конденсации ДНК буфер (Таблица 1) и 1,4 мкг γ2s ГАМК-рецептора субъединица кДНК. Добавить 11,2 мкл Enhancer и вихрь в течение 1 секунды, прежде чем выходить при комнатной температуре в течение 5 мин.
  16. Добавить 35 мкл без липосомальной липидов реагента для трансфекции и вихря в течение 10 сек перед выходом при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавить 3 мл G418 / флеомицина D1-содержащей среды и пипеткой содержимое в центрифужную пробирку вверх и вниз в два раза BEFруды передачи его по каплям на клетки, растущие в 10 см планшета для культуры ткани. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе).
  17. Вымойте клетки мягко стерильным PBS и разбавить их в новые 10 см ткани чашек для культивирования, в следующих соотношениях: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 и 1:20.
  18. Начало выбор α1 / β3-клеток НЕК293, экспрессирующие субъединицу γ2s добавлением 800 мкг / мл антибиотика селективного маркера гигромицину B к G418 / флеомицина D1-содержащий носитель. Заменить старую среду со свежим G418 / флеомицина D1 / гигромицину B-содержащей среде (10 мл) каждые 2 дня.
  19. Повторите этапы 2.7-2.12, при непрерывном отбора в G418 / флеомицина D1 / гигромицину B-содержащий клеточную культуральную среду.
  20. Хранить положительные клоны при -140 ° С в антибиотической свободной клеточной культуральной среды и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) для использования в будущем.
  21. Проверьте уровеньэкспрессии α1, β3 и γ2s ГАМК R субъединиц иммуноблоттингом и иммунофлюоресценции в каждом клоне следующей размораживания, поскольку выражение может измениться в связи с сокращением выживания клеток под выборе антибиотика.

3. Поддержание НЕК293 клеточных линий

  1. Размораживание пузырек управления НЕК293 или те, выражающие рупий либо α1 / β2 / γ2-ГАМК A (Таблица 1) или α1 / β3 / RS γ2-ГАМК A (описанный выше) в 10 мл клеточной культуральной среды в 15 мл стерильной Центрифуга трубки. Центрифуга при 440 х г в течение 5 мин для удаления избытка ДМСО.
  2. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 1 мл свежей среды для культивирования клеток.
  3. Во-первых добавить 9 мл свежей среды для культивирования клеток на 10 см чашки для культивирования тканей, покрытые поли-D-лизином (0,1 мг / мл) и затем 1 мл ресуспендировали клеток. Перемешивайте осторожно, из стороны в сторону, чтобы разогнать клетки и инкубировать при температуре 37 ° С в увлажненной5% СО 2 атмосферы (СО 2 инкубатор).
  4. На следующий день, аспирации среды, чтобы удалить какой-либо остатков клеток и замены с 10 мл свежего HEK293 клеточной культуральной среды.
  5. Выберите стабильных клеточных линий с антибиотиками, чтобы удалить любые клетки, которые не выражают ГАМК R субъединиц и, следовательно, также не хватает экспрессии маркеров устойчивости к антибиотикам. Для α1 линии / β2 / γ2 стабильной клеточной заменить обычную среду со свежим клеточной культуральной среде, содержащей G418 (800 мкг / мл). Для α1 / β3 / γ2 клеточной линии, заменить свежим с клеточной культуральной среды, содержащей G418 (800 мкг / мл), флеомицина D1 (800 мкг / мл) и к гигромицину B (800 мкг / мл). ВНИМАНИЕ! G418 является раздражителем и гигромицина коррозионные, токсичные и раздражение.
  6. Прохождение клеток в новой тканевой культуральной чашке с помощью посева при низкой плотностью, как только они достигают> 70% слияния. Отберите 10 мл клеточной культуральной среды и мыть дважды кратко сPBS, рН 7,4. Добавить 1 мл раствора трипсина-ЭДТА, раствор протеазы трипсина (0,05% трипсина) и Ca 2+ хелатора ЭДТА (0,02%) в PBS, рН 7,4, чтобы отделить клетки от тарелки. Внимание! Трипсин-ЭДТА Решение является раздражителем.
  7. Добавьте 10 мл среды культивирования клеток, содержащих правильные антибиотики, к блюду и аспирации клетки. Центрифуга клетки при 440 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют их в 5 мл клеточной культуральной среды.
  8. Прохождение клеток с использованием разбавление 1:10 в новую колбу культуры ткани (Т-75 колбы), содержащего свежую клеточную культуральную среду и правильные антибиотики. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) и заменить среды каждые два дня. Прохождение клетки, когда> 70% сливной (см шаг 2,8).

4. Подготовка ГАМКергической культуре медиальных шиповатых нейронов

  1. В стерильных условиях подготовить 24-WELL пластина с поли-L-лизина (0,1 мг / мл) -покрытие покровные (13 мм в диаметре) и инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе).
  2. На следующий день, аспирации с пипеткой избыток поли-L-лизин и мыть покровные с двух коротких 10 сек и двух 5 мин длинных промывок стерильной водой. Добавить ламинином (0,01 мг / мл) в течение ночи и инкубировать при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе).
  3. Sanitize рассечение область с 70% этанола и собрать массив рассекающих инструментов, таких как изогнутые и прямые тканей щипцов, ножниц и щипчиков, и поместить в 70% этанола, полностью стерилизовать рассекает инструментов.
  4. Поместите беременной крысы / мыши эвтаназии СО 2 на спине и протереть кожу на ее животе с 70% этанола. Зажмите кожу с помощью пинцета и сократить вокруг живота через кожу, мышцы и брюшину, выявить внутренние органы и маткус эмбрионами ясно. Извлечение эмбрионов (E16-17) из матки и поместите их в чашку Петри с охлажденной PBS.
  5. Поместите эмбрионов в ламинарном боксе и обезглавить их, собирая руководителей в новом чашку Петри с охлажденной ССРХ.
  6. Под микроскопом рассекает, рассекать из мозги, используя изогнутые и прямые щипцы. Поместите мозги в новую чашку Петри, содержащую охлажденный HBSS.
  7. Отделите две полушария и осторожно снимите мозговые оболочки. Вырезать по линии гиппокампе и отогните кору, чтобы выявить стриатуме. Соблюдайте стриатуме как поперечно-полосатой структуры белого на передней полусферы.
  8. Рассеките стриатуме и разрезать его на маленькие кусочки (1 - 2 мм в диаметре), и использовать огневой полировкой пипетки Пастера, чтобы собрать материал в стерильный 15 мл центрифужную пробирку с общим объемом 1 мл. Спиртовая обеспечивает материал собирается без повреждений.
  9. Использование огневой полировкой Tiр пипетки Пастера, аспирации клетки и выпустить их 8 - 10 раз. Принимая новую пипетку с пожарно-польский кончик примерно на 30% от своего первоначального диаметра (1 мм), растирают раствор еще 4 - 6 раз, пока он не появится однородная.
  10. Фильтр клеток с использованием сетчатого фильтра нейлон клеток 100 мкм в свежую стерильную центрифужную пробирку.
  11. Граф клеток с помощью гемоцитометра и пластины 70 000 клеток в 500 мкл культуральной среды нейронов на лунку в культуре ткани пластины 24-луночного. Агитировать скважины слева направо и инкубировать при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе) в течение 14 дней в пробирке (DIV).
  12. Через 7 дней, проверить чистоту нейрональных культур и, если глиальные клетки присутствуют, добавить цитозин β-D-арабинозид (Ara-C; 5 мкМ) в лунки, чтобы остановить их пролиферацию. Чтобы сделать это, удалить 250 мкл культуральной среды нейронов (рН 7,4) из каждой лунки и добавить 250 мкл свежей среды содержатING Ara-C. ВНИМАНИЕ! Ara-C является раздражителем.

5. Совместное культивирование Подготовка

  1. На 11-й день культуры нейронов, пальто 6-луночный планшет с поли-D-лизином (0,1 мг / мл) в стерильных условиях и инкубировать в течение ночи при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе).
  2. На следующий день (день 12 нейронов культуры), аспирации избыток поли-D-лизина и мыть лунки 2x 2x кратко и в течение 5 мин с стерильной водой перед добавлением свежего клеточную культуральную среду (без антибиотиков), чтобы покрыть скважин с небольшим количеством сыворотки из среды.
  3. Аспирируйте культуральную среду из колбы для культуры ткани (Т-75). Промыть клетки дважды PBS перед добавлением 1 мл Ca 2+ / Mg 2+ -chelating агент ЭДТА (0,48 мМ), который плавно и не диссоциирует ферментативно клетки. Перемешивают клеток, чтобы отделить их от нижней части ткани колбу.
  4. Добавьте 10 мл клеточной культуральной среды (без антибиотиков, как это может помешать трансфекции), аспирации клетки и место в стерильную пробирку центрифуги. Гранул клетки при 440 мкг в течение 5 мин с использованием низкоскоростного настольный центрифуги.
  5. Удалить супернатант и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей среды для культивирования клеток. Использование гемоцитометра, подсчет клеток и пластину при плотности 3 × 10 5 клеток на лунку в 6-луночный планшет. Перемешивайте аккуратно и выдержать в течение 24 часов при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубаторе).
  6. На следующий день (день 13 нейронов культуры) временно трансфекции клеток НЕК293 с mCherry кДНК в pcDNA3 конструкции экспрессии, используя липосомальный реагента для трансфекции. Если коротко, то в стерильной трубки микроцентрифужных, добавить 500 мкл среды пониженном сыворотки и 5 мкг mCherry кДНК. Добавить 5 мкл буферного липосомальной реагента и осторожно перемешать перед выходом при комнатной температуре в течение 5 мин.
  7. Добавить 8,75 мкл липосомальной трансфекции КГНЛОР и аккуратно перемешать перед отъездом при комнатной температуре в течение 30 мин. Пипетировать содержимое трубки микроцентрифужных вверх и вниз в два раза, передача по каплям в каждую лунку на планшет для тканевых культур 6-луночный и инкубировать при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы (СО 2 инкубатор).
  8. На следующий день (14 день нейронов культуры), аспирации клеток культуральной среды HEK293 от каждого из 6 скважин и мыть каждый хорошо дважды кратковременно с PBS (рН 7,4). Добавить 300 мкл Ca 2+ / Mg 2+ -chelating агент ЭДТА (0,48 ммоль) и 200 мкл трипсина-ЭДТА (0,02 - 0,48 ммоль) раствора в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин.
  9. Добавить 1 мл свежей HEK293 клеточной культуральной среды на лунку (в этом гасит трипсина) и аспирации отдельные клетки в стерильный 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга клетки при 440 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл культуральной среды нейронов (рН 7,4). </ LI>
  10. Использование гемоцитометра, подсчет клеток и семена при плотности 30000 клеток на лунку в культуре ткани пластины 24-луночный, содержащего нейроны. Интенсивное перемешивание пластину для разгона клетки и инкубировать совместное культивирование при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубатор) в течение 24 часов.

6. Анализ синаптических контактов и их деятельности

  1. После 23 часов в совместной культуре, исследовать формирование «активных» контактов между GABAergic среднего колючих нейронов и клеток HEK293 с использованием активно-зависимый захват анти-Synaptotagmin просвета предметно-ориентированного антитела, конъюгированного с флуоресцентным красителем (Cy5, таблица 1) ,
    ПРИМЕЧАНИЕ: антитело будет только получить доступ к просвета области Synaptotagmin, с которой он связывается, когда существует преемственность между синаптических везикул просвет и межклеточное пространство. Это специально происходит во время высвобождения нейромедиатора, что делает этот АнтибODY отличную маркер активных пресинаптических окончаний.
  2. Во-первых промыть совместное культивирование с нейронной среде (Neurobasal среднего, рН 7,4; таблица 1) и добавить Cy5 меченных мыши анти-Synaptotagmin антитела, разведенного 1:50 в нейронной среде (Neurobasal среде, рН 7,4), в Культуры, в течение 30 мин. Инкубируйте клетки в течение этого времени при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы (CO 2 инкубатор).
  3. Чтобы удалить доступ антитела, мыть совместного культивировани кратко три раза: сначала с холодным нормальной PBS (рН 7,4), второй с холодной PBS (рН 7,4), содержащим 200 мМ NaCl, и третий с холодной нормальной PBS (рН 7,4)
  4. Зафиксировать клетки 300 мкл 4% параформальдегида / 4% сахарозы в PBS (PFA, рН 7,4) в течение 10 мин при перемешивании. Промывают клетки кратко дважды PBS (рН 7,4), то с двух длинных 10 мин стирок.
  5. Добавить глицина (0,3 М) в каждую лунку в течение 10 мин при перемешивании, чтобы погасить PFA.
  6. Вымойте клеток brieflY два раза с PBS (рН 7,4), затем с двух длинных 10 мин перед добавлением стирок 300 мкл блокирующего раствора (1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS, рН 7,4), чтобы уменьшить неспецифическое связывание антитела.
  7. Аспирируйте блокирующий раствор и добавить морской свинки против ГАМК R-γ2 антитело, направленное против γ2 N-терминального домена 33 (1: 3000 в PBS, рН 7,4) в течение ночи при 4 ° С.
  8. На следующий день, аспирации первичных антител из лунок и промыть клетки дважды кратко PBS затем с двух длинных 10 мин стирок.
  9. Клетки проницаемыми с помощью Тритон Х-100 (0,1%) в блокирующем растворе в течение 30 мин при комнатной температуре.
  10. Промывают клетки кратко дважды PBS (рН 7,4), то с двух длинных 10 мин перед добавлением стирок либо мыши декарбоксилазы анти-глутаминовой кислоты (GAD) 65-антитела (1: 4000, Таблица 1) или мышиное анти-Синапсины я антитела ( 1: 1000, Таблица 1) в течение 120 мин при комнатной темпера тура.
  11. Промывают клетки кратко дважды PBS (рН 7,4), то с двух больше 10 мин стирок, а затем добавить блокирующем растворе в течение 30 мин при комнатной температуре.
  12. Центрифуга соответствующие вторичные антитела (обычно козье антитело против морской свинки IgG, конъюгированного с Су5, козий анти-IgG мыши, конъюгированного с Alexa Fluor 488 или козы против мышиного IgG, Alexa Fluor 405, все в 2 мкг / мл), чтобы удалить агрегаты антител на 21910 мкг в течение 10 мин, и добавить антител (1: 750) в блокирующем растворе. Применение в соответствующие лунки в течение 1 часа и крышка с алюминиевой фольгой для защиты от флуорофоров освещенности и, как следствие фотообесцвечивания.
  13. Наконец, промыть клетки кратко дважды PBS (рН 7,4), то с двумя уже 10 мин моет для удаления несвязанного вторичного антитела и смонтировать покровные помощью монтажного реагента (Продлить Gold, Таблица 1) примерно 10 мкл на покровное. Разрешить 24 ч, чтобы установить при комнатной температуре, в защищенном от света до передачи 4° С для длительного хранения.
  14. Анализ образцов, используя лазерный сканирующей конфокальной микроскопии с 63x масло-иммерсионного объектива. Убедитесь, уровень освещения и усиления детектора настраивается, чтобы избежать насыщенности.
  15. Соблюдайте возможные синапсов, как контакты в регионах совместной локализации между пресинаптических окончаний положительных для GAD65, Синапсины я или Cy5-меченого анти-Synaptotagmin и постсинаптических НЕК293 визуализированных с помощью ДВС или флуоресцентным индикаторе mCherry.
  16. Граф потенциальных синапсов, как контакты, используя серию Z-стека оптических секций (8 - 10) через глубину 4 - 5 мкм на клетку с помощью программного обеспечения визуализации.

Representative Results

Протокол для этой системы модели сотового совместно культуры нейрон-HEK293 была точно настроена для оптимального выживания клеток. В этой системе, формирование синапсов, как контактов и их анализ основан на стабильной и последовательной экспрессии всех трех ГАМК R субъединиц, которые собираются в функциональный рецептор. Поэтому важно использовать иммуноцитохимический анализ, для оценки экспрессии субъединицы на поверхности HEK293 клетки перед добавлением их в нейронных культур. В этих экспериментах на клеточной поверхности, выражение α1, β2 и γ2 субъединиц (фиг.1А) или α1, β3 и γ2 субъединиц (рис 1b), была обнаружена с помощью субъединичные-специфические антитела, которые связываются с внеклеточными эпитопами этих субъединиц. Высокая степень совместной локализации между этими субъединицами на поверхности HEK293 была продемонстрирована.

После подтверждения выражение поверхности и совместной локализации ГАМК АR подразделения в НЕК293 клеток, сокультурах были получены с использованием НЕК293 клетки, экспрессирующие α1 / β2 / γ2 ГАМК R подразделений и среднего колючих нейронов культивировали в течение 14 дней (14 дней в пробирке (DIV)). Клетки в со-культуры инкубировали в течение 24 ч, фиксированной и анализировали с помощью иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии. Анализ показал, что контакты GAD65-позитивных ГАМКергических аксонов образуются только спорадические контакты с контрольными клетками НЕК293 (Фигура 2А, 2В). Количество контактов, обнаруженных на 4 ч был 7,3 ± 0,9 HEK293 клетки, и это число было уменьшено до 5,5 ± 0,5 соединений (среднее ± SEM) в HEK293 клетки через 24 часа после добавления клеток НЕК293, чтобы культивируемых нейронах. В отличие от этого, GAD65-положительные аксонов ГАМКергические формируется множество синапсов, как контакты с НЕК293 выражающих ГАМК А рупий. Количество контактов, полученных на 4 ч после добавления клеток НЕК293 был 28,3 ± 4,7 HEK293 клетки, и это число было дальнейшее увеличениеd до 52,1 ± 6,3 (среднее ± SEM) за HEK293 клетки на 24 ч в совместной культуре (Фигура 2А, 2В).

Для определения того, были ли эти синапса как контакты "активный", то есть поддерживается везикулярного высвобождение трансмиттера, пузырек-просвета домен-специфических анти-синаптотагмин Су5-конъюгированные антитела был добавлен к со-культуральной среды после 23 часов инкубации. Это антитело только включены в пресинаптических нервных окончаний, когда поры формы между синаптических везикул просвета и внеклеточной жидкости в синаптической щели во время высвобождения нейротрансмиттеров. После освобождения, пор закрывает, оставляя Synaptotagmin Cy5-сопряженных флуоресцентные антитела, прикрепленный к Synaptotagmin внутри пузырька. Таким образом, только пузырьки активно участвует в высвобождения нейротрансмиттеров помечены антитела. В этих экспериментах несколько, если какие-либо контакты между контролем НЕК293 и нейронные терминалы среднего колючие были "активными и #8217; как показано на отсутствие совместной локализации между пресинаптической GAD65 / синаптотагмин флуоресценции и флуоресценции mCherry в клетках НЕК293 (фиг.3А). В противоположность этому, многие "активный" контакты были сформированы между шиповатых нейронов среднего терминалов и α1 / β2 / γ2-экспрессирующих клеток НЕК293, как показали высокую степень совместной локализации между GAD65 / синаптотагмин и mCherry, выраженное в частности, в клетках НЕК293 ( Фигура 3В).

Чтобы проверить, является ли отличается подтип ГАМК A R также может способствовать синапсов, как образование в пробирке, мы совместно культивируют α1 / β3 / γ2 выражения HEK293 клетки с средних нейронов колючих. Опять же, контроль НЕК293 редко получил контакты с Синапсины-положительным пресинаптических окончаниях, достигающих 10,8 ± 0,48 (среднее ± SEM) контактов в HEK293 клетки после 24 часов в совместной культуре (4А левой, 4В). Тем не менее, НЕК293 выраженияα1 / β3 / γ2 ГАМК рупий форма значительно более синапс, как контакты с Синапсины-положительным пресинаптических терминалах средних колючих нейронов, достигающих 25,3 ± 0,27 (среднее ± SEM) контактов в HEK293 клетки после 24 часов в совместной культуре (рис 4А права, 4B). Это указывает на то, что α1 / β3 / γ2 ГАМК рупий выражено в клетках НЕК293, также могут способствовать образованию синаптического контакта, хотя их активность ниже, чем потенции α1 / β2 / γ2 содержащих ГАМК А Rs.

Эти эксперименты показывают, что модель системы со-культура развивалась в нашей лаборатории позволяет количественный анализ синаптической контактной образования в пробирке, а также оценку эффективности различных подтипов ГАМК A рупий в этом процессе. Эти эксперименты демонстрируют далее, что РС ГАМК А, в дополнение к тому критические функциональные компоненты ГАМКергических синапсов, могут играть ключевую рольв процессе распознавания и формирования синаптических контактов между тормозных нейронов и соответствующих нейрональных клеток-мишеней, независимо от других синаптических белков адгезии.

Рисунок 1
Рисунок 1. Иммуноцитохимическая анализ экспрессии ГАМК R α1 / β2 / γ2 или α1 / β3 / γ2 в стабильных клеточных линий НЕК293. Антител, распознающих внеклеточные домены ГАМК R подразделений были использованы для этикеток рецепторов, выраженных на поверхности клетки. ( ) клеточной линии HEK293, экспрессирующих α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) и γ2 (Су5) на высоком уровне. (Б) HEK293 клеточной линии, экспрессирующей α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) и γ2 (Cy5)субъединицы на высоких уровнях. Масштабная линейка:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. ГАМКергические среднего колючие нейроны образуют синапса, как контакты с α1 / β2 / γ2- выражающие HEK293 клетки в совместной культуре. (A) Люминесцентная маркировка пресинаптических окончаний с анти-GAD65 антител (зеленым) и НЕК293 с mCherry (в красном, левой) или ГАМК R γ2 субъединицы (в синий, правый), выявила точки совместной локализации между ними маркеры, указывающие формирование синапсов, как контакты после 4 или 24 часов в совместной культуре. Масштабная линейка:. 10 мкм (B) Количественный анализ синапсов, как со ntacts. НЕК293 клетки были идентифицированы на основе их формы как показали DIC изображений и / или экспрессии mCherry, и числом контактов между GAD-65 положительной puncta (зеленым) и поверхностью HEK293 клеток подсчитывали на глаз в каждой секции оптического Серия Z-стек (8 - 10) на клетку с помощью программного обеспечения визуализации и выражается в количестве контактов / клетку. График показывает количество контактов между средними колючих нейронов и контроля НЕК293 клеток (светло-серый) или α1 / β2 / γ2-НЕК293 (черный) после 4 и 24 часов в совместной культуре (среднее ± SEM, п = 8 в каждой состояние из двух независимых экспериментов). Эта цифра была изменена с Фуксом и др. (2013) 30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

объявление / 52115 / 52115fig3highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 3. ГАМК А Rs способствовать формированию активных синаптических контактов. Иммунноокрашивания из синаптических контактов, как, образованных после 24 часов в совместной культуре между средней шиповатых нейронов терминалов для положительных GAD65 (Alexa Fluor 405 голубой) и (а) контрольных клетках НЕК293, или (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 клетки, оба транзитной трансфекции mCherry построить (красный). Активные контакты идентифицируются совместной локализации между предметно-ориентированного анти-Synaptotagmin антитела пузырек просвета (Cy5) и GAD65 конкретных антител как в пресинаптических окончаниях, и mCherry выражается в НЕК293. Масштабная линейка:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

igure 4 "л: контент-ширина =" 6in "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 4. ГАМКергические среднего колючие нейроны образуют синапса, как контакты с α1 / β3 / γ2- субъединицы, выражающей HEK293 клеток в совместной культуре. (A) Люминесцентная маркировка пресинаптических окончаний с анти-Синапсины I антитела (зеленым), и контроль НЕК293 клеток (слева), или α1 / β3 / γ2 выражения НЕК293 клетки, как транзитной трансфекции mCherry (в красном), выявила точки совместная локализация между этими маркерами, указывающими на формирование синапсов, как контакты после 24 ч в совместной культуре. Шкала бар: 10 мкм (Б). Количественный анализ синапс, как контакты. НЕК293 клетки идентифицировали путем экспрессии mCherry, и количество контактов между Синапсины I-положительных puncta (зеленым) и поверхностью HEK293 клеток подсчитывали на глаз в каждой секции оптического серии Z-стека (8 - 10) на клетку с помощью обработки изображений, и выражается в количестве контактов / клетку. График показывает количество контактов между средними колючих нейронов и контроля НЕК293 клеток (светло-серый) или α1 / β3 / γ2-НЕК293 (черный) после 24 часов в совместной культуре (среднее ± SEM, п = 8-12 клеток в каждое условие, от двух независимых экспериментов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Хотя этот протокол не является технически сложным для выполнения, есть несколько важных шагов, которые необходимо соблюдать для достижения наиболее точных и воспроизводимых сокультуре анализов. Во-первых, культивируемые нейроны среднего колючие должны быть высевали при оптимальной плотности. Если высевают слишком слабо, нейроны имеют тенденцию к развитию очень медленно и выживание значительно снижается. С другой стороны, если высевают слишком густо, нейроны, как правило, агрегат, который ставит под угрозу анализ контактов с НЕК293. Во-вторых, рекомендуется, чтобы временно выразить флуоресцентного репортера, GFP или mCherry в клетках НЕК293, стабильно экспрессирующих GABA A R, до ножкой их в совместной культуре. Это позволяет надежное распознавание НЕК293, которые могут быть скомпрометированы путем сходства по форме и размеру между этими клетками и редких сохранившихся глии клетки в нейронные культур. Для достижения эффективной трансфекции с GFP или mCherry кДНК, клеточные линии HEK293 должны быть в экспоненциальной фазе роста ивысевали при соответствующей плотности в 6-луночных планшетах. Редкие посев с последующим трансфекции вызовет клеткам расти плохо, в то время как более-посева помешает клетки от занимая кДНК. В идеале, клетки должны быть посеяны так, что они находятся между 70 - 90% сплошности в день трансфекции. В-третьих, трансфекции должна быть оптимизирована для каждого клеточной линии, используемой, как некоторые клеточные линии, более чувствительны, чем другие. Это потому, что конститутивный ГАМК R выражение в клетках НЕК293, снижает выживаемость клеток и способность клеток к восстановлению после трансфекции. Кроме того, выживание зависит от типа ГАМК А Rs, выраженных в клетках НЕК293, при этом некоторые клеточные линии быть значительно более чувствительны, чем другие. Трансфекцию помощью липосом реагент является оптимальным методом для экспрессии чужеродных белков в быстро растущих клеточных линий, обеспечивая как высокую эффективность трансфекции и уровень экспрессии. Тем не менее, этот реагент вызывает слишком большой ущерб медленно растущих клеточных линий, в течениекоторые мы регулярно использовать не липосомную реагента для трансфекции. Это работает таким же образом, к липосомальной реагента, но количество ДНК, необходимое для эффективной трансфекции значительно снижается. Это обеспечивает большую выживаемость клеток (примерно 80 - 90% по сравнению с 60% при использовании липосомальной реагента), но с более низкой эффективности трансфекции (60%). Наконец, число управления HEK293 или α1 / β2 / γ2 HEK293 экспрессирующих клеток добавили в нейронных культур должен быть оптимизирован. Добавление слишком мало клеток компрометирует успешную анализ контактов между НЕК293 и нейронов, потому что они стали очень редкими. И наоборот, добавив слишком много клеток HEK293 вызывает гибель нейронов в течение нескольких часов.

Эмбриональные культуры средних колючий нейронов в идеале должны быть получены с использованием полосы ткань расчлененный от эмбрионального возраста 15 - 17. Тем не менее, часто бывает, что эмбрионы немного моложе или старше оптимального возраста. В этом случае, количество нейронов в культуре высевают будетнеобходимо варьировать. Ткани, которая моложе E15 возможно, должны быть высевали при немного более низкой плотности, в то время как ткани, которая старше, чем E17, возможно, должны быть высевают при высокой плотности, чтобы позволить оптимальное выживание клеток. Кроме того, цитозинарабинозид (Ara-C), возможно, потребуется, чтобы быть добавлены в более старых культур, чтобы предотвратить рост глии, которая является более распространенным в старой ткани.

При создании совместное культивирование, важно, чтобы пластина оптимизированный количество трансфицированных HEK293 или α1 / β2 / γ2 НЕК293, экспрессирующих клеток, как упоминалось выше. Тем не менее, это может быть необходимо, чтобы определить это для каждого отдельного клеточной линии, из-за различий в их выживание. Обычно 30000 клеток в максимальном объеме 50 мкл, должны быть добавлены в каждую лунку блюдо 24-луночный, который уже содержит 500 мкл культуральной среды нейронов, так как это гарантирует, что обусловлено нейронов среднего не разбавляется слишком много, и что условия в каждую лунку остаются примерно постоянными, например,

Одним из основных недостатков метода со-культуры в том, что нейронные культуры создаются из диссоциированных клеток, выращенных в виде монослоя, что означает, что нейроны были удалены из их нормального микроокружения и не могут установить их нормальную анатомическую организацию. Поэтому им не хватает соответствующих соединений, входов и секретируемые молекулы из других клеток, которые могут повлиять на начальных этапах развития синапсов. Например, в естественных условиях медиальных шиповатых нейронов плотно иннервируют глутаматэргических входов от коры, таламуса и других областях мозга 34, тем не менее, в наших нейрональных культур глутаматергические синапсы не образуют, потому что эти входы повреждены во время рассечения тканей полосатого тела. Как отсутствие функциональных глутаматергических синапсов в культуре нейронов среднего колючих AFFECTS их способность образовывать ГАМКергические синапсы друг с другом и / или НЕК293 выражения ГАМК A рупий остается открытым вопросом. Этот вопрос может быть легко решить путем культивирования медиальных шиповатых нейронов вместе с корковые нейроны глутаматергические тем самым позволяя им с образованием функциональных синапсов 35 перед добавлением в клетках НЕК293. Альтернативный подход заключается в разработке системы модели со-культуры на основе органотипических культур ломтик, которые поддерживают некоторые из цитоархитектуры что может быть важно для созревания и формирования синапсов. Тем не менее, органотипической культуры ломтик имеют плотную и гетерогенную нейропиля которые могут поставить под угрозу анализ выполняется здесь. Еще один важный недостаток использования совместное культивирование анализов является то, что ГАМК рупий выражено на поверхности клеток НЕК293 не кластерных как они находятся в нейронах, хотя это представляется не быть необходимыми для формирования синапсов данной достаточно высокую экспрессию поверхность 30. Например, в гОден мозга и в гиппокампе культур, α1 ГАМК R субъединицы находится в большинстве GABAergic синапсов на всех постсинаптических областях пирамидальных клеток. Тем не менее, α2 специально расположен в подмножестве синапсах на дендритах и somata но высоко обогащенного в начальном сегменте аксона, как показали иммунофлюоресценции и электронной микроскопии 36. Учитывая, что формирование синапса в совместных культурах все еще ​​может быть надежно обнаружены и проанализированы 30, это говорит о том, что плотность ГАМК А Rs на клеточной поверхности клеток НЕК293 могут быть аналогичны или даже выше, чем плотность этих рецепторов в пределах синаптических кластеры в нейронах. Это можно объяснить, по крайней мере частично, почему синаптические адгезии белки, такие как Нейролигины и постсинаптические белки плотности, такие как gephyrin, не являются необходимыми для формирования синапсов в совместных культурах, если соответствующим образом собранные Rs ГАМК А присутствуют в достаточно Плотность.

Хорошо известно, что ГАМК А Rs структурно и функционально гетерогенную, и что рецептор субъединица определяет их состав внутриклеточную локализацию и фармакологические свойства. Например, включение 2 субъединиц, как известно, является необходимым условием для синаптической локализации ГАМК A рупий в то время как субъединицы почти исключительно присутствует в внесинаптических рупий ГАМК A. Рецепторы, которые включают только αβ комбинаций также полагают, преимущественно локализуется в внесинаптических доменов 12- 14. Будь это специфика сохраняется в нашей системе сокультуры можно легко проверить с помощью временно трансфекции 2 или субъединицы кДНК в НЕК293 клеточных линий, стабильно экспрессирующих α и β субъединиц, перед добавлением их в нейронных культур. Наши предварительные эксперименты с использованием этого подхода полагают, что синаптические контакты легко образуются только в присутствии 2-субъединицы, указывая, что удельнаяснова и снова доказывать наблюдается в естественных условиях, вероятно, будет сохранена в пробирке (данные не показаны).

Кроме того, GABA A рупий, включающие различные α субъединицы избирательно локализуется в синаптических контактов, образованных с конкретными видами пресинаптических нейронов. Например, в бледный шар, РС α1-ГАМК А, как правило, найти на striatopallidal (ул-GP) и palliopallidal (GP-GP) синапсов, расположенных на дендритов и соматических регионах средних нейронов колючих, соответственно. РС-α3 ГАМК А расположены в районах perisomatic медиальных шиповатых нейронов и приводят в контакт с местными коллатералей аксонов GP, в то время как Rs α2-ГАМК А расположены на дистальных дендритов этих нейронов и приводят в контакт в основном, из входов полосатом теле 32. Экспрессия специфических субъединиц α в различных типах синапсов и в различных нейрональных отсеков Также было продемонстрировано и в других областях мозга, таких как Hippocampus 21 и неокортекс 18,20. Эти данные ставят вопрос о том, как конкретные тормозные синапсы образуются в головном мозге. Адгезия определенного типа пресинаптических окончаний вызывают ли вставку конкретных подтипов ГАМК R в точках контакта? Являются ли рецепторы продают в специальных внутриклеточных местах в соответствии с их субъединицы состава, где их вставки плазматическая мембрана является необходимым условием для адгезии аксонов терминалов определенного происхождения? На сегодняшний день эти вопросы остаются без ответа. Использование пониженных модельных систем, таких как системы модели сокультуры, позволяют нам начать отвечать на этот комплекс вопросов, потому что система легко поддается трансфекции ДНК-конструкций и применения реагентов и, главное, она подходит для живой анализа изображений клеток 30. Таким образом, с помощью этой модели системы мы можем начать тестирование роль отдельных молекул, в том числе различных видов ГАМК A рупий, знаюп присутствовать на синаптических контактов. Еще одним преимуществом является то, что синапсы в этой модели формы системы быстро, в течение нескольких минут до нескольких часов, снижая продолжительность экспериментов. Модели Аналогичная совместное культивирование системы были успешно применены в прошлом для выявления новыми синапсов молекул 27,37,38.

Понимание того, как развивается центральная нервная система, созревает и формы связи между нейронами, так затейливо, чтобы контроль, например, поведения или познания, имеет принципиальное значение. Это отдаленная цель будет достигнута только путем разграничения молекулярные механизмы, которые регулируют отдельные этапы признания и от клетки к клетке связи в процессе развития. В связи с явной сложности, молекулярные детали этих нескольких клеточных взаимодействий в настоящее время могут быть изучены с точностью только в уменьшенных систем. Тем не менее, способность увеличивать сложность этих систем, выразив несколько комбинаций белков и изучения того, какони взаимодействуют имеет некоторые преимущества по сравнению с, например, генетических подходов на удаление. Это происходит потому, что точной интерпретации эффектов одной делеции гена часто под угрозу изменений, связанных с компенсаторных механизмов маскирует эффекты первоначальных поражений, особенно в развивающемся мозге. Простая техника, но информативным совместное культивирование описано здесь позволило открытие структурного роли ГАМК A рупий в формировании синапсов и открыл возможность исследовать, как GABA A рупий и другие молекулы клеточной адгезии и / или синаптические белки матрикса взаимодействуют друг с другом во синаптогенеза. Synaptic матричные белки представляют особый интерес, учитывая, что они недавно было показано, играют ключевую роль в формировании синапсов глутаматергической 39. Дальнейшее развитие моделей сотрудничества культуры важно, потому что у них есть потенциал, чтобы продвинуть наше знание молекулярных механизмов, которые направляют «нормальным &# 8217; развитие мозга и, таким образом, увеличить наше понимание того, как эти механизмы меняются во многих нервной системы заболеваний, таких как эпилепсия, шизофрения, расстройства аутистического спектра и многие другие.

Acknowledgments

Мы хотели бы отметить финансовую поддержку от MRC Великобритании (G0800498). Мы хотели бы также поблагодарить профессора JM Fritschy, Университет Цюриха, для обеспечения ГАМК -R субъединицы конкретных γ2 антитела и профессор Р. Харви, UCL школа фармации, для обеспечения pcDNA 3,1 (+) векторов экспрессии, содержащий устойчивость к антибиотикам гены для производства стабильно трансфицированных клеточных линий НЕК293.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Life Technologies 11960-044 Warm in water bath at 37 °C before use
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10106-169
Neuralbasal Life Technologies 21103-049 Warm in water bath at 37 °C before use
B27 Supplement Life Technologies 17504-044
Glucose Sigma-Aldrich G8769
HBSS (10X) Life Technologies 14180-046
HEPES (1M) Life Technologies 15630-056
PBS (1X) Life Technologies 10010-031
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) Life Technologies V790-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) Life Technologies V860-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) Life Technologies V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1149
G418 disulfate salt (Geneticin) Sigma-Aldrich G5013 Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin) Life Technologies R25001
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 Warm in water bath at 37 °C before use. Danger: irritant.
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Laminin Sigma-Aldrich L2020
100 μm Nylon Cell Strainer VWR 734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich C1768 Danger: Irritant
Chelating agent (Versene) Life Technologies 15040-033
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). Life Technologies 15338-100 Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) Qiagen 301425
Reduced serum medium (Opti-MEM) Life Technologies 11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 Synaptic Systems 105311C5
Neurobasal A Life Technologies 10888-022
Sodium Chloride (NaCl) VWR 27810.364
Glycine Sigma-Aldrich G1726
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody Prof. Jean Marc Fritschy N/A (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100 Promega H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody Merck Millipore MAB351
Mouse anti-synapsin antibody Synaptic Systems 106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) Merck Millipore MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody Professor Anne Stephenson N/A (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody Merck Millipore AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Merck Millipore AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody Life Technologies A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody Life Technologies A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies A11008
Mounting reagent (Prolong Gold) Life Technologies P36930 Use at room temperature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

Tags

Neuroscience выпуск 93 с развитием нейробиологии синапсов синаптической торможение совместно культуры устойчивые клеточные линии ГАМК средние нейроны колючие НЕК 293 клеток линии
Inhibitory Synapse Формирование в совместной культуре модель, включающая ГАМКергические средний Колючие нейронов и клеток НЕК293, стабильно экспрессирующих GABA<sub&gt;</sub&gt; Рецепторы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson,… More

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson, M. W., Stephenson, F. A., Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors. J. Vis. Exp. (93), e52115, doi:10.3791/52115 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter