Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52118
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1,2,3,4
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology, Boston Children's Hospital, 3Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute
* These authors contributed equally

Protocol

1. CRISPR Ontwerp

  1. Ontwerp sgRNAs handmatig of met behulp van vrij beschikbare online tools 7. Gebruik deze tools te helpen identificeren gids sequenties die identiek genomische lucifers of bijna-wedstrijden minimaliseren van het risico van splitsing te verminderen weg van doelplaatsen (off-target effecten). Zorg ervoor dat de gids sequenties bestaan ​​uit een 20-mer ("protospacer sequentie") stroomopwaarts van een "NGG" sequence ("protospacer aangrenzende motief" of PAM) bij de genomische erkenning website.
    Opmerking: Figuur 1 beschrijft mogelijke deletie strategieën genen en niet-coderende elementen. Voor het maken van een gen knock-out, zal twee sgRNA zich binnen exons zelfs monoallelische deletieklonen verrijken voor verlies van functie. Dit komt door de hoge frequentie van indels gevormd van niet verwijderde allelen 12, die waarschijnlijk frameshift mutaties die leiden tot nonsense gemedieerde afbraak van het mRNA transcript (Figuur 1B) veroorzaken.
  2. Gebruik deZo begeleidt voor de beoogde schrapping van Pim1 in de muis (Mus musculus, Tabel 1, Figuur 2A).
    Opmerking: In dit voorbeeld sgRNA-A protospacer sequentie en PAM toevallig vallen op de bodem (Crick) streng terwijl sgRNA-B protospacer sequentie en PAM vallen op de bovenzijde (Watson) streng (Figuur 2A). Toch zal DSB optreden onafhankelijk van de oriëntatie van de protospacer sequence / PAM ten opzichte van de bovenste of onderste streng.
  3. Bepaal het omgekeerde complement (rc) van elke gids reeks. Voorbeeld omgekeerde complement sequenties van de Pim1 sgRNA uit tabel 1 zijn vermeld in tabel 2.
  4. Verkrijgen 24- of 25-mer oligo's voor elke gids en de bijbehorende omgekeerde complement inclusief bijkomende nucleotiden voor klonering en expressie doeleinden.
    LET OP: Hier het gebruik van de pSpCas9 (BB) plasmide (pX330) (Addgene plasmide ID 42230) bespreken we. Dit plasmide laat de gelijktijdigeuitdrukking van sgRNA en SpCas9, maar heeft geen markers voor selectie 7 bevatten. Andere constructen kunnen worden gebruikt, zoals pX458 (Addgene plasmide ID 48138) of pX459 (Addgene plasmide ID 48139), welke GFP en puromycine als selecteerbare merkers, respectievelijk, of constructen waarin meerdere sgRNAs expressie kan worden gebracht vanuit één plasmide bevatten.
    1. Add "CACC" voor de 20-mer gidssequentie en "AAAC" voor de gids reverse complement voor klonering in de vector pX330 met BbsI restrictie-enzym (tabel 3).
    2. Voeg een G nucleotide na de CACC-sequentie en voor het 20-meer als de eerste positie van het 20-meer niet G. sgRNA expressie van het U6 promotor van de pX330 vector wordt versterkt door de opname van een G nucleotide na de CACC-sequentie . Voeg een C aan het 3 'uiteinde van het omgekeerde complement oligo (bijv sgRNA-A in tabel 4). Het verkregen oligo zou 25-meer oligo's.
    3. Hoeooit, indien de eerste positie van de 20-mer (protospacer sequentie) is G, geen andere G voegen (bv sgRNA-B in Tabel 4) en geen C niet aan de eindpositie van de omgekeerde complement oligo. In dit geval zou de resulterende oligonucleotiden zijn 24-meer oligo's (Tabel 4).

2. Ontwerp Verwijdering Screening Primers

  1. Ontwerp een set primers intern in de volgorde die moet worden verwijderd ("non-deletie band") en een andere set primers stroomopwaarts en stroomafwaarts van de sgRNA klievingsplaatsen ("schrapping band"; Figuren 1-2). Bij afwezigheid van deletie, de "deletie band" is vaak te groot om efficiënt amplificeren. Typisch gebruiken primers ten minste 100 bp van de voorspelde knipplaats te zorgen detectie zou niet worden beïnvloed door een kleine indel het sgRNA doelplaats.
    1. Ontwerpen aanvullende primers te analyseren voor littekens (kleine indels geproduceerd in de sgRNA cleavage site zonder de beoogde schrapping). Gebruik een paar van voorwaartse en achterwaartse primers flankerende elke sgRNA target site (binnen 150-350 bp) aan de sgRNA target site te onderzoeken voor littekens te versterken. Dit kan nuttig zijn om de niet verwijderde allel karakteriseren monoallelische deletieklonen.
  2. Voor kleine deleties (zoals de "deletie band" kunnen nog versterken), opgelost amplicons op een agarose gel om te bepalen of inhoud is verenigbaar met de aanwezigheid of afwezigheid van deletie. Voor deze aanpak, kan de interne primers in stap 2.1 beschreven worden weggelaten.

3. CRISPR Klonen

  1. Versmelten en phosphorylate oligo's.
    1. Resuspendeer oligo bij een concentratie van 100 uM in DDH 2 O.
    2. Bereid een 10 ul reactie mix voor elke gids en zijn omgekeerde complement: 1,0 ul sgRNA 24- of 25-mer oligo (100 uM; zie stap 1.4), 1,0 ul sgRNA 24- of 25-mer reverse complement oligo (100 uM; zie stap 1.4), 1,0 gl 10x T4 ligatiebuffer, 6,5 gl DDH 2 O, en 0,5 pl T4 Polynucleotide Kinase (PNK) (10.000 E / ml).
      OPMERKING: gefosforyleerd oligo's kunnen in plaats daarvan worden besteld. Voor deze aanpak is het gebruik van T4 PNK weggelaten.
    3. Gloeien in een thermocycler met de volgende parameters: 37 ° C gedurende 30 min; 95 ° C gedurende 5 minuten en vervolgens uitlopen tot 25 ° C bij 5 ° C / min.
    4. Verdun oligo 01:10 in DDH 2 O (bijvoorbeeld 1,0 pi oligo + 9,0 pl DDH 2 O tot een concentratie van 1 uM opbrengst).
  2. Ligeer gehechte oligo in pX330 behulp van een Golden Gate assemblage kloneringsstrategie 26.
    1. Bereid een 50 ul reactie mix: 100 ng ronde pX330 vector, 1,0 ul gehechte oligo (1 micrometer; zie stap 3.1.4), 5,0 ul restrictie-enzym buffer (10x), 4,0 pi (20 U) BbsI restrictie-enzym (5.000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 ui (5 ug) BSA (20 mg / ml), 0,375 pl (750 U) T4 DNA ligase (2000000 U / ml), en H2O tot eindvolume van 50 pi. Deze reactie kan naar beneden worden geschaald tot een kleinere eindvolume indien nodig.
    2. Run monsters in een thermocycler met de volgende parameters: cycli 1-20 (37 ° C gedurende 5 min, 20 ° C gedurende 5 minuten); Cyclus 21 (80 ° C gedurende 20 min). Deze fietsen omstandigheden het toelaten voor de spijsvertering en ligatie te voorkomen in een reactie (zie stap 3.2).
    3. Transformeren 10 ui DH5a E. coli-cellen met 1 pi reactie (van 3.2.1 - 3.2.2).
    4. Plate op een lysogenie bouillon (LB) agar plaat met 100 ug / ml ampicilline en incubeer O / N bij 37 ° C.
  3. Pick 2-3 kolonies en te enten in een mini-prep cultuur.
    1. Uitvoeren mini-prep voor elk monster en de volgorde elke kolonie met een U6 promotor voorwaartse primer: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Dit is arepresentative sequentieprimer; andere flankerende primers kunnen worden gebruikt.
  4. Kies een sequentie geverifieerd kolonie en te enten in een maxi-prep cultuur. Prep maat worden geschaald op basis van de gewenste DNA opbrengst.
  5. Voeren maxi-prep voor elke CRISPR / Cas9 construct.

4. transfecteren CRISPRs in cellen van belang

LET OP: Dit protocol omvat de levering van CRISPR / Cas9 plasmiden door elektroporatie 27. Dit protocol wordt gedetailleerd beschreven voor muizen erythroleukemie (MEL) cellen, een suspensie cellijn. Het kweekmedium alle stappen uit DMEM aangevuld met 2% penicilline / streptomycine en 1% L-glutamine, die wordt gebruikt om MEL cellen. Kan echter transiënte transfectie van CRISPR / Cas9 plasmiden met succes worden aangepast aan verschillende celtypen met kweekomstandigheden en transfectie strategieën voorkeur per celtype. Hoewel MEL cellen suspensie cellen instructies hechtende cellen have ook opgenomen.

  1. Zorg ervoor dat er 2 x 10 6 cellen per CRISPR paar. Resuspendeer 2 x 10 6 cellen in 100 pl van elektroporatie oplossing en aan elektroporatie cuvet.
    1. Voeg 5 ug van elk CRISPR / Cas9 construct (10 ug totaal). Voeg 0,5 ug van GFP expressie construct.
  2. Electroporate cellen met 250 volt bij 5 msec in een 2 mm cuvette met een elektroporatie systeem.
    OPMERKING: U kunt ook gebruik maken van een andere transfectiemethode zoals kationische liposoom-gebaseerde transfectie. Optimaliseren transfectie voorwaarden voor elke cellijn met een reporter construct robuuste plasmide levering te garanderen voordat genoom bewerken.
  3. Onmiddellijk overbrengen oplossing van cuvette in 1 ml van de cultuur media na elektroporatie. Minimaliseren van de tijd tussen elektroporatie en overbrengen van de oplossing in media cellevensvatbaarheid bevorderen.
  4. Incubeer bij 30-37 ° C gedurende 24-72 uur. 30 ° C kan verhogen genoombewerken efficiency, maar 37 ° C is aanvaardbaar.

5. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van getransfecteerde cellen

  1. Bereid cellen voor FACS door ze te filtreren door een 50 urn filter in een FACS buis.
  2. FACS sorteren boven ~ 3% van GFP positieve cellen om te verrijken op cellen die hoge niveaus van de CRISPR ontvangen / Cas9 constructen.
  3. Plaat gesorteerde cellen afzonderlijk met 96 putjes met ronde bodem platen met sorteermachine of met beperkende verdunning 30 cellen per 96 putjes ronde bodemplaat. Optimaliseren plating het gebruikte celtype in beperkende verdunning voorafgaand aan deze stap tot ongeveer 30 cellen per 96-well plaat betrouwbaar verkrijgen.
  4. Omvatten 100 ul per putje van celkweek media.
  5. Voor het overige gesorteerde cellen ("bulk") die niet geplateerd werden, bevriezen helft van de cellen voor toekomstig plating. Plate de andere helft voor de screening en primer validatie (zie stap 6).
    LET OP: Dit pROTOCOL is voor suspensiecellen. Hechtende cellen kunnen ofwel groeien als individuele cellen in 96-well plaat met vlakke bodem of in een 10 cm schaal bij lage concentratie zodat afzonderlijke eencellige afgeleide klonen kunnen worden opgenomen en verplaatst naar een platbodem 96-well plaat.
  6. Laat de bulk cellen te incuberen bij 37 ° C gedurende 3-7 dagen en laat de klonen te incuberen bij 37 ° C gedurende 7-14 dagen. Variëren deze tijden afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellijn.
    LET OP: Deze incubatietijd zorgt voor voldoende celproliferatie voor het screenen van genomische DNA (gDNA) voor de beoogde verwijdering door PCR (zie stap 6.1 en 7.1). De bulk cellen zijn voldoende verspreid wanneer de concentratie hoger is dan ~ 100.000 cellen / ml of voor hechtende cellen, hebben de cellen ~ 80% samenvloeiing bereikt. De klonen zijn voldoende verspreid eenmaal macroscopisch zichtbaar met ~ 2 mm diameter.

6. Primer Validatie en Screening op CRISPR / Cas9-Mediated Verwijdering

  1. Isoleer gDNA van ouderlijke en bulk gesorteerde cellen door resuspenderen ouders en bulk cel pellets in 50 ul van DNA-extractie-oplossing.
    OPMERKING: algemeen ~ 100.000 cellen worden gebruikt voor DNA-extractie, hoewel een groot aantal celaantallen aanvaardbaar. Het grootste gesorteerd cellen bestaan ​​uit een polyklonale populatie blootgesteld aan sgRNA-A en sgRNA-B (zie stap 5). Het doel van de volgende PCR primers valideren en verifiëren van de aanwezigheid van de beoogde genomische deletie.
  2. Run monster in thermocyclusinrichting en voer het volgende programma: 65 ° C gedurende 6 min, 98 ° C gedurende 2 minuten te gDNA halen. Meet de DNA concentratie.
    Opmerking: hoewel stappen 6.1 en 6.2 aanbevolen een efficiënte werkwijze voor DNA extractie, kan elke werkwijze voor genomisch DNA isolatie worden gebruikt kunnen uitvoeren van PCR in stap 6.3.
  3. Monteer een 20 ul PCR met de volgende onderdelen: 10 pi 2x PCR-mix, 0,5 ul voorwaartse primer (10 _6; M), 0,5 ui reverse primer (10 uM), 50-100 ng gDNA, en H2O tot 20 ul. Gebruik de primers ontworpen in stap 2 hierboven. Gedrag PCR voor "non-deletie band" en "verwijdering band" in afzonderlijke reacties.
    OPMERKING: Tal polymerasen worden gebruikt voor stap 6.3.
    1. Run monsters in een thermocycler met de volgende parameters: 95 ° C gedurende 15 min, 35 cycli van (95 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 1 min) en 72 ° C gedurende 10 min . Optimaliseren PCR-omstandigheden voor elk primerpaar ontworpen op basis van testen bulk gesorteerde cellen.
  4. Run monsters op 2% agarosegel bij 10 V / cm met 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer.
  5. Onderzoek op de aanwezigheid / afwezigheid van niet-deletie en deletie banden (figuur 2). Beschouw de multiplexing "deletie" en "niet-deletie" PCR-primerparen in een enkele reactie. Optimaliseren multiplexingin een polyklonale populatie (dat wil zeggen, bulk gesorteerde cellen) voor het screenen van individuele klonen. Het is essentieel dat de deletie en niet-deletie amplicons gemakkelijk worden opgelost op een agarose gel voor multiplexing.

7. Screening CRISPR / Cas9 Klonen voor deleties en Clone Selection

  1. Verende cellen overdracht van alle klonen een 96-well plaat die reeds bevat 50 pi celkweekmedium per goed voor een eindvolume van 150 pl. Dit vergemakkelijkt screening doordat een multichannel pipet wordt gebruikt voor de rest van de stappen in stap 7.
    1. Pipetteer 50 ul van elk putje (waarbij 100 gl per putje) aan een 96-well PCR plaat met een multichannel pipet.
    2. Centrifuge PCR-plaat bij 400 xg gedurende 5 minuten en verwijder supernatant door de knop van de PCR-plaat over een wastafel. Voeg 50 ul van DNA-extractie-oplossing per putje en resuspendeer. Ga verder met stap 7.3 voor suspensiecellen.
    3. Voor hechtende cellen, aspireren media. Voeg 20 ul van 0,05% trypsine-EDTA aan elk putje met een kloon aanwezig.
      1. Resuspendeer cellen in 200 pl medium. Pipet mengen om cellen los.
      2. Plaat 100 pl elk in twee afzonderlijke 96-well platbodem platen. Houd een plaat om voor klonen te groeien en gebruik de andere plaat aan elke kloon voor schrappingen screenen.
      3. Voeg nog eens 100 pl aan elk putje voor een totaal volume van 200 ui. Wacht 24-72 uur om cellen te groeien.
      4. Zuig media. Voeg 50 ul DNA-extractie-oplossing per well, resuspendeer en transfer naar 96-wells PCR-plaat. Ga verder met stap 7.3.
    4. Pak de gDNA van klonen. Run monster thermocycler: 65 ° C gedurende 6 minuten en 98 ° C gedurende 2 min gDNA extraheren.
    5. Scherm elke kloon met dezelfde PCR-primers en de reactieomstandigheden geoptimaliseerd op bulk cellen (zie stap 6).
    6. Selecteer het klonen idenceerd met de gewenste deletie en naar grotere plaat of kolf groei.

    8. Validatie van Biallele deletieklonen

    1. Om de verkregen klonen karakteriseren en bevestig een succesvolle knockout evalueren klonen op DNA en RNA en / of eiwitniveaus.
      1. Om het DNA te evalueren, amplificeren deletie bands biallele deletieklonen met een corrigerend polymerase en kloon amplicons (bijvoorbeeld met een PCR klonering kit) in een plasmidevector. Transformeer de plasmide in DH5a E. coli-cellen en plaat op LB agar platen met de desbetreffende antibioticum. Selecteer meerdere kolonies, mini-prep elk een, en bloot elke kloon te Sanger sequencing om elke verwijdering allel 28 karakteriseren - 30. Herhaling van de PCR-test voor verwijdering na het eerste scherm, wordt het juiste kloon geselecteerd en reproduceerbaarheid.
      2. Aan het RNA te evalueren, presteren RT-qPCR voor gene expressie van het betreffende gen 30,31.
      3. Om het eiwit te evalueren, voert een immunoblot met een antilichaam tegen het betreffende eiwit 33.

Representative Results

Het doel van dit experiment was het schrappen van Pim1 in MEL cellen. Het gebruik van meerdere niet-overlappende sgRNA paren (dwz onafhankelijk protospacer sequenties) kan helpen om te controleren voor off-target effecten (Figuur 1A). Een consistente fenotype zou waarschijnlijk leiden tot een on-target effect in tegenstelling tot een gewone off-target effect door meerdere onafhankelijke protospacer sequenties. Elk paar zou leiden tot de productie van een unieke verwijdering breekpunt. Als dicht bij elkaar (dat wil zeggen, n minder dan ~ 150 bp), kan dezelfde screening primers worden gebruikt om schrappingen geproduceerd door elke set van sgRNAs detecteren. Genomische deleties kunnen genen verstoord door sgRNA paren op verschillende locaties ten opzichte van het gen (Figuur 1B). Bijvoorbeeld kan de sgRNA pair een gen voor deletie van het gehele gen lichaam flankeren; het paar kunnen worden gevestigd in twee exons, met het potentieel om frameshift indels maken zelfs indien één of beide alleles werden niet verwijderd; of het paar kan een specifiek exon flankeren verstoring van een bepaalde isovorm mogelijk.

De deletie strategie voor Pim1 was het ontwerpen flankerende sgRNAs het gehele gen lichaam, een 8 kb deletie (figuur 2) verwijderen. Deze strategie werd gekozen voor een deel te wijten aan de relatief kleine omvang van de Pim1 gen. Dit voorbeeld toont een PAM (groen) aan de bovenzijde (Watson) streng en een PAM op de bodem (Crick) streng; Maar DSB is onafhankelijk van PAM volgorde lokalisatie aan de boven- of onderkant streng. sgRNA pairs zowel PAM sequenties op de bovenste streng, zowel aan de onderste streng, of één van elk. Met de hierboven beschreven protocol, werden twee sgRNA ontworpen, gekloneerd in de expressievector pX330, en MEL cellen geleverd door elektroporatie met een GFP reporter (Figuur 2A). De top 3% van GFP + cellen werden naargelang twee dagen na de elektroporatie en klonaal uitgeplaat bij beperkte verdunning. Scherming primers werden ontworpen zoals beschreven in stap 2 en zoals getoond in figuur 2. PCR-omstandigheden werden geoptimaliseerd gebruik gDNA geïsoleerd uit ouderlijke MEL ​​cellen en van "bulk" gesorteerd cellen.

10 dagen na het plateren, werd gDNA geïsoleerd van alle klonen en gescreend voor verwijdering via PCR, waarbij niet-deletie, monoallelische en biallele deletieklonen volgens de patronen van niet-deletie (ND) en verwijdering (D) amplicons geïdentificeerd (Figuur 3) . Niet-deletie klonen werden geïdentificeerd als de aanwezigheid van de niet-deletie amplicon en de afwezigheid van de deletie amplicon. Monoallelische klonen werden geïdentificeerd als de aanwezigheid van zowel de niet-deletie en verwijdering amplicons. Biallele klonen werden geïdentificeerd als de afwezigheid van de niet-deletie amplicon en de aanwezigheid van de deletie amplicon. Voor deze schrapping, werden 400 klonen gescreend waarvan 126 monoallelische deletieklonen en 32 biallelisch delet geïdentificeerd ion klonen (het is belangrijk op te merken dat deletie frequentie varieert met schrapping grootte 12). Biallelisch deletieklonen werden geselecteerd en verplaatst naar kolven met 8 ml van de media. Nadat men 5 dagen groei werd elke kloon opnieuw getest door PCR van gDNA bevestigen biallele deletie en verwijdering amplicons werden onderworpen aan Sanger sequentiebepaling de precieze deletie (figuur 2B) te identificeren. Heterogeniteit binnen de verwijdering ampliconen weerspiegelt onvolmaakte-indel vormen NHEJ reparatie. Sequencing van de niet-deletie allel in monoallelelic deletieklonen ontdekt INDELs in de meeste gevallen blijkt dat ook de niet verwijderde allel frequent wordt uitgegeven door CRISPR / Cas9, die belangrijk zijn voor toepassingen waar zowel monoallelische en biallele deletieklonen vereist . RNA werd geïsoleerd uit biallele deletieklonen en RT-qPCR geanalyseerd om verlies van Pim1 expressie te bevestigen (Figuur 4).

manieren "> Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van eventuele schrapping strategieën. (A) Twee voorbeeld sgRNA paren voor genomische deleties (getoond in zwart en oranje, respectievelijk). De blauwe pijlen geven primers voor de niet-deletie amplicon te detecteren en rode pijlen geven primers om de verwijdering amplicon te detecteren. sgRNA posities 17 en 18 zijn gemarkeerd in het rood en blauw op sgRNA-sites-A 1 / A 2 en worden gemarkeerd in paars en oranje op sgRNA-sites-B-1 / B 2 met een rode lijn geeft de voorspelde Cas9 splitsing tussen de posities 17 en 18. (B)-CRISPR gericht breuklijnen worden weergegeven als verticale zwarte lijnen. De blauwe pijlen geven primers aan de niet-deletie amplicon te detecteren en rode pijlen geven primers om de verwijdering amplicon te detecteren. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.

Figuur 2
Figuur 2. Strategie voor de productie en verwijdering van sporen Pim1, met volgorde deletie en niet-deletie allelen. (A) Schematische voorstelling van de PCR gebaseerde screening strategie Pim1 deletieklonen identificeren. Een primer paar ligt intern om de verwijdering (blauwe pijlen) en één primer paar is gelokaliseerd buiten de deletie (rode pijlen). sgRNA sequenties (protospacer sequenties) getoond in het paars. De verticale rode lijnen geven de voorspelde Cas9 splitsing tussen posities 17 en 18 van het sgRNA sequentie. (B) Sanger sequentiebepaling onthult indel formatie op het sgRNA herkenningsplaats. sgRNA sequenties worden weergegeven in paars en PAM sequenties in het groen. Verwijdering gebeurtenissen sheigen door een equivalent aantal dash merken en inserties zijn blauw gekleurd. Verticale rode lijnen geven de voorspelde knipplaats, tussen de posities 17 en 18 van de sgRNA. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve gel identificeren van niet-deletie, monoallelische en biallele klonen. Voor elke kloon, de linker laan vertegenwoordigt de niet-deletie amplicon ("ND" blauw) en de rechterbaan is de deletie amplicon ("D" in rood ). Afzonderlijke klonen worden gescheiden door stippellijnen. De drie monoallelische deletie klonen klonen 5, 6 en 2. Drie biallele deletie klonen klonen 15, 17 en 13. Zoals in de sequentiedata, de deletie band C alleenstaande 13 heeft een kleinere afmeting door grotere deleties de deletieverbinding.

Figuur 4
Figuur 4. Verlies van Pim1 expressie in biallele deletieklonen. Pim1 expressie werd berekend voor twee biallele verwijdering klonen door RT-qPCR. Gegevens zijn genormaliseerd naar GAPDH met de 2 - ACt methode.

Protospacer Sequence
sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '

Tabel 1. 20-mer protospacer sequenties voor twee sgRNA voor de verwijdering van Pim1.

543 "> Omgekeerde complement van Protospacer Sequence sgRNA-A-rc 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

Tabel 2. omgekeerde complement van de protospacer sequenties voor de twee sgRNA uit tabel 1.

Sequenties
sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 '
sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '
sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

Tabel 3. Protospacer sequenties en hun omgekeerde aanvult met "CACC" en "AAAC" toegevoegd voor het kloneren in de pX330 vector behulp BbsI restrictie-enzym.

Sequenties
sgRNA-A CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT 5'-3 '
sgRNA-A-rc AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC 5'-3 '
sgRNA-B CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA 5'-3 '
sgRNA-B-rc AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC 5'-3 '

Tabel 4. sgRNA expressie van het U6 promotor van de pX330 vector wordt versterkt door de toevoeging van een G nucleotide na de CACC-sequentie en voor het20-mer. De toevoeging van een extra G nucleotide vereist de toevoeging van een C-nucleotide aan het 3'-uiteinde van de reverse complement oligo (bijv sgRNA-A). Indien de eerste positie van de 20-mer (protospacer sequentie) is reeds een G nucleotide, hoeft een ander G voegen (bv sgRNA-B) en hoeft C aan de eindpositie van de omgekeerde complement oligo.

Discussion

De CRISPR / Cas9 systeem kan worden gebruikt om genomische deleties van een aantal formaten te genereren. Hoewel we hebben waargenomen dat de frequentie van deletie varieert omgekeerd met betrekking tot beoogde deletie grootte hebben we kunnen deleties tot 1 Mb, schrappingen terug tot 100 kb routinematig verkregen meerdere biallele verwijderd klonen. We hebben geen verlies in efficiëntie van sequentieel introduceren schrappingen in een cellijn waargenomen. Deze strategie kan worden gebruikt voor het maken van combinatorische deletie van talrijke genen en elementen. Het verkrijgen biallele deletie klonen kunnen worden versneld door schatting van het minimale aantal klonen moeten worden gescreend op basis schrapping grootte om het gewenste aantal klonen te verkrijgen met biallele deletie 12.

De mogelijkheid om monoallelische deletie met de afwezigheid van biallele deletie op probabilistische te bekomen kon cel letaliteit geassocieerd met volledig verlies van functie te geven. Lage frequency afwezig of deleties kunnen een aantal scenario's met slechte transfectie inefficiënt sgRNAs of inefficiënte PCR screening primers (bij gebrek aan een positieve controle voor PCR-primers valideren screenen voor verwijdering) weerspiegelen. GFP + cellen kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor transfectie-efficiëntie (zie stap 5.2), dus een vermindering van GFP + cellen waarschijnlijk reflecteert slechte transfectie en een resulterende verminderde deletie efficiëntie. Met behulp van twee verschillende sgRNA paren met onafhankelijke screening primers kunnen helpen bij het controleren van inefficiënte sgRNA en screening PCR-primers en het maximaliseren van kansen op het verkrijgen biallelisch deletieklonen. Celsorteren voor GFP + cellen een verrijking voor verwijdering allelen. Hoewel deze stap kan worden weggelaten, zal nalaten waarschijnlijk noodzaken screening meer klonen die met monoallelische of biallelisch schrappingen identificeren. In de mate dat de transfectie-efficiëntie kan worden geoptimaliseerd, zouden we verwachten genoom bewerken efficiency worden verbeterd.

(figuur 2B). Vaak lijken deze allelen het resultaat van microhomology gebaseerde reparatie 34,35 zijn. Opgemerkt zij dat de PCR gebaseerde detectie strategie beschrijven we niet groter of ingewikkelder inserties, deleties, inversies of herrangschikkingen identificeert. Hoewel deze gebeurtenissen komen minder vaak voor, hebben we klonen waarin noch verwijderen noch niet-deletie amplicons gedetecteerd konden worden waargenomen, en bij nader onderzoek weerspiegelen deze meer complexe uitkomsten.

We hebben waargenomen uitgebreide CRISPR / Cas9 gemedieerde "littekens" niet-deletie allelen van monoallelische en niet-deletie klonen (zie figuur 2B). Deze "littekens" bestaan ​​uitkleine INDELs geproduceerd in het sgRNA splitsingsplaats zonder de beoogde deletie (dwz deletie van het tussenliggende segment tussen sgRNAs A en B). Deze littekens onderbreken vaak doelwit erkenning door de sgRNA. Daarom willen wij u voorzichtig te dringen in retargeting allelen in cellen eerder zijn blootgesteld aan sgRNAs met dezelfde sgRNAs. Een meer succesvolle retargeting strategie zou uniek sgRNA gebruiken sequenties onderscheiden van vroeger "littekens" erkenning sites. In gevallen waarin een paar sgRNAs herkent exon sequenties (Figuur 1B, onder) kan leeskader allelen, zelfs bij afwezigheid van deletie geproduceerd. Daarom kan monoallelische deletieklonen worden verrijkt voor verlies-van-functie door de hoge frequentie van frameshift mutaties op het allel 12 niet-gewist.

Een zorg met de CRISPR / Cas9 systeem is off-target effecten, dat wil zeggen, genomische modificatie bij onbedoelde locaties 36-38. RECENTE rapporten hebben gesuggereerd dat korter gids RNA's met 17-19 nucleotiden van de frequentie van CRISPR kan verminderen / Cas9-based off-target effecten 39. Daarnaast kan een dubbel-nicking strategie met behulp van twee gidsen per doelgroep met een nickase worden gebruikt om DSB's maken terwijl het minimaliseren van off-target effecten 7. Alternatief, analoog aan strategieën voor RNAi, stellen we voor dat verschillende paren sgRNAs met niet-overlappende protospacer sequenties worden aangetoond dat het waargenomen fenotype is het resultaat van het betreffende target CRISPR / Cas9 wijziging in tegenstelling tot een mogelijke off-target effect. Een handige aanpak zou zijn om ten minste twee aangrenzende, maar niet-overlappende sgRNA paren zo te ontwerpen dat een enkele set van screening primers (zie stap 2) kan worden gebruikt voor meerdere sgRNA paren (Figuur 1A). Bovendien, als aanvulling op een deletie cellijn door de herinvoering van de ontbrekende volgorde en / of verstoorde gen kan een causaal verband tussen onderbouweneen bepaalde genomische deletie en fenotype.

Voor biologen werken met cellulaire modelsystemen, heeft RNAi een krachtig hulpmiddel voor functionele genomica vertegenwoordigd. Echter, de beperkingen van deze aanpak hebben opgenomen onvolledige reductie in target mRNA transcript niveaus, heterogeniteit van het effect van de onafhankelijke reagentia richten hetzelfde gen, en bekende off-target effecten waaronder zaad gebaseerd en niet-zaad effecten 40-42. Genoom bewerken strategieën beloven om veel van deze problemen aan te pakken en vertegenwoordigen een boeiende, complementaire aanpak voor potentiële genetische verstoring 8,36,37. Bovendien genoom bewerken maakt de studie van niet-coderende genetische elementen zodanig niet mogelijk RNAi en uitdagende conventionele benaderingen voor targeting 25. We moedigen generatie van genomische deleties door CRISPR / Cas9 als een robuust en specifieke methode om te produceren en te karakteriseren verlies-van-functie allelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, molecular biology grade New England Biolabs B9000S
BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX solution and 2 mm cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
Plasmid Addgene 42230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
  6. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  9. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  10. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Canver, M. C., et al. Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  13. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).
  14. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. , (2014).
  15. Wang, T., et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Niu, Y., et al. Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  18. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  19. Xie, K., Yang, Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).
  20. Waaijers, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).
  21. Bassett, A. R., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).
  22. Schwank, G., et al. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  23. Wu, Y., et al. Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).
  24. Lappalainen, T. M., et al. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).
  25. Bauer, D. E., et al. An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level. Science. 342 (6155), 253-257 (2013).
  26. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3, e3647 (2008).
  27. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).
  28. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  29. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  30. Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. Molecular cloning of PCR products. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).
  31. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).
  32. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas. J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).
  33. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  34. McVey, M., Lee, S. E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).
  35. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  36. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  37. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. , (2014).
  38. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  39. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).
  40. Alemán, L. M., Doench, J., Sharp, P. a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects. RNA. 13 (3), 385-395 (2007).
  41. Anderson, E. M., et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14, 853-861 (2008).
  42. Marine, S., et al. Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens. Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).

Tags

Molecular Biology CRISPR Cas9 Genome Engineering Gene Knockout Genomic verwijdering genregulatie
Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin,… More

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter