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Purifier l'impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d'animaux associés

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l'article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d'approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d'origine animale associée.

Abstract

L'accessibilité de séquençage à haut débit a révolutionné de nombreux domaines de la biologie. Afin de mieux comprendre les communautés microbiennes et virales hôte associé, un flux de travail complet pour extraction de l'ADN et l'ARN a été développé. Le flux de travail génère simultanément de métagénomes virales et microbiennes, ainsi que metatranscriptomes, à partir d'un seul échantillon pour le séquençage de prochaine génération. Le couplage de ces approches donne un aperçu à la fois des caractéristiques taxonomiques et les fonctions communautaires codé. Les méthodes présentées utilisent la fibrose kystique (CF) crachats, un type d'échantillon problématique, car il est exceptionnellement visqueux et contient une quantité élevée de mucines, l'ADN de neutrophiles libre, et d'autres contaminants inconnus. Les protocoles décrits ici ciblent ces problèmes et avec succès récupérer l'ADN viral et microbienne avec une contamination minimale de l'ADN humain. Pour compléter les études de métagénomique, un protocole de metatranscriptomics a été optimisé pour récupérer deux microbienneet l'ARNm hôte qui contient relativement peu de l'ARN ribosomique (ARNr) séquences. Un aperçu des caractéristiques de données est présenté à servir de référence pour évaluer le succès de ces méthodes. Échantillons de crachats CF supplémentaires ont également été recueillies pour (i) évaluer la cohérence des profils sur le microbiome dans sept jours consécutifs dans un seul patient, et (ii) comparer la cohérence de l'approche métagénomique à un séquençage à base de gène ARN ribosomal 16S. Les résultats ont montré que la fluctuation quotidienne des profils microbiens sans perturbation antibiotique était minime et les profils de taxonomie des bactéries communes CF-associés étaient très similaires entre les bibliothèques ADNr 16S et métagénomes générés par la lyse hypotonique (HL) -derived ADN. Toutefois, les différences entre les profils d'ADNr 16S taxonomiques générés à partir de l'ADN total et HL-ADN dérivé suggèrent que la lyse hypotonique et les étapes de lavage à bénéficier non seulement la suppression de l'ADN d'origine humaine, mais également extracellul origine microbiennear ADN qui peuvent déformer les profils microbiens réels.

Introduction

Communautés virales et microbiennes associées avec le corps humain ont été étudiés en détail dans la dernière décennie grâce à l'application des technologies de séquençage 1,2. Les résultats ont conduit à la reconnaissance des microbes d'importance en matière de santé humaine et la maladie. La principale initiative est venue du projet humain de microbiome qui décrit les bactéries (et certains archées) résidant sur ​​la peau humaine, et à l'intérieur des cavités orales, les voies respiratoires, tractus urogénital, tractus gastro-intestinal et 3. D'autres études sur le microbiome de voies respiratoires humains sains par lavage broncho-alvéolaire (LBA) 4,5 et 4 prélèvements nasopharyngés ont montré que le poumon peut servir de dispositif d'échantillonnage de l'environnement, les résultats dans la colonisation microbienne transitoire dans les voies respiratoires. Toutefois, l'incidence de la colonisation microbienne de surfaces des voies aériennes aveugles peut conduire à des infections pulmonaires sévères et chroniques, telles que celles observées dans la fibrose kystique (CF) patients.

t "> CF est une maladie génétique létale provoquée par la mutation dans la fibrose kystique régulateur transmembranaire (CFTR) 6. Ces mutations donnent lieu à des protéines CFTR défectueux qui à son tour affecte le transport des ions transépithélial sur la surface apicale de l'épithélium. La maladie affecte systèmes d'organes multiples, mais la majorité de la mortalité et de la morbidité est imputable à la maladie pulmonaire CF 7. Le FC poumon fournit un écosystème unique pour la colonisation microbienne. Le défaut de transport d'ions provoque le mucus à se accumuler dans les voies aériennes des FC, la création des micro-environnements constitués d'aérobie , microaérophiles ou des compartiments anaérobies ancrés par une surface muqueuse riche en éléments nutritifs statique. Cet environnement facilite la colonisation et la prolifération des microbes, notamment virales, des bactéries et des champignons. aiguë et les infections microbiennes pulmonaires chroniques conduisent à des réponses immunitaires constants mais inefficaces, d'où vaste remodelage des voies respiratoires, perte de capacité pulmonaire, et, finalement, pulmoéchec naire.

Les communautés bactériennes associées au poumon CF ont été bien décrits en utilisant deux approches de la culture-dépendantes et indépendante de la culture, qui comprennent l'aide de l'ARN ribosomal 16S (ARNr) de séquençage des gènes 8 et métagénomique de fusil de chasse 9,10. L'approche fondée sur les ARNr 16S est capable de caractériser un large éventail d'espèces microbiennes et de capturer de vastes changements dans la diversité de la communauté. Toutefois, il est limité dans sa résolution en définissant les collectivités (résumé dans Claesson et al. 2010 11) et les prédictions des potentiels métaboliques sont limités aux fonctions générales connues pour la taxons identifiés. Par conséquent, ARNr 16S méthodes de séquençage de gènes sont insuffisantes pour l'exactitude taxonomique et fonctionnelle analytique nécessaire des diverses communautés microbiennes présentes dans les poumons des FC. L'approche métagénomique décrit ici complète l'approche fondée sur les ARNr 16S, surmonte ses limites, et permet une manière relativement efficaced'analyser à la fois la taxonomie de la communauté microbienne et contenu génétiques dans les poumons des FC.

ADN isolé à partir d'échantillons microbiens d'origine animale associé contient souvent une grande quantité d'ADN de l'hôte. Échantillons d'expectorations ou de tissus du poumon CF contiennent généralement une grande quantité d'ADN humain libérée par les neutrophiles dans la réponse immunitaire, souvent supérieure à 99% de l'ADN total de 12 à 14. Bien que certaines cellules humaines intactes peuvent être présents, plus de cet ADN est libre en solution ou adsorbé à la surface des microbes. En outre, la présence de bouchons de mucus visqueux exceptionnellement, les débris cellulaires et d'autres contaminants inconnus compliquent encore l'isolement de cellules microbiennes. Plusieurs procédés ont été testés pour appauvrissant ces échantillons d'ADN humain, y compris les gradients de Percoll à humain distinct de cellules microbiennes 15, le traitement par la DNase I, du bromure d'éthidium à monoazoture dégrade sélectivement l'ADN humain 16, et le kit MolYsis, le tout avec un succès limité. A ce jour, le procédé de purification plus efficace de l'ADN microbien pour expectorations CF a été une modification du procédé décrit par Breitenstein et coll. (1995) 17. Cette approche, appelée ici méthode de lyse hypotonique (HL), utilise une combinaison de β-mercaptoéthanol pour réduire les liaisons disulfures de mucine, une lyse hypotonique des cellules eucaryotes, et le traitement de l'ADN de la DNase I soluble 9. Malgré l'absence de solutions de rechange la méthode de HL a soulevé certaines préoccupations en raison de (i) de biais possibles résultant de lyse indésirable de microbes et (ii) si les fluctuations observées dans la composition des communautés 9,10 sont un artefact de variations associées avec le traitement des échantillons. En plus de la génération de métagénomes de fusil de chasse, nous abordons ces questions en comparant les profils de gènes ARNr 16S de l'ADN total et de l'ADN microbien extrait de la méthode de HL en utilisant le même ensemble d'échantillons de crachats prélevés chez un seul patient sur sept jours consécutifs.

ent "> Comparé aux communautés microbiennes, la caractérisation des communautés virales associé avec des animaux est limitée 18,19 Les communautés virales dans les voies respiratoires des FC ne ont été caractérisé minimalement 20 -.. 22 La première étude métagénomique caractériser l'ADN des communautés virales des voies respiratoires FC ont montré que la plupart des virus associés aux poumons FC sont phages 20. Le potentiel métabolique de phage dans les FC et les individus non-FC était significativement différente. En particulier, les communautés de phages chez les individus FC réalisées gènes reflète adaptations hôtes bactériennes à la physiologie des voies aériennes des FC, et bactériennes. virulence 20 études métagénomiques ultérieures de virus dans les tissus pulmonaires FC démontré hétérogénéité spatiale distinct de communautés virales entre les régions anatomiques 22. En outre, le tissu pulmonaire FC nourrissait le plus bas diversité virale observée à ce jour dans tout écosystème 22. La plupart des virus identifiés étaient phagesavec le potentiel d'infecter pathogènes FC. Cependant, les virus eucaryotes tels que des virus herpétiques, les adenovirus et les virus du papillome humain (VPH) ont également été détectées. Dans un cas, où kystes dans les tissus pulmonaires ont été observées lors de la dissection, plus de 99% d'un génome de papillomavirus humain a été récupéré, même si le patient n'a jamais été diagnostiqué avec un papillome ou du carcinome pulmonaire. Cela indique que la diversité virale présente non seulement reflète la gravité des lésions tissulaires, mais peut également exposer et expliquer une maladie sous-jacente non caractérisée. Les protocoles décrits ici fournissent un moyen simple, mais puissant pour isoler des particules virales (VLP) à partir d'échantillons constitués de grandes quantités de mucus épais, hôte et des cellules microbiennes, ADN libre, ainsi que les débris cellulaires.

En complément de la métagénomique, metatranscriptomics est utilisé pour suivre la dynamique de l'expression génique dans la communauté microbienne et l'hôte 9,23. Dans ce cas, à la fois microbienne et host ARNm doivent être préférentiellement choisi. Étant donné que les ARNm polyadénylés bactériennes ne sont pas, un procédé déroulant ARNm basée sur oligo-dT ne peut être exploitée. Polyadénylation de l'ARN dépendant de l'amplification peut pas être utilisé dans des échantillons de l'hôte associé si les échantillons sont connues pour contenir de grandes quantités d'ARNm eucaryote. De nombreux échantillons d'origine animale, y compris les expectorations associé CF, contiennent une forte densité de cellules en plus de grandes quantités de débris cellulaires et des nucleases qui comprennent des RNases. Par conséquent, un autre défi est d'éviter une dégradation de l'ARN au cours metatranscriptome traitement. Dans la plupart des cas, l'ARN total extrait de crachats CF est partiellement dégradé, ce qui limite les applications en aval et l'utilité de l'ARN dérivé. Au cours des dernières années, plusieurs approches pour l'ARNr épuisement ont été développés et adaptés dans des kits disponibles dans le commerce. L'efficacité de ces approches est toutefois limitée, en particulier lorsque vous travaillez avec partiellement dégradée ARNr 9,24. Les méthodes employées ici permettented pour la récupération de l'ARN total partiellement dégradé adapté pour aval enlèvement de ARNr totale efficace. La comparaison directe de l'efficacité dans l'élimination de l'ARN total à partir de l'ARNr partiellement dégradé comparant deux kits différents a été illustrée par Lim et al. (2012) 9.

Dans l'ensemble, l'objectif de ce manuscrit est de fournir un ensemble complet de protocoles (Figure 1) pour générer métagénomes virales et microbiennes fusil de chasse, et un metatranscriptome, à partir d'un seul échantillon de l'animal associé, en utilisant échantillon d'expectoration induite comme un exemple. Moléculaire flux de travail du laboratoire devrait inclure des zones pré- et post-amplification séparés pour minimiser la contamination croisée. Les méthodes sont facilement adaptables à d'autres types tels que les tissus 22, du nasopharynx et oropharyngés 25, lavage broncho-alvéolaire (LBA) et le corail (données non publiées) échantillons. Chaque échantillon doit être traité dès la collecte surtout quand métagénomique microbiennes et a rencontréétudes de atranscriptomics sont souhaitées. Si les échantillons ont été congelés, il limite l'isolement de cellules microbiennes intactes pour que le gel métagénomes microbiennes potentiellement perturber l'intégrité cellulaire. Cependant, la congélation ne exclut pas metatranscriptomics et isolement viral, mais la qualité de l'ARN et la quantité de particules virales récupérées peuvent être affectés par le processus de congélation-décongélation. Il est important de noter que l'expectoration induite a servi de principale source d'échantillons dans de nombreuses études associés aux patients atteints de mucoviscidose adultes et d'autres maladies pulmonaires chroniques comme 26,27 BAL peut être trop envahissante. Dans nos études, les échantillons d'expectoration ont été recueillies avec une méthode d'échantillonnage minutieuse et cohérente, ce est à dire, à la suite rince-bouche et le rinçage de la cavité buccale en utilisant une solution saline stérile pour maintenir la contamination des microbes oraux dans les échantillons de crachats au minimum.

Protocol

NOTE: induit échantillons de crachats ont été recueillies conformément à la University of Institutional Review Board de Californie (HRPP 081 500) et le Conseil de San Diego State University Institutional Review (SDSU CISR N ° 2121), par le coordonnateur de la recherche de l'Université de Californie, San Diego (UCSD ) CF adulte clinique.

1. collecte d'échantillons et de pré-traitement (Échantillons de pré-traiter dans les 30 minutes après la collecte)

  1. Avant de goûter à la collecte, l'étiquette quatre tubes de 15 ml que: (i) de métagénome virale, (ii) métagénome microbien, (iii) metatranscriptome, et (iv) des expectorations supplémentaire. Répétez l'opération pour chaque échantillon. Ajouter 2 ml de billes de silice de 0,1 mm dans le tube étiqueté «Metatranscriptome", suivi par 6 ml de tampon de lyse à base d'ARN-isothiocyanate de guanidine (tampon GITC-lyse).
  2. Lors de la collecte de l'échantillon, utiliser une solution saline stérile (60 ml) comme un rince-bouche pour minimiser la contamination par les microbes oraux. Prélever des échantillons de crachats sur une période de temps de 30 min après leinhalation de 4 ml d'une solution saline hypertonique 7% via un nébuliseur. Traitement des échantillons immédiatement, comme décrits ci-dessous.
  3. Diluer l'échantillon à un volume total de 8 ml.
    1. Estimer le volume de l'échantillon en pesant vide crachats tasse avant et après le prélèvement.
    2. Si le volume de l'échantillon est inférieure à 8 ml, ajouter quantité appropriée de 0,02 um 1x PBS filtré pour générer un volume d'échantillon total d'au moins 8 ml.
    3. Immédiatement homogénéiser l'échantillon avec une seringue de 3 ml jusqu'à ce qu'aucun amas visibles restent dans les expectorations
    4. En utilisant la même seringue, élaborer 2 ml de crachats et de procéder immédiatement à l'étape 1.4.
  4. Préserver l'ARN total de l'échantillon d'expectoration
    1. Injecter 2 ml crachats échantillon de l'étape 1.3.4 dans le tube "de metatranscriptome" contenant des billes de silice et le tampon de lyse GITC.
    2. Fermer le couvercle et sceller le tube en toute sécurité avec du Parafilm pour éviter les fuites.
    3. Homogénéiser immédiatement les crachats à vitesse moyenne pendant 10 kmn. Selon le vortex, placer le tube horizontalement et fixer avec du ruban adhésif si nécessaire.
    4. Garder le tube à 4 ° C ou dans une boîte de glace et le transport au laboratoire si nécessaire.
  5. En utilisant la même seringue, aliquote de 2 ml de crachats chacun dans les tubes étiquetés «métagénome virale» et «métagénome microbien» et transférer les crachats reste de la tasse de crachats dans le tube étiqueté «crachats extra".
  6. Conservez tous les tubes à 4 ° C ou la boîte de glace et le transport au laboratoire si nécessaire.

2. Génération virale Metagénome

  1. Préparation de Tampons et solutions
    1. Préparer 50 mM dithiothréitol (DTT) à l'avance et conserver à 4 ° C. Ce est stable pendant deux semaines.
    2. Préparer Saline magnésium (SM) tampon (250 ml): 1 M de NaCl, 10 mM de MgSO 4, 50 mM Tris-HCl; ajuster le pH à 7,4. Stériliser par filtration (0,02 um de taille des pores) et stocker à température ambiante. Préparer DNase I enzyme à 100 U / pl (dans l'eau de qualité moléculaire) à partir de pancréas bovin lyophilisé DNase I selon l'activité définie par Dornase unité / mg de poids sec.
    3. Préparer DNase I 10x tampon (50 ml): 100 mM de MgCl2, 20 mM de CaCl2; ajuster le pH à 6,5. Stériliser par filtration (0,02 um de taille des pores) et stocker à température ambiante.
    4. Préparer 4% de paraformaldéhyde.
    5. Préparer 200x tampon TE: 2 M de Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M d'EDTA. Stériliser par filtration (0,02 um de taille des pores) et stocker à température ambiante.
    6. Préparer 10 ml de 10% de dodécylsulfate de sodium (SDS) avec de l'eau moléculaire de qualité.
    7. Préparer 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. MM NaCl 700) avec de l'eau moléculaire de qualité. Dissoudre CTAB nuit. Si précipités persistent, faire chauffer la solution à 65 ° C. La solution est hautement visqueux dans la température ambiante.
      REMARQUE: La filtration de 0,02 um en utilisant des tampons filtre permet l'élimination des particules pseudo-virales à l'intérieur de la solution, mais pascontamination de l'acide nucléique libre.
  2. Pré-Traitement de l'échantillon
    1. Préparer une quantité appropriée de frais dithiothréitol 6,5 mM (DTT).
    2. Diluer l'homogénat par addition de tampon SM 0,02 um filtré pour produire un volume total de 6 ml.
    3. Pour aider à la dissolution du mucus, ajouter un volume égal (6 ml) 6,5 mM de dithiothréitol (DTT) à l'échantillon, vortex pour mélanger vigoureusement et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    4. Vortex de l'échantillon traité vigoureusement et rotation à 10 ° C, 3056 g pendant 15 à 20 min.
    5. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml.
    6. Répétez l'étape 2.2.3 et 2.2.5 pour l'échantillon suivant.
    7. Transfert et filtrer le surnageant avec un filtre de 0,45 um monté sur une seringue dans un nouveau tube de 15 ml.
      NOTE: Si les sabots de filtre, de récupérer les échantillons provenant de la seringue et omettent l'étape de filtration.
    8. Prenez un sous-échantillon de 100 pi de 0,45 um échantillon filtré, effectuez le chloroforme et le traitement DNase I (voir soiction 2.3.12-2.3.15) et ajouter un volume égal de 4% de paraformaldehyde à fixer l'échantillon pour la microscopie à épifluorescence (figure 2A).
    9. Pour un "fourre-tout" particules virales approche enrichissement (voir Discussion), passez à l'étape 2.3.12 d'omettre la sélection des particules virales sur la base de chlorure de césium gradient ultracentrifugation. Toutefois, cela peut entraîner la contamination bactérienne résistant chloroforme et le montant élevé de l'ADN hôte dans le lysat viral.
  3. Les particules pseudo-virales (VLP) Enrichissement et Purification
    1. Préparer des solutions individuelles chlorure de césium (CsCl) en dissolvant la quantité appropriée de tampon de CsCl avec non filtré SM à la densité souhaitée (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml et 1,2 g / ml). Filtrer chaque solution à travers un filtre de 0,02 um avant utilisation.
    2. Mettre en place un gradient de CsCl comme représenté sur la figure 2B.
    3. Charge 1 ml de 1,7 g / ml dans chaque tube, une charge de 1,5 ml g / ml dans chaque tube, une charge de 1,35 g ml/ ml dans chaque tube, charge 1,2 g / ml dans chaque tube (en option), et enfin charger 6-8 ml d'échantillon dans le tube respectif. Marquer les couches individuelles pour désigner l'emplacement de chaque fraction.
    4. Équilibrer chaque paire opposée de tubes à 1 mg.
    5. Charger soigneusement chaque tube dans le seau de spin. Spin tous les godets même se ils sont vides. Chargez le seau de spin sur le rotor.
    6. Centrifuger à 82 844 g à 4 ° C pendant 2 heures.
    7. Après la centrifugation, retirer soigneusement les tubes de la porte sans perturber les gradients de densité.
    8. Utiliser une seringue de 3 ml avec une aiguille de 18 G, percer le tube juste en dessous du g / ml couche de densité 1,5 (figure 2, flèche rouge) et tirez ~ 1,5 ml dans la seringue.
    9. Recueillir la fraction supérieure en retirant lentement l'aiguille et permettant à la fraction restant dans le tube de se écouler dans un nouveau tube de 15 ml à travers la ponction. Nommez ce "déchets fraction supérieure".
    10. Recueillir le 1,5 g / ml fraction (VLP) contenant de la seringue en éjectant le contenu dans deux nouveaux tubes de microcentrifugation.
    11. Répétez l'étape 2.3.8-2.3.10 pour tous les échantillons.
    12. Ajouter 0,2 volume de chloroforme dans le concentré virale, agiter vigoureusement, incuber à température ambiante pendant 10 min, rotation à une vitesse max pendant 5 min, et recueillir la phase aqueuse.
    13. Ajouter 10x tampon de DNase et de la DNase I (concentration finale = 2,5 U / ul) dans le concentré viral chloroforme-traitée, et incuber à 37 ° C pendant 1,5 à 2 heures.
    14. Inactiver l'activité de la DNase à 65 ° C pendant 15 min.
    15. Retirer 15 pi de la fraction virale chloroforme et traité à la DNase I dans un nouveau tube, et ajouter 15 ul de paraformaldehyde à 4% pour fixer l'échantillon pour la microscopie à épifluorescence.
  4. Extraction de l'ADN
    1. Piscine concentrés viraux provenant de chaque échantillon dans un 50 ml Oak Ridge tube de centrifugation à grande vitesse nettoyés et autoclavés.
    2. Ajouter le texte suivant: tampon TE 200x 0,1 volume, 10 ul d'EDTA 0,5 M par ml de sample, 1 volume de formamide, et 10 ul glycogène. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min.
    3. En utilisant les nouveaux volumes, ajouter 2 volumes de la température ambiante à 100% d'éthanol. Bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant au moins 30 min.
    4. Pellet ADN par centrifugation à 17 226 du tube xg pendant 20 min, à 4 ° C en utilisant un rotor SS-34.
    5. Jeter le surnageant soigneusement à l'aide d'une pipette sérologique. Laver le culot deux fois avec de la glace-éthanol à 70% froid.
    6. Retirez autant de liquide que possible et de permettre le culot sécher à l'air à la température ambiante pendant 15 min.
    7. Remettre en suspension le culot d'ADN dans 567 ul de tampon 1 x TE (pH 8,0).
      REMARQUE: Attendre au moins 15 min pour la remise en suspension complète à la température ambiante. Stocker l'ADN remis en suspension pendant une nuit à 4 ° C jusqu'à traitement ultérieur.
    8. Transférer la totalité de 567 pi de solution d'ADN remis en suspension dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de SDS à 10% préchauffé et 3 l de protéinase K (20 _6; g / ml), bien mélanger et incuber pendant 1 heure à 56 ° C. Préchauffer CTAB / NaCl à 65 ° C.
    9. Ajouter 100 pi de 5 M de NaCl et mélanger soigneusement. Ajouter 80 ul de la solution préchauffée CTAB / NaCl, vortex, et incuber pendant 10 min à 65 ° C.
    10. Ajouter volume égal de chloroforme, vortex pour mélanger, et de spin à 16100 g pendant 5 min.
    11. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter un volume égal de phénol / chloroforme, vortex pour mélanger, et de spin à 16 100 g pendant 5 min.
    12. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter un volume égal de chloroforme, vortex pour mélanger, et de spin à 16 100 g pendant 5 min.
    13. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter un volume égal d'isopropanol à la fraction de surnageant, mélanger et incuber à 20 ° C pendant au moins 30 min.
    14. Pellet l'ADN, tournent à 16 100 g pendant 15 min à 4 ° C. Pipeter avec soin le surnageant et on lave le culot deux fois avec de la glace-éthanol à 70% froid. Effectuer un essorage court et éliminer l'éthanol restant dans le tube. Air sécher le culot pendant 15 min.
    15. Remettre en suspension le culot d'ADN avec 50 ul de tampon d'élution (Tris 5 mM, pH 8,5). Laisser le pellet se réhydrater pendant au moins 5 min à température ambiante.
    16. Quantifier l'ADN en utilisant un dosage à base de fluorescence à haute sensibilité.
  5. Amplification utilisant Phi29 polymérase (Facultatif)
    1. Préparer 2x tampon d'hybridation: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM de MgCl2.
    2. Diluer Phi29 l'ADN polymérase à 5 U / pl.
    3. Tampon d'échantillon de pré-mélange, composé de 50 ul aléatoire amorce hexamère (100 M), 125 tampon de recuit ul 2x, et 25 pi d'eau. Aliquoter et conserver à -20 ° C.
    4. Mémoire tampon de pré-mélange réaction, composé de 100 pi de tampon Phi29 10x, mM dNTP 40 pi 10 et 560 pi d'eau. Aliquoter et conserver à -20 ° C.
    5. Ajouter ADN matrice 1 pi 4 dans un tampon d'échantillon ul.
    6. Incuber ee mélange à 95 ° C pendant 3 minutes et laisser refroidir sur glace.
    7. Ajouter 14 ul de tampon de réaction dans le mélange de 2.4.4, mélanger par pipetage de haut en bas.
    8. Ajouter 1 ul de Phi29 l'ADN polymérase, mélanger par pipetage de haut en bas, et incuber à 30 ° C pendant 18 heures puis de 65 ° C pendant 10 min.
    9. Nettoyer les réactions en utilisant des colonnes d'ADN génomique ou phénol / chloroforme et précipitations à l'éthanol.
  6. Microscopie épifluorescence (Reportez-vous à Haas et al. 2014 28 pour l'installation du système de filtration)
    REMARQUE: Après isolement et purification, la microscopie à épifluorescence avec des colorants d'acides nucléiques peut être utilisée pour vérifier la présence et la pureté des particules virales dans des échantillons (figures 2A et 2C). ADN libre dans l'échantillon peut donner lieu à une forte fluorescence de fond. Par conséquent, l'échantillon doit être DNase I-traité avant la fixation et la coloration pour les micrographies.
    1. Préparer la solution de montage (0,1% d'acide ascorbique, 50% de glycerol). Ajouter 100 ul de 10% d'acide ascorbique à 4,9 ml de solution saline tamponnée 1 x au phosphate (PBS), bien mélanger. Ajouter 5 ml de 100% de glycérol au mélange, bien mélanger et étiqueter le tube comme "monter".
    2. Montage en utilisant un filtre de 0,02 um matrice alumine filtre seringue jetable, aliquote dans des tubes à centrifuger, et conserver à -20 ° C.
    3. Aliquote de 100 ul d'échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse et ajouter du volume égal de 4% de paraformaldéhyde pour fixer les VLP. Incuber le mélange à température ambiante pendant au moins 10 min.
    4. Compléter le volume à 1 ml en ajoutant 800 pi de 0,02 um l'eau filtrée. Ajouter 1 pi de colorant SYBR or dans le tube et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Mettre en place le système de filtration en tournant sur la pompe à vide entre -9 et -10 psi (-62,1 -68,9 et kPa).
    6. Laver le socle avec de l'eau et placez un filtre de matrice d'alumine de 0,02 um avec bague de support en polypropylène annulaire dans le socle de filtre.
    7. Placer une tour de filtration au-dessus du socle de filtre avec le filtre et sécurisé avec une pince.
    8. Introduire à la pipette le contenu du tube de centrifugeuse de 1,5 ml dans la tour de filtre, et attendre quelques minutes pour l'échantillon de filtrer à travers.
    9. Étiquetage et pipette 10 ul de réactif dans un montage lame de microscope.
    10. Laissez le vide sur tout en enlevant la tour de filtre et pince.
    11. Retirez soigneusement le filtre du piédestal de filtre et efface le fond du filtre avec un Kimwipe, puis placez le filtre directement sur le dessus de la montagne sur la lame de microscope.
    12. Pipeter encore 10 ul de réactif de montage sur le filtre et placez une lamelle sur le filtre.

3. Génération microbienne Metagénome

  1. Préparation des solutions tampons et
    1. Préparer 50 ml de tampon DNase 1x: NaAc 50 mM, 10 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2; ajuster le pH à 6,5. Stériliser par filtration (0,22 um) et magasinà la température ambiante.
    2. Préparer DNase I enzyme à 1000 U / pl (dans l'eau de qualité moléculaire) à partir de pancréas bovin lyophilisé DNase I selon l'activité définie par Dornase unité / mg de poids sec.
    3. Préparer 100 ml de tampon SE: 75 mM de NaCl, 25 mM d'EDTA; ajuster le pH à 7,5. Stériliser par filtration (0,22 um) et stocker à température ambiante.
  2. Pré-Traitement de l'échantillon avant l'extraction de l'ADN
    1. Diluer l'homogénat en ajoutant 5 volumes de 0,22 um filtré 1x PBS. Par exemple, ajouter 10 ml de 1 x PBS dans 2 ml d'échantillon.
    2. Ajouter β-mercaptoéthanol à 2% (v / v) de concentration finale. Agitez le mélange (dans la hotte chimique) à la température ambiante pendant 2 heures.
    3. Spin l'échantillon à 10 ° C et 3056 g pendant 15 min et éliminer le surnageant.
    4. Reprendre le culot dans 10 ml d'eau de qualité moléculaire (ou de l'eau filtrée de 0,22 um) et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    5. Répétez les étapes 3.2.3 et 3.2.4 fois.
    6. Spin à 10 ° C et 3056 g pendant 15 min et éliminer le surnageant.
    7. Remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon DNase 1x et ajouter 15 ul de DNase I (1 000 U / pl) par ml d'échantillon.
    8. Incuber à 37 ° C avec mélange répété pendant 2 heures.
    9. Inactiver l'activité de la DNase à 65 ° C pendant 15 min.
    10. Tourner à 10 ° C et 3056 g pendant 15 min et éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 10 ml SE tampon.
    11. Répétez l'étape 3.2.10.
    12. Tourner à 10 ° C et 3056 g pendant 15 min et éliminer le surnageant.
    13. Reprendre le culot dans 2 ml de tampon SE, et transfert à deux des microtubes.
    14. Pellet les cellules dans des tubes de microcentrifugation. Faites tourner les tubes à 16 100 xg à température ambiante pendant 15 min.
    15. Eliminer le surnageant et extraire l'ADN à partir des cellules en granulés en utilisant un kit d'extraction d'ADN génomique, le protocole de variation Gram positif.

4. Génération Metatranscriptome

  1. Échantillon pré-traitement
    1. Effectuer lyse mécanique des cellules de cordon battre dans un tampon de lyse GITC immédiatement après la collecte et l'homogénéisation échantillon. Voir l'étape 1.4.
    2. Faites tourner le mélange à 4 ° C et 600 g pendant 5 min pour sédimenter les billes de silice.
    3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
    4. Ajouter 200 pi de chloroforme pour chaque 750 pi de tampon de lyse GITC utilisés, agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes, incuber à température ambiante pendant 10 min, et de spin à 4 ° C et 3056 g pendant 15 min. Au cours de cette 15 min de spin, se préparer à l'étape 4.2.
    5. Après la rotation 15 min (une séparation claire des formes de phase phase interphase-organiques aqueux), extraire la phase aqueuse (sans perturber l'interphase) dans un nouveau tube (s) RNase-free.
      NOTE: La phase aqueuse contient l'ARN. Gardez les tubes sur la glace jusqu'à ce que la prochaine étape.
  2. Effectuer l'extraction de l'ARN total et la purification en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour la purification de l'ARN ou des colonnes à base de conveNtional ARN précipitation à base d'isopropanol.
    1. basé sur colonne de silice purification d'ARN
      1. Mesurer le volume total de la fraction aqueuse obtenue.
      2. Ajouter le volume approprié de tampon de liaison à l'ARN pour échantillonner et bien mélanger.
      3. Ajuster mélange d'affecter l'état de liaison selon le protocole du fabricant. Bien mélanger et faire un petit tour.
      4. Chargez le mélange dans l'ARN-colonne. Pour un grand échantillon de volume, utilisez le chargement multiple et charger chaque colonne jusqu'à 4x. Sinon, envisagez d'utiliser plusieurs colonnes pour chaque échantillon.
      5. Laver la colonne appropriée selon le protocole du fabricant.
      6. Eluer l'ARN d'au moins 30 ul d'eau exempte de RNase. Double-élution sera légèrement augmenter le rendement en ARN. Cependant, cela va diluer la concentration de l'ARN.
      7. Mesurer la concentration d'ARN et procéder directement à un traitement DNase I. Utilisez le Bioanalyzer pour vérifier la qualité de l'ARN (recommandé).
      8. ARN Précipitations
        1. Ajouter un volume égal d'isopropanol (par exemple, 500 ul d'isopropanol dans 500 ul de la fraction aqueuse) et 2 ul de 10 ug / ul de glycogène RNase-free à l'échantillon.
        2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 min.
        3. Centrifuger à 12 000 x g et 4 ° C pendant 15 min.
        4. Retirer délicatement le surnageant, ajouter 1 ml de RNase 75% d'éthanol. Spin le mélange à 7500 xg et 4 ° C pendant 5 min pour se assurer que la pastille est intact.
        5. Retirez délicatement la éthanol.
        6. Répétez les étapes 4.2.2.4 et 4.2.2.5 fois.
        7. Air sécher le culot pendant 10 min.
        8. Réhydrater le culot dans 50 ul d'eau sans RNase, incuber à 55 ° C pendant 5 minutes et passer directement à un traitement DNase. Utilisez le Bioanalyzer pour vérifier la qualité de l'ARN (recommandé).
        9. Magasin ARN dans des aliquotes à -20 ° C ou -80 ° C pour stockage à long terme.

Representative Results

Métagénomes virales

Crachats CF est exceptionnellement visqueux et contient une grande quantité de mucine et de l'ADN libre (figure 2A); l'ultracentrifugation en gradient de densité facilite l'élimination de l'ADN dérivée de l'hôte (figure 2B). Les résultats d'une étude précédente montrant 9 huit viromes générées par le flux de travail présenté sont résumées ici (tableau 1). Sept échantillons (CF1-D, CF1-E, F-CF1, CF4-B, CF4-C, CF5-A et B-CF5; Tableau 1) ont été traités comme décrit dans la section 2. Les viromes générés contiennent peu (0,02 % -3,7%) des séquences d'origine humaine avec une seule exception près (70%). CF4-A a été omis dans l'étape gradient de densité d'ultracentrifugation (CF4-A) et le virome générés à partir de cet échantillon spécifique contenaient> 97% des séquences d'origine humaine (tableau 1). La figure 2 montre un exemple de l'image de microscopie à épifluorescence d'un typique CF sputum échantillon avant (figure 2A) et après (figure 2C) ultracentrifugation sur gradient de densité. Des particules de type viral (VLP) Effacer ont été observées dans les micrographies sans grosses particules suivant la séparation par gradient de densité. Après extraction de l'ADN VLP, contamination bactérienne est souvent testée à l'aide de l'ADNr 16S amplification avant le séquençage de l'ADN VLP.

Microbiennes métagénomes

Sept échantillons d'expectoration présentées ici ont été recueillies auprès d'un patient CF unique sur sept jours consécutifs. Le patient a commencé le antibiotique oral (ciprofloxacine et la doxycycline) le jour 3 après l'expectoration a été recueillie. Le volume de chaque échantillon d'expectorations recueilli à partir de ce patient était de 15 ml à travers les 7 jours; par conséquent, PBS n'a pas été ajouté à l'échantillon. Le but de cet événement d'échantillonnage était d'évaluer les protocoles présentés dans ce flux de travail en (i) l'évaluation de la fluctuation quotidienne de la structure de la communauté microbienne, et (ii) comparerla structure de la communauté microbienne et la résolution entre la métagénomique et le séquençage de l'ADNr 16S. Par conséquent, l'ADN total et HL-ADN ont été extraits à partir de chaque échantillon.

La concentration HL-ADN de chaque échantillon de crachat après extraction de l'ADN est présentée dans le Tableau 2. Le rendement total de HL-ADN variait de 210 ng à> 5 pg. Bibliothèques de séquençage Illumina ont été générés avec un matériau de départ total de 1 ng de chaque échantillon (figure 3). Les caractéristiques des données de métagénomique sont présentés dans le Tableau 2. Toutes, sauf une bibliothèque ont donné plus de 1 million de séquences et plus de 85% de séquences de haute qualité ont été retenus sur le prétraitement des données en utilisant le logiciel PRINSEQ 29. Tous les ensembles de données ont d'abord été prétraitées à supprimer les doublons et les séquences de faible qualité (quality score minimum de 25), suivie par une nouvelle sélection et la suppression de séquences d'origine humaine à l'aide DeconSeq 30. Le montant de l'homme derivé contamination de séquence est hautement dépendant des propriétés de l'échantillon. Ici, la quantité totale de séquences d'origine humaine a varié de 14 à 46% (tableau 2). Les séquences ont ensuite été prétraités annotées en utilisant le pipeline Metaphlan 31 ainsi que MG-32 RAST serveur.

En plus de métagénomes, les bibliothèques d'amplicon d'ADNr 16S ont été générées à partir de l'ADN total à la fois et HL-ADN via des amorces ciblant environ 300 pb de la région variable V1-V2 dans le gène de l'ARNr 16S 33,34. Les produits de PCR à partir d'échantillons individuels ont été normalisées et mis en commun pour un séquençage en utilisant le cycle Illumina 500 paires de gamme séquençage effectué sur la plate-forme MiSeq. Jumelé de gamme ADNr 16S séquences d'amplicons ont été triées par échantillon par l'intermédiaire des codes à barres en utilisant un script python et l'apparié lectures ont été assemblés à l'aide phrap 35,36. Extrémités de séquence assemblée ont été coupés jusqu'à ce que le score moyen de la qualité a été ≥20 utilise une fenêtre de 5 nt. Chimères potentiels étaient lesn Uchime éliminé en utilisant un sous-ensemble 37 contre-libre chimère des séquences de référence SILVA 38. Taxonomie a été attribuée à la haute qualité lit avec SINA 39 (version 1.2.11) en utilisant les séquences bactériennes 418497 de la base de données SILVA 38. Séquences avec affectations taxonomiques identiques ont été regroupés pour produire des unités taxonomiques opérationnelles (UTO). Ce processus a généré 1.655.278 séquences pour 16 échantillons (de taille moyenne: 103 455 séquences / min; exemples: 72603; max: 127 113). Le marchandises médians pointage de couverture, une mesure de l'exhaustivité de séquençage, était ≥ 99,9%. Le logiciel Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) a été utilisé pour l'analyse et la génération de figure. Alpha-diversité (intra-échantillon) et bêta-diversité (inter-échantillon) ont été calculées dans Explicet au point de 72 603 séquences avec 100 bootstrap rééchantillonnages raréfaction.

La première question visée par cette étude était de savoir si la lyse hypotonique preferentiallié sélectionne pour (ce est à dire, conserve ou lyse préférentiellement) des groupes particuliers de microbes. Après la première lyse hypotonique, culot de cellules remises en suspension ont été échantillonnés à partir des deux premiers échantillons (CF1-1A * et CF1-2A *) à comparer avec les mêmes échantillons après la seconde lyse hypotonique (CF1-1and CF1-2). Tous les échantillons ont été traités de manière égale, ce est-traités à la DNase I avant l'extraction de l'ADN, suivie d'une extraction d'ADN et le séquençage de pipeline. Comme le montre la figure 4, les profils des sous-échantillons microbiens sont très similaires aux échantillons après deux traitements de lyse hypotonique. En outre, la seconde lyse hypotonique augmente la fraction de séquences non humaines par 6-17% dans les métagénomes (tableau 2).

Pour tester les différences de composition microbienne entre metagenomic- et le profilage basé à ADNr 16S, et de changement avant et après lyse hypotonique qui pourraient expliquer les différences précédemment observées entre notre élevages et d'autres, les bibliothèques bactériennes de séquençage d'ADNr 16S ont été générées à partir de l'ADN total à la fois l'ADN et HL-dérivé (Figure 4B). Au niveau du genre, les profils de taxonomie des bactéries FC associée communs tels que Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella, et Streptococcus étaient très similaires entre les bibliothèques ADNr 16S et métagénomes générés à partir de l'ADN de HL-dérivée. Cependant, la détection Rothia dans les bibliothèques ADNr 16S ne était pas aussi abondante que les bibliothèques métagénomiques. Lorsque l'on compare les profils de taxonomiques ADNr 16S générés par l'ADN total et l'ADN HL-dérivée, Pseudomonas a été différemment représenté dans l'ADN total par rapport à l'ADN de départ HL-dérivé de Jour 3.

Metatranscriptomes

Typiquement, l'ARN total extrait à partir de crachat CF est partiellement dégradée et de la taille varie de 25-4,000 bps (figures 5A et et al. 2012 9. La fraction de l'ARNr dans les metatranscriptomes non appauvrie varie de 27 à 83%, et l'abondance relative de l'ARNr variait d'échantillons (tableau 3; données extraites de Lim et al. 9). Toutefois, l'épuisement avec le kit Ribo-Zero a diminué la ARNr abondance relative de l'ARNr de 5.1% à l'exception de l'échantillon CF1-F. La variation de l'efficacité de l'élimination ARNr pourrait refléter la qualité de l'ARN extrait, ou des différences dans la communauté microbienne présente et donc l'accessibilité des ARNr pour les sondes hybridation neuf. Les électrophérogrammes d'un succès (figure 5B) et échec (Figure 5D) ARNr procédure de retrait en utilisant le kit d'enlèvement Ribo-Zero ARNr diffèrent, à laquelle pics ARNr sont visibles dans l'enlèvement infructueuses.

La gamme de la taille des banques d'ADNc geexonéré en reflète souvent la gamme de taille de l'échantillon d'ARN de départ. Les banques d'ADNc présentées ici ont été obtenues avec un ensemble transcriptome kit d'amplification (WTA2) à l'épuisement de l'ARNr suivie par Roche-454 préparation de la bibliothèque de séquençage 9. L'ADNc généré contenir des fragments allant de 50-4,000 bps (figures 5E et 5F) et est très cohérent entre les échantillons (Lim et al. 2012) 9. La disponibilité de l'ARN-Seq autres kits de préparation de bibliothèque spécifiques à la plateforme fournissent actuellement plus d'options alternatives pour une de combiner synthèse d'ADNc et la préparation de la bibliothèque de séquençage dans des conditions optimales. Une option recommandée à ce jour est le kit complet d'or ScriptSeq combinant ARNr réactifs d'élimination recommandées ci-dessus et kit de préparation de la bibliothèque ARN-Seq.

Figure 1
Figure 1: Workflow pour la préparationaration d'échantillons d'accueil associée, comme échantillon de crachat, pour virome, microbiome, et le séquençage de metatranscriptome.

Figure 2
Figure 2: chlorure de césium gradients de densité ultracentrifugation faciliter l'élimination de l'ADN extracellulaire et de grandes particules (A), et pour permettre l'isolement optimal de particules pseudo-virales à partir de crachat CF. Un millilitre de chaque gradient sont posés l'un sur l'autre avant le chargement de l'échantillon pré-traité (B). Particules après isolement et purification, la microscopie à épifluorescence avec des colorants d'acides nucléiques tels que l'or SYBR sont utilisés pour vérifier la présence et la pureté des particules virales dans des échantillons. Des particules de type viral Effacer (C; flèche blanche) ont été observés après la séparation par gradient de densité de CF échantillon de crachat.


Figure 3:. Exemple de la distribution de la taille des bibliothèques Nextera XT générés à partir de 1 ng d'ADN-HL qui a abouti à microbiomes d'expectoration FC normalisation bibliothèque, la mise en commun, et le chargement montant a été effectuée comme décrit dans le protocole du fabricant, sans déviation.

Figure 4
Figure 4: analyse taxonomique des communautés microbiennes dans neuf échantillons prélevés longitudinalement d'un patient d'un FC (A) profils microbiens basés sur les bibliothèques métagénomiques générés à partir d'ADN sur la base de la méthode de lyse-hypotonique.. L'affectation d'espèces a été basée sur les données de pipeline suivante prétraitement Metaphlan que supprimer les doublons et des séquences à faible qualité et homologie de séquence humaine. Afin de montrer que deux-steps lyse hypotonique n'a pas de préférence sélectionne pour des groupes particuliers de microbes, sous-échantillons (*) après le premier lyse hypotonique ont été inclus. (B) profils microbiens fonction de la région V1V2 du séquençage du gène 16S ARNr de l'ADN total (T) et la méthode de lyse hypotonique ADN à base de (HL). Ces données ne ont pas été publiées précédemment.

Figure 5
Figure 5: Exemples de Agilent 2100 électrophérogrammes Bioanalyseur d'ARN (AD) et l'ADNc (EF) généré pour les bibliothèques metatranscriptomic, en utilisant pico de l'ARN et de haute sensibilité puces ADN double brin respectivement. (A) et (C) montrent les exemples de électrophérogrammes avant les procédures de retrait ARNr. Les électrophérogrammes de succès d'un (B) et échec (D) ARNr procédure de retrait en utilisant le kit de suppression totale ARNr diffèrent légèrement, unt qui Rrna pics sont visibles dans l'enlèvement infructueuses. La gamme de taille des ADNc (EF) généré en utilisant le kit d'amplification entier transcriptome (Sigma-Aldrich) est similaire à la gamme de taille de l'ARN ARNr appauvri départ, et très cohérente dans les deux échantillons différents. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Nombre de lectures 224859 87891 106189 93301 140020 1558 272552 217438
Prétraitment lit un 109389 73624 67070 82011 68617 1137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Nombre de bases 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
Longueur moyenne de lecture 432 453 431 337 428 215 441 439
séquences d'accueil b 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0,21% 0,71% 0,04% 97,27% 0,02% 70,10% 0,27% 3,70%
Affichages virales c 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31,99% 6,07% 0,90% 6,77% 1,93% 3,00% 3,78%
Non affecté Lit d 103888 60490 32780 1935 68440 311 105612 119551
94,97% 82,16% 48,87% 2,36% 99,74% 27,35% 48,94% 75,46%
A lit après que les données pré-procéssing par PRINSEQ 29.
b humain lectures identifié par DeconSeq 30 plus lit avec un meilleur succès de BLASTn (base de données de nucléotides NCBI) à l'embranchement des chordés.
c TBLASTX frappe contre la base de données du génome viral en interne. Le pourcentage a été calculé en utilisant le nombre total de lit prétraité.
d Lit sans BLASTn frappé contre la base de données NCBI nucléotidique. Le pourcentage a été calculé en utilisant le nombre total de lit prétraité. Certaines lectures sans BLASTn frappé contre la base de données NCBI nucléotidique ont été identifiés comme virale au niveau de protéines dans l'analyse TBLASTX.

Tableau 1:. Caractéristiques Bibliothèque de huit viromes générés à partir d'échantillons de crachats utilisant flux de travail présenté Ce tableau est extrait de Lim <em> et al. (2012) 9. Sept échantillons (CF1-D, CF1-E, F-CF1, CF4-B, CF4-C, CF5-A, et CF5-B) ont été traités comme décrit dans la section 2 et viromes qui contenaient peu (0,02% généré - 3,7 séquences%) d'origine humaine à une exception près (70%). CF4-A a été omis dans l'étape gradient de densité d'ultracentrifugation (CF4-A) et virome généré contenant> 97% de séquences d'origine humaine.

Échantillon Concentration Rendement total Non Nombre de lectures Nombre total Lit (b transformés) Des séquences non humaines
(Ng / ul) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28,8 2880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24,1 2410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33,6 3360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43,2 4320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57,8 5780 1000174 872036 565376
65%
* 1 ml d'échantillon ont été échantillonnés à partir CF1 -1 Et CF1-2 la suite de la première étape de lyse hypotonique (étape 3.1.5) avant la seconde procédure de lyse hypotonique. Les cellules ont été centrifugées comme décrit dans 3.1.7 et procéder à travers le protocole restant sans aucune modification.
Non traité Illumina un lit un pb séquençage de MiSeq terme 2 x 300.
B se lit ont été évaluées, coupé, et retiré basée sur la qualité et la longueur comme décrit dans la discussion.

Tableau 2:. Caractéristiques de microbiomes générés à partir d'échantillons de crachats à l'aide de flux de travail présenté La concentration d'ADN de chaque échantillon dans 100 ul de tampon d'élution (5 mM de Tris / HCl, pH 8,5) et les caractéristiques des données de séquence sont présentés. Un total de 1 ng a été utilisé pour générer la bibliothèque individu en utilisant le kit de préparation bibliothèque Nextera XT.

0 "fo: keep-together.within-page =" always "> Échantillon CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Traitement Aucun Ribo-Zero Aucun Ribo-Zero Aucun Ribo-Zero Aucun Ribo-Zero Prétraitment lit 2088 1991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 Longueur moyenne de lecture 275 245 262 270 233 259 240 267 Total ARNr lit 1737 91 29499 17267 5285 291 16371 1761 83,20% 4,60% 72,20% 68,40% 26,80% 0,90% 51,50% 4,90% Microbienne ARNr 1414 32 19978 12035 23 227 6916 1076 67,70% 1,60% 48,90% 47,70% 0,10% 0,70% 21,80% 3,00% Eucaryotes ARNr 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15,50% 3,00% 23,30% 20,70% 26,70% 0,20% 29,70% 1,90% % ARNr supprimé * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Non-ARNr lit 351 (16,8%) 1900 (95,4%) 11 377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14 443 (73,2%) 32 446 (99,1%) 15 420 (48,5%) 34 411 (95,1%) Total hits NR 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2857 (11,3%) 4938 (25,0%) 10 751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15 766 (43,6%) Eucaryote 74 407 2790 2524 4614 10227 4553 8274 Bactérien 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Non affecté lit 249 (11,9%) 1209 (60,7%) 8050 (19,7%) 5114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21 695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18 645 (51,5%) * La quantité de l'ARNr retiré En exprimée en pourcentage de la quantité présente dans l'aliquote non appauvrie.

Tableau 3:. Caractéristiques bibliothèque de l'metatranscriptomes avec et sans l'ARNr épuisement Les données sont extraites de Lim et al (2012) 9, qui comporte la comparaison supplémentaire d'autres kits d'enlèvement d'ARNr et l'effet de l'ADNc nébulisation avant la préparation de la bibliothèque de séquençage..

Discussion

La métagénomique virales

Les particules virales sont concentrées en utilisant du polyethylene glycol (PEG) ou de petits concentrateurs de volume. Dans certains cas, la concentration peut ne pas être nécessaire, mais pré-filtration ou étapes de centrifugation basse vitesse sont utilisés pour éliminer les cellules eucaryotes et microbiennes. Lysats viraux seront enrichis et purifiés par gradient de densité 9,41 ultracentrifugation ou des filtres de petite taille (par exemple, 0,45 um) pour éliminer les cellules microbiennes eucaryotes et grandes 25. ultracentrifugation en gradient de densité est généralement effectuée avec des solutions denses mais inertes, tels que saccharose ou du chlorure de césium pour isoler et concentrer les particules virales 41. La séparation physique est basée sur la taille et la densité de flottaison des particules virales. Par conséquent, un choix approprié de la taille des pores du filtre et la préparation rigoureuse des gradients sont essentielles pour isoler les communautés viraux spécifiques, comme le succès de la récupération physique deVLP détermine la communauté isolé 41 (c.-à-particules virales qui ne passent pas par le filtre ou relèvent de la densité de l'extraction ne sera pas détecté dans le métagénome). Après l'isolement du virus et de la concentration, il peut y avoir contamination de matériau non viral génomique présent dans l'échantillon à la fois sous la forme d'acides nucléiques libres et microbiennes et des cellules eucaryotes. Par conséquent, il est essentiel de vérifier la pureté des particules virales dans des échantillons (figures 1A et 1B). Un traitement au chloroforme est généralement utilisé pour lyser les cellules restantes, suivi par traitement à la nuclease pour dégrader les acides nucléiques libres avant l'extraction d'acide nucléique.

Une mise en garde au flux de travail présenté était l'utilisation de gradient de densité de séparation pour isoler des particules virales comme il peut exclure particules virales enveloppées qui peuvent être trop soutenue pour entrer dans le gradient de CsCl. Une alternative "fourre-tout" méthode consiste à omettre le separ de gradient de densitéation et d'isoler l'ADN de la communauté des 0,45 um - filtrats traités avec du chloroforme et DNase I. Cette approche est également approprié pour accueillir petits volumes d'échantillons tels que ceux de tampons ou plasma sanguin. Toutefois, cela peut entraîner la contamination bactérienne du chloroforme et résistant montant plus élevé de l'ADN extracellulaire DNase I résistant.

Protocoles de séquençage actuelles exigent une ng à 1 ug d'acides nucléiques pour la préparation de la bibliothèque de séquençage lequel des rendements plus élevés d'ADN fournissent un plus grand choix d'options de séquençage. La concentration d'ADN de viromes générés varie souvent en dessous de la limite de détection à plus de 200 ng / ul. La quantité d'acides nucléiques viraux récupérés peut être insuffisant pour la préparation de la bibliothèque de séquençage direct. Dans de tels cas, l'amplification de l'acide nucléique est essentielle. Linker amplification shotgun bibliothèques (LASLs) 2,42,43 et l'amplification du génome entier basé sur l'amplification par déplacement multiple (MDA) sont les deuxméthodes les plus couramment utilisées pour générer suffisamment d'ADN pour le séquençage. MDA méthodes telles que celles basées sur l'ADN polymerase Phi29 sont connus pour souffrir d'biais d'amplification, et peuvent amplifier préférentiellement ADNsb et d'ADN circulaire, d'où la non-taxonomique quantitative et la caractérisation fonctionnelle 44,45. Une version optimisée de l'approche LASLs a été montré à introduire seulement biais minimes, favorise une plus grande sensibilité (pour de petites quantités de matière première), et est facilement adapté pour différentes plates-formes de séquençage 43. Cependant, l'approche comporte de nombreuses étapes, nécessite un équipement spécialisé pour minimiser la perte de l'ADN, et est limitée à des modèles de ADNdb. Dans notre laboratoire, cette approche a été adaptée avec succès pour amplifier quantité détectable et indétectable de l'ADN extrait de lavage- broncho, VLP coral- et maritimes provenant de l'eau (non publiées et de Hurwitz et al. 46).

Développer pipelines d'analyse de données a classically été l'un des aspects les plus difficiles de l'analyse virale métagénomique en raison de la nature très diverse et largement inconnu des communautés virales. Bien qu'il existe environ 10 huit génotypes viraux dans la biosphère, à ce jour des bases de données virales actuelles contenir ~ 4000 génomes viraux, soit environ 1 / 100.000ème de cette diversité virale total approximatif. Par conséquent, les recherches par similarité (telles que BLAST 47) pour l'affectation taxonomique et fonctionnelle dans métagénomes virales possèdent défis inhérents. De nombreuses séquences manquer d'avoir des similitudes importantes avec génomes dans la base de données, et par conséquent, sont classés comme inconnu. Bien que les recherches reposant sur ​​l'homologie sont les applications les plus importantes pour l'attribution taxonomie et fonctionnent de séquencer les données, des approches alternatives basées sur l'analyse de base de données indépendante ont été développés 48- 50. Fancello et al. 51 fournissent un examen complet des outils informatiques et des algorithmes utilisés dans viral métagénomique.

Microbienne métagénomique

Typiquement, la quantité totale d'ADN extrait de communautés microbiennes de lyse traité hypotonique (HL-ADN) vont de 20 ng à 5 ug. Le rendement est fortement tributaire de l'état de santé du patient et de la quantité d'échantillon d'expectorations recueilli, ce qui explique les variations observées dans la production totale de HL-ADN extrait dans cette étude (tableau 2). Les étapes essentielles pour générer des données de séquences de bonne qualité se appuient sur ​​la qualité des bibliothèques de séquençage générées. La figure 2 montre une gamme typique de taille pour les bibliothèques de séquençage générées par ADN microbien FC crachats dérivé en utilisant une procédure de fragmentation de l'ADN à base enzymatique. La taille optimale de la bibliothèque dépend du choix de la plateforme de séquençage et d'application, et par conséquent, la procédure de fragmentation peut être optimisé, si nécessaire, par des approches alternatives, telles que la sonication et la nébulisation. En plus deles résultats représentatifs présentés, le succès de la méthode présentée sur crachats FC recueillies auprès de plusieurs patients à travers de multiples points dans le temps est également illustrée dans Lim et al. (2012) 9 et Lim et al. (2014) 10.

Des études antérieures suggèrent que 9,10 chaque patient abrite un ensemble unique de communauté microbienne qui se déplace dans le temps, reflétant ainsi la persistance des acteurs majeurs au sein de la communauté tout fluctuations sont probablement dues à des perturbations telles que les traitements antibiotiques. Que ces fluctuations se produisent quotidiennement, même sans perturbations externes ou en raison de la procédure d'échantillonnage et le traitement de l'échantillon, est toujours en question. Sur la base de la metagénomique HL-ADN et analyse de l'ADNr 16S de l'amplicon, l'échantillonnage longitudinal 7 jours montre que la variation journalière de profils microbiens sans perturbation antibiotique (jour 1, 2 et 3) a été minime (figures 3A et 3B). Dès l'introproduction d'antibiotiques par voie orale immédiatement après l'échantillonnage Jour 3, les changements dans le profil de la communauté est devenu évident lors de la Journée 4. Alors que le antibiotique ciprofloxacine cible un large spectre de bactéries pathogènes connus tels que P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus et la pneumonie, le traitement a augmenté l'abondance relative de P. aeruginosa tout en diminuant le Streptococcus spp. et P. melaninogenica. Par Jour 6, la communauté récupéré lentement à la structure de la communauté de départ initial. Les résultats suggèrent que les fluctuations de profils microbiens dans un seul patient sont plus probablement due à des perturbations de la communauté dans les voies respiratoires.

Compte tenu de la cohérence entre les profils microbiens des bibliothèques et métagénomes ADNr 16S de l'ADN HL dérivés, nous nous sommes prononcés sur les biais provenant des amorces 16S ARNr utilisées dans cette étude. Une explication possible pour les différences observées dans l'ADNr 16S taxonomiqueal profils générés à partir d'ADN et l'ADN total de HL-dérivé (figure 3B) peut être la présence de quantités élevées de Pseudomonas spp. ADN extracellulaire après le traitement antibiotique. Ceci est soutenu par les résultats que ces différences étaient plus apparent au Jour 7, trois jours après le traitement aux antibiotiques, qui vise Pseudomonas spp. en plus des autres. La ciprofloxacine est couramment utilisé comme traitement de première ligne chez les patients atteints de mucoviscidose et P. chronique aeruginosa l'infection, même si son spectre d'activité inclut la plupart des agents pathogènes des FC associée. Nous émettons l'hypothèse que le traitement antibiotique éradique communautés sensibles en incluant Streptococcus spp. et donc la création d'un créneau rempli par P. résistant aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa peut gagner la résistance en augmentant ses communautés des biofilms et de l'ADN extracellulaire a été démontré que le principal soutien structurel de son architecture de biofilm 52. Même en tant que til structure de la communauté récupéré, l'ADN extracellulaire soit restée dans les expectorations FC. Par conséquent, ces données suggèrent que la lyse hypotonique et les étapes de lavage présentés dans ce flux de travail potentiellement bénéficier non seulement de retirer l'ADN d'origine humaine, mais l'ADN extracellulaire également origine microbienne qui peuvent déformer les profils microbiens réels.

Metatranscriptomics

Une haute qualité metatranscriptome doit contenir relativement peu de séquences ARN ribosomique (ARNr) et représentent un échantillonnage biaisé des transcriptions communautaires (ARNm). En raison de la courte demi-vie et de la quantité limitée de l'ARNm, il est essentiel que le protocole, tel que présenté ici, réduit au minimum la manipulation des échantillons de maximiser le nombre de transcrits récupérés.

Au cours des dernières années, plusieurs approches pour l'ARNr épuisement ont été développés et adaptés dans des kits disponibles dans le commerce. Il se agit notamment MICROB Enrich, Ribo-Zero, et spécifique échantillon h soustractiveybridizations 53 qui sont basées sur l'hybridation d'oligonucléotides, et l'ARNm-ONLY kit qui est basée sur l'activité enzymatique de l'ARN exonucléase de ciblage contenant une 'monophosphate 5. En outre, plusieurs approches pour enrichissements ARNm tels que le Kit II-bactéries MessageAmp que polyadenylates préférentiellement et amplifie l'ARN linéaire sont également disponibles. Certaines de ces méthodes (par exemple, ARNm-ONLY, MICROB E xpress et MessageAmp) sont utilisés en même temps pour une efficacité optimale. Cependant, l'efficacité de toutes ces approches sont limitées, en particulier lorsque vous travaillez avec partiellement dégradée ARNr, aussi souvent observé dans l'ARN total extrait à partir d'échantillons FC. Polyadénylation de l'ARN-dépendante amplification ne peut pas être utilisé pour générer metatranscriptomes constitués à la fois de l'ARNm eucaryote et procaryote. En outre, le poly (A) ajouté à la queue les séquences peuvent réduire la quantité de données de séquences utiles. Régions avec des étendues d'homopolymère auront tendance à avoir des scores de qualité inférieure, cAUtilisation un nombre important de lit à filtrer par séquençage et logiciel de post-séquençage, et la durée moyenne de lecture utile après rogner poly (A) queues seront réduits de manière significative 54.

Traiter avec les communautés microbiennes du FC complexes et ARN partiellement dégradé (figures 4A et 4C), notre étude précédente a montré que la méthode d'hybridation de capture par le kit Ribo-Zero or était plus efficace pour éliminer à la fois ARNr humaine et microbienne par rapport aux traitements combiner à l'aide d'autres kits 9 (tableau 3). Les données résultantes permet l'analyse simultanée de deux hôte humain et les transcriptions microbiennes. Selon le rendement et la qualité de l'ARN, ainsi que le choix final de la plate-forme de séquençage, beaucoup de ces procédés comprenant l'étape de synthèse d'ADNc peut être simplifié avec la génération de la bibliothèque de séquençage. Par exemple, l'ARN traité Ribo-Zero peut être utilisé pour faire le séquençage de metatranscriptome libraRies utilisant le kit ScriptSeq ARN-Seq Bibliothèque Préparation.

Analyse métagénomique des communautés animales associées fournit une représentation globale de l'entité fonctionnelle globale qui comprend l'hôte et ses communautés associées. Le flux de travail présenté ici peut être adapté à une variété d'échantillons d'origine animale associée complexes, en particulier ceux qui contiennent du mucus épais, de grandes quantités de débris cellulaires, de l'ADN extracellulaire, les protéines et les complexes glycoprotéiques, ainsi que des cellules hôtes, en plus de la microbienne virale et souhaitée particules. Bien que les particules virales et microbiennes peuvent être perdues à chaque étape, les particules isolement et la purification sont essentiels pour réduire au minimum la quantité d'ADN de l'hôte. Bien que les données de la métagénomique fournit potentiels métaboliques des communautés examinés, metatranscriptomics compléter ce en révélant l'expression différentielle des fonctions codées 9. Une évaluation complète de la génomique et les transcriptions des données a donné de nouvelles insDROITS à la dynamique des interactions communautaires et facilite le développement d'améliorer les thérapies 9,10,55.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé (1 R01 GM095384-01) décerné Forest Rohwer. Nous remercions Epicentre, une société Illumina pour fournir un accès précoce aux kits Ribo-Zero Epidémiologie. Nous remercions Mark Hatay pour la conception et la production du support de tube d'ultracentrifugation. Nous remercions Andreas Haas et Benjamin Knowles pour des lectures critiques et discussions du manuscrit, et Lauren Paul pour aider le processus de tournage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

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