Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hämmande Synapse Formation i en Co-kultur Modell Införliva GABAergiska Medium Spiny neuron och HEK293 celler som stabilt uttrycker GABA Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52115
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1UCL School of Pharmacy, University College London

Summary

De molekylära mekanismer som samordnar bildandet av hämmande GABAerga synapser under ontogenin är till stor del okända. För att studera dessa processer, har vi utvecklat en samodling modellsystem som inkorporerar embryonala mediet taggig GABAerga neuron odlade tillsammans med stabilt transfekterade humana embryonala njur-293 (HEK293) -celler som uttrycker funktionella GABA A-receptorer.

Introduction

GABA är en av de tidigaste signalsubstanser som finns i den embryonala hjärnan, som föregår det mest rikligt förekommande excitatoriska neurotransmittorn glutamat 1. Under utvecklingen depolarizes GABA och retas omogna nervceller, spelar en viktig roll i regleringen av celltillväxt, migration och bildandet av neuronala nätverk utan att inducera excitotoxicitet. I den vuxna hjärnan, är återföring potential för GABA-A-receptorkanaler skiftas till mer negativa potentialer på grund av en minskning i den intracellulära koncentrationen av klorid. Denna förändring beror på uppreglering av kaliumklorid co-transportör (KCC2), som transporterar klorid ut ur cellen, och parallellt, nedreglering av natrium-kaliumklorid transportör (NKCC1), som har motsatt effekt 2.

I hjärnan GABA binder primärt till antingen GABA A eller GABA-B-receptorer för att mediera snabb eller långsam synaptisk hämning, respektively. GABA A Rs är en klass av receptorer som också kallas heteropentameric jonotropa eller ligandstyrda Cys-loop jonkanaler. Två molekyler av GABA krävs för aktivering av receptorn, som är permeabelt för kloridjoner, och i mindre grad, bikarbonatjoner. Ökningen av kloridkonduktans minskar effektiviteten av depolariserande, excitatoriska evenemang i aktivering av postsynaptiska neuron 3.

Strukturell mångfald av GABA A Rs har länge setts som en viktig faktor för att fastställa deras breda utbud av funktionella och farmakologiska egenskaper. Native GABA A Rs är hetero pentamererna sammansatta av subenheter med flera isoformer som klassificeras som: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π och θ 3, med en gemensam transmembrantopologin som innefattar en stor N-terminal extracellulär domän, fyra transmembrandomäner (TMS), och ett stort intracellulärt område mellan minnen 3 och 4 4. Denβ3 och γ2 subenheter är viktiga för synaptisk inhibition och organism överlevnad, eftersom möss med utslagen gen av dessa subenheter dör efter födseln 5,6. I motsats härtill individuella isoformer av α-subenheten är viktiga för funktionen av specifika synaptiska förbindelser i hjärnan associerad med olika beteenden såsom ångest, sedering, upphetsning, och andra, men inte är det, var för sig, väsentligt för livet 7-9. GABA A skivor är de viktigaste platserna i åtgärder för en mängd olika läkemedel med potent lugnande, sömnmedel, ångestdämpande och kramplösande effekter, såsom bensodiazepiner, barbiturater, neurosteroider och bedövningsmedel 7,10,11.

Synaptic GABA A Rs innehåller vanligen en γ2 subenhet, två β-subenheter (oftast β2 eller β3) och två α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 12,13. Den dominerande klassen av extra-synaptiska receptorer innehåller δ subenheten i kombinationmed två α-subenheter (α4 eller α6) och två β-subenheter (β2 eller β3) 14. Subcellulär lokalisering av GABA A Rs till axoner, dendriter eller soma och sätts in i plasmamembranet är beroende av förekomsten av β-subenheter 15,16. Men selektiv inkorporering av olika GABA A R subtyper i olika typer av synapser korrelerar väl med förekomsten av specifika α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 7,17,18. Viktigt radering av α1 och α2 subenheten hos möss orsakar ultra förändringar vid hämmande synapser 19. Detta tyder på att GABA A RS själva kan spela en direkt roll i regleringen av synaps bildning.

Bevis tyder på att GABAergic synaps utveckling är en exakt koordinerad händelseförlopp, där både neuronala mål i kontakt med olika typer av hämmande axoner och de receptorer som är grupperade påvarje klass av hämmande synaps är selektiva och funktionellt anpassade 17,20-22. Denna grundläggande princip för specificitet på GABAergiska synapser väcker frågan om hur de pre- och postsynaptiska parter erkänner varandra under inledningen av synaptiska kontakter.

In vitro co-kultur-analyser har använts framgångsrikt för att studera några av mekanismerna i synaps bildning och för att testa rollen av individuella synapsen överbryggande proteiner i denna process. Ett av de vanligaste trans synaptiska samverkande proteinkombinationer som fungerar dubbelriktat för att mediera synaps bildning och mognad, är de Neurexins (Nrxns) och Neuroliginer (NLS). Nrxns är presynaptiska proteiner som uppvisar alternativ splits inom sina laminin-neurexin-könshormonbindande proteindomäner, vilket ger upphov till många olika isoformer 23. Medan Nrxns också interagera med andra proteiner, är NLS tros vara deras allestädes närvarande postsynaptiska partners 24. Tillsammans dessa proteiner bidrar till att hålla de presynaptiska och postsynaptiska membran i nära och stela apposition 25. De två mest förekommande isoformer är NL-1 och NL-2, som är närvarande vid excitatoriska och hämmande synapser, respektive 26. En av de tidigaste co-kultur modellsystem, utformade för att studera trans synaptiska proteininteraktioner, anställd olika typer av icke-neuronala celler, oftast odödliga cellinjer såsom mänskliga embryonala Kidney (HEK) 293-celler, som överuttrycker NL- 2. När dessa celler odlades med Pontine neuroner, var en ackumulering av presynaptiska proteiner i omedelbar närhet till ytan av HEK-celler observerades, vilket indikerar bildning av synaps liknande kontakter. Tillsats av lösligt β-neurexin dessa samkulturer hämmade bildningen av kontakter, vilket tyder på att trans synaptiska interaktioner mellan Nrxns och NLS är nödvändiga för synaptisk kontakt bildning 27. Dessutom övergående uttryckav β-neurexin i COS (C V-1 (simian) i O rigin, och bär S V40 genetiskt material) celler samodlade med dissocierad hippocampus glutamaterg och GABAerga neuroner inducerad expression av den postsynaptiska protein gephryin och av GABAA-R-subenheter γ2 och α2 vid kontaktpunkter mellan dessa två celltyper 28. Ett annat exempel på en co-kultur-modellen används för att studera synaps bildning involverade HEK293-celler, transient transfekterade med GABA A R subenheter α2 / β3 / γ2 och NL-2, och en blandad population av hypotalamus nervceller 29. Denna studie drog slutsatsen att uttryck av NL-2 är ett absolut krav för bildning av hämmande synapser.

Men i den aktuella studien co-kultur, stabilt transfekterad α1 / β2 / γ2 GABA A skivor i HEK293-celler visade sig vara tillräcklig för att inducera funktionella synapser när samodlade med GABAergiska Medium taggiga nervceller, utan behov av ytterligare trans synaptiska eller postsynaptiska vidhäftningsproteiner. Dock var en framstående ökning av synaps bildning och styrka observerades när NL-2 samuttryckas med GABA A Rs 30. Detta tyder på att detta samarbete kultur modellsystem har fördelar jämfört med tidigare beskrivna modellsystem, de flesta uppenbarligen en ökad känslighet och tillförlitlighet synaptiska kontaktdetektering. Två viktiga faktorer som bidrar till den allmänna förbättringen av detektion av synaptiska kontakter är: i) Användningen av stabilt transfekterade HEK293 cellinjer med hög och jämn uttryck av GABA A R subenheter på ytan av enskilda celler. Denna konsekvens underlättar kvantitativa jämförelser mellan olika sam-odlingsbetingelser. ii) Användning av en ren population av GABAergiska medel taggiga nervceller odlas från embryonala striatum 31 avlägsnar komplikationer och oklarheter till följd av användning av blandade neuronala populationer och allows, till exempel val av de lämpligaste postsynaptiska GABA A R typer som kan jämföras med varandra under synaps bildning.

Bildning av synapser tros involvera många trans synaptiska signaler inom pre- och postsynaptiska cellvidhäftningskomplex. På grund av den dubbelriktade karaktär synaptisk signalering och det stora antalet celladhesionsmolekyler, är det svårt att identifiera nyckelkomponenter är inblandade i synaps bildning. Således transfektera en enda celladhesionsprotein till en icke-neuronal cell (i detta fall, de två mest förekommande postsynaptiska mål för GABAergiska medel taggiga nervceller in vivo, α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) kraftigt minskar komplexiteten i trans synaptiska signaler tillgängliga vid postsynaptiska ytan och ger exakt kvantitativ analys av effekten av detta protein för att främja synaps bildning.

Protocol

Sprague-Dawley råttor eller BAB / c inavlade möss (Harlan, Storbritannien, antalet dräktiga honor som användes var 30) inhystes och avlivades enligt brittiska Home Office [och Europeiska gemenskapernas rådets direktiv av den 24 november 1986 (86/609 / EEG) ] riktlinjer. Projektet godkändes formellt av UCL School of Pharmacy etikkommitté.

1. Beredning av Instrument, odlingsmedier och rätter

  1. Slå på och rengöra huv med laminärt flöde med 70% etanol för att arbeta under sterila betingelser vid alla tidpunkter.
  2. Förbered HEK293 cellodlingsmedium, innehållande Dulbeccos modifierade Eagle-medium pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutamin (2 mM), penicillin (50 enheter / ml), streptomycin (50 | ig / ml) och fetalt bovinserum (10 %).
    OBS: penicillin och streptomycin är irriterande.
  3. Förbered serumfri neuronala odlingsmedium, innehållande Neurobasal-medium pH 7,4 (500 ml), B27 supplement (25 ml), L-glutamin (2 mM), penicillin(50 enheter / ml), streptomycin (50 pg / ml) och glukos (6 mM).
  4. Bered 500 ml HEPES-buffrad koksaltlösning (HBSS), innehållande HBSS 10x lager (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) och vatten (445 ml), pH 7,4.
  5. Autoklav fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4; 1 L), vatten (1 L), täckglas av glas (13 mm i diameter) och glas pasteurpipetter för att sterilisera dem.

2. Beredning av HEK293 stabil cellinje som uttrycker α1 / β3 / γ2-GABA A Rs

  1. Plate 2x10 6 HEK293-celler i en 10 cm steril vävnadsodlingsplatta och inkuberas vid 37 ° С i en fuktad 5% koldioxid (CO 2) atmosfär (CO 2 inkubator) för att nå 70-90% konfluens över natten.
  2. Följande dag transfektera HEK293-celler med GABA A-R α1-subenhet-cDNA i pcDN 3,1 (+) expressionsvektor som innehåller G418-disulfat (tabell 1) resistensgenen,och GABA A R β3 subenhet cDNA i expressionsvek införliva fleomycin D1 (tabell 1) resistensgenen (både under reglering av en human cytomegalovirus omedelbara tidiga (CMV) promotor), med hjälp av en katjonisk liposomformulering, som bildar komplex med negativt laddade nukleinsyramolekyler (tabell 1) enligt tillverkarens protokoll.
  3. I korthet, tillsätt 500 | il av reducerat serummedium (pH 7,4; Tabell 1) och 7,5 ^ g av varje cDNA-konstruktionen till ett sterilt 15 ml centrifugrör, följt av 15 pl av liposomal transfektion buffrande reagens, och blanda försiktigt innan de lämnar vid rumstemperatur under 5 min.
  4. Till denna blandning, tillsätt 8,75 pl av liposomalt transfektionsreagens och blanda försiktigt innan de lämnar vid rumstemperatur under 30 min. Efter detta, tillsätt 3 ml av HEK293-cellkulturmedium (utan antibiotika), pipettera innehållet i centrifugröret upp och ned två gånger, överfr droppvis på cellerna som växer i en 10 cm vävnadsodlingsskål, och inkubera under 48 h vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  5. Tvätta de HEK293-celler försiktigt med steril PBS, pH 7,4, och späd de transfekterade HEK293-celler i nya 10 cm vävnadsodlingsskålar, i följande förhållanden: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 och 01:20. Detta säkerställer att cellerna inte kommer att bli alltför konfluenta.
  6. Börja urval av de HEK293-celler som uttrycker både GABA A-R-subenheter genom tillsats av 800 | j, g / ml av varje antibiotikum selektionsmarkör, G418, och fleomycin D1, till odlingsmediet. Inkubera cellerna vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) och ersätta den antibiotikainnehållande medium (10 ml) var 2 dagar.
  7. När små vita kolonier börjar form (vanligen efter ca 7 dagar), noggrant välja en enda koloni från var och en av rätterna och hämta det med en steril P1000pipettspetsen. Överföra den till en brunn i en 24-och vävnadsodling skylt som innehåller 500 l av medelhög och noggrant tersuspendera genom att pipettera mediet upp och ned. Säkerställa att exakt en koloni överföres till varje brunn (totalt 5-20 kolonier rekommenderas). Inkubera cellerna vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) och ersätta den antibiotikainnehållande medium var 2 dagar.
  8. När samhällena blir 70-80% sammanflytande, försiktigt pipet mediet upp och ner för att få bort cellerna från botten av 24-och vävnadsodlingsplatta. Överför och dela suspensionen av celler mellan 2 brunnar i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta. Inkubera cellerna vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) och ersätta den antibiotikainnehållande medium var 2 dagar.
  9. När 70-80% sammanflytande, samla cellerna från 1 av de 2 brunnar innehållande celler som härrör från en och samma kolony och förbereda proteinlysat. Kortfattat, tvätta cellerna 2x med PBS, pH 7,4, och tillsätt 200 pl av 2% natriumdodecylsulfat (SDS) i PBS, pH 7,4. Samla lysatet och överföra den till mikrocentrifugrör. Mäta proteinkoncentration med användning av BCA-proteinreagens (se tabell 1) i enlighet med tillverkarens protokoll. Analysera uttrycket av α1 och β3 subenheter av GABA A-receptorer genom SDS / PAGE och immunoblotting använder subenheten specifika antikroppar (kanin anti-α1 specifika och kanin anti-β3 specifika GABA A R-antikroppar, se tabell 1 för information om dessa antikroppar).
  10. Loss och överföra enbart positiva kloner från de återstående brunnarna till större 6 cm vävnadsodlingsskålar. Inkubera cellerna vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) och ersätta den antibiotikainnehållande medium var 2 dagar.
  11. Successivt utöka kolonier av celler under den antibiotikaselektion genom att överföra dem till 10 cm vävnadskulturskålar och slutligen till vävnadsodlingskolvar (T-75 kolvar). Inkubera cellerna vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) och ersätta den antibiotikainnehållande medium var 2 dagar.
  12. Plate 70.000 celler från varje koloni på täckglas (13 mm i diameter) och fixera cellerna att analysera cellytan uttryck och samlokalisering av GABA A R-subenheter genom immunofluorescens.
  13. Välj den positiva klonen av HEK293-celler som uttrycker höga nivåer av både α1 och β3 subenheter av GABA A-receptorer, tallriks 2 x 10 6 celler i en 10 cm steril vävnadsodlingsskål och inkubera vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär ( CO 2 inkubator) över natten. Säkerställa att cellerna inkuberas i antibiotikainnehållande (G418 och fleomycin D1) medium vid alla tidpunkter.
  14. Följande dag transfektera HEK293-celler med GABAA-R γ2s subenhet-cDNA i pcDNA ™ 3,1 (+) expressionsvektor som innehåller hygromycin B-resistens-genen med användning av en icke-liposomal lipid transfektionsreagens (tabell 1).
    OBS: Denna transfektionsmetoden ger bättre överlevnad och högre uttryck effektivitet främmande proteiner i långsamt växande stabila cellinjer som är under ständig val med antibiotika.
  15. I ett sterilt 15 ml centrifugrör, tillsätt 250 | il av Enhancer och DNA-kondensation-buffert (Tabell 1) och 1,4 | ig av γ2s GABAA-receptorunderenhet-cDNA. Lägg 11.2 pl Enhancer och skaka i 1 sek innan de lämnar i rumstemperatur i 5 minuter.
  16. Addera 35 pl av icke-liposomal lipid transfektionsreagens och vortexa i 10 sekunder innan de lämnar vid rumstemperatur under 10 min. Lägg 3 ml av G418 / fleomycin D1-innehållande medium och pipettera innehållet i centrifugröret upp och ned två gånger befmalm överföra den droppvis på cellerna växer i en 10 cm vävnadsodlingsplatta. Inkubera cellerna under 48 h vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  17. Tvätta cellerna försiktigt med steril PBS och späda ut dem i nya 10 cm vävnadsodlingsskålar, i följande förhållanden: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 och 1:20.
  18. Börja urval av α1 / β3-HEK293-celler som uttrycker den γ2s subenheten genom att tillsätta 800 | j, g / ml av antibiotikumet selektionsmarkör Hygromycin B till G418 / fleomycin D1-innehållande medium. Byt ut det gamla mediet med färska G418 / fleomycin D1 / Hygromycin B-innehållande medium (10 ml) var 2 dagar.
  19. Upprepa steg från 2,7 till 2,12, under kontinuerlig selektering i G418 / fleomycin D1 / hygromycin B-innehållande cellodlingsmedium.
  20. Lagra de positiva klonerna vid -140 ° C i antibiotikafritt cellodlingsmedium och 10% dimetylsulfoxid (DMSO) för framtida användning.
  21. Testa nivåav uttryck av α1, β3 och γ2s GABA A R subenheter av immunoblotting och immunofluorescens i varje klon efter avfrostning, eftersom uttrycket kan ändras på grund av minskad överlevnad av celler under antibiotikaselektion.

3. Underhåll av HEK293 cellinjer

  1. Avfrostning en flaska med kontroll HEK293 celler eller sådana som uttrycker antingen α1 / β2 / γ2-GABA A Rs (tabell 1) eller α1 / β3 / γ2-GABA A Rs (beskriven ovan) i 10 ml cellodlingsmedium i en 15 ml steril centrifugrör. Centrifugera vid 440 xg under 5 min för att avlägsna överskott av DMSO.
  2. Avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 1 ml färskt cellkulturmedium.
  3. Först lägga till 9 ml färskt cellkulturmedium till en 10 cm vävnadsodlingsskål belagd med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) och sedan 1 ml av återsuspenderade celler. Agitera försiktigt från sida till sida, för att dispergera celler och inkubera vid 37 ° С i en fuktad5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  4. Följande dag, aspirera mediet för att avlägsna eventuella cellrester och ersätt med 10 ml färsk HEK293 cellodlingsmedium.
  5. Välj stabila cellinjer med antibiotika för att avlägsna eventuella celler som inte uttrycker GABA ^ R-subenheter och därför även saknar expression av antibiotikaresistensmarkörer. För α1 / β2 / γ2 stabil cellinje, ersätta normalt medium med färskt cellodlingsmedium innehållande G418 (800 | ig / ml). För α1 / β3 / γ2 cellinje, ersätt med nytt cellodlingsmedium innehållande G418 (800 mikrogram / ​​ml), fleomycin D1 (800 mikrogram / ​​ml) och Hygromycin B (800 mikrogram / ​​ml). OBSERVERA! G418 är en irriterande och Hygromycin B är frätande, giftiga och irriterande.
  6. Passage av cellerna i en ny vävnadsodlingsskål genom ympning vid en lägre densitet när de uppnå> 70% sammanflytning. Aspirera 10 ml cellodlingsmedium och tvätta två gånger snabbt medPBS, pH 7,4. Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA-lösning, en lösning av proteaset trypsin (0,05% trypsin) och en Ca 2 + kelator EDTA (0,02%) i PBS, pH 7,4, för att lösgöra cellerna från skålen. Trypsin-EDTA-VARNING! Lösningen är irriterande.
  7. Tillsätt 10 ml cellodlingsmedium som innehåller de korrekta antibiotika, till skålen och aspirera cellerna. Centrifugera cellerna vid 440 x g under 5 min och återsuspendera dem i 5 ml av cellodlingsmedium.
  8. Passage cellerna med hjälp av en 1:10 spädning i en ny vävnadsodlingskolv (T-75-kolv) innehållande färskt cellkulturmedium och rätt antibiotika. Inkubera cellerna vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) och ersätta mediet varannan dag. Passage cellerna när> 70% sammanflytande (se steg 2.8).

4. Beredning av GABAergic Medium Spiny Neuron kultur

  1. Under sterila betingelser framställa en 24-vill platta med poly-L-lysin (0,1 mg / ml) -belagda täckglas (13 mm i diameter) och inkubera vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  2. Följande dag, aspirera med en pipett överskottet poly-L-lysin och tvätta täckglas med två kort 10 sek och två 5 min långa tvättningar med sterilt vatten. Lägg laminin (0,01 mg / ml) över natten och inkubera vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  3. Desinficera dissektion område med 70% etanol och samla en rad dissekera verktyg som böjda och raka vävnad pincett, sax och pincett, och placera i 70% etanol för att fullt ut sterilisera dissekera instrument.
  4. Placera dräktig råtta / mus avlivades med CO2 på ryggen och rengör huden på buken med 70% etanol. Nyp ihop huden med pincett och skars runt buken genom huden, muskel och bukhinna, för att avslöja de inre organen och livmodernmed embryon tydligt. Utdrag embryon (E16-17) från livmodern och placera dem i en petriskål med kyld PBS.
  5. Placera embryona i dragskåp med laminärt flöde och decapitate dem, samla in huvudena i en ny petriskål med kyld HBSS.
  6. Under ett dissektionsmikroskop, dissekera ut hjärnan med hjälp av de böjda och raka pincett. Placera hjärnan i en ny petriskål med kylt HBSS.
  7. Separera de två hjärnhalvorna och försiktigt bort hjärnhinnorna. Skär längs linjen av hippocampus och skala tillbaka cortex för att avslöja striatum. Observera striatum som ett räfflat vitt struktur vid den främre av halvklotet.
  8. Dissekera striatum och skär den i mycket små bitar (1-2 mm i diameter) och använda en brand-polerad pasteurpipett för att samla in materialet i en steril 15 ml centrifugrör med en total volym av 1 ml. Brand polering garanterar att materialet samlas in utan att skadas.
  9. Med hjälp av brand polerade tip av Pasteur pipett aspirera cellerna och släppa dem 8-10 gånger. Intag av en ny pipett med en brand-polish spets av ungefär 30% av sin ursprungliga diameter (1 mm), triturera lösningen ytterligare 4-6 gånger tills det visas homogen.
  10. Filtrera cellerna med hjälp av en 100 pm nylon cell sil i en ny sterilt centrifugrör.
  11. Räkna cellerna med en hemocytometer och plattan 70.000 celler i 500 | il av neuronala odlingsmedium per brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Agitera brunnarna vänster till höger och inkubera vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) för 14 dagar in vitro (DIV).
  12. Efter 7 dagar, kontrollera renheten hos neuronala kulturer och om gliaceller är närvarande, till cytosin β-D-arabinosid (Ara-C, 5 M) till brunnarna för att stoppa deras spridning. För att göra detta, ta bort 250 pl neuronal odlingsmedium (pH 7,4) från varje brunn och tillsätt 250 | il färskt medium innehållering Ara-C. VARNING! Ara-C är irriterande.

5. Co-kultur Förberedelse

  1. På dag 11 av neuronal kultur, belägga en 6-brunnars platta med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) under sterila betingelser och inkubera över natten vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  2. Den följande dagen (dag 12 av neuronal kultur), aspirera överskott poly-D-lysin och tvätta brunnarna 2x kort och 2x i 5 minuter med sterilt vatten före tillsats av färskt cellkulturmedium (utan antibiotika) för att belägga brunnarna med en liten mängd av serum från mediet.
  3. Aspirera odlingsmediet från vävnadsodlingskolv (T-75). Skölj cellerna två gånger med PBS före tillsats av 1 ml av Ca2 + / Mg2 + -chelating aren EDTA (0,48 mM) som försiktigt och icke-enzymatiskt dissocierar celler. Agitera cellerna att lossa dem från botten av vävnadskolv.
  4. Tillsätt 10 ml cellodlingsmedium (utan antibiotika eftersom det kan störa transfektion), aspirera cellerna och plats i ett sterilt centrifugrör. Pellets cellerna vid 440 xg under 5 min med hjälp av en låg hastighet bänkcentrifug.
  5. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml färskt cellkulturmedium. Med användning av en hemocytometer, räkna cellerna och platta vid en densitet av 3 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnsplatta. Skaka försiktigt och inkubera i 24 h vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  6. Följande dag (dag 13 av neuronala kultur) transient transfektera HEK293 celler med mCherry cDNA i pcDNA3 expressionskonstruktet använder liposomalt transfektionsreagens. Kortfattat, i ett sterilt mikrocentrifugrör, tillsätt 500 ìl av minskad serummedium och 5 pg av mCherry cDNA. Tillsätt 5 pl liposomalt buffrande reagens och blanda försiktigt innan de lämnar i rumstemperatur i 5 minuter.
  7. Lägg 8,75 pl av liposomal transfektion REAGent och blanda försiktigt innan de lämnar vid rumstemperatur i 30 minuter. Pipet innehållet i mikrocentrifugrör upp och ned två gånger, överföring droppvis till varje brunn på 6-brunnars vävnadsodlingsplatta och inkuberas vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  8. Den följande dagen (dag 14 av neuronal kultur), aspirera HEK293 cellodlingsmedium från var och en av de 6-brunnar och tvätta varje brunn två gånger hastigt med PBS (pH 7,4). Addera 300 pl av Ca2 + / Mg2 + -chelating aren EDTA (0,48 mM) och 200 | il av trypsin-EDTA (0,02-0,48 mM) lösning till varje brunn och inkubera vid 37 ° С för 5 min.
  9. Tillsätt 1 ml färsk HEK293 cellodlingsmedium per brunn (detta släcker trypsin) och aspirera de lösgjorda cellerna i en steril 15 ml centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 440 xg under 5 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten. Återsuspendera pelleten i 500 | il av neuronala odlingsmedium (pH 7,4). </ Li>
  10. Med användning av en hemocytometer, räkna cellerna och frö vid en densitet av 30.000 celler per brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande neuroner. Agitera plattan för att dispergera celler och inkubera samkulturer vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator) för 24 h.

6. Analys av synaptiska kontakter och deras aktivitet

  1. Efter 23 timmar i samodling, utreda bildandet av "aktiva" kontakter mellan GABAergiska medel taggiga neuroner och HEK293 celler med hjälp av aktivitetsberoende upptag av anti synaptotagmin luminala domän-specifik antikropp konjugerad med ett fluorescerande färgämne (Cy5, se tabell 1) .
    OBS: antikropp kommer endast att få tillgång till den luminala domänen av synaptotagmin, till vilken den binder, när det finns en kontinuitet mellan de synaptiska vesikler lumen och extracellulära utrymmet. Detta sker speciellt under frisättningen av neurotransmittorer, vilket gör detta AntibODY en utmärkt markör för de aktiva presynaptiska terminalerna.
  2. För det första skölj samkulturer med neuronal-medium (Neurobasal Ett medium, pH 7,4, se tabell 1) och tillsätt Cy5-märkt mus-anti-synaptotagmin antikropp, utspädd 1:50 i neuronalt medium (Neurobasal Ett medium, pH 7,4), till kulturer, till 30 min. Inkubera cellerna under denna tid vid 37 ° С i en fuktad 5% CO 2 atmosfär (CO 2 inkubator).
  3. För att ta bort åtkomst av antikroppen, tvätta samkulturer kortfattat tre gånger: först med kallt normal PBS (pH 7,4), andra med kall PBS (pH 7,4) innehållande 200 mM NaCl, och den tredje med kall normal PBS (pH 7,4)
  4. Fixera cellerna med 300 | il av 4% paraformaldehyd / 4% sackaros i PBS (PFA, pH 7,4) under 10 min med omröring. Tvätta cellerna kortvarigt två gånger med PBS (pH 7,4) och därefter med två längre 10 minuterstvättar.
  5. Lägg glycin (0,3 M) till varje brunn under 10 minuter med omröring för att släcka PFA.
  6. Tvätta cellerna briefly två gånger med PBS (pH 7,4) och därefter med två längre 10 minuterstvättar före tillsats av 300 | j, l av blockeringslösning (1% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4) för att reducera icke-specifik bindning av antikroppar.
  7. Aspirera den blockerande lösningen och tillsätt marsvin anti-GABA A R-γ2 antikropp riktad mot γ2 N-terminal domän 33 (1: 3000 i PBS, pH 7,4) över natten vid 4 ° С.
  8. Följande dag, aspirera den primära antikroppen från brunnarna och tvätta cellerna snabbt två gånger med PBS sedan med två längre 10 min tvättar.
  9. Permeabilisera celler med användning av Triton X-100 (0,1%) i blockeringslösning under 30 min vid rumstemperatur.
  10. Tvätta cellerna kortvarigt två gånger med PBS (pH 7,4) och därefter med två längre 10 minuterstvättar före tillsats av antingen mus-anti-glutaminsyradekarboxylas (GAD) 65 antikropp (1: 4000, tabell 1) eller i mus-anti-synapsin I-antikropp ( 1: 1000, tabell 1) för 120 minuter vid rums temperatur.
  11. Tvätta cellerna kortvarigt två gånger med PBS (pH 7,4) och därefter med två längre 10 minuterstvättar och sedan lägga blockerande lösningen i 30 min vid rumstemperatur.
  12. Centrifugera lämpliga sekundära antikroppar (vanligen get-anti-marsvins-IgG konjugerat till Cy5, get anti-mus IgG konjugerad till Alexa Fluor 488 eller get-anti-mus-IgG-Alexa Fluor 405, allt på 2 | ig / ml) för att avlägsna aggregat av antikroppar vid 21.910 xg under 10 minuter, och tillsätt antikroppar (1: 750) för att blockeringslösning. Ansök till lämpliga brunnar under 1 timme och täck med aluminiumfolie för att skydda fluoroforema från ljusexponering och därav fotoblekning.
  13. Slutligen tvätta cellerna kortvarigt två gånger med PBS (pH 7,4) och därefter med två längre 10 minuterstvättar för att avlägsna eventuell obunden sekundär antikropp och montera täckglas med användning av monterings reagens (Prolong Guld, tabell 1) ca 10 | j, l per täckglas. Tillåt 24 h för att ställa om vid rumstemperatur samtidigt som skyddas från ljus innan de överförs till fyra° С för långtidsförvaring.
  14. Analysera prover med en laserskanning konfokalmikroskop med 63X oljeimmersionsobjektiv. Säkerställa de ljusnivåer och detektor förstärkningen justeras för att undvika mättning.
  15. Observera eventuella synaps liknande kontakter som regioner av samlokalisering mellan de presynaptiska terminalerna positivt för GAD65, synapsin I eller Cy5-märkt anti-synaptotagmin och postsynaptiska HEK293-celler visualiseras genom DIC eller av mCherry fluorescerande indikatorn.
  16. Räkna potentiella synaps liknande kontakter med Z-stack serie optiska sektioner (8-10) genom ett djup av 4-5 um per cell med hjälp av bildprogram.

Representative Results

Protokollet för denna neuron-HEK293 cell samodlingssystemet modellsystem har finstämt att tillåta optimal cellöverlevnad. I detta system, bildandet av synaps-liknande kontakter och deras analys förlitar sig på en stabil och enhetlig expression av alla tre GABAA-R-subenheter som monterar in en funktionell receptor. Det är därför viktigt att använda immunocytokemisk analys till test för subenhet uttryck på ytan av HEK293 cell innan du lägger dem till neuronala kulturer. I dessa experiment var cellyteexpression av α1, β2 och γ2 subenheter (Figur 1A), eller α1, β3 och γ2 subenheter (Figur 1B), detekteras med användning av subenhet-specifika antikroppar som binder till de extracellulära epitoper av dessa subenheter. En hög grad av samlokalisering mellan dessa subenheter vid HEK293 ytan demonstrerades.

Efter att ha bekräftat ytan uttryck och samlokalisering av GABA AR-subenheter i HEK293 celler, co-kulturer har sammanställts med HEK293 celler som uttrycker α1 / β2 / γ2 GABA A R-subenheter och medel taggiga neuroner odlade i 14 dagar (14 dagar in vitro (DIV)). Celler i samodling inkuberades i 24 timmar, fasta och analyseras med hjälp av immuncytokemi och konfokalmikroskopi. Analys av kontakter visade att GAD65-positiva GABAergic axon terminaler bildas endast sporadiska kontakter med kontroll HEK293-celler (Figur 2A, 2B). Antalet kontakter som upptäcktes vid 4 timmar var 7,3 ± 0,9 per HEK293-cell, och detta antal minskades till 5,5 ± 0,5 anslutningar (medelvärde ± SEM) per HEK293 cell vid 24 timmar efter att ha lagt HEK293 celler för de odlade nervceller. Däremot GAD65-positiva GABAergic axon terminaler bildade talrika synaps-liknande kontakter med HEK293 celler som uttrycker GABA A Rs. Antalet kontakter som erhållits vid 4 timmar efter att ha lagt HEK293-celler var 28,3 ± 4,7 per HEK293-cell, och detta antal var ytterligare ökningd till 52,1 ± 6,3 (medelvärde ± SEM) per HEK293 cell vid 24 timmar i samodling (Figur 2A, 2B).

För att avgöra om synaps liknande kontakter var "aktiv", dvs stöd frigivning vesikulär sändare, var en blås luminal domän-specifika anti-synaptotagmin Cy5-konjugerad antikropp till co-odlingsmedium efter 23 timmars inkubation. Denna antikropp är bara införlivas i presynaptiska nervterminaler när en por former mellan de synaptiska vesikler lumen och den extracellulära vätskan i den synaptiska klyftan vid neurotransmittorfrisättning. Efter release, stänger porerna, lämnar synaptotagmin Cy5-konjugerade fluorescerande antikropp bunden till synaptotagmin inuti vesikeln. På detta sätt är endast de vesiklar som är aktivt engagerade i neurotransmittorfrisättning märkt med antikroppen. I dessa experiment få om några kontakter mellan kontroll HEK293 celler och medel taggiga nervterminaler var "aktiv & #8217; vilket framgår av bristen på samlokalisering mellan den presynaptiska GAD65 / synaptotagmin fluorescens och mCherry fluorescens i HEK293-celler (Figur 3A). Däremot var det många "aktiva" kontakter bildas mellan de medel taggig nervterminaler och α1 / β2 / γ2-uttryck HEK293-celler, vilket framgår av en hög grad av samlokalisering mellan GAD65 / synaptotagmin och mCherry uttryckte specifikt i HEK293-celler ( Figur 3B).

För att testa om en annan subtyp av GABA A R också kan främja synaps liknande formation in vitro, har vi samodlas α1 / β3 / γ2 uttryck HEK293 celler med medel taggiga nervceller. Återigen, kontroll HEK293 celler mottagna sällan kontakter med synapsin-positiva presynaptiska terminaler når 10,8 ± 0,48 (medelvärde ± SEM) kontakter per HEK293 cell efter 24 timmar i samodling (Figur 4A vänster, 4B). Emellertid HEK293-celler som uttryckerα1 / β3 / γ2 GABA A Rs formulär betydligt mer synaps-liknande kontakter med synapsin-positiva presynaptiska terminaler medel taggiga nervceller når 25.3 ± 0,27 (medelvärde ± SEM) kontakter per HEK293 cell efter 24 timmar i samodling (Figur 4A rätt, 4B). Detta indikerar att α1 / β3 / γ2 GABA A Rs uttryckt i HEK293-celler har även möjlighet att främja synaptisk kontakt bildning, om än deras potens är lägre än styrkan av α1 / β2 / γ2-innehållande GABA A Rs.

Dessa experiment visar att co-kultur-modellen som utvecklats i vårt laboratorium möjliggör kvantitativ analys av synaptiska kontaktbildning in vitro samt utvärdering av effektiviteten av olika undertyper av GABA A skivor i den här processen. Dessa experiment visar vidare att GABA A Rs, förutom att vara kritiska funktionella komponenter i GABAergic synapser, kan spela en nyckelrolli processen för erkännande och bildandet av synaptiska kontakter mellan hämmande nervceller och lämpliga neuronala målceller, oberoende av andra synaptiska vidhäftningsproteiner.

Figur 1
Figur 1. Immunocytokemisk analys av uttryck av GABA A-R α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 i stabila HEK293-cellinjer. Antikroppar som känner igen de extracellulära domänerna av GABA A-R-subenheter användes för etikett-receptorer uttryckta på cellytan. ( A) HEK293-cellinje som uttrycker α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) och γ2 (Cy5) vid höga nivåer. (B) HEK293-cellinje som uttrycker α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) och γ2 (Cy5)subenheter vid höga nivåer. Skala bar:. 10 mikrometer klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. GABAergiska medel taggiga nervceller bildar synaps liknande kontakter med α1 / β2 / γ2- uttrycker HEK293 celler i samodling. (A) Fluorescent märkning av presynaptiska terminaler med anti-GAD65-antikroppar (i grönt) och HEK293 celler med mCherry (i rött, vänster) eller GABA A R γ2 subenhet (i blått, höger), avslöjade punkter samlokalisering mellan dessa markörer som anger bildandet av synaps liknande kontakter efter 4 eller 24 timmar i samodling. Skala bar:. 10 mikrometer (B) Kvantitativ analys av synaps liknande co ntacts. HEK293-celler identifierades baserat på deras form såsom avslöjas genom DIC avbildning och / eller mCherry uttryck, och antalet kontakter mellan GAD-65 positiv puncta (i grönt) och ytan av HEK293-celler räknades genom ögat i varje optisk sektion av en Z-stack serien (8-10) per cell med hjälp av bildbehandlingsprogram, och uttrycks som antalet kontakter / cell. Diagrammet visar antalet kontakter mellan medel taggiga nervceller och kontroll HEK293 celler (ljusgrå) eller α1 / β2 / γ2-HEK293-celler (svarta) efter 4 och 24 timmar i samodling (medelvärde ± SEM, n = 8 i varje tillstånd från två oberoende experiment). Denna siffra har ändrats från Fuchs et al. (2013) 30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3. GABA A Rs främja bildningen av aktiva synaptiska kontakter. Immunomärkning av synaps liknande kontakter som bildas efter 24 timmar i samodling mellan medel taggiga nervterminaler positivt för GAD65 (Alexa Fluor 405 cyan) och (A) kontroll HEK293-celler, eller (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 celler, både transient transfekterad med mCherry konstruera (röd). Aktiva kontakter identifieras genom samlokalisering mellan vesikler luminala domänspecifika anti-synaptotagmin antikropp (Cy5) och GAD65-specifik antikropp både i presynaptiska terminaler och mCherry uttryckt i HEK293-celler. Skala bar:. 10 mikrometer klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

igure 4 "fo: innehålls width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4. GABAergiska medel taggiga nervceller bildar synaps liknande kontakter med α1 / β3 / γ2- subenhet uttryck HEK293 celler i samodling. (A) Fluorescent märkning av presynaptiska terminaler med anti-synapsin I-antikroppar (i grönt), och kontroll HEK293-celler (vänster), eller α1 / β3 / γ2 uttryck HEK293-celler, både transient med mCherry (i rött), avslöjade punkter samlokalisering mellan dessa markörer som anger bildandet av synaps liknande kontakter efter 24 timmar i samodling. Skala bar: 10 m (B). Kvantitativ analys av synaps-liknande kontakter. HEK293-celler identifierades genom mCherry uttryck, och antalet kontakter mellan synapsin I-positiv puncta (i grönt) och ytan av HEK293-celler räknades genom ögat i varje optisk sektion av en Z-stack-serien (8-10) per cell med hjälp av bildbehandlingsprogram, och uttrycks som antalet kontakter / cell. Diagrammet visar antalet kontakter mellan medel taggiga nervceller och kontroll HEK293 celler (ljusgrå) eller α1 / β3 / γ2-HEK293-celler (svarta) efter 24 timmar i samodling (medelvärde ± SEM, n = 8-12 celler i varje tillstånd, från två oberoende experiment). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Även om detta protokoll är inte tekniskt svårt att genomföra, det finns flera viktiga steg som måste följas för att uppnå den mest exakta och repeterbara co-kulturanalyser. För det första måste odlade medel taggiga nervceller seedas på en optimal täthet. Om seedade alltför glest, nervceller tenderar att utvecklas mycket långsamt och överlevnad är kraftigt reducerad. Å andra sidan, om ympades alltför tätt, nervceller tenderar att aggregera som äventyrar analys av kontakterna med HEK293-celler. För det andra är det rekommenderat att transient uttrycka en fluorescerande reporter, GFP eller mCherry i HEK293-celler som stabilt uttrycker GABA A Rs före Platting dem i co-kultur. Detta möjliggör tillförlitlig erkännande av HEK293-celler, som kan äventyras av likhet i form och storlek mellan dessa celler och sällsynta överlevande glia cell i neuronala kulturer. För att uppnå en effektiv transfektion med GFP eller mCherry cDNA, HEK293-cellinjer måste vara i den exponentiella tillväxtfasen ochympades vid lämplig densitet i 6-brunnars plattor. Gles sådd följt av transfektion orsakar cellerna att växa dåligt, medan över-seeding förhindrar cellerna från att ta upp cDNA. Idealt bör cellerna såddes så att de är mellan 70 till 90% sammanflytande på dagen för transfektion. För det tredje måste transfektionen optimeras för varje cellinje som används, eftersom vissa cellinjer är mer känsliga än de andra. Detta beror på att konstitutivt GABAA-R-expression i HEK293-celler reducerar cellöverlevnad och förmågan hos celler att återhämta sig efter transfektion. Dessutom överlevnad beror på typen av GABA A-Rs uttryckt i HEK293-celler, med en del cellinjer är betydligt mer känsliga än de andra. Transfektion med hjälp av liposomalt reagens är en optimal metod för att uttrycka främmande proteiner i snabbväxande cellinjer, som ger både hög transfektionseffektivitet och uttrycksnivå. Emellertid orsakar detta reagens för mycket skada för att långsamt växande cellinjer, försom vi använder regelbundet en icke-liposomalt transfektionsreagens. Denna fungerar på ett liknande sätt till den liposomala reagenset men mängden av DNA som krävs för effektiv transfektion har minskat avsevärt. Detta medger större cellöverlevnad (ungefär 80 till 90% jämfört med 60% med användning av liposomalt reagens) men med lägre transfektionseffektivitet (60%). Slutligen har antalet kontroll HEK293 eller α1 / β2 / γ2 HEK293 uttryckande celler läggs till neuronala kulturer behöver optimeras. Lägga för få celler äventyrar framgångsrik analys av kontakter mellan HEK293-celler och neuroner, eftersom de blir mycket sällsynt. Omvänt, lägga alltför många HEK293-celler orsakar nervcellsdöd inom några timmar.

Embryonala medel taggig neuron kulturer bör helst beredas genom att använda striatal vävnad dissekerades från embryonala ålder 15 - 17. Dock händer det ofta att embryon är något yngre eller äldre än den optimala åldern. I detta fall är antalet neuroner inokuleras i ett odlings kommerbehöva varieras. Vävnad som är yngre än E15 kan behöva såddes vid en något lägre densitet, medan vävnaden som är äldre än E17 kan behöva såddes vid en högre densitet, för att möjliggöra en optimal cellöverlevnad. Vidare kan cytosinarabinosid (Ara-C) måste läggas till äldre kulturer för att förhindra tillväxt av glia, vilket är mer rikligt förekommande i äldre vävnad.

När man skapar samkulturer, är det viktigt att plätera det optimerade antalet transfekterade HEK293 eller α1 / β2 / γ2 HEK293-uttryckande celler, såsom nämnts ovan. Emellertid kan det vara nödvändigt att bestämma detta för varje enskild cell-linje, på grund av skillnader i deras överlevnad. Normalt 30.000 celler i en maximal volym av 50 ul bör läggas till varje brunn i en 24-bra maträtt, som redan innehåller 500 l av neuronala odlingsmedium, eftersom det säkerställer att rade neuronala mediet inte späds för mycket och att de villkor inom varje brunn förbli ganska konstant, t.ex.

En av de största nackdelarna med co-kultur teknik är att de neuronala kulturer skapas från dissocierade celler odlas som ett monolager, vilket innebär att nervceller har tagits bort från sin normala mikro och inte kan styrka sin normala anatomiska organisation. Därför att de saknar lämpliga anslutningar, ingångar och utsöndrade molekyler från andra celler som kan påverka de inledande faserna av synaps utveckling. Exempelvis in vivo medel taggiga neuroner är tätt innerveras av glutamaterga insignaler från cortex, thalamus och andra hjärnregioner 34, emellertid, i våra neuronala kulturer glutamaterga synapser bildar inte eftersom dessa ingångar är skadad under dissektion av striatal vävnad. Så avsaknaden av funktionella glutamaterg synapser i odlade medel taggiga nervceller AFFekter deras förmåga att bilda GABAergic synapser med varandra och / eller HEK293-celler som uttrycker GABA ^ Rs är fortfarande en öppen fråga. Denna fråga kan lätt åtgärdas genom odling medel taggiga nervceller tillsammans med kortikala glutamaterga neuroner tillåter därmed dem att bilda funktionella synapser 35 före tillsättningen av HEK293-celler. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att utforma en samarbetskultur modellsystem baserat på organotypiska slice kulturer som behåller en del av cytoarchitecture som kan vara viktiga för mognad och synaps bildning. Men organotypiska slice kulturer har tät och heterogena neuropil som kan äventyra analys här. En annan viktig nackdel med användning av sam-odlingsanalyser är att GABAA-Rs uttryckt vid ytan av HEK293-celler som inte är klustrade som de är i neuroner, även om detta inte verkar vara nödvändig för synaps bildning ges en tillräckligt hög ytexpression 30. Till exempel, i den rOdent hjärna och i hippocampus kulturer är α1 GABA A R-subenhet finns i de flesta GABAerga synapser på alla postsynaptiska områden av pyramidala celler. Dock är α2 specifikt belägen i en delmängd av synapser på somata och dendriter men höganrikat i axonet inledande segmentet, vilket framgår av immunofluorescens och elektronmikroskopi 36. Med tanke på att synaps bildning i samkulturer fortfarande tillförlitligt kan upptäckas och analyseras 30, tyder detta på att tätheten av GABA A R på cellytan hos HEK293 celler kan likna, eller till och med högre än densiteten hos dessa receptorer i synaptic kluster i nervceller. Detta kan förklara, åtminstone delvis, varför synaptiska vidhäftningsproteiner, såsom neuroligin och postsynaptiska densitetsproteiner, såsom gephyrin, är inte nödvändiga för synaps bildning i samkulturer, om de på lämpligt sätt sammanfogade GABA A Rs är närvarande vid tillräcklig densitet.

Det är väl dokumenterat att GABA A Rs är strukturellt och funktionellt heterogen och att receptorsubenhet kompositionen bestämmer deras subcellulära lokalisering och farmakologiska egenskaper. Till exempel är inkorporering av de två subenheterna känt för att vara en förutsättning för den synaptiska lokalisering av GABA A-Rs medan subenheten är nästan uteslutande närvarande i extrasynaptic GABA A Rs. Receptorerna som innehåller endast αβ kombinationer också tänkt att vara övervägande lokaliserad till extrasynaptic domänerna 12- 14. Huruvida denna specificitet bibehålls i vår samodlingssystemet kan lätt testas genom transient transfektion 2 eller subenhet cDNA i HEK293 cellinjer stabilt uttrycker α och β-subenheter, innan du lägger dem till neuronala kulturer. Våra preliminära experiment med användning av denna metod har föreslagit att synaptiska kontakter bildas lätt endast i närvaro av 2-subenheten, vilket indikerar att den specificity observerats in vivo är troligen bevaras in vitro (data ej visade).

Dessutom är GABA A skivor som innehåller olika α subenheter selektivt lokaliserad till synaptiska kontakter som bildas med specifika typer av presynaptiska neuroner. Till exempel i globus pallidus, den α1-GABA A Rs allmänhet finns på striatopallidal (str-GP) och palliopallidal (GP-GP) synapser, som ligger på dendriter och somatiska regioner av medel taggiga nervceller, respektive. De α3-GABA A R låg i perisomatic regioner av medel taggiga nervceller och kontaktas av lokala GP axon säkerheter, medan α2-GABA A R låg på distala dendriter av dessa neuroner och kontaktade främst av insatsvaror från striatum 32. Uttryck av specifika α subenheter i olika typer av synapser och på olika neuronala fack har också påvisats i andra områden i hjärnan, såsom Hippocampus 21 och neocortex 18,20. Dessa fynd ger upphov till frågan om hur de specifika hämmande synapser bildas i hjärnan. Har vidhäftningen av en viss typ av presynaptiska terminal framkalla det införs särskilda GABA A R subtyper i kontaktpunkterna? Är receptorerna smugglas till specifika subcellulära platser enligt deras subenhet sammansättning, där deras plasmamembran insättning är en förutsättning för vidhäftning av axonal terminaler specifika ursprung? Hittills har dessa frågor förblir obesvarade. Användningen av reducerade modellsystem såsom samodlingssystemet modellsystem, tillåter oss att börja svara denna komplicerade frågor, eftersom systemet är lätta att transfektion av DNA-konstruktioner och tillämpning av reagens och, viktigare, är den lämplig för levande cell imaging analys 30. Således, med hjälp av denna modell system som vi kan börja testa rollen av enskilda molekyler, inklusive olika typer av GABA A Rs, vetn att närvara vid synaptiska kontakter. En annan fördel är att synapser i detta modellsystem formulär snabbt, inom några minuter till timmar, minska varaktigheten av experiment. Liknande samodling modellsystem har med framgång använts i det förflutna för att screena för de nya synaptogenic molekylerna 27,37,38.

Att förstå hur det centrala nervsystemet utvecklas, mognar och bildar kopplingar mellan nervceller så intrikat att kontrollera, till exempel, beteende eller kognition, är av grundläggande betydelse. Denna avlägsna mål kan bara uppnås genom att avgränsa de molekylära mekanismer som styr de enskilda stegen i erkännande och cell till cell kommunikation under utveckling. På grund av ren komplexitet, kan de molekylära detaljerna i dessa multipla cellulära interaktioner närvarande studeras med precision endast i minskade system. Emellertid är förmågan att öka komplexiteten i dessa system genom att uttrycka multipla kombinationer av proteiner och studerar hurde interagerar har vissa fördelar i jämförelse med till exempel genetiska radering metoder. Detta beror på att den korrekta tolkningen av effekterna av en enda gen deletion ofta äventyras av förändringar i samband med kompensationsmekanismer maskera effekterna av original skador, särskilt i den växande hjärnan. Den enkla men informativa co-kultur teknik som beskrivs här har gjort en upptäckt av den strukturella rollen av GABA A skivor i synaps bildning och öppnade en möjlighet att undersöka hur GABA A RS och celladhesionsmolekyler och / eller synaptiska matris proteiner interagerar med varandra under synaptogenes. Synaptic matrixproteiner är av särskilt intresse med tanke på att de har nyligen visat sig spela en viktig roll i glutamaterg synaps bildning 39. Vidareutveckling av samarbete odlingsmodeller är viktiga eftersom de har potential att förbättra vår kunskap om de molekylära mekanismer som styr den "normala &# 8217; hjärnans utveckling och därmed öka vår förståelse för hur dessa mekanismer förändras i många nervsystemets sjukdomar, såsom epilepsi, schizofreni, autism och många andra.

Acknowledgments

Vi vill tacka för det ekonomiska stödet från MRC Storbritannien (G0800498). Vi vill också tacka professor JM Fritschy, universitetet i Zürich, för att förse GABA A -R subenhet specifik γ2 antikropp och professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, för att tillhandahålla den pcDNA 3.1 (+) expressionsvektorer innehållande antibiotikaresistens gener för produktion av stabilt transfekterade HEK293 cellinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Life Technologies 11960-044 Warm in water bath at 37 °C before use
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10106-169
Neuralbasal Life Technologies 21103-049 Warm in water bath at 37 °C before use
B27 Supplement Life Technologies 17504-044
Glucose Sigma-Aldrich G8769
HBSS (10X) Life Technologies 14180-046
HEPES (1M) Life Technologies 15630-056
PBS (1X) Life Technologies 10010-031
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) Life Technologies V790-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) Life Technologies V860-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) Life Technologies V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1149
G418 disulfate salt (Geneticin) Sigma-Aldrich G5013 Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin) Life Technologies R25001
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 Warm in water bath at 37 °C before use. Danger: irritant.
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Laminin Sigma-Aldrich L2020
100 μm Nylon Cell Strainer VWR 734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich C1768 Danger: Irritant
Chelating agent (Versene) Life Technologies 15040-033
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). Life Technologies 15338-100 Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) Qiagen 301425
Reduced serum medium (Opti-MEM) Life Technologies 11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 Synaptic Systems 105311C5
Neurobasal A Life Technologies 10888-022
Sodium Chloride (NaCl) VWR 27810.364
Glycine Sigma-Aldrich G1726
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody Prof. Jean Marc Fritschy N/A (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100 Promega H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody Merck Millipore MAB351
Mouse anti-synapsin antibody Synaptic Systems 106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) Merck Millipore MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody Professor Anne Stephenson N/A (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody Merck Millipore AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Merck Millipore AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody Life Technologies A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody Life Technologies A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies A11008
Mounting reagent (Prolong Gold) Life Technologies P36930 Use at room temperature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

Tags

Neurovetenskap Develop neurovetenskap synaptogenesis synaptisk inhibition co-kultur stabila cellinjer GABAergic medel taggiga nervceller HEK 293 cellinje
Hämmande Synapse Formation i en Co-kultur Modell Införliva GABAergiska Medium Spiny neuron och HEK293 celler som stabilt uttrycker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson,… More

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson, M. W., Stephenson, F. A., Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors. J. Vis. Exp. (93), e52115, doi:10.3791/52115 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter