Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rense Impure: Sekvense Metagenomes og Metatranscriptomes fra Komplekse Animal-assosiert Samples

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

Bruke cystisk fibrose airway som et eksempel, presenterer manuskriptet en omfattende arbeidsflyt består av en kombinasjon av metagenomic og metatranscriptomic tilnærminger for å karakterisere mikrobiell og viral lokalsamfunn i dyreassosierte prøver.

Abstract

Tilgjengeligheten av high-throughput sekvensering har revolusjonert mange felt av biologien. For bedre å forstå verts-assosierte virale og mikrobielle samfunn, ble en omfattende arbeidsflyt for DNA og RNA-ekstraksjon utviklet. Arbeidsflyten samtidig genererer viral og mikrobielle metagenomes, samt metatranscriptomes, fra en enkelt prøve for neste generasjons sekvensering. Koblingen av disse metodene gir en oversikt over både de taksonomiske egenskaper og samfunnet kodet funksjoner. De presenterte metoder bruker Cystisk fibrose (CF) oppspytt, en problematisk prøvetype, fordi det er usedvanlig tyktflytende og inneholder høy mengde muciner, gratis nøytrofile DNA, og andre ukjente forurensninger. Protokollen beskrevet her målrette disse problemene og hell gjenopprette viral og mikrobiell DNA med minimal menneskelig DNA forurensning. Å utfylle metagenomikk studiene ble en metatranscriptomics protokoll optimalisert for å gjenopprette både mikrobiellog verts mRNA som inneholder relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser. En oversikt over dataegenskaper er presentert for å tjene som en referanse for å vurdere suksessen av metodene. Andre CF spyttprøver ble også samlet inn til (i) evaluere konsistensen av mikrobiomer profiler innenfor syv påfølgende dager innenfor en enkelt pasient, og (ii) sammenligne konsistensen av metagenomic tilnærming til en 16S ribosomalt RNA gen-basert sekvensering. Resultatene viste at daglig svingning av mikrobielle profiler uten antibiotika perturbasjon var minimal og taksonomi profiler av de vanlige CF-assosierte bakterier var meget lik mellom 16S rDNA-biblioteker og metagenomes generert fra hypotonisk lysis (HL) avledede DNA. Forskjellene mellom 16S rDNA taksonomiske profiler genereres fra total DNA og HL-avledet DNA antyder at hypoton lysis og vasketrinnene nytte på ikke bare å fjerne human-avledet DNA, men også mikrobielt avledede extracellular DNA som kan gi feil opplysninger de faktiske mikrobielle profiler.

Introduction

Virale og mikrobielle samfunn er forbundet med det menneskelige legeme har blitt undersøkt i stor utstrekning i det siste tiåret gjennom anvendelse av sekvenseringsteknologi 1,2. Resultatene har ført til anerkjennelse av betydningen mikrober i menneskers helse og sykdom. Storsatsingen kom fra Normalflora prosjekt som beskriver bakterier (og noen archaea) bosatt på menneskelig hud, og innen munnhulen, luftveier, urogenitaltractus, og mage-tarmkanalen tre. Ytterligere mikrobiomer studier av friske mennesker luftveiene gjennom bronchoalveolar lavage (BAL) 4,5 og nasofaryngeale spinner 4 har vist at lungen kan tjene som en miljøprøvetaking enhet, resulterer i forbigående mikrobiell kolonisering i luftveiene. Imidlertid kan virkningen av mikrobiell kolonisering i svekket luftveis overflater føre til alvorlige og kroniske lungeinfeksjoner, slik som de har sett i Cystisk fibrose (CF) pasienter.

t "> CF er en dødelig genetisk sykdom forårsaket av mutasjon i cystisk fibrose transmembranregulator (CFTR) gen 6. Disse mutasjoner gir opphav til defekte CFTR proteiner som i sin tur påvirker transepitelial ionetransport over den apikale overflate av epitel. Sykdommen rammer flere organsystemer, men de fleste av dødelighet og sykelighet skyldes CF lungesykdom 7. CF lunge gir et unikt økosystem for mikrobiell kolonisering. Feilen i ion transport forårsaker slim for å bygge opp i CF luftveiene, noe som skaper microenvironments består av aerobic , mikroaerofile og anaerobe kammer forankret ved en statisk næringsrik slimhinneoverflaten. Dette letter miljø kolonisering og formering av mikroorganismer, inkludert virus, bakterier og sopp. Akutte og kroniske pulmonale mikrobielle infeksjoner føre til konstant men ineffektive immunresponser som resulterer i omfattende luftveis ombygging, tap av lungekapasitet, og til slutt Pulmoordinært fiasko.

Bakteriesamfunn knyttet til CF lunge har blitt godt beskrevet ved hjelp av både kultur-avhengige og kulturuavhengig tilnærminger, som inkluderer hjelp 16S ribosomalt RNA (rRNA) gensekvensering 8 og hagle metagenomikk 9,10. 16S rRNA-basert tilnærming er i stand til å karakterisere et bredt spekter av mikrobielle arter og fange brede skift i samfunnet mangfold. Det er imidlertid begrenset i sitt vedtak i å definere de samfunnene (oppsummert i Claesson et al. 2010 11) og spådommer om metabolske potensialer er begrenset til de generelle funksjoner som er kjent for taxa identifisert. Derfor 16S rRNA-genet sekvenseringsmetoder er utilstrekkelige for den nødvendige taksonomiske og funksjonell analytisk nøyaktigheten av de ulike mikrobielle samfunn stede i CF lungene. Den metagenomic tilnærming beskrevet her utfyller 16S rRNA-basert tilnærming, overvinner sine begrensninger, og gjør det mulig for en relativt effektiv måteå analysere både den mikrobielle samfunn taksonomi og genetiske innholdet i CF lungene.

Mikrobiell DNA isolert fra dyreassosierte prøvene inneholder ofte en vesentlig mengde av vertens DNA. CF-spytt eller lunge vevsprøver inneholder vanligvis en stor mengde av humant DNA utgitt av neutrofiler i immunresponsen, ofte mer enn 99% av den totale DNA-12-14. Selv om noen intakte humane celler kan være tilstede, er det meste av dette DNA fri i løsning eller adsorbert på overflaten av mikrober. I tillegg er nærvær av usedvanlig tyktflytende slim plugger, cellulært avfall og andre ukjente forurensninger ytterligere kompliserer isolering av mikrobielle celler. Flere metoder ble testet for å tappe disse prøver av humant DNA, inkludert Percoll gradienter til separate humane fra mikrobielle celler 15, behandling med DNase I, etidiumbromid monoazide å selektivt degradere human DNA 16, og både Molysis kit, alle med begrenset suksess. Til dags dato har den mest effektive mikrobielle DNA-renseprosedyre for CF-spytt har vært en modifikasjon av fremgangsmåten beskrevet av Breitenstein et al. (1995) 17. Denne tilnærmingen, heri kalt hypotonisk lysis (HL) -metoden, benytter en kombinasjon av β-merkaptoetanol for å redusere slimstoff disulfidbindinger, hypotonisk lysis av eukaryote celler, og DNase I-behandling av oppløselig DNA-9. Til tross for mangelen på alternativer HL metoden reist noen bekymringer på grunn av (i) mulige skjevheter som følge av uønsket lyse av mikrober og (ii) hvorvidt de observerte svingningene i samfunnet sammensetning 9,10 er en gjenstand av variasjoner knyttet til utvalgets behandling. I tillegg til genereringen av hagle metagenomes, tar vi disse problemene ved å sammenligne 16S rDNA-profiler av det totale DNA og mikrobielle DNA ekstrahert fra HL-metoden ved å bruke samme sett av spyttprøver samlet fra en enkelt pasient over syv påfølgende dager.

ent "> Sammenlignet med mikrobielle samfunn, er karakterisering av virus samfunn assosiert med dyr begrenset 18,19 Virus samfunn i CF airways har bare vært preget minimalt 20 -.. 22 Den første metagenomic studien karakteriserer DNA av virus lokalsamfunn i CF airways viste at de fleste virus forbundet med CF lungene er fager 20. Den metabolske potensialet i fag i CF og ikke-CF individer var signifikant forskjellig. Nærmere bestemt fag samfunn i CF individer gjennomført gener reflekterende av bakterielle verts tilpasninger til fysiologi av CF luftveiene, og bakterielle virulens 20. Påfølgende metagenomic studier av virus i CF lungevev demonstrerte tydelig romlig heterogenitet av virus lokalsamfunn mellom anatomiske regioner 22. I tillegg CF lungevev næret den laveste viral mangfold observert hittil i ethvert økosystem 22. De fleste virus identifisert var fagermed potensiale til å infisere CF patogener. Imidlertid ble eukaryote virus som herpesviruses, adenovirus, og human papilloma virus (HPV) også oppdaget. I ett tilfelle hvor cyster i lungevevet ble observert under disseksjon, ble mer enn 99% av et humant papillomavirus genom utvinnes, selv om pasienten aldri ble diagnostisert med en lunge papilloma eller karsinom. Dette tyder på at det virale mangfold tilstede ikke bare gjenspeiler graden av vevsskade, men kan også eksponere og forklare en underliggende uncharacterized sykdom. Protokollen beskrevet her gir en enkel, men effektiv måte å isolere viruslignende partikler (VLP) fra prøver som består av store mengder tykt slim, vert og mikrobielle celler, gratis DNA, samt celleavfall.

Utfyller metagenomikk, er metatranscriptomics brukes til å overvåke dynamikken i genuttrykket over den mikrobielle samfunn og verts 9,23. I dette tilfelle, både mikrobielt og host mRNA må fortrinnsvis valgt. Siden bakterielle mRNAs ikke er polyadenylert, kan en oligo-dT-baserte mRNA pull-down metoden ikke utnyttes. Polyadenylerings-avhengig RNA-amplifikasjon, kan ikke brukes i verts-assosiert prøver hvis prøvene er kjent for å inneholde store mengder av eukaryot mRNA. Mange dyreassosierte prøvene, inkludert CF-spytt, inneholder en høy tetthet av celler, i tillegg til høye mengder av cellerester og nukleaser som inkluderer RNaser. Derfor er en annen utfordrende oppgave å hindre omfattende RNA degradering under metatranscriptome behandling. I de fleste tilfeller total-RNA ekstrahert fra CF-spytt er delvis nedbrutt, noe som begrenser den nedstrøms applikasjoner og nytten av den utledede RNA. I de senere årene har flere tilnærminger for rRNA utarming blitt utviklet og tilpasset i kommersielt tilgjengelige kits. Effekten av disse tilnærmingene er imidlertid begrenset, spesielt ved arbeid med delvis degradert rRNA 9,24. Metodene som benyttes her tillateed for gjenfinning av delvis nedbrutt total RNA egnet for effektiv nedstrøms total rRNA fjerning. Direkte sammenligning av effektiviteten i rRNA fjerning fra delvis nedbrutt total RNA sammenligne to forskjellige kits ble illustrert ved Lim et al. (2012) 9.

Samlet sett er målet med dette manuskriptet for å gi et komplett sett av protokoller (figur 1) for å generere viral og mikrobielle hagle metagenomes, og en metatranscriptome, fra et enkelt dyr-assosiert prøven etter indusert spyttprøve som et eksempel. Molekylær laboratorium arbeidsflyt bør inkludere egne pre- og postforsterkningsområder for å minimere krysskontaminering. Metodene kan enkelt tilpasses andre typer prøve eksempel vev 22, nasofaryngealt og orofaryngeal vattpinner 25, bronchoalveolar lavage (BAL) og koraller (upubliserte data). Hver prøve skal behandles umiddelbart etter samling spesielt når mikrobielle metagenomikk og møtteatranscriptomics studier er ønskelig. Hvis prøvene ble frosset, begrenser det isolering av intakte mikrobielle celler for mikrobielle metagenomes som frysing forstyrre cellens integritet. Imidlertid, frysing ikke til hinder metatranscriptomics og viral isolasjon, men kvaliteten av RNA og mengden av virale partikler utvinnes kan påvirkes gjennom fryse-tineprosessen. Det er viktig å merke seg at indusert sputum har fungert som den primære kilde til prøver i mange studier assosiert med voksne CF-pasienter og andre kroniske lungesykdommer 26,27 som BAL kan være for invasiv. I våre studier ble spyttprøver oppsamlet med en forsiktig og konsistent prøvetakingsmetoden, dvs. følgende munnvann og skylling av munnhulen ved hjelp av steril saltoppløsning for å holde orale mikrober forurensninger innenfor spyttprøver til et minimum.

Protocol

MERK: Indusert sputum prøver ble samlet inn i samsvar med University of California Institutional Review Board (HRPP 081500) og San Diego State University Institutional Review Board (SDSU IRB # 2121), ved forskningskoordinator ved University of California, San Diego (UCSD ) voksen CF klinikken.

1. prøvetaking og Pre-behandling (Pre-treat Prøver innen 30 min etter Collection)

  1. Før prøvetakingen, etikett fire 15 ml rør som: (i) viral metagenome, (ii) mikrobiell metagenome, (iii) metatranscriptome, og (iv) ekstra slim. Gjenta for hver prøve. Tilsett 2 ml 0,1 mm silikakuler inn i røret merket "Metatranscriptome", etterfulgt av 6 ml av guanidinisotiocyanat basert RNA lyseringsbuffer (GITC-lyseringsbuffer).
  2. Under prøvetakingen, bruk steril saltløsning (60 ml) som et munnskyllemiddel for å minimalisere forurensning av orale mikrober. Samle spyttprøver over en 30 min periode etterinnånding av 4 ml 7% hyperton saltløsning via en forstøver. Prosessprøver umiddelbart, som beskrevet nedenfor.
  3. Fortynne prøven til et totalt volum på 8 ml.
    1. Anslå prøvevolum ved veiing tom sputum cup før og etter prøvetaking.
    2. Hvis volumet av prøven er mindre enn 8 ml, tilsett passende mengde på 0,02 um-filtrert 1x PBS for å generere et totalt prøvevolum på minst 8 ml.
    3. Umiddelbart homogenisere prøven med en 3 ml sprøyte inntil ingen synlige klumper forblir i sputum
    4. Bruker samme sprøyte, trekke opp 2 ml spytt og fortsette umiddelbart til trinn 1.4.
  4. Sikrer Total RNA fra spyttprøve
    1. Injiserer 2 ml spyttprøve fra trinn 1.3.4 i "metatranscriptome" rør inneholdende silikaperler og GITC-lyseringsbuffer.
    2. Lukk lokket og forsegle røret sikkert med Parafilm for å unngå lekkasje.
    3. Homogenisere sputum umiddelbart på middels hastighet i 10 min. Avhengig av vortexer tilgjengelig, plasser røret horisontalt og fest med tape hvis det er nødvendig.
    4. Holde røret ved 4 ° C eller i en isboks og transport til laboratoriet om nødvendig.
  5. Ved hjelp av den samme sprøyte, aliquot 2 ml sputum hver i rørene merket "viral metagenome" og "mikrobiell metagenome" og overføre det resterende sputum fra sputum koppen inn i røret merket "ekstra sputum".
  6. Lagre alle rørene ved 4 ° C eller isboks og transport til laboratoriet om nødvendig.

2. Generering Viral Metagenome

  1. Utarbeidelse av buffere og løsninger
    1. Forbered 50 mM dithiothreitol (DTT) i forveien og oppbevares ved 4 ° C. Dette er stabil i 2 uker.
    2. Forbered Saline Magnesium (SM) buffer (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl; justere pH til 7,4. Filter sterilisere (0,02 mikrometer pore størrelse) og oppbevar ved romtemperatur. Forbered DNase I enzym til 100 U / mL (i molekylær klasse vann) fra frysetørket bovint pankreas-DNase I henhold til aktiviteten defineres av Dornase enheter / mg tørrvekt.
    3. Forbered 10x DNase I-buffer (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; justere pH til 6,5. Filter sterilisere (0,02 mikrometer pore størrelse) og oppbevar ved romtemperatur.
    4. Forberede 4% paraformaldehyde.
    5. Forbered 200x TE-buffer: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filter sterilisere (0,02 mikrometer pore størrelse) og oppbevar ved romtemperatur.
    6. Forbered 10 ml 10% Sodium (SDS) ved hjelp av molekylære grade vann.
    7. Forbered 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) med molekylær grade vann. Oppløse CTAB over natten. Hvis bunnfall vedvarer, varme opp løsningen ved 65 ° C. Løsningen er svært tyktflytende i romtemperatur.
      MERK: filtrering av buffere ved hjelp 0,02 um filter tillater fjerning av viruslignende partikler i løsningen, men ikkegratis nukleinsyre forurensning.
  2. Prøven Forbehandling
    1. Forberede passende mengde frisk 6,5 mm dithiothreitol (DTT).
    2. Fortynn homogenatet ved å tilsette 0,02 um-filtrert SM-buffer til et samlet volum på 6 ml.
    3. Til hjelp i slim oppløsning, tilsett likt volum (6 ml) av 6,5 mM ditiotreitol (DTT) til prøven, vortex kraftig for å blande og inkubere i 1 time ved 37 ° C.
    4. Vortex den behandlede prøven kraftig og sentrifugering ved 10 ° C, 3056 x g i 15 til 20 min.
    5. Samle supernatanten til et nytt 15 ml tube.
    6. Gjenta trinn 2.2.3 og 2.2.5 for den neste prøve.
    7. Overføring og filtrere supernatanten med en sprøyte som er montert på et 0,45 um filter til et nytt 15 ml tube.
      MERK: Hvis filter tresko, hente prøver fra sprøyten og utelate filtreringstrinnet.
    8. Ta en 100 mL subsample av 0,45 mikrometer-filtrert prøve, utføre kloroform og behandling DNase (se seDette skjer 2.3.12-2.3.15) og legge tilsvarende volum på 4% paraformaldehyde å fikse prøven for epifluorescence mikroskopi (Figur 2A).
    9. For en "catch-all" viruspartikler berikelse tilnærming (se diskusjon), går du til trinn 2.3.12 å utelate viruspartikler utvalg basert på cesiumkloridgradient ultrasentrifugering. Men dette kan resultere i kloroform-motstandsdyktig bakteriell forurensning og høyere beløp av host-DNA i viral lysatet.
  3. Viral lignende partikler (VLP) Enrichment og rensing
    1. Forbered individuelle cesiumklorid (CsCl) løsninger ved å oppløse den riktige mengde av CsCl med ikke-filtrert SM-buffer til den ønskede densitet (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml og 1,2 g / ml). Filtrer hver løsning gjennom et 0,02 um filter før bruk.
    2. Sett opp CsCl-gradient, som vist i figur 2B.
    3. Belastnings 1 ml av 1,7 g / ml i hvert rør, last 1 ml 1,5 g / ml i hvert rør, last 1 ml 1,35 g/ ml i hvert rør, last 1,2 g / ml i hvert rør (valgfritt), og slutt legger 6-8 ml prøve inn i det respektive rør. Marker individuelle lag for å betegne stedet for hver fraksjon.
    4. Balansere hverandre motsatte par av rør til innen 1 mg.
    5. Laste hvert rør forsiktig inn i spinn bøtte. Spinne alle bøtter selv om de er tomme. Laste spin bøtte på rotoren.
    6. Sentrifuger ved 82844 x g ved 4 ° C i 2 timer.
    7. Etter sentrifugering, forsiktig fjerne rørene fra holderen uten å forstyrre tetthetsgradienter.
    8. Ved hjelp av en 3 ml sprøyte med en 18 G nål stikkes hull i røret like under 1,5 g / ml tetthet lag (figur 2, rød pil) og trekk ~ 1,5 ml inn i sprøyten.
    9. Samle øvre fraksjon ved langsomt å fjerne kanylen og slik at den gjenværende fraksjon i røret å dryppe inn i et nytt 15 ml rør gjennom punktering. Merke dette som "øvre brøkdel avfall".
    10. Samle 1,5 g / ml fraction (som inneholder VLP) fra sprøyten ved å ta ut innholdet i to nye mikrofugerør.
    11. Gjenta trinn 2.3.8-2.3.10 for alle prøver.
    12. Legg 0,2 volum kloroform i den virale konsentrat, ristes kraftig, inkuber ved romtemperatur i 10 min sentrifugering ved maksimal hastighet i 5 min, og samle den vandige fase.
    13. Legg 10x DNase buffer og DNase I (endelig konsentrasjon = 2,5 U / pl) i kloroform-behandlede viruskonsentrat, og inkuberes ved 37 ° C i 1,5-2 timer.
    14. Inaktivere DNase-aktivitet ved 65 ° C i 15 min.
    15. Fjerne 15 mL av kloroform og DNase-behandlet viral brøkdel inn i et nytt rør, og legge til 15 mL 4% Paraformaldehyde å fikse prøven for epifluorescence mikroskopi.
  4. DNA Extraction
    1. Basseng virale konsentrater fra hver prøve til en rengjort og autoklaveres 50 ml Oak Ridge høyhastighets sentrifugerør.
    2. Legg til følgende: 0,1 volum 200x TE-buffer, 10 pl 0,5 M EDTA pr ml srikelig, 1 volum av formamid, og 10 ul glykogen. Bland godt og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
    3. Ved hjelp av de nye volumer, tilsett 2 volumer av romtemperatur 100% etanol. Bland godt og inkuber ved 4 ° C i minst 30 min.
    4. Pellet-DNA ved å spinne rør ved 17226 xg i 20 min, ved 4 ° C ved anvendelse av en SS-34 rotor.
    5. Kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en serologisk pipette. Vask pelleten to ganger med iskald 70% etanol.
    6. Fjerne så mye væske som mulig og tillater pelleten lufttørket ved romtemperatur i 15 min.
    7. Resuspender DNA-pelleten i 567 pl av 1x TE-buffer (pH 8,0).
      MERK: La det være minst 15 min for fullstendig resuspensjon ved romtemperatur. Oppbevar det resuspenderte DNA over natten ved 4 ° C inntil videre behandling.
    8. Overfør hele 567 ul av resuspenderte DNA-løsningen inn i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg 30 mL av forvarmet 10% SDS og 3 mL av proteinase K (20 _6; g / ml), blandes grundig og inkuberes i 1 time ved 56 ° C. Pre-varm CTAB / NaCl ved 65 ° C.
    9. Tilsett 100 mL av 5 M NaCl og bland godt. Legg 80 ul av forvarmet CTAB / NaCl-oppløsning, vortex, og inkuber i 10 min ved 65 ° C.
    10. Legg likt volum kloroform, vortex-blandes, og sentrifugering ved 16 100 xg i 5 min.
    11. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg et likt volum fenol / kloroform, vortex-blandes, og sentrifugering ved 16 100 xg i 5 min.
    12. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg et likt volum kloroform, vortex-blandes, og sentrifugering ved 16 100 xg i 5 min.
    13. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg like stort volum av isopropanol til den overliggende fraksjon, blande og inkubere ved -20 ° C i minst 30 min.
    14. Pelletere DNA, sentrifugering ved 16 100 xg i 15 min ved 4 ° C. Pipetter av supernatanten forsiktig og vaske pelleten to ganger med iskald 70% etanol. Utføre en kort sentrifugering og fjerne den gjenværende etanol fra røret. Luft tørke pelleten i 15 min.
    15. Resuspender DNA-pelleten med 50 ul elueringsbuffer (5 mM Tris, pH 8,5). Tillat pelleten å rehydrere i minst 5 minutter i romtemperatur.
    16. Kvantifisere DNA ved hjelp av en høy følsomhet fluorescens-basert analysen.
  5. Forsterkning ved hjelp Phi29 Polymerase (valgfritt)
    1. Forbered 2x sammensmeltningsbuffer: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2.
    2. Fortynne Phi29 DNA polymerase til 5 U / mikroliter.
    3. Pre-miksen prøvebuffer som besto av 50 ul tilfeldig heksamer primer (100 pM), 125 ul 2 x annealing-buffer, og 25 ul vann. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
    4. Pre-miksen reaksjonsbuffer, som består av 100 pl Phi29 10x buffer, 40 pl 10 mM dNTP, og 560 pl vann. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
    5. Tilsett 1 mL mal DNA i 4 mL prøve buffer.
    6. Ruge the blandingen ved 95 ° C i 3 minutter og avkjøles på is.
    7. Legg 14 ul reaksjonsbuffer inn i blandingen fra 2.4.4, bland ved å pipettere opp og ned.
    8. Tilsett 1 mL av Phi29 DNA-polymerase, bland ved å pipettere opp og ned, og inkuber ved 30 ° C i 18 timer fulgt av 65 ° C i 10 min.
    9. Rydd opp reaksjonene ved hjelp genomiske DNA kolonner eller fenol / kloroform og etanolutfellinger.
  6. Epifluorescens Mikroskopi (Se Haas et al. 2014 28 for oppsett filtreringssystem)
    MERK: Etter isolering og rensing, epifluorescens mikroskopi med nukleinsyrefarvestoffene kan brukes for å bekrefte nærværet og renhet av virale partikler i prøvene (figurene 2A og 2C). Fri DNA i prøven kan gi opphav til høy bakgrunnsfluorescens. Derfor bør prøven være DNase-behandlet før fiksering og farging for mikrografer.
    1. Forbered mount løsning (0,1% askorbinsyre, 50% glyserol). Tilsett 100 ul 10% askorbinsyre i 4,9 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), blandes godt. Tilsett 5 ml 100% glyserol til blandingen, bland godt og merke røret som "mount".
    2. Filter montere ved hjelp av en 0,02 mikrometer alumina matrise engangssprøyte filter, delmengde inn mikrofugerør, og oppbevares ved -20 ° C.
    3. Delmengde 100 ul prøve inn i en ny mikrofugerør og legge tilsvarende volum på 4% paraformaldehyde å fikse VLPene. Inkuber blandingen ved romtemperatur i minst 10 min.
    4. Gjøre opp volumet til en ml ved å legge 800 mL av 0,02 mikrometer-filtrert vann. Tilsett 1 mL av SYBR Gold flekken inn i røret og inkuber ved romtemperatur i 10 min.
    5. Sett opp filtreringssystem ved å slå på vakuumpumpen mellom -9 og -10 psi (-62,1 og -68,9 kPa).
    6. Vask pidestall med vann og plassere en 0,02 mikrometer Aluminiumoksydmatriksen filter med ringformet polypropylen støttering inn i filter pidestall.
    7. Plassere et filter tårn på toppen av filter pidestall med filteret og sikkert med en klemme.
    8. Pipette innholdet fra 1,5 ml mikrofugerør inn i filteret tårnet, og la noen få minutter for prøve å filtrere gjennom.
    9. Label og pipette 10 mL av mount reagens i en mikroskopisk lysbilde.
    10. La vakuum på mens du fjerner filteret tårnet og klemme.
    11. Ta forsiktig ut filter fra filter pidestall og blot bunnen av filteret med en Kimwipe, deretter plassere filteret direkte på toppen av fjellet på mikroskopisk lysbilde.
    12. Pipette ytterligere 10 mL av mount reagenset inn i filteret, og sett en dekkglass over filteret.

3. Generering Microbial Metagenome

  1. Utarbeidelse av buffere og løsninger
    1. Forbered 50 ml 1x DNase buffer: 50 mm NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl 2; justere pH til 6,5. Filter sterilisere (0,22 mikrometer) og butikkved romtemperatur.
    2. Forbered DNase I enzym til 1000 U / mL (i molekylær klasse vann) fra frysetørket bovint pankreas-DNase I henhold til aktiviteten defineres av Dornase enheter / mg tørrvekt.
    3. Forbered 100 ml SE buffer: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; justere pH til 7,5. Filter sterilisere (0,22 mikrometer) og oppbevar ved romtemperatur.
  2. Prøven Forbehandling Før DNA Extraction
    1. Fortynn homogenatet ved tilsetning av 5 volumdeler 0,22 um-filtrert 1x PBS. For eksempel legge til 10 ml 1x PBS i 2 ml av prøven.
    2. Legg β-merkaptoetanol til 2% (v / v) sluttkonsentrasjon. Rock blandingen (i den kjemiske hette) ved romtemperatur i 2 timer.
    3. Spinn prøven ved 10 ° C og 3056 x g i 15 min, og supernatanten kastes.
    4. Resuspender pelleten i 10 ml molekyl grade vann (eller 0,22 um filtrert vann), og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    5. Gjenta trinn 3.2.3 og 3.2.4 gang.
    6. Spin ved 10 ° C og 3056 xg i 15 minutter, og kast supernatanten.
    7. Resuspender pelleten i 5 ml 1 x DNase buffer og tilsettes 15 mL DNase I (1000 U / mL) per ml prøve.
    8. Inkuber ved 37 ° C med gjentatt blanding i 2 timer.
    9. Inaktivere DNase-aktivitet ved 65 ° C i 15 min.
    10. Spinne ved 10 ° C og 3056 xg i 15 minutter, og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 10 ml SE buffer.
    11. Gjenta trinn 3.2.10.
    12. Spinne ved 10 ° C og 3056 xg i 15 minutter, og kast supernatanten.
    13. Resuspender pelleten i 2 ml SE buffer, og overført til to mikrofugerør.
    14. Pellet cellene i mikrofugerør. Spinne rørene ved 16.100 xg ved romtemperatur i 15 min.
    15. Fjern supernatanten og pakke DNA fra de pelleterte celler ved anvendelse av en genomisk DNA-ekstraksjon kit, gram-positiv variasjon protokoll.

4. Generere Metatranscriptome

  1. Eksempel Pre-treatment
    1. Utføre mekanisk lyse av cellene ved perle juling i GITC-lysisbuffer umiddelbart etter prøvetaking og homogenisering. Se trinn 1.4.
    2. Spinne blandingen ved 4 ° C og 600 xg i 5 minutter for å pelletere de silikakuler.
    3. Overfør supernatanten til et nytt rør.
    4. Tilsett 200 ul kloroform for hver 750 ul av GITC-lysis buffer som brukes, ristes kraftig for hånd i 15 sekunder, inkuber ved romtemperatur i 10 min og sentrifugering ved 4 ° C og 3056 x g i 15 min. I løpet av denne 15 min spinn, forberede trinn 4.2.
    5. Etter 15 min sentrifugering (en klar separering av vannfase-interfase-organisk fase former), ekstraher den vandige fase (uten å forstyrre interfase) i ny RNase-frie rør (r).
      MERK: Den vandige fasen inneholder RNA. Hold rørene på is til neste trinn.
  2. Utføre total RNA ekstraksjon og rensing ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kolonnebaserte RNA rensing kits eller conventional isopropanol-basert RNA nedbør.
    1. Silika kolonne-basert RNA Rensing
      1. Måle det totale volum av den vandige fraksjon erholdt.
      2. Legg passende volum av RNA-bindingsbuffer for å prøve og bland godt.
      3. Justere blandingen til riktig innbindings tilstand i henhold til produsentens protokoll. Bland godt og gjøre en kort sentrifugering.
      4. Laste blandingen i RNA-kolonnen. For et stort volum prøve, bruke flere lasting og laste hver kolonne opptil 4x. Ellers vurdere å bruke flere kolonner for hver prøve.
      5. Vask kolonnen riktig i henhold til produsentens protokoll.
      6. Eluere RNA med minst 30 ul RNase-fritt vann. Dobbelt eluering du forsiktig øke utbyttet av RNA. Men dette vil fortynne RNA-konsentrasjon.
      7. Mål RNA konsentrasjon og gå direkte til behandling DNase. Bruk Bioanalyzer å sjekke kvaliteten på RNA (anbefales).
      8. RNA Nedbør
        1. Legg et likt volum isopropanol (for eksempel 500 ul av isopropanol i 500 ul av vandige fraksjon) og 2 pl av 10 pg / pl RNase-fritt glykogen til prøven.
        2. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 min.
        3. Sentrifugering ved 12 000 xg og 4 ° C i 15 min.
        4. Fjern forsiktig supernatanten, tilsett 1 ml RNase-fritt 75% etanol. Spinne blandingen ved 7500 xg og 4 ° C i 5 min for å sørge for at pellets er intakt.
        5. Fjern forsiktig etanol.
        6. Gjenta trinn 4.2.2.4 og 4.2.2.5 gang.
        7. Luft tørke pelleten i 10 min.
        8. Rehydrere pelleten i 50 ul RNase-fritt vann, inkuberes ved 55 ° C i 5 minutter og gå direkte til DNase-behandling. Bruk Bioanalyzer å sjekke kvaliteten på RNA (anbefales).
        9. Butikk RNA i alikvoter ved -20 ° C eller -80 ° C for lagring over lang tid.

Representative Results

Virus Metagenomes

CF-spytt er eksepsjonelt tyktflytende og inneholder en høy mengde av mucin og gratis DNA (Figur 2A); den densitetsgradient-ultrasentrifugering muliggjør eliminering av vert-avledet DNA (figur 2B). Resultatene fra en tidligere studie 9 viser åtte viromes generert fra den presenterte arbeidsflyten er oppsummert her (tabell 1). Syv prøver (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, og CF5-B, tabell 1) ble behandlet som beskrevet i kapittel 2. De genererte viromes inneholdt lite (0,02 % -3,7%) human-deriverte sekvenser med bare ett unntak (70%). CF4-A ble utelatt fra densitetsgradient-ultrasentrifugering trinn (CF4-A) og virome generert fra denne bestemte prøven inneholdt> 97% human-deriverte sekvenser (tabell 1). Figur 2 viser et eksempel på epifluorescens mikros bilde av en typisk CF sputum prøven før (figur 2A) og etter (Figur 2C) densitetsgradient-ultrasentrifugering. Klare viruslignende partikler (VLP) ble observert i mikrografer uten store partikler følgende densitetsgradienten separasjon. Etter VLP-DNA-ekstraksjon, er bakteriell forurensning ofte testet ved hjelp av 16S rDNA forsterkning før sekvensering av DNA-VLP-er.

Mikrobielle Metagenomes

Syv spyttprøver som presenteres her ble samlet fra en enkelt CF pasient over syv påfølgende dager. Pasienten startet på oral antibiotika (Ciprofloxacin og Doxycycline) på dag 3 etter sputum ble samlet. Volumet av hver spyttprøve hentet fra denne pasienten var 15 ml i hele syv dager; Derfor, PBS ble ikke tilsatt til prøven. Målet med denne prøvetaking arrangementet var å evaluere protokollene som presenteres i denne arbeidsflyten ved (i) evaluere den daglige svingninger av mikrobiell samfunnsstruktur, og (ii) sammenlignemikrobiell samfunnsstruktur og oppløsning mellom metagenomikk og 16S rDNA sekvensering. Derfor ble samlet DNA og HL-DNA ekstrahert fra hver prøve.

HL-DNA konsentrasjon av hver sputumprøve følgende DNA-ekstraksjon er vist i tabell 2. Det totale utbyttet av HL-DNA varierte fra 210 ng til> 5 ug. Illumina sekvense bibliotekene ble generert med en total utgangsmateriale av 1 ng for hver prøve (figur 3). Egenskapene til de metagenomikk data er presentert i tabell 2. Alle bortsett fra ett bibliotek ga mer enn 1 million sekvenser og mer enn 85% av høy kvalitet sekvenser ble tilbakeholdt på data preprosessering hjelp av PRINSEQ 29 programvare. Alle datasett ble først preprocessed å fjerne duplikater og sekvenser av lav kvalitet (minimum kvalitet score på 25), etterfulgt av ytterligere screening og fjerning av human-deriverte sekvenser ved hjelp DeconSeq 30. Mengden av human-derived sekvens forurensning er svært avhengig av prøveegenskaper. Her er den totale mengde av human-deriverte sekvenser varierte 14-46% (Tabell 2). De forhåndsbehandlet sekvenser ble deretter forsynt med Metaphlan 31 rørledningen samt MG-RAST 32 server.

I tillegg til metagenomes, ble 16S rDNA-biblioteker fragment genereres fra både det totale DNA og HL-DNA via primere målrettet mot omtrent 300 bp av den V1-V2 variabelt område i 16S rRNA-genet 33,34. PCR-produkter fra enkeltprøver ble normalisert og samlet for sekvensering ved hjelp av Illumina 500-syklus parvise end sekvensering utført på MiSeq plattformen. Parvise end 16S rDNA amplicon sekvensene ble sortert etter prøven via strekkoder med en python script og den sammenkoblede leser ble satt sammen ved hjelp phrap 35,36. Sammensatte sekvens ender ble trimmet til den gjennomsnittlige kvaliteten poengsum ble ≥20 ved hjelp av en 5 nt vindu. Potensielle kimærene varn fjernes ved hjelp Uchime 37 mot en chimera-fri undergruppe av SILVA 38 referansesekvenser. Taxanomy ble tildelt den høye kvaliteten leser med SINA 39 (versjon 1.2.11) med 418 497 bakterie sekvenser fra SILVA 38 database. Sekvenser med identiske taksonomiske oppgaver ble gruppert å produsere Operative Taksonomiske Units (Otus). Denne prosessen generert 1.655.278 sekvenser for 16 prøver (gjennomsnittlig størrelse: 103455 sekvenser / sample, min: 72 603, max: 127 113). Den median Varer dekning score, et mål på fullstendigheten av sekvensering, var ≥ 99,9%. Programvarepakken Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) ble brukt for analyse og figur generasjon. Alfa-mangfold (intra-utvalget) og beta-mangfold (inter-utvalget) ble beregnet i Explicet ved vakuum, poenget med 72603 sekvenser med 100 bootstrap re-prøvetakinger.

Det første spørsmålet målrettet av denne studien var om hypoton lyse preferentialliert velger for (dvs. beholder fortrinnsvis eller lyserer) bestemte grupper av mikrober. Etter den første hypoton lysis, ble re-suspendert pelleterte celler delutvalgt fra de to første prøver (CF1-1A * og CF1-2A *) for å sammenligne med de samme prøver etter den andre hypotonisk lysis (CF1-1and CF1-2). Alle prøver ble behandlet likt, dvs. behandlet med DNase I forut for DNA-ekstraksjon, etterfulgt av DNA-ekstraksjon og sekvense rørledningen. Som vist i figur 4, er de mikrobielle profiler av delprøver er meget lik prøvene etter to hypotone lysebehandlinger. I tillegg øker den andre hypoton lysis brøkdel av ikke-humane sekvenser med 6-17% i løpet av de metagenomes (tabell 2).

For å teste for forskjeller i mikrobiell sammensetning mellom metagenomic- og 16S rDNA-baserte profilering, og for endringer før og etter hypoton lyse som kan forklare forskjellene tidligere sett mellom vår studies og andre, ble det bakterielle 16S rDNA-sekvense biblioteker genereres fra både det totale DNA og HL-avledet DNA (figur 4B). På slektsnivå, de taksonomi profiler av de vanlige CF-forbundet bakterier som Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella og Streptococcus var svært lik mellom 16S rDNA biblioteker og metagenomes generert fra HL-avledet DNA. Men Rothia deteksjon i 16S rDNA bibliotekene var ikke så rikt som med metagenomic biblioteker. Ved å sammenligne 16S rDNA-profiler taksonomiske generert fra total DNA og HL-avledet DNA, ble Pseudo differensielt representert i det totale DNA i forhold til HL-avledet DNA starter fra dag 3.

Metatranscriptomes

Typisk er det totale RNA ekstrahert fra CF-spytt er delvis nedbrutt og størrelsen varierer fra 25-4,000 bps (figurene 5A og et al. 2012 9. Fraksjonen av rRNA innen de ikke-utarmet metatranscriptomes varierer 27-83%, og den relative overflod av rRNA varierte over prøvene (tabell 3; data hentet fra Lim et al. 9). Imidlertid uttømming med Ribo-Zero kit redusert rRNAs relative overflod av rRNA til 1-5% med unntak av prøven CF1-F. Variasjonen i effektiviteten av rRNA fjerning kunne gjenspeiler kvaliteten av ekstrahert RNA, eller forskjeller i den mikrobielle fellesskap til stede og således tilgjengeligheten til rRNAs prober for hybridisering 9. De electropherograms av en vellykket (Figur 5B) og mislykket (Figur 5D) rRNA fjerning prosedyren med Ribo-Zero rRNA fjerning kit forskjellig, der rRNA toppene er synlig i mislykket fjerning.

Størrelsesområdet av cDNA-bibliotekene generated reflekterer ofte størrelsesområdet av utgangs RNA-prøven. CDNA bibliotekene som presenteres her ble generert med en hel transkriptom forsterkning kit (WTA2) ved rRNA utarming fulgt av Roche-454 sekvense bibliotek forberedelse 9. CDNA genererte inneholde fragmenter som spenner fra 50-4,000 bps (Tall 5E og 5F) og er svært konsistente på tvers av prøvene (Lim et al. 2012) 9. Tilgjengeligheten av andre plattformspesifikke RNA-Seq bibliotek forberedelse kits tiden gi flere alternative muligheter for en å kombinere cDNA syntese og sekvense bibliotek forberedelse i optimale forhold. En anbefalte alternativet til dags dato er det ScriptSeq Komplett Gold Kit kombinerer rRNA fjerning reagenser anbefalt ovenfor og RNA-Seq bibliotek forberedelse kit.

Figur 1
Figur 1: Arbeidsflyt for prepFraskilling av verts-forbundet prøver, for eksempel spyttprøve, for virome, mikrobiomer, og metatranscriptome sekvensering.

Figur 2
Figur 2: cesiumklorid ultrasentrifugering tetthetsgradienter lette eliminering av ekstracellulært DNA og store partikler (A), og tillater optimal isolering av viruslignende partikler fra CF-spytt. En milliliter av hver gradienten er lagvis oppå hverandre før lasting den forbehandlede prøve (B). Følgende partikler isolering og rensing, epifluorescens mikroskopi med nukleinsyre-fargestoff så som SYBR Gull brukes for å bekrefte nærværet og renhet av virale partikler i prøvene. Ble observert etter densitetsgradient separasjon av CF-spytt prøven; klare viruslignende partikler (hvit pil C).


Figur 3:. Eksempel på størrelsesfordelingen av NextEra XT biblioteker generert fra en ng av HL-DNA som resulterte i CF spytt microbiomes Bibliotek normalisering, pooling, og lasting beløpet ble gjort som beskrevet i produsentens protokoll uten avvik.

Figur 4
Figur 4: Taksonomisk analyse av mikrobielle samfunn i ni prøver samlet inn i lengderetningen fra CF pasient (A) Mikrobielle profiler basert på metagenomic biblioteker generert fra hypoton lysemetode-basert DNA.. Arten Oppdraget var basert på Metaphlan rørlednings følgende data preprosessering som fjerner duplikater og sekvenser med lav kvalitet og menneskelig sekvenshomologi. For å vise at to-steps hypoton lysis ikke fortrinnsvis velges for spesielle grupper av mikrober, delprøver (*) etter den første hypoton lysis ble inkludert. (B) Mikrobielle profiler basert på v1v2 regionen av 16S rRNA-genet fra total DNA-sekvensering (T) og hypotonisk lysis metoden -basert DNA (HL). Disse data er ikke tidligere publisert.

Figur 5
Figur 5: Eksempler på Agilent 2100 Bioanalyzer electropherograms av RNA (AD) og cDNA (EF) genereres for metatranscriptomic biblioteker, ved hjelp av RNA pico og høy følsomhet dsDNA- chips hhv. (A) og (C) viser eksempler på electropherograms før rRNA fjerning prosedyrer. De electropherograms av en vellykket (B) og mislykket (D) rRNA fjerning prosedyre ved hjelp av total rRNA fjerning kit avvike noe, ent som rRNA toppene er synlig i mislykket fjerning. Størrelsen spekter av cDNA (EF) generert ved hjelp av hel-transkriptom forsterkning kit (Sigma-Aldrich) ligner på størrelsen spekter av start rRNA-utarmet RNA, og svært konsistente på tvers av de to forskjellige prøver. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Totalt antall leser 224859 87891 106189 93301 140020 1558 272552 217438
Preprocessed leser en 109389 73624 67070 82011 68617 1.137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Antall baser 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
Bety lese lengde 432 453 431 337 428 215 441 439
Verts sekvenser b 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0.21% 0.71% 0,04% 97,27% 0,02% 70.10% 0.27% 3,70%
Viral hits c 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6.59% 31.99% 6.07% 0,90% 6.77% 1.93% 3.00% 3,78%
Unassigned Leser d 103888 60490 32780 1935 68440 311 105612 119551
94,97% 82,16% 48.87% 2.36% 99,74% 27,35% 48.94% 75,46%
en Leser etter data pre-prosessen;ssing av PRINSEQ 29.
b Menneskelig leser identifisert av DeconSeq 30 pluss leser med et beste BLASTn hit (NCBI nucleotide database) phylum Chordata.
c tBLASTx treffer mot in-house viral genom database. Prosentandelen ble beregnet ved hjelp av det totale antall forhåndsbehandlet leser.
d Leser uten BLASTn truffet mot NCBI nucleotide database. Prosentandelen ble beregnet ved hjelp av det totale antall forhåndsbehandlet leser. Noen leser uten BLASTn truffet mot NCBI nucleotide databasen ble identifisert som viral på proteinnivå i tBLASTx analyse.

Tabell 1:. Bibliotek karakteristikker av åtte viromes generert fra spyttprøver ved presenteres arbeidsflyten Denne tabellen hentet fra Lim <em> et al. (2012) 9. Syv prøver (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, og CF5-B) ble behandlet som beskrevet i punkt 2 og genererte viromes som inneholdt lite (0,02% - 3.7 %) human-avledede sekvenser med ett unntak (70%). CF4-A ble utelatt fra densitetsgradient-ultrasentrifugering trinn (CF4-A), og genereres virome som inneholdt> 97% human-avledede sekvenser.

Sample Konsentrasjon Total Yield Totalt ant Leser Totalt ant Leser (Bearbeidet b) Ikke-menneskelige Sekvenser
(Ng / mL) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28.8 2880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24.1 2410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33.6 3360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43.2 4320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57.8 5780 1000174 872036 565376
65%
* 1 ml prøve ble delutvalgt fra CF1 -1 Og CF1-2 etter den første hypoton lysetrinnet (trinn 3.1.5) før den andre hypoton lyseringsprosedyre. Cellene ble spunnet ned som beskrevet i 3.1.7 og gå gjennom de resterende protokollen uten modifisering.
en Ubehandlet Illumina leser fra en 2 x 300 bp MiSeq sekvense løp.
b Leser ble vurdert, trimmet, og fjernet basert på kvalitet og lengde som beskrevet i diskusjonen.

Tabell 2:. Karakteristika for microbiomes generert fra spyttprøver ved presenteres arbeidsflyt DNA konsentrasjon av hver prøve i 100 ul elueringsbuffer (5 mM Tris / HCl, pH 8,5), og egenskapene til sekvensdata er presentert. Totalt 1 ng ble brukt til å generere enkelte bibliotek bruker NextEra XT bibliotek forberedelse kit.

0 "fo: keep-together.within-side =" always "> Sample CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Behandling None Ribo-Zero None Ribo-Zero None Ribo-Zero None Ribo-Zero Preprocessed leser 2088 1991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 Bety lese lengde 275 245 262 270 233 259 240 267 Total rRNA leser 1737 91 29499 17267 5285 291 16371 1761 83.20% 4,60% 72,20% 68.40% 26.80% 0,90% 51.50% 4,90% Mikrobiell rRNA 1414 32 19978 12035 23 227 6916 1076 67.70% 1,60% 48.90% 47.70% 0,10% 0.70% 21.80% 3.00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15.50% 3.00% 23.30% 20.70% 26.70% 0.20% 29.70% 1.90% % RRNA fjernet * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Non-rRNA leser 351 (16,8%) 1900 (95,4%) 11 377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14 443 (73,2%) 32 446 (99,1%) 15 420 (48,5%) 34 411 (95,1%) Totalt NR treff 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2857 (11,3%) 4938 (25,0%) 10 751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15 766 (43,6%) Eukaryote 74 407 2790 2524 4614 10227 4553 8274 Bakteriell 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Unassigned leser 249 (11,9%) 1209 (60,7%) 8050 (19,7%) 5114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21 695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18 645 (51,5%) * Mengden av rRNA fjernet uttrykt som en prosentandel av mengden som er tilstede i den ikke-utarmet alikvot.

Tabell 3:. Bibliotek karakteristikker av metatranscriptomes med og uten rRNA uttømming Data blir trukket ut fra Lim et al (2012) 9, som har ytterligere sammenligning av andre rRNA fjerningssett og effekten av cDNA forstøvning før sekvense bibliotek preparatet..

Discussion

Viral metagenomikk

Virale partikler er konsentrert ved hjelp av polyetylenglykol (PEG) utfelling eller lite volum konsentratorer. I noen tilfeller kan konsentrasjonen ikke være nødvendig, men før filtrering eller lavhastighetssentrifugering trinn brukes til å fjerne og eukaryote mikrobielle celler. Virale lysater blir ytterligere anriket og renset ved anvendelse av densitetsgradient-ultrasentrifugering 9,41 eller mindre størrelse filtre (f.eks, 0,45 pm) for å fjerne store og eukaryote mikrobielle celler 25. Densitetsgradient-ultrasentrifugering blir vanligvis utført med tette, men inerte oppløsninger som for eksempel sukrose eller cesium-klorid for å isolere og konsentrere viruspartikler 41. Fysisk separering er basert på størrelsen og flytedensitet av virale partikler. Derfor, riktig valg av filter porestørrelse og streng fremstilling av gradienter er nødvendig for å isolere spesifikke virale miljøer, som lykkes i fysisk utvinning avVLPer bestemmer fellesskap isolert 41 (dvs., virale partikler som ikke passerer gjennom filteret eller faller innenfor ekstraksjon densitet vil ikke bli påvist i det metagenome). Etter viral isolasjon og konsentrasjon, kan det være forurensende ikke-viralt genomisk materiale som er tilstede i prøven, både i form av frie nukleinsyrer og mikrobiologisk og eukaryote celler. Derfor er det viktig å kontrollere renheten av virale partikler i prøvene (figur 1A og 1B). En kloroform behandling brukes vanligvis til å lysere gjenværende celler, etterfulgt av nuklease-behandling for å nedbryte frie nukleinsyrer før nukleinsyre-ekstraksjon.

En påminnelse til den presenterte arbeidsflyten var bruken av tettshetsgradient separasjon for å isolere viruspartikler som det kan utelukke omhyllede viruspartikler som kan være for spenstig å gå inn i CsCl gradient. Et alternativ "catch-all" metoden er å utelate densitetsgradienten SEPARasjon og isolere samfunnet DNA fra 0,45 mikrometer - filtratene behandlet med kloroform og DNase I. Denne tilnærmingen er også hensiktsmessig å imøtekomme små prøvevolumer slik som de fra spinner eller blodplasma. Dette kan imidlertid resultere i kloroform-resistente bakterieangrep og høyere mengde av DNase-resistente ekstracellulært DNA.

Nåværende sekvense protokoller krever en ng til 1 mikrogram av nukleinsyrer for sekvense bibliotek forberedelse der høyere DNA gir gi et bredere utvalg av sekvense alternativer. DNA-konsentrasjonen av genererte viromes ofte varierer fra under deteksjonsgrensen til mer enn 200 ng / mL. Mengden av virale nukleinsyrer utvinnes kan være utilstrekkelig for direkte sekvense bibliotek preparat. I slike tilfeller, er nukleinsyre-amplifikasjon avgjørende. Linker forsterkning hagle bibliotek (LASLs) 2,42,43 og hele genomet forsterkning basert på multiple forskyvning forsterkning (MDA) er de tometoder som oftest anvendes for å generere tilstrekkelig DNA for sekvensering. MDA fremgangsmåter slik som de som er basert på Phi29 DNA polymerase er kjent for å lide av forsterknings skjevheter, og kan fortrinnsvis forsterke ssDNA og sirkulært DNA, noe som resulterer i ikke-taksonomisk kvantitativ og funksjonell karakterisering 44,45. En optimalisert versjon av LASLs tilnærming har vist seg å innføre bare minimale skjevheter, fremmer høyere sensitivitet (for små mengder av utgangsmaterialet), og er lett tilpasses for forskjellige sekvenseringsplattformene 43. Imidlertid har tilnærmingen mange trinn, krever spesialisert utstyr for å minimalisere tap av DNA, og er begrenset til dsDNA-maler. I vårt laboratorium har denne løsningen blitt tilpasset for å forsterke detekterbar og detekterbar mengde av DNA ekstrahert fra bronchoalveolar lavage-, coral og sjøvann-avledede VLP (upubliserte og Hurwitz et al. 46).

Utvikle dataanalyse rørledninger har classically vært en av de mest utfordrende aspektene ved viral metagenomikk analyse på grunn av den svært mangfoldig og stort sett ukjent art av de virale lokalsamfunn. Mens det er anslagsvis 10 8 viral genotyper i biosfæren, til dags dato dagens virus databaser inneholder ~ 4000 virale genomer, som er omtrent 1 / 100.000 av dette omtrentlig total viral mangfold. Derfor likheten baserte søk (som BLAST 47) for taksonomisk og funksjonell oppdrag i virus metagenomes besitter iboende utfordringer. Mange sekvenser klarer å ha betydelige likheter med genomer i databasen, og derfor er klassifisert som ukjent. Selv om homologi baserte søk er de viktigste bruksområdene for tildeling taksonomi og fungere å sekvens data, har alternative tilnærminger basert på database-uavhengig analyse blitt utviklet 48- 50. Fancello et al. 51 gir en fullstendig gjennomgang av dataverktøy og algoritmer som brukes i viral metagenomikk.

Mikrobiell metagenomikk

Typisk er den totale mengden av DNA ekstrahert fra hypotone lysebehandlet mikrobielle samfunn (HL-DNA) variere fra 20 ng til 5 ug. Utbyttet er sterkt avhengig av pasientens helsetilstand og mengden av spyttprøve oppsamlet, noe som forklarer de variasjoner sett i det totale utbytte av HL-DNA ble ekstrahert i denne studien (tabell 2). De kritiske trinn for å generere god kvalitet sekvensdata er avhengige av kvaliteten av sekvenserings biblioteker genereres. Figur 2 viser en typisk størrelsesområde for sekvense biblioteker genereres fra CF-spytt-avledet mikrobielle DNA ved hjelp av en enzymatisk baserte DNA-fragmentering prosedyre. Den optimale bibliotekstørrelsen er avhengig av valget av sekvenseringsplattformen og anvendelse, og derfor kan den fragmentering måten optimaliseres, om nødvendig, ved alternative metoder som sonikering og forstøvning. Forutende presenterte representative resultater, er suksessen til den presenterte metoden på CF-spytt samlet inn fra flere pasienter på tvers av flere tidspunkter også illustrert i Lim et al. (2012) 9 og Lim et al. (2014) 10.

Tidligere studier 9,10 tyder på at hver pasient havner et unikt sett av mikrobiell fellesskap som skifter over tid, og dermed reflekterer utholdenhet av de store aktørene i samfunnet mens svingningene skyldes mest sannsynlig forstyrrelser som for eksempel antibiotika behandlinger. Hvorvidt disse svingningene oppstår daglig selv uten eksterne forstyrrelser eller skyldes utvalgsprosedyre og utvalgets behandling, er fortsatt aktuelle. Basert på HL-DNA metagenomic og 16S rDNA-amplikon analyse, viser 7 dagers langsgående sampling at den daglige svingning av mikrobielle profiler uten antibiotika perturbasjon (dag 1, 2 og 3) var minimal (figur 3A og 3B). Ved introduksjon av oral antibiotika umiddelbart etter Dag 3 prøvetaking, endringer i samfunnet profilen ble klart på dag 4. Mens antibiotika ciprofloxacin rettet mot et bredt spekter av kjente bakterielle patogener som P. aeruginosa, Staphylococcus aureus og Streptococcus pneumonia, øket behandlingen den relative overflod av P. aeruginosa mens redusere Streptococcus spp. og P. melaninogenica. Ved dag 6, samfunnet langsomt gjenvinnes til den opprinnelige start fellesskap struktur. Resultatene tyder på at svingninger i mikrobielle profiler innenfor en enkelt pasient er mer sannsynlig på grunn av samfunnet forstyrrelser i luftveiene.

Gitt konsistens mellom de mikrobielle 16S rDNA-profiler av biblioteker og metagenomes fra HL-avledet DNA, styrt vi de skjevheter som stammer fra 16S rRNA-primerne anvendt i denne studien. En mulig forklaring på forskjellene sett over 16S rDNA taksonomiskal profiler genereres fra total DNA og HL-avledet DNA (figur 3B) kan være nærvær av høye mengder av Pseudomonas spp. ekstracellulært DNA etter antibiotikabehandling. Dette understøttes av resultatene at disse forskjellene var mest synlig på dag 7, tre dager etter antibiotika-behandling, som er rettet mot Pseudomonas spp. i tillegg til andre. Ciprofloxacin er ofte brukt som førstelinjebehandling hos pasienter med CF og kronisk P. aeruginosa infeksjon selv om dens spekter av aktivitet inkluderer de fleste CF-assosiert patogener. Vi antok at antibiotikabehandling eradicates mottakelige lokalsamfunn inkludert Streptococcus spp. og dermed skape en nisje fylt av resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa, kan oppnå ved å øke dets motstand biofilm miljøer og ekstracellulært DNA har vist seg å være den viktigste strukturell støtte av sin biofilm arkitektur 52. Selv som tHan samfunnsstruktur restituert, ekstracellulære DNA kan ha forblitt i CF-spytt. Derfor er disse data at hypoton lysis, og vasketrinnene er presentert i denne arbeidsflyten potensielt ha nytte i ikke bare å fjerne human-avledet DNA, men også mikrobielt avledede ekstracellulært DNA som kan uriktige opplysninger om den faktiske mikrobiologiske profiler.

Metatranscriptomics

En høy kvalitet metatranscriptome bør inneholde relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser og representerer en objektiv prøvetaking av felles transkripsjoner (mRNA). På grunn av den korte halveringstiden og begrenset mengde av mRNA, er det kritisk at den protokoll som er presentert her, reduserer prøvehåndtering for å maksimere antallet transkripter gjenvunnet.

I de senere årene har flere tilnærminger for rRNA utarming blitt utviklet og tilpasset i kommersielt tilgjengelige kits. Disse inkluderer Microb Enrich, Ribo-Zero, og sample-spesifikke subtractive hybridizations 53 som er basert på oligonukleotid hybridiseringen, og mRNA-KUN sett som er basert på eksonuklease enzymatisk aktivitet rettet RNA inneholdende et 5'-monofosfat. I tillegg er flere tilnærminger for mRNA enrichments som MessageAmp II-Bakterier Kit som fortrinnsvis polyadenylates og forsterker lineær RNA er også tilgjengelig. Noen av disse metodene (f.eks mRNA-ONLY, Microb E Xpress og MessageAmp) brukes samtidig for optimal effektivitet. Imidlertid er effekten av alle disse tilnærmingene begrenset, spesielt ved arbeid med delvis nedbrutt rRNA, som ofte observert i total RNA hentet fra CF prøver. Polyadenylerings-avhengig RNA-amplifikasjon kan ikke brukes til å generere metatranscriptomes som består av både eukaryot og prokaryote mRNA. I tillegg tilsettes den poly (A) halen til sekvensene kan reduserer mengden av nyttige sekvensdata. Regioner med homopolymere strekninger vil tendens til å ha lavere kvalitet score, cA ved å bruke et betydelig antall leser som skal filtreres ut ved sekvensering og post-sekvensering programvare, og gjennomsnittlig nyttig lese lengde etter trimming av poly (A) haler vil bli redusert betydelig 54.

Håndtere komplekse CF mikrobielle samfunn og delvis degradert RNA (Tall 4A og 4C), vår tidligere studie viste at hybridisering-fangst metode ved Ribo-Zero Gold kit var mer effektiv i å fjerne både menneskelig og mikrobiell rRNA i forhold til de kombinerer behandlinger med andre kits 9 (Tabell 3). Den resulterende data tillater samtidig analyse av både menneskelig vert og mikrobielle transkripsjoner. Avhengig av utbytte og kvalitet av RNA, samt endelig valg av sekvense plattform, kan mange av disse prosesser, inkludert cDNA syntesetrinnet være strømlinjeformet med sekvense bibliotek generasjon. For eksempel kan Ribo-Zero behandlet RNA brukes til å lage metatranscriptome sekvense librarier ved hjelp ScriptSeq RNA-Seq Bibliotek Forberedelse kit.

Metagenomic analyse av dyreassosierte samfunn gir en omfattende fremstilling av den samlede funksjonell enhet som omfatter verts og assosierte lokalsamfunn. Arbeidsflyten presentert her kan tilpasses en rekke komplekse dyreassosierte prøver, spesielt de som inneholder tykt slim, høye mengder av cellerester, ekstracellulært DNA, protein og glykoprotein-komplekser, så vel som vertsceller i tillegg til det ønskede virale og mikrobielle partikler. Selv om virale og mikrobielle partikler kan gå tapt for hvert skritt, partikler isolering og rensing er nødvendig for å minimalisere mengden av vertens DNA. Mens metagenomikk data gir metabolske potensialer av de samfunnene som ble undersøkt, metatranscriptomics utfylle dette ved å avsløre differensial uttrykk for kodede funksjoner 9. En omfattende vurdering av genomikk og transkripsjoner data har gitt nye insights til dynamikken i samfunnet interaksjoner og forenkler utviklingen av bedre behandlinger 9,10,55.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) tildelt Forest Rohwer. Vi takker Epicentre, en Illumina selskap for å gi tidlig tilgang til Ribo-Zero Epidemiologi kits. Vi takker Mark Hatay for design og produksjon av ultrasentrifuge rørholder. Vi takker Andreas Haas og Benjamin Knowles for kritiske lesninger og diskusjoner av manuskriptet, og Lauren Paul for å assistere filming prosessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).

Tags

Molecular Biology virome mikrobiomer metagenomikk metatranscriptomics cystisk fibrose slimhinneoverflaten
Rense Impure: Sekvense Metagenomes og Metatranscriptomes fra Komplekse Animal-assosiert Samples
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M.,… More

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter