Abstract
果蝇蛹发展的内在过程可以转移和扭曲眼球上皮细胞的方式，使各个细胞的行为很难在活细胞成像跟踪。这些方法包括：视网膜旋转，细胞生长和有机体的运动。此外，在上皮的拓扑，包括细微凸块和凹凸褶皱经常引入作为蛹被用于成像准备，使其具有挑战性获得在单个焦平面在焦像以上几个小眼。这里的工作流程概述了补救这些问题，让细胞过程中果蝇蛹眼睛的发育很容易分析。适当上演蛹被布置在可容易地装配在大多数实验室成像钻机泛素- DE-钙粘蛋白：GFP和GMR-GAL4驱动的UAS-α连环蛋白：GFP被用于可视化小区边界在眼上皮1 -3。反褶积之后是施加到在多个焦平面捕获荧光图像，产生用于每个时间点的最大的投影图像，并使用图像编辑软件增强。比对算法用于快速稳定多余的动作，使得单个细胞的行为更容易追踪。
Introduction
化合物果蝇眼睛的特征在于它的〜750小眼由一个蜂窝状晶格附件色素细胞4,5的隔开的定型装置。局部细胞运动，细胞生长，改变细胞形状和细胞凋亡：这些色素细胞是由事件的协调组合图案化。这种上皮现场可视化允许一个研究在生理学相关和泰然自若的三维环境支撑这些事件的分子机制。
相较于以前的协议6,7，这里概述的技术结合用于稳定外部组织的运动，不能从成像过程耦合的有效方法。这种方法提高了在显影果蝇蛹眼上皮细胞的行为的研究- ，生长，旋转的组织，并移过成像的过程。此外，运动稳定技术去这里划线将是在无关的运动发生其他上下文研究细胞是有用的。
可视化细胞界限在果蝇视网膜领域，产生了转基因飞线表达UBI-DE-钙粘蛋白：GFP和UAS-α-catenin的：GFP在眼部专用的驱动程序GMR-GAL4 1-3的控制权。使用两个GFP标记膜标记允许小区边界的在较低强度的光的可视化。本上重复暴露于高能量波长的光，使增加的帧速率和电影的持续时间最小化组织损伤和光漂白。为了提高转基因的RNAi，UAS-DCR-2也被纳入到第二飞线8疗效。
在以前协议的第三次更新，这是很容易组装在大多数实验室一个简单的成像钻机描述。该装置避免了要求有一个专门的成像řIG一所大学的“加工车间”或类似的服务产生。该成像钻机类似于用于其它图像蛹组织9,10。
这里介绍的是可以用来直接评估，经过17至42小时puparium形成（小时APF）有助于眼睛的图案来自〜的形态发生事件的简单的活细胞成像协议。具体地，该协议使得人们能够确定蛹发育过程中修饰基因表达的后果。
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Protocol
图3示出的实验程序的概要。
1.组织准备
- 要确定目标基因的表达修饰的后果，双份以下的交叉，在25℃保持C：UAS-转基因 （男性）X GMR-GAL4; UAS-α-猫：GFP，UBI-DE-加元：GFP; + / SM5-TM6b（处女女）注：要获得控制组织交叉UAS-lacZ的男性为GMR-GAL4; UAS-α-猫：GFP，UBI-DE-加元：女性GFP。 β半乳糖苷酶产生在视网膜中的细胞行为没有缺陷。
- 为了提高转基因的RNAi的疗效，跨UAS-RNA干扰雄性GMR-GAL4，UAS-DCR-2; UAS-α-猫：GFP，UBI-DE-加元：GFP; + / SM5-TM6b处女的女性。
注：在细胞行为表达异位DCR-2已经观察到偶尔的缺陷在视网膜（数据未示出）。警惕，建议如果使用这种方法。 - S选白色预蛹适当的基因型和地点1.5 ml离心管。如果蛹表达DCR-2，选择男或女蛹：UAS-DCR-2，X染色体上的插入，表达是男性更强。蛹应在0小时的APF蛹壳的色素前绝育手术 - 男性性腺如在蛹（大约三分之一从后）的侧面大半透明地球仪可见。
- 孵育含蛹，在一个干净的塑料提示框，在25℃的离心管。为了防止蛹的地方干燥10 平方厘米片组织，浸泡在蒸馏水中，将尖端盒。
注意：如果湿度在尖部 - 框变得太高蛹壳可能会变得潮湿和难以在后续步骤中进行解剖。 - 孵育适当的时间。为了捕捉构图眼有关的细胞行为，准备蛹成像约17小时APF，20小时APF或24小时APF.查看时，特定的细胞行为是最好的观察作进一步的讨论代表性的成果。
- 将一块新鲜的双面胶带上一个黑色的SYLGARD解剖盘。定位蛹，背侧，与坚持双面胶带（ 图1A）蛹的头。尝试不坚持蛹的胸部和腹部地区的双面胶带。用钳子小心地提起并取出鳃盖，露出蛹头。沿蛹壳的侧撕到区域露出围绕一只眼睛。
- 轻轻地取下胶带蛹。如果蛹仍粘附的，施加一个小体积的蒸馏水，以结蛹壳和带之间，以削弱的粘合。
2.安装
- 构造从吸墨纸小15毫米2帧和冲头在middlethat一个孔为5.5毫米的直径（ 图1B）。浸泡在蒸馏水中并将其放置在中心的显微镜载玻片。使用30毫升注射器，挤压出凡士林的均匀环以围绕吸墨纸帧。确保凡士林环稍高于蛹的宽度和该环的直径略微大于盖玻片的宽度小于高。
- 添加一个小珠凡士林直接到幻灯片，在冲压成的吸水纸（ 图1C）.Carefully安排蛹，在其一侧洞口，由凡士林珠（ 图1D）的支持。
- 放置盖玻片上凡士林环的顶部，使得其接触上述眼球神经上皮（ 图1D）的上皮。轻轻压缩编制以密封的凡士林盖玻片并生成蛹眼睛区域和盖玻片之间的小平面的接触表面。
3.荧光成像
- 图像使用蛹准备荧光显微镜。每7分钟捕获通过眼睛神经上皮的心尖域，在粘着路口的区域连续切片。
注：a）适当的串行部分通常是4-5元的z栈包括0.2微米的Z-步骤。 b）在上皮细胞的拓扑结构，包括轻度颠簸和不规则的褶皱，可能使其具有挑战性的收购聚焦图像组织大型的区域。而成像，人们可以发现感兴趣的区域的一部分，以在聚焦，和相邻区域是失焦。包括蒸馏水蛹眼睛和盖玻片之间的小液滴可以消除一些急性组织褶皱而不是蛹眼形态的早期阶段的轻度不均匀拓扑特征。在这些情况下，过采样的组织通过扩展Z堆叠直到在焦切片获取整个字段。三）捕获连续切片，每7分钟应使活成像为3至4个小时没有显著热镀ction在GFP荧光可能危害图像质量的强度。较短的时间间隔可以降低成像的总时间。 - 继续成像为3至4个小时。不要使用自动对焦和时间的函数，是许多荧光显微镜，因为蛹增长和血淋巴抽移动视网膜的位置警惕再聚焦，需要每14-21分钟。注：该成像超过4时间可能会减缓或停滞眼睛的形态。
- 使用适当的反卷积软件，以减少背景和增强连续切片图像的对比度。对于每一个Z堆栈文件，请在LAS AF软件以下（见表材料）：导航到工具面板中，选择3D反卷积，然后单击应用。
- 生成每个卷积堆栈文件的最大投影（MP）影像：导航到工具面板中，选择3D投影，然后单击应用。
注：最大投影的算法可能无法生成一个统一的LY聚焦图像用于组织已经被过取样。一个技术磨砺出焦地区在步骤5.2概述。
4.成像后蛹救援和表型验证
- 为了解决文物是否引进或成像过程中损害了蛹，小心地取出从成像钻机蛹：使用镊子取出盖玻片和蛹转移到食物的干净的小瓶。储存在室温或25℃，直到成年果蝇出现。
- 仔细检查成人眼睛的表型，并比较成蝇新兴从原始蝇交叉的眼睛。
5.图像处理
- 自动图像对齐方式：
注：本次现场果蝇组织将转向和整个成像过程成长。因此，图像的中心聚集在连续的时间点可能不对应于同一点，在果蝇的组织。在另外的整个视网膜盘片旋转21〜23小时之间APF约30°。为了突出单个细胞的行为和减少因有机体的生长杂念，调整每个MP image.While这可以手动执行，这里使用的图像编辑软件（ 见表材料 ）有内置的算法，可以加快这一进程。- 从主菜单，打开脚本，选择将文件加载到堆栈的文件选项卡。
- 导入MP图像文件转换加载图层面板中，选择确定。确保尝试自动对齐源图像选项没有被选中。
注意：如果选择此选项，该软件可使用比对算法的扭曲的图像数据。 - 一旦所有的MP文件已加载到图层面板中，确保所有的图像都按时间顺序，例如，最早的时间点是在层堆栈的顶部。如果层不按正确的顺序，拖放他们，直到他们被命令正确。
- 从主菜单中的编辑选项卡中选择自动对齐图层。选择重新定位，然后单击确定。
- 如果自动对齐算法不能帧定位到相关的焦点，让使用移动工具小幅调整。
- 复合锐化：
注：离焦的初始的MP图像的区域可以通过“裁剪”在LAS AF软件的相应解卷积堆栈进行锐化。裁剪一叠文件允许一个手动限制经受最大投影算法的z堆栈的间隔。- 找到在工具面板中的裁剪功能（进程选项卡下）。手动限制的最初和最后的片，使得它们仅跨越最初失焦区域内的粘合带。单击应用生成针对该区域优化的新的堆栈文件。
- 生成一个新的投影最大的本地优化堆栈和出口为TIFF文件。
- 在日Ë图像编辑软件（见表材料），开放式脚本（位于主菜单中的文件选项卡），然后选择将文件加载到堆栈。
- 导入特定时间点进入加载图层面板中的初始MP图像文件，并在本地优化的MP文件，并选择确定。确保尝试自动对齐源图像选项没有被选中。
- 选择这两个图层的图层窗格，然后选择自动混合图层（位于主菜单中的编辑选项卡）来自动屏蔽两个图像的适当区域，产生一个统一的，集中的视网膜领域。保存此合成图像为TIFF文件。
- 重复步骤5.2.1到5.2.5的所有不理想的MP图像。
- 进一步的调整：旋转，裁剪和调整图层电影的水平：
- 与所有层的选择，使用变换工具（编辑>自由变换），旋转图像，使视网膜的背腹轴一致到电影帧的y轴。
- 如果需要的话，可使用裁剪工具，以减少视场成所需的尺寸和形状。
- 使用电平调整（的各个帧），以帮助提高细胞膜和细胞体之间的对比。
- 为文体的目的，并强调特定的细胞的行为，引入假色突出显示的每个帧中的兴趣点。
- 动画：转换图像成电影：
- 从主菜单中的Windows选项卡，打开动画面板。选择做自层帧从位于动画面板的右上角的菜单。
- 注意，这些层被添加到动画窗格按顺序从堆栈的底部开始。为了扭转帧的顺序，首先选择所有的帧，然后从动画面板菜单中选择逆向框架。
- 使用帧拇指下方的下拉菜单中选择用于每个帧一帧的延迟时间钉子。
注：帧延迟为电影1至4本文介绍的是0.8秒。 - 在主菜单中，打开导出的文件选项卡，然后选择渲染视频。选择QuickTime导出下文件选项，然后选择所需的视频格式。在渲染选项设置帧速率自定义，进入15帧速率，并单击渲染。
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Representative Results
实时成像蛹眼睛是一个成功的策略，以观察细胞的行为，有助于神经上皮的图案。特定蛋白质的作用，可以通过表达眼睛的发育过程中修改的蛋白质水平的转基因可以容易地评估。要做到这一点的GMR-GAL4用于驱动所述形态发生沟后面的转基因表达。这提供了不扰动早期事件，在头两个幼虫龄建立眼场的优点。此外，许多的RNAi的转基因需要显著的时间来有效地降低蛋白质的水平（数据未示出）。因此，推动转基因的RNAi与GMR-GAL4车手阵容往往使第三龄幼虫眼睛发育的眼球盘和外翻变态期间进行毫发无损，并显著降低蛋白水平只是到了后来，在蛹的眼睛形态。如果幼虫发育是一种高效的转基因的RNAi然而波澜不惊，飞十字架能被保持在18℃，以减少的转基因表达和蛹转移至25℃，在0小时的APF。以解决的RNAi的转基因表达，转录物或蛋白质水平的疗效应该使用标准的技术级匹配蛹进行评估（ 例如，定量-PCR，免疫荧光，免疫印迹）。
在幼虫发育，每个小眼的感光内核招募作为移动从后到眼睛光盘11的前侧一浪。这一发展梯度保留在蛹的眼睛。事实上，当在22.5小时APF，GMR-GAL4，UAS-DCR-2的图形成像; UAS-α-猫：GFP，UBI-DE-加元：GFP; + / SM5-TM6b视网膜是显着的后部区域更加成熟（ 图2）。这些视网膜的表型是媲美的野生型飞株（数据未示出）。传统蛹眼睛形态是根据发育时间描述（ 如小时APF）。但是，由于明显的发育梯度我们建议按照以下事件描述眼图案：
1°缠绕 （ 图2和电影1）：最初多达八个细胞直接接触感光体束。两个单元 - 通常是前部和后部的细胞 - 被招募为初选（1°S）。这些1迅速包围感光体束，相互连接，以形成稳定的结。未分化细胞interommatidial（IC）的躺在每个网膜组之间的杂乱无章的方式。伴随1°细胞募集，细胞凋亡如先前所描述的集成电路池12（在电影1中未注明）的修剪约5％。
IC插 （ 图2和电影2）：由于1°S包裹和密封每个感光捆绑，本地CELL运动重组分组，每个小眼的背，腹两侧的集成电路。从多个嵌入的芯片（通常两个）行成一行。动IC的目标位置可以通过观察大“蜂窝扩展'方向投影自信地预言在野生型组织。 1°细胞的生长，并伴有可能造成IC插13。许多集成电路将继续分化为二次电池（2°多个）（未示出）。
3°的竞争 （ 图2和电影3）：继插，三芯片竞争中占据第三（3°）的利基。在这个充满活力的战斗中，细胞被取代之前频频占据了3°利基低至5到10分钟。最后一个单细胞建立了稳定的3°的利基。
最后的修剪 （ 图2和电影4）：凋亡3,15-18一股IC的数量减少到必需以有效地产生一个整齐六边形集成电路晶格穿过复眼5,14最小：3 3°s和6 2°S围绕每个小眼。如前面所指出的那样，通常是那些过量的IC位于最靠近刷毛是由凋亡7消除。我们观察到的细胞死亡伴随着集成电路嵌入和3°利基建立与提出过量细胞促成这些事件的效率即修剪。此外，猪鬃organules微妙的重新定位常常观察到的IC进行了修剪。
图1：蛹解剖和成像（A）中的厣从果蝇蛹（这里，在23小时的APF示出）除去，以暴露一个的头部nimal。虚线表示了一块双面胶带。（B）的示意图的简单实时成像钻机。（C和D）随着头露出，蛹被定位在约35℃搁置在凡士林珠。（D）的位于凡士林珠顶上蛹高放大倍率的图像。盖玻片和客观的立场是说明（不按比例绘制）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：发展跨越蛹眼梯度。 （A）的蛹眼成像在22.5小时APF一个图像。粘着路口被标记了DE-加元：GFP和αCat：GFP。盒装地区被标注在（C）（B）中期阶段，全面图案小眼，分别插图在24和41小时APF。两个1°S（蓝色）包围4视锥细胞（白色）的中心组。 41小时APF interommatidial细胞（浅灰色）的图案齐全：3 3°S占用交替的顶点和一个2°形式六边形的每一端。三鬃organules（深灰色）围绕每个小眼。（C）注释眼（来自A）的小区域。两个1°细胞（例子伪色的淡蓝色）扩大到包围每个感光束。集成电路（绿色，黄色，红色和深蓝色）插成单排。在每一个备选顶点三个单元格的竞争（粉红色概述）占据3°利基（橙色）。看到电影1-4观察这些事件展开。 请点击此处查看此造型玩具的放大版本。即
图3：实验过程的总结 ，请点击这里查看此图的放大版本。
电影1 ：主包装 1°细胞从周围的每个小眼雏鸟小区池选定。由于两个1°S包围每个小眼并连接，粘着路口迅速形成（粉色系）。直1°：1°细胞连接扩大和1°S开始生长，从周围的集成电路绝缘感光体束。最初，感光焕发明亮，密集的GFP标记精心粘着路口。形态变化GRA双重绘制成像和每组4根尖锥细胞顶上每个之间X形结的平面之下，这些感光体结的小眼变得清晰。原始图像的左侧;伪色彩和注解引入到右边的面板。从21小时APF眼成像。
电影2 ：Interommatidial细胞intercalaction的interommatidial细胞（IC）的在突出红色，蓝色，黄色和绿色的初步形成一个象限由两个小区的距离分离背侧（上）和腹侧（底部）的小眼。红色和黄色的集成电路伸展腹部和背部分别为（从t = 42分钟），用56分钟使接触目标1°S。蓝色和绿色的集成电路同样延伸到目标相对小眼。 “新”1°：IC路口迅速扩大横向。在112分钟的IC原来象限具有完全插通用电气nerate细胞的单个行。原始图像的左侧;伪色彩和注解引入到右边的面板。从23小时APF眼成像。
电影3 ：第三比赛在交替顶点两三细胞（粉色所述）的竞争中占据了3°的利基。看似'推'他们的邻居一边，细胞生成达到向相反小眼大的扩展。占据3°利基（橙色）往往是短暂的，无论是细胞收回或正在推出的立场，他们的邻居。这个217分钟的影片结束后，不少3°壁龛出现成立。原始图像的左侧;伪色彩和注解引入到右边的面板。从23小时APF眼成像。
莫争夺4：最后的修剪是通过细胞凋亡在去除毛organules附近的细胞。实例在紫色，红色，黄色和蓝色突出显示。在成像过程中，去除细胞的左只是一个2°沿所述IC六边形的每个水平臂。在IC六边形的对角线两边多余细胞的修剪是不捕获在这个电影。在这种基因型安置鬃组小错误往往观察（与图2B比较）。两三个鬃机动到角落的壁龛组成像过程：重新定位似乎由相邻IC的清除和运动提供便利。原始图像的左侧;伪色彩和注解引入到右边的面板。从26小时APF眼成像。
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Discussion
野生型的发展（上图）的描述形成的基础，在RNAi的图案事件或过表达基因型比较。精确确定哪些细胞行为是由感兴趣的蛋白质调节的时活组织发育的比较是非常宝贵的。此外，并没有在这里描述的，活细胞成像使得人们能够使所关注的基因的作用的定性和/或定量描述的事件模式的眼睛。经30-32小时APF最色素细胞已经获得稳定的位置和凋亡已经从视网膜现场修剪多余的细胞。在此之后，仅微妙的变化被观察到的色素细胞通过它们的特征形状：3°S成为六角形，并且作为1°S微妙地扩大，相邻矩形2°细胞的宽度减小。随后生成颜料和镜片材料可能阻碍粘着路口成功成像。
虽然VALuable策略，有几个陷阱必须成像活蛹的眼睛，当铭记。首先，除去前蛹壳呈现动物特别容易脱水，过热以及损伤和安装在成像期间。损伤如这些可以通过诱导非典型组织发育不相关于被检查基因型混淆的数据。其次，这里所描述的协议要求的玻璃盖玻片使与蛹头部上皮的直接接触。我们已经观察到视网膜发育档如果推压眼盖玻片当过大的压力被施加。的确外生机械力已显示在其他系统以影响包括组织架构19,20发育过程。由于这些原因，非常轻轻地放在对眼睛盖玻片是重要的。此外，成像蛹应该从成像钻机救出，并允许出现像成人：成像过程中的文物可以介绍常由成像眼这些成人眼睛年龄匹配蝇从原始交叉比较来检测。另外，从多个成像会话的数据必须进行比较，以验证细胞的行为。最后，标准免疫荧光应被用来确定的布置，大小和细胞数的阶段匹配组织中是否相同。
异位DCR-2被 频繁用于增强RNA干扰的功效。然而，在异位DCR-2，集成电路插层，所述3°利基和凋亡的稳定的存在下偶尔扰乱（数据未示出）。因此，DCR-2的表达，应慎用。
这里所描述的协议利用GFP标注粘着路口和评估蛹眼色素细胞的形态。这个策略很容易被修改为其他目的（ 如评估感光形态）。对于双标记方法，额外的UAS转基因的标注利益与非GFP标记其他细胞成分（ 如书记囊泡，内质网，核）可能被纳入。但是这些转基因的强度和持久性，需要评价：RFP，红色荧光蛋白和mCherry，例如，已被证明是用于成像蛹眼捕捉色素细胞图案化所需的长时间穷标签（数据未显示）。如果调查快速细胞行为（ 如分泌）这里所描述的协议，可以很容易地修改了合适的荧光蛋白质的共聚焦显微镜。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
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