Protocol
1. CRISPRデザイン
- デザインsgRNAs手動または自由に利用できるオンラインツール7を使用。離れて標的部位（オフターゲット効果）からの切断の危険性を減らすために、同一のゲノム一致またはほぼ一致を最小化するガイド配列を特定するためにこれらのツールを使用してください。ガイド配列は、ゲノムの認識部位での「NGG」配列（「protospacer隣接モチーフ」またはPAM）の上流の20マー（「protospacer配列」）で構成されていることを確認してください。
メモ： 図1は、遺伝子と非コード要素の削除の可能性戦略を説明します。遺伝子ノックアウトを作成するための、エクソン内にある2 sgRNAは機能の損失に対してもアレル欠失クローンを豊かにします。これは、mRNA転写物（ 図1B）のナンセンス媒介崩壊をもたらすフレームシフト変異を引き起こす可能性があり、非削除対立12上に形成されたインデル、高周波によるものである。 - 使用してください例は、マウスにおけるPIM1の意図削除（; 表1、図2A ハツカネズミ ）のためにガイドします。
注：この例では、sgRNA-Aのprotospacer配列と、PAMはsgRNA-Bのprotospacer配列と、PAMは、トップ（ワトソン）鎖（ 図2A）上に落下しながら、ボトム（クリック）鎖上に落下してしまった。しかし、DSBは、上部または下部の鎖にprotospacerシーケンス/ PAMの向きとは無関係に発生します。 - 各ガイド配列の逆相補（RC）を決定します。例を表2に発見された表1からPIM1 sgRNAの相補配列を逆転。
- クローニングおよび発現の目的のために追加のヌクレオチドを含む、各ガイドおよびそれに関連する逆補完のために24または25-merのオリゴを取得します。
注：ここでは、pSpCas9（BB）プラスミド（pX330）（AddgeneプラスミドID 42230）の使用を検討する。このプラスミドは、同時を可能にするsgRNAとSpCas9の発現が、 選択の7用のマーカーが含まれていません。他の構築物は、GFPおよびピューロマイシン選択マーカーとして、それぞれ、または複数sgRNAsは単一のプラスミドから発現することが可能な構築物を含むpX458（AddgeneプラスミドID 48138）またはpX459（AddgeneプラスミドID 48139）として、利用することができる。- のBbsI制限酵素（ 表3）を用いてpX330ベクターへのクローニングのためのガイドの逆相補体の前に20-merのガイド配列と「AAAC「前」CACC」を追加する。
- 20量体の最初の位置はCACCシーケンス後Gヌクレオチドを含めることによって強化されるpX330ベクトルのU6プロモーターからではないG. sgRNA式がある場合にCACCシーケンス後と20-merの前にGヌクレオチドを追加します。 。逆相補オリゴ（ 例えば、 表4のsgRNA-A）の3 '末端にCを追加する。結果として得られるオリゴは、25-merのオリゴだろう。
- どうやってこれまでに、20マー（protospacer配列）の最初の位置がGであれば、別のG（ 表4の例、sgRNA-B）を追加しないと逆相補オリゴの最終位置にCを追加しないでください。この場合、得られたオリゴは、24-merのオリゴ（ 表4）である。
2.デザイン削除のスクリーニングプライマー
- デザイン削除される配列に対する内部プライマーの一組（「非削除バンド」）および他の上流のプライマーのセットとsgRNA切断部位の下流（「削除バンド」; 図1 - 2）。欠失が存在しない場合には、「削除バンド」は、しばしば効果的に増幅するには大きすぎる。通常、検出はsgRNAの標的部位での小インデルの影響を受けれないことを確認することが予測切断部位からのプライマー、少なくとも100bpのを使用しています。
- 瘢痕化のために分析するために、追加のプライマーを設計（sgRNA Cで生産小さなインデル意図削除せずにleavageサイト）。前方のペアを使用し、（150内 - 350 bp）の各sgRNA標的部位に隣接するプライマーをリバース瘢痕のため調べるsgRNA標的部位を増幅する。これは、アレル欠失クローン非削除対立遺伝子を特徴づけることが有用であり得る。
- 小さな欠失のために（「削除バンド「静止増幅することができるように）、サイズは欠失の存在または非存在と一致しているかどうかを決定するために、アガロースゲル上でのアンプリコンを解決する。このアプローチでは、 ステップ2.1に記載された内部プライマーを省略してもよい。
3. CRISPR遺伝子クローニング
- アニールし、オリゴをリン酸化する。
- のddH 2 O中の100μMの濃度で再懸濁オリゴ
- 各ガイドとその逆相補のために10μlの反応ミックスを調製する：1.0μLsgRNA 24または25-merのオリゴ（100μM; 工程1.4を参照）、1.0μLsgRNA 24または25-merのはcomplemenリバースTオリゴ（100μM; 工程1.4を参照）、1.0μlの10倍のT4ライゲーションバッファー、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）（10,000 U / ml）をμlの6.5μlののddH 2 O、および0.5。
注：リン酸化オリゴは、代わりに注文することがあります。このアプローチのために、T4 PNKの使用が省略されている。 - 以下のパラメータを使用して、サーモサイクラー中でアニーリング：30分間37℃で、 95°Cで5分間、次いで5℃/分で25℃まで下降。
- オリゴのddH 2で1:10 O（ 例えば、1.0μlのアニーリングしたオリゴ+ 1μMの濃度を得9.0μLのddH 2 O）を希釈します。
- ゴールデンゲートアセンブリクローニング戦略26を使用してpX330にライゲートアニールしたオリゴ。
- （; ステップ3.1.4を参照1μM）、5.0μlの制限酵素バッファー（10倍）、4.0μL（20 U）のBbsI制限酵素（5,000 U / 100ngの円形pX330ベクトル、オリゴをアニーリングさ1.0μL：50μlの反応ミックスを調製するml）を、5.0μLのATP（10mM）を、0.25μlの（5μgの）BSA（20 mg / ml）で、0.375μlの（750 U）のT4 DNAリガーゼ（200万U / ml）を加え、H 2 O50μlの最終体積に。必要であれば、この反応は、小さな最終容量にスケールダウンすることができる。
- 次のパラメータを使用して、サーモサイクラー中で実行したサンプル：サイクル1-20（5分間、37℃、5分間、20℃）。 21サイクル（20分間、80℃）。これらのサイクル条件は一つの反応（ ステップ3.2を参照）で発生する消化および連結を可能にします。
- DH5αE.10μlのトランスフォーム（ - 3.2.2 3.2.1からの）反応の1μlの大腸菌細胞 。
- 37℃でO / Nを100μg/ mlのアンピシリンをLB培地（LB）寒天プレート上でプレートとインキュベートする。
- 3個のコロニーとミニプレップ文化に接種する - 2を選択してください。
- CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC：U6プロモーターフォワードプライマーを使用して、各サンプルおよびシーケンスの各コロニーをミニプレップを行います。これはARですepresentative配列決定プライマー。他の隣接するプライマーを利用することができる。
- 配列検証されたコロニーを選択し、マキシプレップ文化に接種する。準備サイズが必要とされるDNAの収量に基づいてスケーリングすることができる。
- 各CRISPR / Cas9の構築物についてマキシプレップを行います。
4.目的の細胞にCRISPRsをトランスフェクション
注：このプロトコルは、エレクトロポレーション27によるCRISPR / Cas9プラスミドの送達を含む。このプロトコルは、マウス赤白血病（MEL）細胞は、懸濁細胞株について詳細に説明する。全ての工程中の培養培地は、MEL細胞のために使用される2％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを補充したDMEMから成る。しかし、CRISPR / Cas9プラスミドの一過性トランスフェクションに成功し、各細胞型に好適な培養条件およびトランスフェクションストラテジーを使用して、多数の細胞タイプに適合させることができる。 MEL細胞は接着細胞時間浮遊細胞、説明書ですがAVEも含まれて。
- CRISPRペア当たり2×10 6個の細胞が存在することを確認してください。エレクトロポレーション溶液100μlで2×10 6個の細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに追加します。
- 各CRISPR / Cas9構築物（10μgの全）を5μgを追加します。 GFP発現構築物の0.5μgのを追加します。
- エレクトロポレーションシステムを使用して、2mmのキュベット中で5ミリ秒のために250ボルトで電気穿孔細胞。
注：またはそのようなカチオン性リポソームベースのトランスフェクションのような別のトランスフェクション法を使用します。ゲノムの編集を行う前に、堅固なプラスミド送達を確実にするために、レポーター構築物で、各細胞株についてのトランスフェクション条件を最適化する。 - すぐにエレクトロポレーション後の培地の1ミリリットル中にキュベットからソリューションを転送する。エレクトロポレーション及び細胞生存率を向上させるために培地中に溶液を移す間の時間を最小にする。
- 72時間 - 24 37℃ - 30でインキュベートする。ゲノムを高めることができる30℃で効率を編集するが、37℃で許容される。
トランスフェクションされた細胞の5蛍光活性化細胞選別（FACS）
- FACSチューブに50μmのフィルターを介してそれらをフィルタリングすることにより、FACSのために細胞を準備します。
- FACSは、CRISPR / Cas9構築物の高レベルの受信細胞を濃縮するために、GFP陽性細胞の最上部〜3％を並べ替える。
- プレートは、セルソーターを用いて、96ウェル丸底プレートに、または96ウェル丸底プレートあたり30個の細胞を限界希釈法を用いて個々に細胞を選別した。前に確実に96ウェルプレート当たり約30細胞を得るためにこのステップを実行することに限界希釈で使用した細胞型をメッキ最適。
- 細胞培養培地のウェル当たり100μlのを含めます。
- メッキされていない残りのソートされた細胞（「バルク」）については、今後のメッキのための細胞の半分を凍結する。 （ ステップ6を参照） をスクリーニングし、プライマーの検証のための他の半分はプレート。
注：このProtocolは浮遊細胞用です。個々の単一細胞由来クローンを採取し、平底96ウェルプレートに移動させることができるように、接着細胞を、96ウェル平底プレート中、または低濃度で10cmディッシュ内の個々の細胞として成長することができます。 - 7日とクローンは7、37℃でインキュベートすることができます - - 14日バルク細胞は3、37℃でインキュベートすることを許可する。これらの時間は、使用される細胞株の倍加時間に応じて変化する。
注：このインキュベーション時間（ ステップ6.1および7.1を参照）PCRによる意図した削除のために、ゲノムDNA（gDNAを）をスクリーニングするための十分な細胞増殖を可能にします。濃度〜100,000細胞/ mlまたは接着細胞超えるとバルク細胞が十分に増殖し、細胞が~80％のコンフルエンスに達した。クローンは十分〜2mmの直径を有する一回の肉眼で見える増殖している。
6.プライマー検証とCRISPR / Cas9介在欠失のスクリーニング
- DNA抽出溶液50μlに親およびバルク細胞ペレットを再懸濁することによって、親及びバルク選別した細胞からのgDNAを分離します。
注：細胞数の広い範囲が許容されるが、一般〜100,000個の細胞を、DNA抽出のために使用されている。バルクソート細胞はsgRNA-AとsgRNA-Bにさらされるポリクローナル集団で構成されている（ ステップ5を参照）。次のPCRの目的は、プライマーを検証し、意図されたゲノム欠失の存在を確認することである。 - サーモでサンプルを実行し、次のプログラムを実行します。65℃を6分間、98℃を2分間のgDNAを抽出する。 DNA濃度を測定します。
注： ステップ6.1および6.2は、DNA抽出のために効率的な方法をお勧めしますが、ゲノムDNAを単離するための任意の方法は、 ステップ6.3でPCRを行うことができるように利用することができる。 - 10μlの2倍PCRミックス、0.5μlのフォワードプライマー（10 _：次のコンポーネントで20μlのPCRを組み立てる6; M）、0.5μlのリバースプライマー（10μM）、50〜100 ngのgDNAを、そしてH 2 O最大20μL。上記の手順2で設計されたプライマーを使用してください。別々の反応における「非削除バンド」と「削除バンド」についてPCRを実施する。
注：多くのポリメラーゼは、 ステップ6.3のために使用することができる。- 10分間、15分間、95℃（30秒、1分、60℃、1分間72℃、95℃）の35サイクル、および72℃以下のパラメータを使用して、サーモサイクラー中で実行したサンプル。バルクソートされた細胞をテストに基づいて設計された各プライマーペアのPCR条件を最適化します。
- 1×トリス - 酢酸-EDTA（TAE）緩衝液を用いて10 V / cmの2％アガロースゲル上で泳動したサンプル。
- 非削除し、削除バンドの存在/不在（ 図2）のためのサンプルを調べます。多重「削除」および「非削除」とは、単一の反応においてPCRプライマー対を考慮する。多重化を最適化ポリクローナル集団内の個々のクローンをスクリーニングする前に（ すなわち、バルク、細胞をソート）。それは、削除と非削除アンプリコンが簡単に多重化するためのアガロースゲルで分離することが重要です。
7.スクリーニングCRISPR /欠失およびクローン選択のためのCas9クローン
- 懸濁細胞については、既に150μlの最終体積のために、ウェルあたり50μlの細胞培養培地を含む単一の96ウェルプレートに全てのクローンを転送する。これは、マルチチャンネルピ ペットをステップ7の手順の残りのために使用できるようにすることで、スクリーニングを容易にする。
- マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルPCRプレートに、各ウェル（各ウェルに100μlのを残して）からの振替を50μl。
- 5分間400×gで遠心しPCRプレートとシンクの上にPCRプレートをフリックで上清を除去。よく再懸濁あたりのDNA抽出溶液50μlを追加します。浮遊細胞のための7.3に進みます。
- 付着細胞、培地を吸引してください。クローンが存在して各ウェルに0.05％トリプシンEDTA20μlのを追加します。
- メディアの200μlの中で細胞を再懸濁。ピペットは、細胞を剥離するために混ぜる。
- 二つの別々の96ウェル平底プレートに各μlをプレート100。クローンが成長し、削除の各クローンをスクリーニングするために、他のプレートを使用することを可能にするために一つのプレートを保管してください。
- 200μlの総体積のために各ウェルに追加の100μlのを追加します。細胞が成長できるように、72時間 - 24を待ちます。
- 吸引するメディア。よく、再懸濁し、96ウェルPCRプレートへの転送あたり50μlのDNA抽出溶液を追加します。 7.3に進みます。
- クローンからのgDNAを抽出します。サーモでサンプルを実行します。6分65℃、2分のgDNAを抽出するための98℃。
- 画面の各クローンをバルク細胞に最適化された同一のPCRプライマーおよび反応条件を用いて（ ステップ6を参照）。
- クローンのiDENはを選択希望する削除をtifiedと成長のためのより大きなプレートまたはフラスコに移動します。
対立遺伝子の削除クローンの8検証
- 得られたクローンを特徴付ける成功ノックアウトを検証するために、DNAにおけるクローンならびにRNAおよび/またはタンパク質のレベルを評価する。
- DNAを評価するために、プルーフリーディングポリメラーゼで二対立遺伝子欠失クローンから削除バンドを増幅し、プラスミドベクターにアンプリコン（ 例えば、PCRクローニングキット付き）をクローンする。 DH5αE.にプラスミドをトランスフォーム関連する抗生物質を含むLB寒天プレート上に大腸菌細胞プレート。複数のコロニー、ミニプレップ各1を選択し、各欠アレル28特徴付けるのサンガー配列決定に各クローンを施す- 30。初期画面の後に削除するためのPCR検査を繰り返すこと正しいクローンが選択され、結果の再現されたことを保証します。
- RNAを評価するために、GENのためのRT-QPCRを行う関連する遺伝子30,31のE発現。
- タンパク質を評価するために、関連するタンパク質33に対する抗体を用いたイムノブロットを行う。
Representative Results
この実験の目的は、MEL細胞におけるPIM1の削除だった。複数の非重複sgRNA対（ すなわち、独立protospacer配列）の使用は、オフターゲット効果（ 図1A）をコントロールするのに役立ち得る。複数の独立protospacer配列により共有される一般的なオフターゲット効果とは対照的に一貫性のある表現型は、オンターゲット効果に起因する可能性が高いであろう。各ペアは固有の削除ブレークポイントの生成につながる。 （ すなわち、n〜150塩基対未満で）近接している場合、同一のスクリーニングプライマーはsgRNAsの各セットによって生成される欠失を検出するために使用することができる。ゲノム欠失は、遺伝子（ 図1B）に関して、様々な場所にsgRNAのペアを使用して、遺伝子を破壊することができる。例えば、sgRNAペアが全遺伝子本体の削除のための遺伝子に隣接すること。ペアは、フレームシフトインデルを作成する可能性を有する、2つのエクソン内に位置することができた場合でも、一方または両方のallelESは削除されませんでした。またはペアは、特定のアイソフォームの破壊を可能にするために特定のエクソンに隣接することがあります。
PIM1に使用し、削除戦略は、全遺伝子本体、8キロバイトの削除（ 図2）を削除するフランキングsgRNAsを設計することでした。この戦略により、PIM1遺伝子の比較的小さいサイズに部分的に選択した。この例では、ボトム（クリック）鎖上のトップ（ワトソン）鎖と1 PAM上の1つのPAM（緑）を示している。しかし、DSBは、上部または下部の鎖にPAMシーケンスローカリゼーションとは無関係です。 sgRNA対はボトム鎖上に、上の鎖の両方に、両方のPAM配列を有する、または各一ができる。上述のプロトコルを使用して、2つのsgRNAを設計pX330発現ベクターにクローニングし、そしてGFPレポーター（ 図2A）に沿ってエレクトロポレーションによりMEL細胞に送達した。 GFP +細胞のトップ3％、ポストエレクトロポ二日ソートして、限界希釈でクローン的にプレーティングした。スクリーンステップ2および図2に示されるように説明したようるプライマーを設計した。PCR条件は親MEL細胞から及び「バルク」ソートされた細胞から単離されたgDNAを用いて最適化した。
10日めっき後、gDNAを、すべてのクローンから単離し、非削除（ND）、削除（D）アンプリコンのパターンに応じて、非削除、アレル及び対立遺伝子の欠失クローンを同定したPCRによる欠失についてスクリーニングした（ 図3） 。非欠失クローンは、非削除アンプリコンの存在および削除リコンの有無を有すると同定された。アレルクローンは非欠失および欠失のアンプリコンの両方の存在を有すると同定された。対立遺伝子クローンは、非削除リコンの有無および欠失アンプリコンの存在を有すると同定された。この削除のために、400個のクローンをスクリーニングした126アレル欠失クローンと32二対立DELETを特定しているイオンクローン（これは、削除周波数が削除サイズ12によって変化することに留意することが重要である）。対立遺伝子の欠失クローンを選択し、メディア8 mlのフラスコに移した。拡張のために5日間与えた後、各クローンは、二対立遺伝子欠失及びアンプリコンが正確な欠失（ 図2B）を識別するサンガー配列決定に供した確認のためのgDNA PCRにより再試験した。削除アンプリコン内の不均一性は不完全なインデル形成NHEJ修復を反映している。多くの場合インデルを発見monoallelelic欠失クローン非欠失対立遺伝子の配列決定、アレル及び対立遺伝子の欠失クローンの両方が要求される用途のために重要であり得る、偶数非削除対立遺伝子が頻繁CRISPR / Cas9によって編集されることを実証。 RNAは、二対立遺伝子欠失クローンから単離し、PIM1発現（ 図4）の消失を確認するために、RT-qPCRにより分析した。
方法は ">
削除の可能性戦略の図1.。（A）は 、ゲノムの欠失のための2つの例sgRNAペア（それぞれ黒とオレンジ色で表示）。青い矢印は、非削除リコンを検出するためのプライマーを示し、赤い矢印は、削除リコンを検出するためのプライマーを示している。 sgRNAは17位置および18で赤と青で強調表示されsgRNA-サイト-1/2と位置17との間の予測Cas9切断を示す赤い線でsgRNA-サイト-B 1 / B 2で紫とオレンジ色で強調表示されますおよび18（B）CRISPR指向の切断は、縦の黒い線で示されている。青い矢印は、非削除リコンを検出するためのプライマーを示し、赤い矢印は、削除リコンを検出するためのプライマーを示す。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
シークエンシングの削除と非欠失アレルを含む、PIM1の欠失を生成し、検出するために、図2の戦略。PIM1 欠失クローンを同定するためのPCRベースのスクリーニング戦略の（A）の回路図。一つのプライマー対が欠失（青い矢印）と一つのプライマー対の内部に配置されているが欠失（赤矢印）の外部に局在している。 sgRNA配列（protospacer配列）が紫色で示されている。縦の赤い線は17位とsgRNA系列の18との間の予測Cas9切断を示している。（B）サンガーシーケンシングがsgRNA認識サイトでインデル形成を明らかにしている。 sgRNA配列は、緑、紫、およびPAM配列に示されている。削除イベントはshにあるダッシュマークと挿入の同等の数によって自身が青で強調表示されます。赤い縦線は17位とsgRNAの18との間に、予測された切断部位を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。非削除、アレル、および対立遺伝子クローンを同定する代表ゲル。各クローンについて、左車線が非削除アンプリコン（青で「ND」）と右車線を表し、赤の欠失アンプリコン（「D」を表し）。個々のクローンは、点線で分離されている。 3アレル欠失クローンは、クローン5、6であり、そして配列決定データに見られるように、2 3対立遺伝子の欠失クローンは、cに対する欠失バンドクローン15,17、および13である唯一の13は、欠失接合部に大きな欠失によるサイズが小さい。
対立遺伝子の欠失クローンでPIM1式図4.損失。PIM1発現はRT-qPCRにより2対立遺伝子の欠失クローンを算出した。 ΔCtの方法-データは2を使用して、GAPDHに対して正規化した。
| Protospacerシーケンス | |
| sgRNA-A | 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-B | 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
PIM1の削除の2 sgRNA表1. 20-merのprotospacerシーケンス。
543 ">表1から2 sgRNAためのprotospacer系列の表2.逆相補。
| シーケンス | |
| sgRNA-A | 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-A-RC | 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' |
| sgRNA-B | 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
| sgRNA-B-RC | 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' |
表3. Protospacer配列およびそれらの逆が「CACC」と「AAAC」で補完するには、BbsIで制限酵素を使用してpX330ベクターへのクローニングのために追加。
| シーケンス | |
| sgRNA-A | 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-A-RC | 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 ' |
| sgRNA-B | 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
| sgRNA-B-RC | 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' |
pX330ベクトルのU6プロモーターから表4 sgRNA発現はCACC配列の後および前のGヌクレオチドの添加によって増強される20マー。余分のGヌクレオチドの付加は、逆相補オリゴの3 '末端（ 例えば、sgRNA-A）におけるCヌクレオチドの添加を必要とする。 20マー（protospacer配列）の最初の位置は既にGヌクレオチドである場合は、別のGを追加する必要がない（ 例えば、sgRNA-B）および逆相補体の最終位置にCを追加する必要なしオリゴ。
Discussion
CRISPR / Cas9システムは、サイズの範囲のゲノム欠失を生成するために使用され得る。私たちは、削除の周波数が意図された削除サイズに関して反比例して変化することを観察したが、私たちは日常的に複数の二対立削除されたクローンを得100キロバイトまで最大1 Mbの欠失、および削除を回復することができました。我々は、細胞株に順次導入欠失の効率の損失が観察されなかった。この戦略は、多数の遺伝子および要素の組み合わせの欠失を作成するために使用することができる。対立遺伝子欠失クローンを取得するプロセスは、二対立遺伝子欠失12クローンの所望の数を得るために、欠失サイズに基づいてスクリーニングするために必要なクローンの最小数を推定することにより促進することができる。
確率分布における二対立遺伝子欠失の不在とアレル削除を得る能力は、関数の完全な喪失に関連する細胞致死性を示す可能性があります。低FRequencyまたは不在欠失は、（削除をスクリーニングするためのPCRプライマーを検証するために、正対照の不足）が悪いトランスフェクション、非効率的なsgRNAsまたは非効率的なPCRスクリーニングプライマーを含む、多くのシナリオを反映している可能性があります。 GFP +細胞は、トランスフェクション効率（ ステップ5.2参照）の代わりとして使用することができるので、GFP +細胞の減少は、おそらく悪いトランスフェクションを反射し、結果として生じる、削除効率を低下させた。非効率的なsgRNAの制御を助けることができる独立したスクリーニングプライマーを有する2つの異なるsgRNA対を用いてPCRプライマーをスクリーニングし、対立遺伝子の欠失クローンを得る機会を最大化。 GFP +細胞のための細胞選別は、欠失対立遺伝子のために豊かにします。この工程を省略することができるが、省略可能性が高いアレルまたは対立遺伝子欠失を有するものを同定するためのより多くのクローンをスクリーニングする必要になる。トランスフェクション効率を最適化することができる程度に、我々は、ゲノム編集効率を向上させることが予想される。
図2B）の部位で欠失-主な成果は、小さな〜1である。多くの場合、これらの対立遺伝子は、マイクロホモロジーベースの修理34,35の結果であると思われる。それは我々が記述するPCRに基づく検出戦略は、より大きな又はより複雑な挿入、欠失、逆位、または再配列を識別しないことに留意すべきである。これらのイベントはあまり一般的ですが、私たちはどちらも削除も非削除アンプリコンを検出することができているクローンを観察し、さらなる調査の際に、これらのより複雑な成果を反映している。
我々は、大規模なCRISPR /アレルと非欠失クローンからの非欠失対立遺伝子のCas9媒介「瘢痕」（ 図2B参照） を観察した。これらの「傷は "から構成され意図された欠失なしsgRNA切断部位で産生された小インデル（ すなわち、sgRNAs AとBの間に介在するセグメントの欠失）。これらの傷は、多くの場合、sgRNAによって標的認識を中断。そこで我々は、以前に同じsgRNAsを使用してsgRNAsに曝露した細胞における対立遺伝子をターゲット変更に注意を促すだろう。より成功した再標的化戦略は、認識部位の「瘢痕」以前とは異なる独特のsgRNAシーケンスを利用するであろう。 sgRNAs一対のエキソン配列（ 図1B、下部）を認識したときのケースでは、フレームシフト対立さえ欠失の不存在下で製造することができる。したがって、アレル欠失クローンは、機能喪失により非削除されたアレル12上のフレームシフト変異の高頻度にのために濃縮することができる。
38 - CRISPR / Cas9システムの一つの懸念は、オフターゲット効果、 すなわち、意図しないサイト36におけるゲノム修飾である。 R19ヌクレオチドCRISPR / Cas9ベースのオフターゲット効果39の頻度を減らすことができます- ecentレポートは17と短いガイドRNAがあることを示唆している。さらに、ニッカーゼで標的部位ごとに2つのガイドを使用して二重ニッキング戦略は、オフターゲット効果を最小限にしながら7 DSBを作成するために使用することができる。あるいは、RNAiに使用戦略と類似の、我々は、非重複protospacer配列とsgRNAsの異なる対がオフターゲット潜在的とは対照的に観察された表現型は、オンターゲットCRISPR / Cas9修飾の結果であることを実証するために使用されることを示唆している効果。便利な方法は、スクリーニングプライマー（ ステップ2を参照）の単一のセットは、複数のsgRNA対（ 図1A）のために使用することができるように、少なくとも二つの隣接するが重なり合わないsgRNA対を設計することであろう。また、不足している配列および/または破壊された遺伝子を再導入することによって削除細胞株を補完することとの因果関係を立証することができ与えられたゲノム欠失と表現型。
セルラーモデル系での作業生物学者のために、RNAiは機能ゲノミクスのための強力なツールを表現している。 42 -しかし、このアプローチの限界は、標的mRNA転写レベルの不完全な還元、同じ遺伝子を標的とする独立した試薬の効果の不均一性、及び種子ベースおよび非種子効果40を含む既知のオフターゲット効果が含まれている。ゲノム編集戦略は、これらの懸念の多くに対処することを約束し、将来の遺伝的摂動8,36,37のための刺激的な、補完的なアプローチを表している。従来の標的とすることによって、RNAiによる可能性と挑戦的ではない方法で、非コード遺伝的要素の研究は、25に近づくためにさらに、ゲノムの編集ができます。私たちが生産し、機能喪失型対立遺伝子を特徴づけるために、堅牢で具体的な方法として、CRISPR / Cas9によるゲノムの欠失の生成を促進する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| BSA, molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
| pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
| S.O.C. medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| BTX solution and 2 mm cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
| pmaxGFP plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
| HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 | |
| Plasmid |  Addgene |
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References
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