Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Abstract

Yüksek verimlilik sıralaması erişilebilirlik biyoloji birçok alanda devrim yarattı. Iyi bir başlangıç ​​ile ilişkili viral ve mikrobiyal topluluklar anlamak için, DNA ve RNA ekstresi için kapsamlı bir iş akışı geliştirilmiştir. iş akışı aynı zamanda, yeni nesil dizileme için, tek bir numuneden virütik ve mikrobik metagenomes yanı sıra metatranscriptomes oluşturur. Bu yaklaşımların birleştirme Taksonomik özellikleri ve toplum kodlanmış fonksiyonların hem genel bir bakış sağlar. o derece ağdalı ve müsinlerin yüksek miktarda, serbest nötrofil DNA ve diğer bilinmeyen kirletici içerdiğinden sunulan yöntemler, Kistik Fibrozis (KF) balgam, sorunlu bir örnek türü kullanın. Burada anlatılan protokoller bu sorunları hedef ve başarılı minimal insan DNA kontaminasyonu ile viral ve mikrobiyal DNA kurtarmak. Metagenomik çalışmaları tamamlamak için, bir metatranscriptomics protokolü hem mikrobik kurtarmak için optimize edildiaz sayıda ribozomal RNA (rRNA) dizileri içerir ve ana oluşturulmaktadır. Veri özellikleri bir bakış yöntemleri başarısını değerlendirmek için bir referans olarak hizmet sunulmaktadır. Ek CF balgamı örnekleri de, (i) bir hastada içinde yedi ardışık gün boyunca mikrobiyomları profilleri tutarlılığını değerlendirmek, ve (ii) bir 16S ribozomal RNA gen temelli sekanslamasına metagenomic yaklaşım tutarlılık karşılaştırma toplanmıştır. Sonuçlar antibiyotik pertürbasyon olmadan mikrobiyal profillerin günlük dalgalanma az ve sık CF-ilişkili bakterilerin taksonomisi profilleri hipotonik lizis (HL) türevi DNA üretilen 16S rDNA kütüphaneler ve metagenomes arasında son derece benzer olduğunu göstermiştir. Hipotonik lizis ve yıkama basamağı, sadece insandan türetilmiş DNA çıkarılması değil yarar göstermektedir Bununla birlikte, 16S rDNA taksonomik profilleri arasındaki fark toplam DNA ve HL-edilen DNA'dan üretilen, aynı zamanda extracellul mikrobiyal türevliGerçek mikrobiyal profilleri yanlış olabilir ar DNA.

Introduction

Insan vücudu ile ilişkili viral ve mikrobiyal topluluklar sekans teknolojilerini 1,2 uygulanması yoluyla, son on yıl içinde yoğun bir şekilde araştırılmıştır. sonuçları insan sağlığı ve hastalıkları önemi mikropların tanınmasına yol açmıştır. büyük girişim, insan derisi üzerinde bulunan bakterileri açıklar insan mikrobiyomları projesi (ve bazı archaea) geldi ve sözlü boşlukların, hava yollarında, ürogenital sistemde, ve gastrointestinal sistem 3 içinde. Bronşalveol lavaj (BAL) 4,5 ve nazofarengeal sürüntü 4 ile sağlıklı insan hava yollarının daha fazla mikrobiyomları çalışmaları akciğer çevre örnekleme cihazı, solunum yollarında geçici mikrobiyal kolonizasyon sonuçları olarak hizmet olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bozulmuş solunum yolu yüzeyleri mikrobiyal kolonizasyon etkisi, Kistik Fibroz (CF) hastalarda görülen gibi ciddi ve kronik akciğer enfeksiyonu, yol açabilir.

t "> CF Kistik Fibrozis Transmembran Regülatör (CFTR) mutasyon geni 6 neden ölümcül bir genetik hastalıktır. Bu mutasyonlar da epitelin apikal yüzeyi boyunca transepitelyal iyon taşıma etkileyen arızalı CFTR proteinleri doğuran. Hastalık etkiler çoklu organ sistemleri, ancak mortalite ve morbidite çoğunluğu CF akciğer hastalığı 7 kaynaklanmaktadır. CF akciğer mikrobiyal kolonizasyon için eşsiz bir ekosistem sunmaktadır. iyon taşınmasında kusur aerobik oluşan mikroçevrelerde oluşturarak, CF hava yollarında kurmak için mukus neden Statik besin yönünden zengin mukoza yüzeyi tarafından demir mikroaerofilik, anaerobik bölmeleri. Bu ortam virüs, bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere kolonizasyon ve mikropların çoğalmasını kolaylaştırır. akut ve kronik akciğer mikrobik enfeksiyonların yapan ve sabit fakat etkisiz immün yanıtlara neden geniş hava yolu yeniden, pulmoner kapasite kaybı ve sonuçta pulmoüriner başarısızlık.

CF akciğer ile ilgili bakteriyel topluma iyi 16S ribozomal RNA (rRNA) ya, gen dizilim 8 ve av tüfeği Metagenomiks 9,10 kullanılarak dahil, her iki kültür bağımlı ve Kültür bağımsız yaklaşımlar kullanılarak tarif edilmiştir. 16S rRNA bazlı bir mikrop türleri geniş bir tanımlama ve topluluk çeşitliliği geniş kaymalar yakalamak edebilmektedir. Ancak, toplulukları tanımlayan kendi çözünürlüğünde sınırlıdır (. Claesson ve ark 2010 11 özetlenmiştir) ve metabolik potansiyellerinin tahminleri belirlenen takson için bilinen genel işlevleri sınırlıdır. Bu nedenle, 16S rRNA gen sıralama yöntemleri CF akciğerlerde bulunan çeşitli mikrobiyal toplulukların gerekli taksonomik ve fonksiyonel analitik doğruluk için yetersizdir. Burada anlatılan metagenomic yaklaşım sınırlamalar üstesinden, 16S rRNA-temelli bir yaklaşım tamamlar ve nispeten etkili bir şekilde sağlarmikrobiyal topluluk taksonomi ve CF akciğerlerde genetik içeriğini hem de analiz etmek.

Hayvan ilişkili örneklerinden izole mikrobiyal DNA, genellikle ana DNA'nın büyük bir miktarda içerir. 14 - CF balgamı veya akciğer doku örnekleri genellikle immün yanıt olarak nötrofiller tarafından serbest insan DNA'sının büyük miktarda, toplam DNA 12 genellikle% 99'undan daha fazlasını ihtiva etmektedir. Bazı bozulmamış bir insan hücreleri mevcut olabilir, ancak bu DNA'nın çoğu çözelti içinde serbest veya mikropların yüzeyine adsorbe edilir. Buna ek olarak, son derece ağdalı mukus tıkaçları, hücresel enkaz ve diğer bilinmeyen kirleticilerin varlığı daha da mikrobiyal hücrelerin izolasyonu zorlaştırıyor. Çeşitli yöntemler seçici insan DNA'sı 16 ve MolYsis kiti, sınırlı başarı ile bütün indirgeme etidyum bromür monoazide mikrobiyal hücrelerin 15 ayrı insan DNase I ile işleme tabi için Percoll gradyenleri dahil olmak üzere insan DNA Bu örnekleri, tüketen için test edildi. CF balgamının için en etkili mikrobiyal DNA saflaştırma prosedürü Bugüne kadar Breitenstein ve arkadaşları tarafından tarif edilen işlemin bir tadilatı olmuştur. (1995) 17. Burada hipotonik lizis (HL) yöntemi olarak bilinen bu yaklaşım, müsin disülfid bağları, ökaryot hücrelerin hipotonik lizis ve çözünebilir DNA 9 DNaz I tedavi azaltmak için β-mercaptoethanol bir kombinasyonunu kullanır. Alternatiflerin olmamasına rağmen HL yöntemi nedeniyle (i) bazı endişeleri istenmeyen mikropların lizisinden ve kaynaklanan olası önyargıları kaldırdı (ii) toplum bileşiminde 9,10 gözlenen dalgalanmalar örnek işleme ile ilişkili varyasyonların bir eserdir olup olmadığını. Av tüfeği metagenomes nesil ek olarak, biz toplam DNA ve yedi gün üst üste genelinde tek bir hastadan toplanan balgam örneklerinin aynı seti kullanarak HL yöntemiyle elde mikrobiyal DNA'nın 16S rRNA gen profilleri karşılaştırarak bu konuları ele.

mikrobiyal topluluklar karşılaştırıldığında ent ">, hayvanlar ile ilgili viral toplulukların karakterizasyonu sınırlı 18,19 CF solunum yollarında virüs topluluklar sadece minimal 20 karakterize edilmiştir -.. 22 CF hava yollarında viral toplulukların DNA karakterize ilk metagenomic çalışma CF akciğerlere ile ilişkili en virüsler fajlar 20 olduğunu gösterdi. CF ve non-CF bireylerde faj metabolik potansiyeli önemli ölçüde farklı oldu. Özellikle, CF bireylerde faj toplulukları CF solunum yollarının fizyolojisine bakteriyel konak uyarlamaları yansıtıcı genleri taşınan, CF akciğer dokusunun virüslerin bakteriyel hastalık oluşturma 20. Daha sonra metagenomic çalışmalar anatomik bölgelerine 22 arasında virüs toplulukları farklı mekansal heterojenlik olduğunu göstermiştir. Ayrıca, CF akciğer dokuları, herhangi bir eko-22 bugüne kadar gözlenen en düşük virüs çeşitlilik barındırmıştır. belirlenmiş olan en virüs fajlar edildipotansiyeline sahip CF patojenleri bulaştırmak için. Bununla birlikte, bu herpes, adenovirüsler ve insan papilloma virüsleri (HPV) gibi ökaryotik virüsler de tespit edilmiştir. Akciğer dokusunda kistler diseksiyonu sırasında gözlendi bir olay, olarak, bir insan papilloma virüsü genomunun fazla% 99 hasta pulmoner papillom veya karsinom tanısı asla olsa bile, elde edildi. Bu viral çeşitlilik, mevcut doku hasarının ciddiyetini yansıtan, aynı zamanda teşhir ve altta yatan hastalığı uncharacterized açıklayabilir sadece gösterir. Burada anlatılan protokollerin kalın mukus, ev ve mikrobiyal hücreleri, serbest DNA, aynı zamanda, hücre kalıntılarının büyük miktarlarda oluşan örneklerinden virüs benzeri partiküller (VLP'ler) izole etmek için basit, ancak güçlü bir yöntem sunar.

Metagenomics tamamlayan metatranscriptomics mikrobiyal eden ve ev sahibi 9,23 gen ekspresyonu dinamikleri izlemek için kullanılır. Bu durumda, her iki mikrobiyal ve HOSt mRNA tercihen seçilmesi gerekir. Bakteriyel mRNAlar poliadenileştirilmiştir olmadığından, bir oligo-dT-tabanlı mRNA açılan yöntemi yararlanılamaz. Numuneler ökaryotik mRNA miktarları ihtiva bilinen durumunda poliadenilasyon bağımlı RNA amplifikasyonu ana ilişkili örneklerde kullanılamaz. CF balgamının dahil olmak üzere birçok hayvan ilişkili örnekleri, RNaz'larına içeren, yüksek hücre kalıntılarının miktarları ve nükleazlardır ek olarak hücrelerin yüksek yoğunluğa içerir. Bu nedenle başka bir zor bir görev metatranscriptome işlem sırasında geniş RNA bozulmasını önlemektir. Pek çok durumda, CF balgamının ekstrakte edilen toplam RNA, elde edilen RNA alt baş uygulamaları ve yardımcı sınırlama kısmen parçalanır. Son yıllarda, rRNA azaltımı için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilen kitler uyarlanmıştır. Bu yaklaşımların etkinliği ancak özellikle kısmen bozulmuş rRNA 9,24 ile çalışırken, sınırlıdır. Burada kullanılan yöntemler izinverimli mansap toplam rRNA çıkarılması için uygun kısmen bozulmuş toplam RNA alımı için ed. İki farklı kitleri karşılaştırarak kısmen bozulmuş toplam RNA'dan rRNA kaldırma verimliliği doğrudan karşılaştırma Lim ve arkadaşları tarafından izah edildi. (2012) 9.

Genel olarak, bu yazının amacı örnek olarak uyarılmış balgam numunesi kullanılarak, tek bir hayvan ile ilişkili örnek protokollerin tam bir set virütik ve mikrobik tüfek metagenomes oluşturmak için (Şekil 1) ve bir metatranscriptome sağlamaktır. Moleküler laboratuvar iş akışı çapraz bulaşmayı en aza indirmek için ayrı öncesi ve sonrası amplifikasyon alanlarını içermelidir. yöntemler, dokusu 22, nazofaringeal ve orofaringeal sürüntü 25, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve mercan (yayınlanmamış veri) gibi diğer örnek türlerine kolaylıkla uyarlanabilir. Her numune toplama üzerine hemen işleme özellikle mikrobiyal metagenomik ve yerine getirilmesi gerekenatranscriptomics çalışmalar arzu edilir. Numuneler dondurulmuş, bu potansiyel hücre bütünlüğünü bozabilir dondurma gibi mikrobiyal metagenomes için temas halindeki mikrobik hücrelerin izolasyonu sınırlar. Bununla birlikte, donma metatranscriptomics ve viral izolasyon ama donma-çözülme süreci etkilenebilir geri kazanılan viral partiküllerin RNA kalitesi ve miktarı engel teşkil etmez. O uyarılmış balgam BAL çok invaziv olabilir gibi erişkin KF hastalarının ve diğer kronik akciğer hastalıkları 26,27 ile ilgili birçok çalışmalarda numunelerin birincil kaynağı olarak görev yapmaktadır dikkat etmek önemlidir. Bizim çalışmalarda, balgam örnekleri gargara ve en az balgam örneklerinin içinde sözlü mikroplar kontaminasyonu tutmak için steril tuzlu su çözeltisi ile ağız boşluğunun durulama sonrasında dikkatli ve tutarlı bir örnekleme yöntemiyle, yani, ile toplanmıştır.

Protocol

NOT: ndüklenmifl balgam Kaliforniya, San Diego Üniversitesi araştırma koordinatörü (UCSD'de tarafından, Kaliforniya Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi (HRPP 081.500) ve San Diego Eyalet Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK 2121 SDSU #) uyarınca toplandı ) yetişkin CF kliniği.

1. Örnek Toplama ve Tedavi öncesi (Koleksiyonu sonra 30 Min içinde Öncesi tedavi Örnekleri)

  1. Önceki örnek için toplama, etiket dört 15 ml tüpler (i), viral metagenome, (ii) mikrobiyal metagenome, (iii) metatranscriptome, ve (iv) ilave balgam. Her bir numune için tekrarlayın. Guanidin izotiyosiyanat RNA dayalı liziz tamponu (GITC-lizis tamponu) 6 ml, ardından "Metatranscriptome" etiketli tüp içine 0,1 mm silis boncuklar 2 ml ilave edilir.
  2. Örnek toplama sırasında, ağız mikroplar tarafından kirlenmesini en aza indirmek için, bir ağız çalkalama suyu gibi steril tuzlu su çözeltisi (60 mi) kullanılır. Sonra 30 dakikalık bir süre boyunca balgam örnekleri toplamakBir püskürtücü ile% 7 hipertonik tuz, 4 ml inhalasyonu. İşlem, örnekler hemen aşağıda tarif edildiği gibi.
  3. 8 ml bir toplam hacme örnek seyreltin.
    1. Öncesi ve numune toplama sonra boş balgam fincan tartılarak örnek hacmi tahmin.
    2. Örneğin hacmi en az 8 mi ise, en az 8 ml toplam numune hacmi oluşturmak için 0.02 um filtreden 1x PBS uygun miktarda.
    3. Hiçbir görünür kümeleri balgam içinde kalır kadar hemen 3 ml şırınga ile örnek homojenize
    4. Balgam 2 ml hazırlamak ve 1.4 adıma hemen geçin, aynı şırınga kullanarak.
  4. Balgam Numune Toplam RNA koruma
    1. Silis boncuklar ve GITC parçalama tampon içeren "metatranscriptome" tüp içine adım 1.3.4 2 mi balgam numunesi enjekte edilir.
    2. Kapağı kapatın ve sızıntıyı önlemek için Parafilm ile güvenli tüp mühür.
    3. 10 mi için orta hızda hemen balgam homojenizen. Mevcut vortexer bağlı, yatay tüp yerleştirmek ve gerekirse bant ile sabitleyin.
    4. Gerekirse laboratuvara buz kutusu ve taşıma 4 ° C'de ya da tüp tutun.
  5. Aynı şırınga, kısım "Viral metagenome" ve "mikrobiyal metagenome" ve "Çok balgam" etiketli bir tüpe balgam fincan kalan balgam transferi etiketlenmiş tüpler içine balgam her biri 2 ml kullanılması.
  6. Gerekirse laboratuara 4 ° C ya da buz kutusu ve nakliye de tüm tüpler saklayın.

2. Yaratma Viral metagenome

  1. Tamponlar ve Çözümleri hazırlanması
    1. 4 ° C'de önceden ve depoda 50 mM ditiotreitol (DTT) hazırlayın. Bu durum 2 hafta boyunca stabildir.
    2. Tuzlu Magnezyum (SM), tampon (250 mi) Hazırlama 1 M NaCI, 10 mM MgSO 4, 50 mM Tris-HCI; pH'ı 7.4'e ayarlayın. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.02 mikron gözenek boyutu) ve mağaza. Ben Dornaz ünitesi / mg kuru ağırlık olarak tanımlanan aktivitesine göre liyofilize sığır pankreas Dnase gelen (moleküler sınıf su içinde) Ben 100 U / ul enzim DNase hazırlayın.
    3. Bir tampon 10x DNase (50 mi) Hazırlama: 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; pH 6,5'e ayarlanır. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.02 mikron gözenek boyutu) ve mağaza.
    4. % 4 paraformaldehid hazırlayın.
    5. 200x TE Tamponu hazırlayın: 2 M Tris-HCl (pH 8.5), 0.2 M EDTA. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.02 mikron gözenek boyutu) ve mağaza.
    6. Moleküler dereceli su ile,% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS), 10 ml hazırlayın.
    7. Moleküler sınıf su kullanarak 50 ml CTAB / NaCl (% 10 CTAB. 700 mM NaCl) hazırlayın. CTAB gecede çözülür. Çökeltiler devam ederse, 65 ° C'de çözüm ısınır. Çözelti, oda sıcaklığında oldukça viskoz.
      NOT: 0.02 um filtre kullanılarak tampon süzme çözeltisi içinde virüs benzeri partiküllerin ayrılmasını sağlar, ancakücretsiz nükleik asit kirlenme.
  2. Örnek Ön arıtma
    1. Taze 6.5 mM ditiyotreitol (DTT), uygun miktarda hazırlayın.
    2. 6 ml 'lik bir toplam hacim oluşturmak için 0.02 um filtreden SM tamponu ilave edilerek Homojenat seyreltin.
    3. Örnek 6.5 mM ditiyotreitol (DTT) eşit bir hacmi (6 mi) ilave mukus çözünmelerine yardımcı olmak için, girdap kuvvetli bir şekilde karıştırın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübasyona.
    4. Vorteks 10 ° C'de kuvvetli bir şekilde muamele edilmiş numune ve sıkma, 15-20 dakika boyunca 3,056 x g.
    5. Yeni 15 ml tüp içine süpernatant toplayın.
    6. Adımı yineleyin 2.2.3 ve sonraki numune için 2.2.5.
    7. Transferi ve yeni bir 15 ml'lik bir tüp içine, bir şırınga üzerine monte edilmiş bir 0.45 um filtre ile süpernatant filtre.
      NOT: Filtre takunya, şırınga numune almak ve filtrasyon adımı atlarsanız.
    8. (Bkz, 0.45 um filtreden numune 100 ul alt-numûnesinin al kloroform ve DNase I tedavi yerine section 2.3.12-2.3.15) ve) Epifloresans mikroskobu (Şekil 2A için örnek düzeltmek için% 4 paraformaldehid eşit hacmi ekleyin.
    9. Bir "catch-all" viral parçacıkların zenginleştirme yaklaşım için (Tartışma), sezyum klorür degrade Ultrasantrifügasyon dayalı viral partiküller seçimi ihmal 2.3.12 adıma gidin. Bununla birlikte, bu kloroform dirençli bakteriyel kontaminasyon ve virüs lizatı konakçı-DNA'nın daha yüksek bir miktarda neden olabilir.
  3. Viral-benzeri partiküller (VLP'ler) zenginleştirilmesi ve saflaştırma
    1. İstenen yoğunluğa filtreden SM tamponu ile CsCl uygun bir miktarının çözülmesiyle tek sezyum klorür (CsCl) çözelti hazırlayın (1.7 ug / ml 1.5 ug / ml, 1.35 ug / ml ve 1.2 ug / ml). Kullanımdan önce bir 0.02 mikron filtre içinden her solüsyonu filtre.
    2. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, bir CsCl gradyanı ayarlayın.
    3. Yük 1.7, 1 ml / ml her bir tüpe, yük 1.5, 1 ml içinde ug / ml her bir tüpe, yükü 1 mi 1.35 g içineHer tüpe / ml (isteğe bağlı), her bir tüpe, yük 1.2 ug / ml ve son olarak söz konusu boru içine 6-8 ml lik bir numuneyi yükleyin. Marka tek tek tabakaların her fraksiyon konumunu göstermek için kullanılır.
    4. 1 mg dahilinde tüplerin her karşıt çifti dengeleyin.
    5. Dikkatle sıkma kova içine her tüp yükleyin. Onlar boş olsa bile, tüm kova Spin. Rotor üzerine sıkma kova yükleyin.
    6. 2 saat süre ile 4 ° C'de 82844 x g'de santrifüjleyin.
    7. Santrifüj sonrasında, dikkatli yoğunluk gradyanları aksatmadan tutucu tüpleri çıkarın.
    8. 18 G iğne ile 3 ml şırınga kullanarak, sadece 1,5 gr / ml yoğunlukta tabakasının altında (Şekil 2, kırmızı ok) tüp delmek ve enjektöre 1.5 ~ ml çekin.
    9. Yavaş yavaş iğne kaldırma ve tüp içinde kalan fraksiyon ponksiyon yoluyla yeni bir 15 ml tüp içine damla izin vererek üst kısmını toplayın. "Üst kısım atık" olarak etiketleyin.
    10. 1.5 ug / ml fractio toplamakn iki yeni mikrofuj tüpleri içine içeriğini püskürtülmesi yoluyla şırınga (VLP'lerini içeren).
    11. Tüm numuneler için yineleyin 2.3.8-2.3.10.
    12. Viral konsantre içine kloroform içinde 0.2 hacim ekleme şiddetle çalkalanır, 5 dakika maksimum hızda, 10 dakika, bir dönüş için oda sıcaklığında inkübe edilir, ve sulu faz toplanır.
    13. Kloroform ile muamele edilmiş, viral konsantre içine 10x DNaz tampon ve DNase I (nihai konsantrasyon = 2.5 U / ul) ekleyin ve 1.5-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    14. 15 dakika boyunca 65 ° C 'de, DNase etkinliğini aktif hale getirmesi.
    15. Yeni bir tüp içine KLOROFORM ve DNase I ile tedavi edilen virüs fraksiyonunun 15 ul çıkarın ve epifloresans mikroskopi için örnek düzeltmek için 15 ul% 4 paraformaldehid ilave edin.
  4. DNA Ekstraksiyon
    1. Bir temizlenmeli ve otoklava 50 ml Oak Ridge yüksek hızlı santrifüj tüpüne her örnekten Havuz viral konsantreler.
    2. S ml başına, 10 ul 0.5 M EDTA 0.1 hacim 200x TE tamponu: Aşağıdaki eklebol, formamid 1 hacim ve 10 ul glikojen. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Yeni birimler kullanılarak, oda sıcaklığında,% 100 etanol içinde 2 hacim ekleyin. İyice karıştırın ve en azından 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. SS-34 rotor kullanılarak 4 ° C'de 20 dakika boyunca 17.226 x g'de tüpün döndürülmesiyle Pelet bir DNA.
    5. Serolojik pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın. Buz soğukluğundaki% 70 etanol ile iki kez pelet yıkayın.
    6. Mümkün olduğu kadar çok sıvıyı çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya pelet sağlar.
    7. 1x TE tamponu (pH 8.0) içinde 567 ul DNA pelletini.
      Not: Oda sıcaklığında tam olarak yeniden süspanse için en az 15 dakika bekleyin. Daha sonra işlenene kadar 4 ° C'de gece boyunca yeniden süspanse edildi DNA saklayın.
    8. Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpü içine yeniden süspanse DNA çözeltisi, tüm 567 ul aktarın. 20 _ (önceden ısıtılmış,% 10 SDS ve 30 ul proteinaz K 3 ul ekle6 g / mi), iyice karıştırın ve 56 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin. 65 ° C sıcaklıkta, CTAB / NaCI öncesi sıcak.
    9. 5 M NaCI ve 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Önceden ısıtılmış CTAB / NaCI çözeltisi, girdap 80 ul ekleyin ve 65 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
    10. 5 dakika boyunca 16.100 xg'de kloroform, karıştırmak için girdap ve spin eşit hacmi ekleyin.
    11. Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe süpernatant aktarın. 5 dakika boyunca 16.100 x g'de, fenol / kloroform, karıştırmak için girdap ve spin eşit hacim.
    12. Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe süpernatant aktarın. 5 dakika boyunca 16.100 x g'de kloroform, karıştırmak için girdap ve spin eşit hacim.
    13. Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe süpernatant aktarın. Süpernatan fraksiyonu izopropanol eşit miktarda ekleme karıştırın ve en azından 30 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
    14. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.100 x g'de DNA, santrifüj pelet. Dikkatle süpernatant pipet ve buz soğukluğundaki% 70 etanol ile iki kere yıkayın pelet. Kısa bir spini gerçekleştirin ve tüp kalan etanol kaldırmak. Hava, 15 dakika boyunca pelet kurutulur.
    15. Elüsyon tamponu (5 mM Tris, pH 8.5), 50 ul DNA pelletini. Topak, oda sıcaklığında en az 5 dakika süre ile rehidrate izin verin.
    16. Yüksek hassasiyetli floresan bazlı analiz kullamlarak DNA miktarı belirlenir.
  5. Phi29 Polymerase kullanarak büyütme (İsteğe bağlı)
    1. 80 mM Tris-HCI (pH 8.0), 20 mM MgCl2: 2x tavlama tamponu hazırlayın.
    2. 5 U / ul Phi29 DNA polimeraz sulandırmak.
    3. 50 ul rasgele heksamer primer (100 uM), 125 ul 2x tavlama tamponu ve 25 ul su içinde oluşan ön karışım örnek tamponu. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
    4. Ön-karışım, reaksiyon 100 ul Phi29 10x tampon oluşan tampon maddesi, 40 ul 10 mM dNTP ve 560 ul su. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
    5. 4 ul numune tamponu içine 1 ul şablon DNA ekleyin.
    6. Th inkübeE, 3 dakika 95 ° C de ilave edilip buz üzerinde soğutulur.
    7. , 2.4.4 den karışıma reaksiyon tamponu 14 ul ekleyin yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
    8. , Phi29 DNA polimerazı 1 ul ilave edin ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın ve 10 dakika boyunca 65 ° C'de, ardından 18 saat 30 ° C'de inkübe edin.
    9. Genomik DNA sütunları veya fenol / kloroform ve etanol yağış kullanarak reaksiyonları temizleyin.
  6. Epifloresans Mikroskobu (Haas ve ark bakın. 2014 28 filtrasyon sistemi kurulumu için)
    Not: nükleik asit boyaları ile izolasyon ve saflaştırma, epifloresans mikroskopi sonra örneklerde viral partiküllerin varlığı ve saflık (Şekil 2A ve 2C) kontrol etmek için de kullanılabilir. Numunedeki serbest DNA yüksek eşiğe ortaya çıkmasına neden olabilir. Bu nedenle, örnek DNaz Mikrograflarda için tespit ve boyamadan önce I-tedavi olmalıdır.
    1. Montaj çözeltisi hazırlayın (% 0.1 askorbik asit, 50% gliserol). 1X fosfat tamponlu salin (PBS) 4.9 mi,% 10 askorbik asit 100 ul ekle, iyice karıştırın. Karışıma,% 100 gliserolden 5 ml ilave iyice karıştırın ve "bağlama" olarak tüp etiketleyin.
    2. Filtre -20 ° C'de bir 0.02 mikron alüminyum matris tek kullanımlık şırınga filtresi, mikrofüj tüplerine kısım ve deposunu kullanan monte edin.
    3. Kısım 100, yeni bir mikrofüj tüpüne örnek ul VLP'lerini düzeltmek için% 4 paraformaldehid eşit hacimde ilave edin. En az 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
    4. 0.02 um filtre edilmiş su, 800 ul ilave edilerek 1 ml hacim tamamlanır. Tüp içine SYBR altın leke 1 ul eklenir ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    5. -9 Ve -10 psi (-62,1 -68,9 ve kPa) arasındaki vakum pompası açarak filtreleme sistemi kurun.
    6. Su ile yıkayın ve kaidesini filtre kaide içine halka şeklinde polipropilen destek halkası ile bir 0.02 mikron alüminyum matris filtre yerleştirmek.
    7. Bir kelepçe ile filtre ve güvenli filtre kaide üstünde bir filtre kule yerleştirin.
    8. Örnek süzülmeye için bir kaç dakika filtre kulesi içine 1.5 ml mikrofuge'de tüp içerikleri pipet, ve bırakın.
    9. Mikroskobik slayt içine monte reaktif Etiket ve pipet 10 ul.
    10. Filtre kulesi ve kelepçe çıkarırken vakumu bırakın.
    11. Dikkatle filtre kaide filtreyi kaldırmak ve bir Kimwipe ile filtrenin alt kurulayın, ardından mikroskobik slaytta dağın tepesine doğrudan filtreyi yerleştirin.
    12. Filtre üzerine monte ayıracı başka bir 10 ul pipet ve filtre üzerinde bir lamel yerleştirin.

3. Yaratma Mikrobiyal metagenome

  1. Tampon ve çözeltilerinin hazırlanması
    1. 1x DNaz tamponu 50 ml hazırlayın: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2; pH 6,5'e ayarlanır. Filtre sterilize (0.22 mikron) ve mağazaoda sıcaklığında karıştırılmıştır.
    2. Ben Dornaz ünitesi / mg kuru ağırlık olarak tanımlanan aktivitesine göre liyofilize sığır pankreas Dnase gelen (moleküler sınıf su içinde) Ben 1000 U / ul enzim DNase hazırlayın.
    3. GD tamponu, 100 ml hazırlayın: 75 mM NaCI, 25 mM EDTA, pH'ı 7.5'e ayarlayın. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.22 mikron) ve mağaza.
  2. DNA Ekstraksiyon için örnek Ön arıtma önce
    1. 0.22 um filtreden 1x PBS 5 hacmi eklenerek Homojenat seyreltin. Örneğin, örnek 2 ml 1 x PBS, 10 ml ilave ediniz.
    2. % 2 (hac / hac) nihai konsantrasyona β-merkaptoetanol ekleyin. 2 saat süre ile oda sıcaklığında (kimyasal başlığı kullanılmıştır) karışımı sallayın.
    3. 10 ° C'de örnek Spin ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır.
    4. Moleküler sınıf, 10 ml su (ya da 0.22 um'lik filtre edilmiş su) pelletini tekrar ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    5. Tekrar bir kez 3.2.3 ve 3.2.4 adımları.
    6. Spi10 ° C'de, n ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır.
    7. 5 mi 1x DNase tamponu pelet yeniden süspanse edin ve örnek ml'si başına 15 ul DNase I (1000 U / ml) ilave edilmektedir.
    8. 2 saat boyunca karıştırma tekrar 37 ° C'de inkübe edilir.
    9. 15 dakika boyunca 65 ° C 'de, DNase etkinliğini aktif hale getirmesi.
    10. 10 ° C'de Spin ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır. 10 mi SE tamponu içinde pelletini.
    11. Adımı yineleyin 3.2.10.
    12. 10 ° C'de Spin ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır.
    13. 2 mi GD tamponu içinde pelletini ve iki mikrofüj tüplere aktarın.
    14. Mikrofüj tüplerinde pelet hücreleri. 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 16,100 x g'de tüpler dönerler.
    15. Süpernatantı ve genomik DNA ekstraksiyon kiti, Gram-pozitif değişimi protokolü kullanılarak pellet haline getirilen hücrelerinden DNA ekstrakte edin.

4. Yaratma Metatranscriptome

  1. Örnek Ön-tedavi
    1. Hemen numune toplama ve homojenizasyon sonrası GITC-lizis tamponunda boncuk dayak hücrelerin mekanik lizisini gerçekleştirin. Adım 1.4 Bkz.
    2. Silis boncuklar pelet haline getirildi, 5 dakika, 4 ° C de bir karışım, 600 xg dönerler.
    3. Yeni bir tüp içine süpernatant aktarın.
    4. Oda 10 dakika süreyle ve bir dönüş 4 ° C'de ve 15 dakika boyunca 3,056 x g 'de inkübe, kullanılan GITC parçalama tamponu, her 750 ul kloroform ve 200 ul ekle 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Bu 15 dakika dönüş sırasında, adım 4.2 hazırlanmak.
    5. 15 dakika kurutma (sulu faz interfaz Organik faz formları açık bir şekilde ayrılması), yeni RNaz içermeyen boru (lar) içine (interfaz bozmadan) sulu faz ekstrakte edin.
      NOT: Sulu faz, RNA'yı ihtiva etmektedir. Bir sonraki safhaya kadar buz üzerinde tüpler tutun.
  2. Piyasada mevcut sütun tabanlı RNA arıtma kitleri veya conve kullanan toplam RNA ekstraksiyon ve saflaştırma gerçekleştirinntional izopropanol-tabanlı RNA yağış.
    1. Silika kolon bazlı RNA saflaştırma
      1. Elde edilen sulu fazın toplam hacmini ölçün.
      2. Örnek ve iyice karıştırın RNA bağlama tamponu uygun hacim.
      3. Üreticinin protokolüne uygun olarak bağlayıcı durumu uygun karışımın ayarlayın. İyice karıştırın ve kısa bir spin.
      4. RNA sütuna karışımı yükleyin. Bir büyük hacimli numune için, birden fazla yükleme kullanmak ve 4x her sütun kadar yük. Aksi takdirde, her bir örnek için birden çok sütun kullanmayı düşünün.
      5. Üreticinin protokolüne uygun olarak uygun sütunu yıkayın.
      6. RNaz içermeyen su içinde en az 30 ul RNA tasfiye edilir. Çift yıkama biraz RNA verimini artıracaktır. Bununla birlikte, bu RNA konsantrasyonu seyreltecektir.
      7. RNA konsantrasyonu ölçün ve DNaz Tedavi doğrudan geçin. RNA kalitesini kontrol etmek Bioanalyzer kullanın (önerilir).
      8. RNA Yağış
        1. Izopropanol eşit hacimde ekleme (örneğin, sulu fazın 500 ul içine izopropanol 500 ul) ve örnek 10 ug / ml RNaz içermeyen glikojen 2 ul.
        2. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
        3. 12,000 xg'de Spin ve 15 dakika boyunca 4 ° C.
        4. Dikkatle, süpernatan RNase içermeyen% 75 etanol içinde 1 ml. Pelet sağlam olduğundan emin olmak için 7500 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de karışım dönerler.
        5. Dikkatlice etanol çıkarmak.
        6. Tekrar bir kez 4.2.2.4 ve 4.2.2.5 adımları.
        7. Hava, 10 dakika boyunca pelet kurutulur.
        8. RNaz içermeyen su, 50 ul pelet rehidrate, 5 dakika boyunca 55 ° C'de inkübe etmek ve DNaz muamelesi ile doğrudan devam edin. RNA kalitesini kontrol etmek Bioanalyzer kullanın (Önerilen).
        9. -20 ° C, ya da uzun süreli depolama için -80 ° C 'de parçalar halinde saklayın RNA.

Representative Results

Viral Metagenomes

CF balgamı derece yapışkan ve müsin ve serbest DNA (Şekil 2A), yüksek bir miktarda içerir; yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme ev sahibi türevli DNA (Şekil 2B) atılmasını kolaylaştırır. sunulan iş akışı elde sekiz viromes gösteren 9 önceki çalışmanın sonuçları burada (Tablo 1) özetlenmiştir. Yedi numune (CF1-D, CF1-E, CF1 F, CF4-B, CF4-Cı, CF5-A ve CF5-B, Tablo 1) 2 oluşturulur viromes az bulunan bölümde tarif edildiği gibi (0.02 işlenmiştir % -3.7%) tek bir istisna dışında (% 70) ile insandan türetilmiş diziler. CF4-bir yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme aşama (CF4-A) ve>% 97 insandan türetilmiş sekanslar (Tablo 1). Şekil 2 içeriyordu, bu özel örnek elde virome unutulmuş tipik bir epifluorışıma mikroskop görüntüsünün bir örneğini göstermektedir CF sputum örnek (Şekil 2A) önce (Şekil 2C) yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü sonra. Açık virüs benzeri partiküller (VLP'ler) yoğunluk dereceli ayırma aşağıdaki büyük parçacıklar olmadan mikrograflar gözlenmiştir. VLP'ler DNA izolasyonundan sonra, bakteriyel kirlenme genellikle VLPler DNA sekanslama önce 16S rDNA amplifikasyonu kullanılarak test edilir.

Mikrobiyal Metagenomes

Burada sunulan yedi balgam örnekleri yedi gün üst üste genelinde tek CF hastadan toplanmıştır. balgam toplanmış sonra hasta Gün 3 oral antibiyotik (Siprofloksasin ve Doksisiklin) başladı. Bu hastadan toplanan her balgam numune hacmi 7 gün boyunca 15 ml; Bu nedenle, PBS örneğe eklendi değildi. Bu örnekleme olayın hedefi mikrobiyal toplum yapısının günlük dalgalanma değerlendirilmesi (i) bu iş akışında sunulan protokolleri değerlendirmek, ve (ii) karşılaştırmakmetagenomics ve 16S rDNA dizileme arasındaki mikrobiyal topluluk yapısı ve çözünürlük. Bu nedenle, toplam DNA, ve HL-DNA, her bir numuneden çıkarıldı.

DNA izolasyonu, aşağıdaki her bir yaymadan HL-DNA konsantrasyonu, Tablo 2'de sunulmuştur. HL-DNA toplam verimi> 5 ng ila 210 arasında değişmektedir. Illumina sıralama kütüphaneleri 1 toplam başlangıç ​​malzemesi her bir örnek (Şekil 3) için ng ile elde edilmiştir. metagenomik verilerin özellikleri Tablo 2. Hepsi sunulmaktadır ama bir kütüphane 1 milyondan fazla dizileri ve daha fazla% 85 yüksek kaliteli dizileri PRINSEQ 29 yazılımını kullanarak veri ön işleme üzerine tutuldu vermiştir. Tüm veri kümeleri önce daha ileri tarama çalışmaları ve DeconSeq 30 kullanılarak insan türevli sekanslar ile uzaklaştırılarak elde edilmiş çoğaltır ve düşük kaliteli (25 en az bir kalite puanı) sekanslarını çıkarmak için ön-işlenmiş edildi. İnsan-de miktarınıyarıp genç dizi kirliliği örnek özelliklerine son derece bağlıdır. Burada, insandan türetilmiş dizilerin toplam miktarı, 14-46% (Tablo 2) arasında değişiyordu. Önişlenmiş diziler daha sonra Metaphlan 31 boru hattı yanı sıra MG-RAST 32 sunucusu kullanarak açıklamalı edildi.

Metagenomes ek olarak, 16S rDNA amplikon kütüphaneleri 16S rRNA geninin 33,34 V1-V2 değişken bölgesinin yaklaşık olarak 300 bp'lik hedefleme primerler ile toplam DNA ve HL-DNA hem de üretilmiştir. Bireysel örneklerden PCR ürünleri normalize edildi ve MiSeq platformunda yapılan Illumina 500-döngüsü eşleştirilmiş-uç sıralama kullanarak sıralama için toplandı. Eşli-end 16S rDNA dizileri amplikonu bir python komut dosyası kullanarak barkod üzerinden örnek tarafından sıralanır ve eşleştirilmiş PHRAP 35,36 kullanılarak monte edildi okur. Montajlı dizi biter ortalama kalite puanı ≥20 5 nt penceresini kullanarak kadar kesilmiş bulundu. Potansiyel kimeralar vardın SILVA 38 referans dizileri bir kuruntu-serbest alt kümesi karşı Uchime 37 kullanılarak kaldırıldı. Yüksek kaliteli SILVA 38 veritabanından 418.497 bakteri dizileri kullanarak SİNA 39 (sürüm 1.2.11) ile okur Taxanomy atandı. Aynı taksonomik atamaları ile Diziler Operasyonel Taksonomik Birimleri (Otus) üretmek için kümelenmiş edildi. Bu işlem 16 numuneler (:;: 72.603; max: 127.113 dk 103.455 dizileri / numune ortalama boyutu) için 1.655.278 dizileri oluşturulur. medyan Ürünler kapsama puanı, sıralama bütünlüğü bir ölçüsü, ≥% 99.9 idi. Yazılım paketi Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) analizi ve Şekil üretimi için kullanılmıştır. Alfa-çeşitlilik (intra-örneklem) ve beta-çeşitlilik (inter-örnek) 100 önyükleme yeniden dağıtımları ile 72.603 dizilerinin seyreltme noktasında Explicet hesaplandı.

Bu çalışma ile hedeflenen ilk soru hipotonik parçalama preferenti olmadığını oldu(yani, tercihen korur veya lyses) mikropların belirli gruplar için müttefik seçer. İlk hipotonik parçalanmasından sonra, yeniden askıya haline gelmiş hücreler, ikinci hipotonik lizis (CF1-1and CF1-2) sonra aynı örnekleri ile karşılaştırmak için ilk iki numuneler (CF1-1A * ve CF1-2A *) den alt örnekler alındı. Bütün örnekler, DNA izolasyonu ve dizi boru, ardından aynı şekilde, yani öncesinde DNA ekstraksiyonu için DNaz ile muamele edilmiş tedavi edildi. Şekil 4 'de gösterildiği üzere, alt örneklere mikrobiyal profilleri iki hipotonik liziz tedaviden sonra örneklere çok benzer. Buna ek olarak, ikinci hipotonik liziz metagenomes (Tablo 2) içerisinde 6-17% oranında non-hümen sekanslarla fraksiyonu arttırır.

Metagenomic- ve 16S rDNA tabanlı profil arasındaki mikrobiyal kompozisyon farklılıkları test, ve daha önce bizim damızlık arasında görülen farklılıklar açıklayabilir öncesi ve hipotonik Parçalama işleminden sonra değişiklikleri içinler ve diğerleri, bakteriyel 16S rDNA dizileme kütüphaneleri toplam DNA ve HL-kaynaklı DNA (Şekil 4B) hem de elde edilmiştir. Cins düzeyinde, Pseudomonas, Stenotropho-, Prevotella, Veillonella ve Streptococcus gibi ortak CF-ilişkili bakterilerin taksonomisi profilleri HL-edilen DNA'dan üretilen 16S rDNA kütüphaneler ve metagenomes arasında oldukça benzerdi. Ancak, 16S rDNA kütüphanelerinde Rothia algılama metagenomic kütüphaneler ile olduğu kadar bol değildi. Toplam DNA ve HL-edilen DNA'dan üretilen 16S rDNA taksonomik profilleri karşılaştırıldığında, Pseudomonas diferansiyel Gün 3 HL-türetilmiş DNA başlayarak göre toplam DNA temsil edildi.

Metatranscriptomes

Tipik olarak, CF balgamının ekstrakte edilen toplam RNA, kısmen parçalanır ve boyut 25-4,000 bps (Şekiller 5A aralıkları ve ve ark. 2012 9 yayımlandı. olmayan tükenmiş metatranscriptomes içinde rRNA fraksiyon 27-83% arasında değişmektedir ve rRNA, nispi bolluktur örnekleri arasında değişmiştir (Tablo 3;. Lim ve diğerleri 9 seçilerek çıkarılan verileri). Ancak, Ribo-Zero kiti ile tükenmesi örnek CF1-F hariç% 1-5 rRNA rRNA göreceli bolluk azalmıştır. rRNA kaldırma etkinliği değişim sondaları melezleme 9 rRNA çıkarılan RNA kalitesini, ya da farklılıkları mikrobiyal topluluk şimdiki ve dolayısıyla erişilebilirlik yansıtıyor olabilir. Ribo-Zero rRNA kaldırma kiti kullanılarak başarılı bir (Şekil 5B) ve başarısız (Şekil 5D) rRNA kaldırma prosedürü elektroferogramları hangi rRNA zirveleri başarısız çıkarılması görünür, farklıdır.

cDNA boyut aralığı ge kütüphanelernerated genellikle başlangıç ​​RNA numunesinin boyutları aralığını gösterir. Burada sunulan cDNA kütüphaneleri Roche-454 dizileme kütüphane oluşturma, ardından 9 rRNA tükenmesi üzerine bir bütün transcriptome amplifikasyon kiti (WTA2) kullanılarak elde edildi. cDNA (Lim ve ark. 2012) 50-4,000 bps (Şekil 5E ve 5F'de) arasında değişen parçaları ihtiva oluşturulan ve örnekler arasında son derece tutarlı 9. Diğer platform spesifik RNA-Seq kütüphane hazırlık kitleri durumu şu anda bir optimum koşullarda cDNA sentezi ve sıralama kütüphane hazırlık birleştirmek için daha fazla alternatif seçenekler sunmak. Bugüne kadar biri önerilen seçenektir yukarıda tavsiye rRNA kaldırma reaktifler ve RNA-Sıra kütüphane hazırlık seti birleştirerek ScriptSeq Komple Altın Kit.

Şekil 1,
Şekil 1: hazırlık için iş akışıvirome, mikrobiyomu ve metatranscriptome dizileme için, balgam numunesi olarak ana ilişkili numune, bir preparasyonu.

Şekil 2,
Şekil 2: Sezyum klorür yoğunluk gradyanları ultrasantrifügasyon, hücre dışı DNA ve büyük partiküller (A) 'nın giderilmesine yardımcı ve CF balgamının viral benzeri parçacıklar uygun izolasyon sağlar. Her bir gradyan Bir mililitre ön muameleye tabi tutulmuş örnek (B) yüklenmesi için birbirinden önce üstüne katmanlı. Sonra parçacıklar izolasyonu ve saflaştırılması, bu SYBR Gold gibi nükleik asit boyaları ile epifloresans mikroskopi örneklerinde viral partiküllerin varlığı ve saflığını teyit etmek için kullanılır. Açık virüs benzeri partiküller (° C; beyaz ok) CF balgamı numunenin yoğunluk dereceli ayırma aşağıdaki gözlenmiştir.


Şekil 3:. Sapma olmaksızın üretici protokolünde tarif edildiği gibi CF balgamı microbiomes sonuçlanan HL-DNA 1 ng elde NextEra XT kütüphanelerinin boyutu dağılımı Örnek havuzu Kütüphane normalleştirme ve yükleme miktarı yapıldı.

Şekil 4,
Şekil 4: Bir CF hastanın uzunlamasına toplanan dokuz örneklerinde mikrobiyal toplulukların taksonomik analizi hipotonik liziz yöntem tabanlı DNA'dan üretilir metagenomic kütüphaneleri göre (A), mikrobiyal profilleri.. türler atama düşük kaliteli ve insan dizisi homoloji ile çoğaltır ve dizileri kaldırın Metaphlan boru hattı aşağıdaki veri ön işleme dayanmaktadır. Bu, iki st göstermek içinhipotonik lizis tercihen vermedi ilk hipotonik lizis dahil edildikten sonra mikroplar, alt örneklere (*) belirli gruplar için seçer eps. (B) Mikrobiyal profiller toplam DNA (T) ve hipotonik parçalama yöntemi 16S rRNA gen dizileme V1V2 bölgeye göre tabanlı DNA (HL). Bu veriler önceden yayınlanmış değil.

Şekil 5,
Şekil 5: RNA (AD) ve cDNA (EF) ve Agilent 2100 Bioanalyzer elektroferogramlarda örnekleri sırasıyla RNA pico ve yüksek hassasiyet dsDNA yongaları kullanan, metatranscriptomic kütüphaneler için oluşturulan. (A) ve (C) rRNA kaldırma işlemlerinden önce elektroferogramlarda örneklerini göstermektedir. Toplam rRNA Kaldırma kiti kullanılarak başarılı bir (B) elektroferogramları ve başarısız (D) rRNA kaldırma işlemi, biraz farklızirveleri rRNA'nın t başarısız çıkarılması görülebilir. cDNA boyut aralığı (EF) tam transcriptome amplifikasyon kiti (Sigma-Aldrich) başlangıç ​​rRNA-tükenmiş RNA boyut aralığı benzer ve iki farklı örnek üzerinde son derece tutarlı kullanılarak oluşturulan. Bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-Cı CF5-A CF5-B
Toplam sayısı okur 224.859 87.891 106.189 93.301 140.020 1,558 272.552 217.438
Önişlemdedir okuyan 109.389 73.624 67.070 82.011 68.617 1,137 215.808 158.432
% 49 84% % 63 88% % 49 % 73 % 79 % 73
Bazların sayısı 47.239.573 33.351.525 28.922.479 27.667.695 29.386.841 243.986 95.205.805 69.581.811
Okuma uzunluğu ortalama 432 453 431 337 428 215 441 439
Sunucu dizileri b 240 526 28 79.774 13 797 585 5859
% 0.21 0.71% % 0.04 97,27% % 0.02 70.10% % 0.27 % 3.70
Viral isabet c 7214 23.550 4,070 737 4642 22 6466 5981
% 6.59 31.99% % 6.07 % 0.90 6.77% % 1.93 3.00% % 3.78
Atanmamış d okur 103.888 60.490 32.780 1,935 68.440 311 105.612 119.551
94,97% 82,16% 48,87% 2.36% 99,74% 27.35% 48,94% 75,46%
Bir veri ön prosedürüne sonra okurPRINSEQ 29 ile ssing.
b İnsan DeconSeq 30 tarafından belirlenen artı Chordata filumuna için iyi bir BLASTN hit (NCBI nükleotid veritabanı) ile okur okur.
c TBLASTX içi viral genom veritabanı karşı vurur. yüzde okuma ile ön-işlenmiş toplam sayısı hesaplandı.
d NCBI nükleotid veritabanına karşı vurmak hiç BLASTN ile okur. yüzde okuma ile ön-işlenmiş toplam sayısı hesaplandı. NCBI nükleotid veritabanına karşı vurmak hiç BLASTN TBLASTX analizinde protein düzeyinde viral olarak belirlendi Bazı okur.

Tablo 1:. Sunulan iş akışını kullanarak balgam örneklerinden oluşturulan sekiz viromes Kütüphane özellikleri Bu tablo Lim <elde edilirem> ve ark. (2012) 9. Biraz (0.02% içerdiği viromes Bölüm 2'de açıklandığı ve oluşturulan yedi örnekleri (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, ve CF5-B) işlendi - 3.7 %) Bir istisna dışında (% 70) dizilerin, insan-türevi. CF4-A>% 97 insandan türetilmiş sekanslar ihtiva yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme aşama (CF4-A) ve üretilen virome çıkartılmıştır.

Örnek Konsantrasyon Toplam Verim: Toplam sayılı okur Toplam sayılı okur (İşlenmiş b) İnsan olmayan sekanslar
(Ng / | il), (Ng) (Raw) (%)
CF1-1A * 2.3 1.098.454 937.688 691.541
% 74
CF1-1 13 1.300 2.212.756 1.958.910 1.574.520
% 80
CF1-2A * 2.1 210 672.878 588.106 407.530
% 69
CF1-2 5.2 520 1.944.012 1.697.010 1.455.174
86%
CF1-3 28.8 2,880 1.048.304 896.756 560.852
% 63
CF1-4 24.1 2410 1.154.922 984.702 621.098
% 63
CF1-5 33.6 3,360 1.029.622 888.630 481.548
% 54
CF1-6 43.2 4320 1.434.016 1.256.504 725.858
% 58
CF1-7 57.8 5780 1.000.174 872.036 565.376
% 65
* Numune 1 ml CF1 gelen alt örnekleri alınmış eş edildi İkinci hipotonik parçalama prosedürü ilk önce hipotonik lizis adım (adım 3.1.5) Aşağıdaki -1 ve CF1-2. herhangi bir değişiklik olmadan kalan protokolü üzerinden 3.1.7 açıklanmıştır ve devam gibi hücreler deveran ettirildi.
Bir İşlenmemiş Ilumina 2 x 300 bp MiSeq sıralama çalıştırmak okur.
b değerlendirildi kesilmiş ve tartışmada tarif edildiği gibi kalite ve uzunluğuna göre kaldırıldı edildi okur.

Tablo 2:. Sunulmuştur iş akışı kullanarak balgam örnekleri elde microbiomes Özellikleri 100 ul yıkama tamponu (5 mM Tris / HCl, pH 8.5) ve dizi verileri özellikleri her bir numunenin DNA konsantrasyonu sunulmaktadır. 1 ng toplam NextEra XT kütüphane hazırlama kiti kullanılarak tek tek kitaplığı oluşturmak için kullanıldı.

0 "fo: keep-together.within-sayfa =" always "> Örnek CF1-D CF1-F CF4-B CF4-Cı Tedavi Hiçbiri Ri-Sıfır Hiçbiri Ri-Sıfır Hiçbiri Ri-Sıfır Hiçbiri Ri-Sıfır Önişlemdedir okur 2.088 1,991 40.876 25.238 19.728 32.737 31.791 36.172 Okuma uzunluğu ortalama 275 245 262 270 233 259 240 267 Toplam rRNA okur 1,737 91 29.499 17.267 5285 291 16.371 1761 83,20% 4.60% 72,20% 68.40% 26.80% % 0.90 51.50% 4.90% Mikrobiyal rRNA 1.414 32 19.978 12.035 23 227 6916 1,076 67,70% 1.60% 48.90% 47.70% % 0.10 0.70% 21.80% 3.00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 % 15.50 3.00% 23.30% 20.70% 26.70% 0.20% 29.70% % 1.90 % RRNA kaldırıldı * 0% % 95 0% % 5 0% % 97 0% 91% Sigara rRNA okur 351 (% 16.8) 1,900 (% 95.4) 11.377 (% 27.8) 7971 (% 31.6) 14.443 (% 73.2) 32446 (% 99.1) 15.420 (% 48.5) 34.411 (% 95.1) Toplam NR hit 102 (% 4.9) 691 (% 34.7) 3327 (% 8.1) 2857 (% 11.3) 4938 (% 25.0) 10.751 (% 32.8) 5905 (% 18.6) 15.766 (% 43.6) Ökaryotik 74 407 2790 2524 4614 10.227 4553 8274 Bakteri 26 283 520 312 287 471 1,326 7442 Atanmamış okur 249 (% 11.9) 1,209 (% 60.7) 8050 (% 19.7) 5114 (20.3%) 9.505 (48.2%) 21.695 (% 66.3) 9515 (% 29.9) 18.645 (% 51.5) * RRNA miktarı olmayan tükenmiş örnekteki bu miktarın bir yüzdesi olarak ifade kaldırılır.

Tablo 3:. Ve rRNA bir azalmaya neden olmadan metatranscriptomes Kütüphane karakteristikleri data Lim ve diğerleri elde edilir (2012) 9, başka ek rRNA kaldırma kitleri karşılaştırmasını ve önceki sekanslama kütüphane hazırlanması, cDNA nebülizasyon etkisi vardır..

Discussion

Viral Metagenomiks

Viral parçacıklar polietilen glikol (PEG), çökeltme ya da küçük hacimli konsantre edici kullanılarak konsantre edilmiştir. Bazı durumlarda, konsantrasyon gerekli olmayabilir, ancak ön-filtreleme ya da düşük hızda santrifüj adımları ökaryotik mikrobiyal hücreleri çıkarmak için kullanılır. Viral lisatlar daha zenginleştirilmiş ve yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon 9,41 veya küçük boyutlu filtreler (örneğin, 0.45 mikron) ökaryot ve büyük mikrobiyal hücrelerin 25 kaldırmak için. Kullanılarak saflaştırılmış olacak Yoğunluk gradyanı santrifüjü gibi teknikler tipik olarak izole edilmesi ve viral partikülleri 41 konsantre sükroz veya sezyum klorür gibi yoğun ama asal çözümler ile gerçekleştirilir. Fiziksel ayırma boyutu ve viral parçacıkların yüzer yoğunluğuna dayanır. Bu nedenle, filtre gözenek büyüklüğüne uygun seçim ve geçişlerini sıkı hazırlık fiziksel iyileşme başarısı olarak, spesifik viral toplulukları izole etmek için gerekli olanVLP'ler 41 (ekstraksiyon yoğunluğu içinde filtre veya sonbaharda geçmesine yok yani, viral parçacıkların metagenome tespit edilmeyecektir) izole topluluk belirler. Virüs izolasyonu ve konsantre edildikten sonra serbest nükleik asit ve mikrobik ve ökaryotik hücre şeklinde hem de örnek olarak, viral olmayan genomik malzeme mevcut kirletici olabilir. Bu nedenle, numuneler içinde viral partiküllerin saflığa (Şekil 1A ve 1B) kontrol etmek çok önemlidir. Bir kloroform tedavi genellikle önce nükleik asit ekstre nükleik asitlerin indirgeme nükleaz işlenerek, ardından kalan hücrelerin, lize etmek için kullanılır.

Sunulan iş akışına bir uyarı da CsCI degrade girmek için çok batmaz olabilir zarflı virüs partikülleri hariç olabilir gibi viral parçacıkların izole etmek yoğunluk gradyan ayrılık kullanımı oldu. Bir alternatif "catch-all" yöntemi yoğunluk gradyan Separ ihmal etmektirme 0.45 mikron topluluk DNA izole ve - kloroform ve DNaz I. Bu yaklaşım ile tedavi süzüntülerden gibi bezlerden veya kan plazmasından gibi küçük bir örnek hacimleri karşılamak için de uygundur. Bununla birlikte, bu kloroform dirençli bakteriyel kontaminasyon ve DNase I dirençli hücre dışı DNA'nın daha yüksek bir miktarda neden olabilir.

Yüksek DNA dizileme verimleri seçenekleri daha geniş bir seçenek sunmak sayede Güncel sıralama protokolleri 1 ng sıralama kütüphane hazırlanması için nükleik asitlerin ug 1 gerektirir. Oluşturulan viromes DNA konsantrasyonu genellikle 200'den fazla ng / ul algılama sınırının altında arasında değişmektedir. geri kazanılan viral nükleik asit miktarı, doğrudan dizileme kütüphane hazırlanması için yetersiz olabilir. Bu gibi durumlarda, nükleik asit amplifikasyon gereklidir. Bağlayıcı amplifikasyon tüfek kütüphaneleri (LASLs) 2,42,43 ve çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) dayalı tüm genom amplifikasyon iki vardıryöntemler, genellikle dizileme için yeterli DNA üretmek için kullanılmaktadır. Bu tür Phi29 DNA polimerazı ilgili olanlar MDA yöntemleri amplifikasyon önyargılara muzdarip bilinmektedir ve tercihen niceliksel olmayan taksonomik ve fonksiyonel karakterizasyonu 44,45 sonuçlanan ssDNA ve dairesel DNA arttırabilir. LASLs yaklaşım optimize edilmiş bir versiyonu, sadece minimal önyargıları tanıtmak için gösterilen (başlangıç ​​materyalinin küçük miktarlarda) yüksek hassasiyet teşvik ve kolayca farklı sıralama platformları 43 için uyarlanmıştır edilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, bir çok aşamaya sahiptir, DNA kaybını en aza indirmek için özel ekipman gerektirir ve dsDNA şablonları ile sınırlıdır. Laboratuvarımızda, bu yaklaşım başarılı bronkoalveoler lavage-, coral- ve deniz suyu kaynaklı VLP'lerden (yayınlanmamış ve Hurwitz ve ark. 46) elde DNA tespit ve saptanamayan bir miktar yükseltmek için adapte edilmiştir.

Veri analizi hatlarının geliştirilmesi cla vardırssically nedeniyle viral toplulukların oldukça çeşitli ve büyük ölçüde bilinmeyen doğa viral metagenomik analizinin en zorlu yönlerinden biri olmuştur. Tarih güncel virüs veritabanlarına biyosferdeki tahmini 10 8 viral genotipleri, orada iken bu yaklaşık toplam viral çeşitliliğin yaklaşık 1/100000 olduğunu ~ 4.000 viral genomları içerir. Bu nedenle, viral metagenomes taksonomik ve fonksiyonel atama için (örneğin BLAST 47 gibi) benzerlik-tabanlı aramalar doğasında zorluklarla sahip. Birçok dizileri veritabanında genomları önemli benzerlikler var başarısız, ve bu nedenle, bilinmeyen olarak sınıflandırılır. Homoloji-esaslı arama sınıflandırma atanması için en önemli uygulama ve veri sırası işlevini de, veritabanı bağımsız analizine göre alternatif yaklaşımlar 48- 50 geliştirilmiştir. Fancello ark. 51 vira kullanılan hesaplama araçları ve algoritmaları tam inceleme sağlamakl metagenomik.

Mikrobiyal Metagenomiks

Tipik haliyle, hipotonik liziz ile tedavi edilen mikrobiyal topluluğu (HL-DNA) elde edilen DNA'nın toplam miktarı 20 ng den 5 ug arasında değişir. Verim, hastanın sağlık durumuna ve bu çalışma (Tablo 2) özütlendi HL-DNA toplam verimle görülen varyasyon açıklanmaktadır toplanan yaymadan miktarı, son derece bağlıdır. kritik adımlar. Kaliteli dizi verileri oluşturulan sıralama kütüphanelerinin kalitesine güveniyor oluşturmak 2 enzimatik-tabanlı DNA parçalanma prosedürü kullanılarak CF balgam kaynaklı mikrobiyal DNA'dan üretilen sıralama kütüphaneleri için tipik bir boyut aralığı gösterir Şekil. Optimal kütüphane büyüklüğü dizileme platformu ve uygulama seçimine bağlıdır, ve gerekirse, bu nedenle, parçalanma prosedür, sonifikasyon ve nebülizasyon gibi alternatif yaklaşımlar yoluyla, optimize edilebilir. Ek olaraksunulmuştur temsili sonuçlar, çoklu zaman noktalarında, çeşitli hastalardan alınan CF balgamının sunulan yöntemin başarısı (2012) 9. Lim ve diğerleri içinde tasvir edilmektedir ve Lim ve diğerleri. (2014), 10.

Önceki çalışmalarda 9,10, her hasta dalgalanmaları nedeniyle antibiyotik tedaviler gibi tedirginlikler muhtemel iken, böylece toplum içinde önemli oyuncuların devamlılığını yansıtan, zamanla geçer mikrobiyal topluluğun bir dizi benzersiz barındırır öneririz. Bu dalgalanmalar bile dış tedirginlikler olmadan veya bağlı örnekleme prosedürü ve örnek işleme günlük meydana olsun, söz hala. HL-DNA metagenomic ve 16S rDNA amplikon analizine dayanarak, 7 günlük uzunlamasına örnekleme gösteren antibiyotik pertürbasyon mikrop profillerin günlük dalgalanma (Gün 1, 2, ve 3) olan en az (Şekil 3A ve 3B). Intro üzerineantibiyotik siprofloksasin gibi P. olarak bilinen bakteriyel patojenler geniş bir yelpazede hedef iken oral antibiyotik duction hemen Gün 3 örnekleme sonra, topluluk profilinde değişiklikler Gün 4. belli oldu aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Streptococcus pnömoni, tedavi P. göreceli olarak artmış aeruginosa Streptococcus spp düşürürken. ve P. melaninogenica. Gün 6 olarak, toplum yavaş yavaş ilk başlangıç ​​toplum yapısına kurtarıldı. Sonuçlar, tek bir hastada içinde mikrobiyal profillerin dalgalanmalar nedeniyle hava yollarında toplum tedirginlikler daha olası olduğunu göstermektedir.

HL-edilen DNA'dan 16S rDNA kütüphaneler ve metagenomes mikrobiyal profiller arasında tutarlılık göz önüne alındığında, bu çalışmada kullanılan 16S rRNA primerleri kaynaklanan önyargıları dışladı. 16S rDNA Taksonomik genelinde görülen farklılıkların olası bir açıklamatoplam DNA ve HL-türevli DNA (Şekil 3B) elde ark profilleri Pseudomonas türlerinin yüksek miktarlarının varlığı olabilir. antibiyotik tedavisi sonrası hücre dışı bir DNA. Bu bu farklılıklar Gün 7 en belirgin olduğu bulgularla desteklenen, üç gün Pseudomonas spp hedefleyen antibiyotik tedavisi, sonra. diğerleri yanında. Siprofloksasin yaygın CF ve kronik P. hastalarda ilk basamak tedavi olarak kullanılır faaliyet spektrumu en CF-ilişkili patojenleri içeren olsa aeruginosa enfeksiyonu. Biz antibiyotik tedavisi Streptococcus spp duyarlı toplulukları ortadan kaldıracak varsayıldı. ve dolayısıyla dirençli P. tarafından doldurulan bir niş oluşturmak aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kendi biyofilm toplulukları artırarak direnç kazanabilir ve hücre dışı DNA kendi biyofilm mimarisi 52 ana yapısal destek olduğu gösterilmiştir. Hatta t olarakO topluluk yapısı dışı DNA CF balgam kalmış olabilir, iyileşti. Bu nedenle, bu veriler hipotonik parçalama ve potansiyel sadece insan kaynaklı DNA kaldırarak değil yarar bu iş akışında sunulan yıkama adımları, ama aynı zamanda mikrobik kaynaklı dışı DNA gerçek mikrobiyal profilleri yanlış olabilir öneririz.

Metatranscriptomics

Yüksek kaliteli bir metatranscriptome nispeten az ribozomal RNA (rRNA) dizileri içerir ve yorumu transkript (mRNA) 'nın tarafsız bir örnekleme temsil etmelidir. Nedeniyle mRNA kısa yarılanma ömrü ve sınırlı miktarda, bu protokol, burada gösterildiği gibi, geri kazanılan transkript sayısını en üst düzeye çıkarmak için örnek işlemlerine en aza kritiktir.

Son yıllarda, rRNA azaltımı için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilen kitler uyarlanmıştır. Bunlar MicroB zenginleştirin, Ribo-Zero, ve örnek özgü Subtractive h dahilybridizations oligonükleotid hibridizasyonu, ve 5 'monofosfat içeren ekzonükleaz enzimatik aktivitesi hedef RNA dayanmaktadır mRNA sadece kit dayanmaktadır 53. Buna ek olarak, bu tür tercihen doğrusal RNA'yı polyadenylates ve güçlendirir MessageAmp II-Bakteri Kit olarak mRNA zenginleşme için çeşitli yaklaşımlar da mevcuttur. Bu yöntemlerin (örneğin, mRNA-SADECE, MicroB E xpress ve MessageAmp) Bazı optimum verimlilik için aynı anda kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, tüm etkinliği kısmen bozulmuş rRNA ile çalışan genellikle CF örneklerinden ekstrakte edilen toplam RNA gözlenen özellikle sınırlıdır. Poliadenilasyon bağımlı RNA amplifikasyonu, hem ökaryotik ve prokaryotik mRNA oluşan metatranscriptomes oluşturmak için kullanılamaz. Buna ek olarak, poli (A) kuyruğu I yararlı dizi veri miktarını azaltır olabilir dizilere eklenir. Homopolimer uzanıyor Bölgeler düşük kalite puanları eğiliminde olacaktır, cönemli sayıda ausing poli kapalı kırparak sonra sıralama ve sonrası sıralama yazılım ve ortalama faydalı okuma uzunluğu tarafından filtre edilecek okur (A) kuyrukları anlamlı 54 azalacaktır.

Karmaşık CF mikrobiyal topluluklar ve kısmen bozulmuş RNA (Şekil 4A ve 4C) ile ilgilenmek, önceki çalışma Ribo-Zero Altın kiti ile hibridizasyon-yakalama yöntemi kullanarak birleştirmek tedavilere kıyasla insan ve mikrobiyal rRNA hem giderilmesinde daha etkili olduğunu gösterdi Diğer kitleri 9 (Tablo 3). Elde edilen veriler, insan ev sahibi ve mikrobiyal transkript hem eşzamanlı analiz sağlar. Verim ve RNA kalitesi, hem de sekanslama platformun nihai seçime bağlı olarak, cDNA sentez adımı da dahil olmak üzere, bu işlemlerin bir çok sekans kitaplığı üretimi ile aerodinamik edilebilir. Örneğin, ribo-sıfır tedavi RNA metatranscriptome dizileme Terazi yapmak için kullanılabilirRies ScriptSeq RNA-Seq Kütüphane Hazırlık kiti kullanılarak.

Hayvan ilişkili toplulukların metagenomic analiz host ve ilişkili topluluklar içeren genel fonksiyonel varlık kapsamlı bir temsilini sağlar. Burada yer alan iş akışı, özellikle, arzu edilen viral ve mikrobiyal ek olarak kalın mukus, hücre artıkları, hücre dışı DNA, protein ve glikoprotein kompleksleri, yüksek miktarlarda, hem de konakçı hücreleri içeren bu karmaşık hayvan ilişkili örnekleri çeşitli uyarlanabilmektedir parçacıklar. Virütik ve mikrobik parçacıkların her adımda kaybolabilir bile, izolasyon ve saflaştırma, ana DNA'nın miktarının en aza düşürülmesi için gerekli olan parçacıklar. Metagenomik verileri incelendiğinde toplulukların metabolik potansiyellerini sağlarken, kodlanmış fonksiyonların 9 diferansiyel ifadesi ortaya koyarak bu tamamlayıcı metatranscriptomics. Genomik ve transkript verileri kapsamlı bir değerlendirme, yeni ins vermiştirtoplum etkileşimleri dinamiklerine ights ve iyileştirilmesi tedavilerin 9,10,55 gelişimini kolaylaştırır.

Acknowledgments

Bu eser Orman Rohwer verilen Ulusal Sağlık Enstitüsü (1 R01 GM095384-01) tarafından desteklenmiştir. Biz Ribo-Zero Epidemiyoloji kitleri erken erişim sağlamak için Epicentre, bir Illumina şirket teşekkür ederim. Biz Ultrasantrifügasyon tüp tutucu tasarımı ve üretimi için Mark Hatay teşekkür ederiz. Biz filme sürecine yardımcı kritik okuma ve yazının tartışmalar için Andreas Haas ve Benjamin Knowles teşekkür ve Lauren Paul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 94 virome mikrobiyomları metagenomik metatranscriptomics kistik fibroz mukozal yüzey
Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M.,… More

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter