Abstract
Un virus atténué du Nil occidental (VNO), un non structurale (NS) 4B-P38G mutant, induite par les cytokines supérieur innée et réponses des lymphocytes T de type sauvage VNO chez les souris. Récemment, facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) la signalisation se est avérée importante pour l'amorçage de cellules T initiale et le développement des cellules T mémoire pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Dans cette étude, deux méthodes de flux basés cytométrie-- in vitro des cellules T dosage dans l'amorçage et une cytokine coloration intracellulaire (ICS) - ont été utilisées pour évaluer les cellules dendritiques (CD) et les fonctions des cellules T. Dans la cellule T amorçage dosage, la prolifération cellulaire a été analysée par cytométrie de flux après co-culture de DC par les deux groupes de souris avec de l'ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) - marqué les cellules de souris transgéniques OTII T CD4 +. Cette approche a fourni une détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 + est nettement améliorée avec sensibilité globale de la traditional dosages avec des réactifs radioactifs. Système de tube de microcentrifugation a été utilisé dans les deux procédés de culture de cellules et une coloration de la cytokine protocole ICS. Par rapport au système traditionnel à base de plaque de culture de tissu, cette procédure modifiée était plus facile à réaliser au niveau de la prévention des risques biotechnologiques (BL) 3 des installations. En outre, les cellules infectées WNV- ont été traités avec du paraformaldéhyde dans les deux essais, ce qui a permis une analyse plus poussée en dehors des installations BL3. Dans l'ensemble, ces tests in vitro immunologiques peuvent être utilisés pour évaluer efficacement des réponses immunitaires à médiation cellulaire au cours de l'infection par le VNO.
Introduction
Le virus du Nil occidental (VNO), un neurotrope, plus-détectées flavivirus, est une menace pour la santé publique émergents. Actuellement, aucun vaccin ont été approuvés pour usage humain 1. Une souche atténuée VNO, qui a une substitution P38G dans le non structurale (NS) protéine 4B, est connu pour induire aucune létalité chez les souris, mais supérieur cytokines innées et les réponses des lymphocytes T chez les souris de type sauvage que le VNO NY99 souche 2. Souris immunisées avec le mutant NS4B-P38G ont tous été protégés contre un défi secondaire avec de type sauvage létale VNO. Ceci suggère que le mutant NS4B-P38G a des caractéristiques appropriées pour un candidat vaccin idéal. Les mécanismes par lesquels le mutant NS4B-P38G induit haute immunité adaptative de protection ne sont pas encore clairement compris. Toll-like récepteurs (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes, jouent un rôle essentiel dans le déclenchement de l'immunité innée à l'infection virale. La voie de signalisation de TLR de base utilise réponse différenciation myéloïde primaire geNE 88 (MyD88) comme carte principale 3,4. Dans une étude récente, la signalisation MyD88 a été montré à jouer un rôle important dans le développement de l'immunité à médiation cellulaire au cours VNO NS4B- P38G infection chez la souris mutante 5. Cellules dendritiques (CD) sont une des plus importantes cellules présentatrices d'antigène présentant la capacité unique d'initier les réponses des cellules T primaires lors de l'infection virale 6,7. Lymphocytes T CD4 + et CD8 + contribuent tous deux à l'immunité protectrice de longue durée et sont importants pour la survie de l'hôte après-type sauvage infection par le VNO 8,9. Deux dosages immunologiques ont été utilisés dans cette étude pour évaluer les fonctions de ces cellules chez les souris mutantes infecté NS4B-P38G.
Tout d'abord, un test d'amorçage de cellules T in vitro a été utilisé pour comparer la capacité de présentation antigénique des CD de type sauvage du VNO-infectés et MyD88 - / - souris. Pour augmenter la sensibilité du test, naïfs CD4 <sup> + cellules T ont été isolés à partir de OTII souris transgéniques, qui expriment une spécifique Vα2 / Vβ5 TCR pour l'ovalbumine de poulet (OVA) peptide 323 - ont été purifiés 339. PED de souris infectées par le VNO, et co-cultivées avec carboxyfluorescéine succinimidyl pâques (CFSE ) marqué à des cellules T CD4 + en présence de peptide OVA. Après 5 jours de co-culture, les cellules ont été récoltées et fixées avec du paraformaldehyde (PFA) et analysées par cytométrie en flux. Des dosages de prolifération ont été traditionnellement réalisée par incorporation de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) ou désoxyriboside de thymine tritiée (3 HTdr) 10. Néanmoins, ces tests sont soit radioactifs et / ou dans le besoin d'équipements spéciaux au niveau de biosécurité (BL) 3 des installations, où des études de VNO sont menées. L'analyse par cytométrie de flux de la prolifération des lymphocytes par division par deux en série de l'intensité de fluorescence du colorant vital CFSE est devenue plus couramment utilisé dans des essais immunologiques comme le colorant est plus stableet incorporé uniformément dans les cellules, facilement détectée par cytométrie de flux, et est non-radioactif 11. L'essai a également la possibilité d'évaluer le nombre de divisions cellulaires. Un avantage majeur de l'utilisation de ce test dans les études VNO est que la fixation des cellules infectées avec 1-2% PFA pourrait inactiver VNO 12, ce qui permettra l'acquisition de l'échantillon avec un cytomètre de flux dans un laboratoire de BL2.
Ensuite, une procédure coloration de cytokine intracellulaire modifié (ICS) a été utilisé pour étudier le rôle de signalisation MyD88 dans la régulation de réponses des lymphocytes T spécifiques du VNO chez les souris mutantes infectées NS4B-P38G. Dans ce dosage, les splénocytes isolés à partir de souris infectées ont été traitées in vitro avec des peptides spécifiques VNO. Bréfeldine A a été ajouté à retenir les cytokines dans la cellule. Après 5 heures d'incubation, les cellules ont été récoltées, lavées et colorées pour des sous-ensembles de cellules T. Les cellules ont ensuite été fixées dans PFA, perméabilisées et colorées pour l'interféron (IFN) -γ et analysées par cytométrie en flux.Comme avec d'autres dosage à base de cytométrie en flux, une fois que les cellules sont traitées avec un tampon de fixation et perméabilisation contenant PFA, les échantillons infectés peuvent être transférés à un laboratoire de BL2 pour un traitement ultérieur et d'analyse. Dans plusieurs études publiées, nous avons utilisé ICS pour mesurer les fonctions T effectrices de cellules chez des souris infectées par le VNO 13,14. Bien qu'il soit bien établi, un inconvénient majeur de ce test est que la procédure est très longue et pourrait être plus de temps lorsqu'il est effectué à l'intérieur des installations BL3. Ici, un procédé à base d'ICS tube de micro-centrifugeuse de se est révélé être plus facile, plus facile de procéder et moins de temps lorsqu'il est effectué dans un laboratoire BL3.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvés par le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université du Texas Medical Branch.
1. Isolement des PED de souris non infectées et infectées par le VNO
- Match de l'âge et le sexe 6-10 semaines-vieux, de type sauvage C57BL / 6 (B6) et MyD88 - / - souris. Inoculer par voie intrapéritonéale (ip) avec 500 unités formant des plaques (PFU) du VNO NS4B- P38G mutant. Au jour 3 après l'infection, euthanasier B6 et MyD88 - / - souris avec du CO 2. Utilisation des souris non infectées de deux groupes comme témoins. Utilisez trois souris de chaque groupe.
- Fourrure mouillée sur le côté gauche de la souris sacrifiées en utilisant 70% d'éthanol et coupé la fourrure le long du côté gauche de la souris, à mi-chemin entre les jambes avant et arrière. Couper ouvrir la cavité du corps. Retirer la rate en utilisant les forceps. Placez la rate dans une boîte de Pétri avec du RPMI.
- Isoler DC spléniques en utilisant des billes magnétiques anti-CD11c selonles instructions du fabricant.
2. Purification et d'étiquetage des cellules T de souris transgéniques OTII
- Récolte une rate d'une souris OTII naïve comme décrit dans l'étape 1.2 ci-dessus et homogénéiser la rate entre les extrémités de deux diapositives givrées. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml, ajouter du milieu RPMI à 14 ml. Laissez la suspension reposer pendant 5 min et 13 ml de transférer à un nouveau tube de 15 ml conique.
- Isoler les cellules T CD4 + spléniques en utilisant un kit T CD4 + d'isolement des cellules selon les instructions du fabricant.
- des cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml, rincer deux fois avec du PBS. Resuspendre les cellules dans du PBS avec 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 x 10 6 cellules par ml, et ajouter 0,5 pmol / ml de CFSE. Incuber à 37 ° C pendant 10 min, à l'abri de la lumière.
- Ajouter 5 ml de milieu complet froid (RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 1/100 voldes antibiotiques / antimycosiques, 1/100 en volume de L-glutamine et 1/1000 x 1000 vol de 2-mercaptoéthanol).
- Incuber sur de la glace pendant 5 min. Laver les cellules une fois avec du PBS, fixent 0,2 x 10 6 cellules T CD4 + marquées dans 2% de PFA et d'acquérir sur un cytomètre de flux. Utilisez cet exemple pour déterminer le niveau de base de CFSE. Re-suspendre le reste de cellules marquées dans un milieu complet.
3. Co-culture OTII cellules T avec DC de souris infectées par le VNO
- Culture 2 x 10 5 cellules T CD4 + purifiées de souris OTII seul ou avec PED purifiées de type sauvage ou MyD88 - / - souris (2 x 10 4) dans une plaque à 24 puits avec ou sans OVA résidus 323-339 (1 g / ml) dans 1 ml de milieu complet par puits.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 jours. cellules de récolte, laver deux fois dans un tampon FACS (PBS avec 1% de FBS) et fixent dans 0,25 ml 2% PFA. Vortexer immédiatement.
4. cytométrie en flux in vitro </ Em> T Cell Amorçage
- Pour l'acquisition, double-cliquez sur l'icône de la cytométrie de flux logiciel. Pour une parcelle de densité linéaire FSC-A vs SSC-linéaire A, sélectionnez canaux 0 à 200 000 sur FSC-A et de 0 à 200 000 le SSC-A. Ensuite, créez une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 1A).
- Pour analyser l'intensité de fluorescence de CFSE, ouvrez l'histogramme pour le canal FL1 et d'acquérir 20 000 événements sur la population fermée. Mettre en place un marqueur sur des échantillons pour les cellules OTII cultivées seules (figure 1A).
- Acquérir des échantillons de cellules OTII co-cultivées avec des DC de type sauvage (figure 1B) ou MyD88 - / - PED (figure 1C) d'une manière similaire.
5. Isolement et stimulation de splénocytes pour dosages de cytokines
- Infecter B6 et MyD88 - / - souris avec mutant VNO NS4B-P38G en utilisant la même procédure que celle décrite dans ste1,1 p. Au jour 30 post-infection, nouveau défi souris survivantes avec 2000 UFP de type sauvage VNO souche ip Au jour 8 et 21 infection par le VNO post-primaire ou au jour 4 après l'infection secondaire, euthanasier les souris avec du CO 2 pour la collecte des rates .
NOTE: Nous avons utilisé 2-3 souris par groupe pour chaque point de temps. - Faire une suspension cellulaire unique de splénocytes comme décrit ci-dessus dans l'étape 1.2 et 2.2 étape. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et remettre en suspension dans 10 ml eux de milieu complet.
- Diluer les cellules avec du milieu complet à 2,5 x 10 6 cellules / ml. Ajouter 1 ml de splénocytes dans 1,5 ml d'un tube de micro-centrifugeuse.
- Pour simuler les cellules T CD8 +, diluer NS4B et E peptides spécifiques de l'infection par le VNO (SSVWNATTA et IALTFLAV) à 1 mg / ml dans du DMSO. Pour la stimulation des cellules T CD4 +, diluer NS3 et E peptides spécifiques de l'infection par le VNO (RRWCFDGPRTNTILE et PVGRLVTVNPFVSVA) à 1 mg / ml dans du DMSO. Ajouter 10 ul de peptides aux cellules followed par une pi d'une solution Bréfeldine. Utiliser des cellules sans traitement des peptides comme témoins. Mélanger les cellules.
- Poinçon deux trous avec une aiguille de 18 G dans le bouchon du tube. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 heures.
6. intracellulaire de cytokines coloration
- cellules de transfert à un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Spin cellules pendant 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant. Ajouter 1 ml tampon FACS, rotation 5 min à 300-400 xg et remettre en suspension les cellules par pipetage avec 120 ul tampon FACS.
- Ajouter 2 ul de Fc de blocage et incuber les cellules à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque tube. Spin 5 min à 300-400 x g.
- Re-suspendre les cellules dans 300 pi FACS tampon et les diviser en trois tubes (environ 0,8 x 10 6 cellules par tube). Comme le montre le tableau 1, se réserver le premier tube de chaque condition de culture de rat IgG-PE coloration. Pour le second tube, ajouter 3 ul d'anti-CD4 APC pour CD4 peptides cellules traitées, 3 μl d'anti-CD8 FITC à des cellules CD8-peptides traités à la fois des anticorps ou des cellules sans traitement des peptides. Utilisez le troisième tube d'indemnisation coloration. Pour chaque condition de culture, utiliser trois tubes de cellules colorées avec APC conjugué CD4, CD8 conjugué au FITC ou PE- anticorps marqués CD3 seul (3 pi par tube) que les contrôles de compensation pour FL1, FL2 et des canaux de FL4.
- cellules Vortex brièvement. Laisser sur la glace pendant 20 min et protéger de la lumière. Ajouter 1,4 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant.
- Agiter à perturber culot cellulaire (ou vortex brièvement). Re-suspendre culot cellulaire dans 250 pi de fixation / perméabilisation solutionby pipetage. Incuber à température ambiante pendant 20 min et à protéger de la lumière.
- Ajouter 1,2 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans un tampon FACS 300 pi.
NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être transférés à un laboratoire BL2 pour un traitement ultérieur ou stocké dans un réfrigérateur et protégé de la lumière pour up à trois jours. - Ajouter 500 pi de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans 500 pi de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g.
- Re-suspendre les cellules dans 100 ul 1x Perm / Wash, ajouter 3,5 pi anti-IFN-PE au tube précédemment ajouté avec des anticorps pour CD4 et ou marqueurs cellulaires / T CD8 à l'étape 6.3 et 3.5 pi rat IgG-PE dans le tube réservé pour le contrôle IgG pendant 25 min sur de la glace et de protéger de la lumière. Laver les cellules en ajoutant 1,4 ml de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g. Répétez l'étape de lavage en ajoutant 1,4 ml 1x tampon perméabilisation / lavage.
- Spin 5 min à 300-400 xg et décanter surnageant. Laver les cellules par addition de 1,4 ml de tampon FACS et remettre en suspension dans 400 ul de tampon pour FACS pour l'acquisition finale.
7. cytométrie en flux de cytokine intracellulaire coloration
- Utilisez les mêmes paramètres d'acquisition comme dans l'étape 4.1. Create une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 2A). Réglez les tensions en utilisant les tubes de rémunération pour chaque groupe.
- Ouvrez deux nouveaux tracés de points, une pour afficher les données recueillies pour FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), et l'autre est d'afficher les données collectées pour FL4 vs. FL2 (vs CD4. IFN-γ). Acquérir 50 000 événements pour la population fermée de chaque échantillon.
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Representative Results
Dans l'essai d'amorçage des cellules T, les cellules T CD4 + marquées CFSE ont été cultivées avec des DC purifié à partir du type sauvage NS4B-P38G mutant infecté et MyD88 - / - souris en présence ou en l'absence de peptides OVA. Les cellules T cultivées seules marqués avec ou sans OVA pendant 5 jours ont été utilisés comme témoins négatifs. Comme le montre la figure 1A, les cellules T totaux ont été bloqués pour l'analyse de l'intensité de fluorescence sur le canal FL1. Le marqueur a été mis en place sur la base des cellules T CD4 + fraîchement marqués sur 0 jours pour déterminer le taux de prolifération sans co-culture des PED. Il y avait un niveau de taux de prolifération (1,6%) sous cette condition de culture faible. Le même marqueur a été utilisé pour déterminer le taux de lymphocytes T CD4 + co-cultivées avec des DC à 10 prolifération: rapport 1. En raison de leur ratio élevé dans la co-culture et de leur prolifération nature, les cellules T peuvent être déclenchés sur les populations mixtes sans phénotypique supplémentaires staiNing. Comme le montre la figure 1B, il y avait un taux de prolifération de 87,0% dans le groupe de type sauvage comme représenté dans une représentatifs de trois échantillons traités dans les mêmes conditions. En outre, CFSE marqué les cellules T co-cultivées avec des DC de MyD88 - / - souris en présence d'OVA avaient un taux de prolifération de 74,5% (figure 1C). Ainsi, le taux de cellules OT II T CD4 + co-cultivées avec des PED NS4B-P38G MyD88 mutant infectées prolifération - / - souris était inférieur de ceux co-cultivées avec des DC de souris de type sauvage. Ces résultats suggèrent qu'une carence en MyD88- voie de signalisation conduit à un antigène présentant une altération de la capacité des DC pendant NS4B-P38G infection mutant.
Pour analyser les résultats de l'ICS, nous fermée sur le total des splénocytes isolés à partir de souris de type sauvage au jour 8 après l'infection (figure 2A), les pourcentages de populations doubles positifs (CD4 <sup> + IFN + et CD8 + IFN +) dans un échantillon représentatif était de 0,4% et 1,7% respectivement. Les pourcentages des cellules CD4 + IFNy + et CD8 + IFNy + de splénocytes totaux dans une gated échantillon représentatif de MyD88 - / - souris ont été de 0,2% et 0,6% respectivement (figure 2B). Aucune différence n'a été notée dans la population double positive des deux groupes de traitement sans splénocytes des peptides (données non présentées). Des analyses similaires ont été réalisées avec des splénocytes isolés de type sauvage, non-infectés et MyD88 - / - souris (figures 2C et 2D). Les pourcentages de double positif populations (CD4 + IFN + et CD8 + IFN +) entre les deux groupes ne étaient pas différents. En outre, dans la figure 2A, les populations positifs uniques de CD4+ Cellules T CD8 + et étaient de 21% et 13,3% du total des splénocytes fermée. Considérant que, ils se sont révélés être de 15,9% et 11,2% de MyD88 - / - splénocytes (figure 2B). Par rapport aux groupes infectés, les différences de pourcentage de populations positifs simples entre le type sauvage de deux non-infectés et MyD88 - / - souris étaient beaucoup moins (19,1% contre 18,4% pour les cellules T CD4 +, 15,7% vs. 13,3% pour les cellules T CD8 +). Combinés ensemble, les réponses des lymphocytes CD4 + et CD8 + T ont été réduits en MyD88 souris - / - par rapport au groupe de type sauvage au jour 8 post-NS4B- P38G infection mutant. Une analyse similaire a été effectuée pour les échantillons prélevés au jour 21 post-infection. Comme représenté sur la figure 3A et 3B, le pourcentage de cellules CD4 + IFNy + de splénocytes totaux en MyD88 <sup> - / - groupe (0,1%) était légèrement inférieur à celui du groupe de type sauvage (0,2%). La population positif unique de cellules T CD4 + en MyD88 - / - groupe (17%) était également inférieur à celui de type sauvage groupe (20,6%). En comparaison, ni le pourcentage de cellules CD8 + IFNy + ni le pourcentage de population unique positive de cellules T CD8 + était différente entre les deux groupes. Au jour 4 de l'infection post-secondaire, les pourcentages de populations doubles positifs (CD4 + IFN + et CD8 + IFN +) dans un échantillon représentatif d'un groupe de type sauvage étaient de 0,3% et 0,5% respectivement (figure 4A). Les pourcentages de CD4 + et CD8 + IFN + IFN + du total des splénocytes fermée dans un échantillon représentatif de MyD88 - / - groupe était de 0,1% et 0,2% (Figure 4B). En outre, la population positif unique de cellules CD4 + et CD8 + T était de 18,7% et 15,8% du total des splénocytes de souris de type sauvage. Considérant que, ce pourcentage a été réduite à 12,1% et 12,3% en MyD88 - / - souris (figure 4B). En résumé de ces résultats, la signalisation MyD88 est impliqué dans l'activation des lymphocytes T initiale des deux populations et contribue à la réponse des cellules T CD4 + à un stade ultérieur d'infection. Elle est également impliquée dans la mémoire CD4 + et CD8 + des réponses cellulaires.
Figure 1:. DC présentatrices de l'antigène dans la capacité de type sauvage et MyD88 - / - souris lors de l'infection NS4B- P38G cellules CFSE marqué T CD4 + ont été co-cultivées seules (A) ou avec des DC du VNO-NS4B-P38G mutant- de type sauvage infectées (B) et MyD88 - / - souris (C) en présence d'OVA 323-339. Les cellules ont été récoltées au jour 5, fermée sur les cellules T basés sur FSC / SSC (panneaux de gauche) et analysées pour leur taux de prolifération (panneaux à droite). Un représentant de trois échantillons dans chaque groupe a été montré. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2: réponses des lymphocytes T à un stade précoce de l'infection par le VNO NS4B-P38G splénocytes ont été isolés du VNO NS4B-P38G mutant- infectées de type sauvage (A) et MyD88 - / - souris (B) au jour 8. A titre de témoins, Des splénocytes ont été récoltés à partir de nonde type sauvage infecté par (C) et MyD88 - / - souris (D). Les cellules ont été cultivées ex vivo avec des peptides du VNO pendant 5 heures, récoltées et colorées pour IFN et CD4 ou CD8. Total des splénocytes provenant de chaque groupe ont été bloqués (P2) et analysés. Les tracés de points indiqués sont un représentant de trois échantillons dans chaque groupe. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3: réponses des lymphocytes T au stade avancé de l'infection par le VNO NS4B-P38G splénocytes ont été isolés du VNO NS4B-P38G mutant- infecté de type sauvage (A) et MyD88 - / - souris (B) au jour 21. Les cellules ont été cultivées ex vivo par le VNOpeptides pendant 5 heures, récoltées et colorées pour l'IFN-γ et CD4 ou CD8. Total des splénocytes provenant de chaque groupe ont été bloqués (P2) et analysés. Un représentant de trois échantillons dans chaque groupe a été montré. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: réponses des lymphocytes T pendant défi secondaire avec de type sauvage VNO souris qui a survécu d'une primo-infection par le VNO NS4B-P38G mutant ont été ré-infecté par un LD 100 de type sauvage VNO.. Au jour 4 de l'infection post-secondaire, les splénocytes ont été isolés du VNO NS4B-P38G mutant- infectés de type sauvage (A) et MyD88 souris - / - (B). Les cellules ont été cultivées ex vivo avec des peptides du VNO pendant 5 heures, harveSTED, et colorées pour l'IFN-γ et CD4 ou CD8. Total des splénocytes provenant de chaque groupe ont été bloqués (P2) et analysés. Un représentant de trois échantillons dans chaque groupe a été montré. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
VNO est un agent pathogène BL3. En raison des règlements de sécurité, les dosages immunologiques avec des échantillons de VNO-infectés sont souvent limités par la disponibilité de l'équipement au BL3 installations ou plus longue et fastidieuse à effectuer. Dans une étude récente, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la cytométrie de flux pour étudier les réponses immunitaires à médiation cellulaire lors de l'infection par le VNO 5. Dans les deux essais, les cellules infectées par le VNO ont été traités avec 1-2% PFA directement ou avec une solution de fixation / perméabilisation contenant 4% de PFA. On sait que 1% de PFA fixation de cellules infectées par le virus pouvait efficacement réduire le nombre de particules infectieuses au-dessous des limites de détection 12. Par conséquent, les deux méthodes ont considérablement réduit le temps de la performance à l'intérieur des installations BL3. Il ya beaucoup de tests établis pour mesurer prolifération des cellules T, y compris ceux par incorporation de BrdU ou thymidine radioactive, le flux basé cytométrie in vitro des cellules T test d'amorçage utilisant CFSE marqué cellules OTII T a fourni more détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 + avec sensiblement amélioré la sensibilité globale. Ici, un ratio de 10: 1 pour les cellules DCS et T a été utilisé pour définir efficacement la capacité de présentation de l'antigène lors de l'infection par le VNO. Une titration de la dose est recommandé d'étudier les fonctions DC lors de l'infection avec un autre agent pathogène, que ce ratio peut varier. ICS est un flux test couramment utilisé pour étudier les réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène basé sur la cytométrie. Toutefois, la procédure est longue et comprend la culture de cellules et de multiples étapes de lavage et de coloration des cellules. Il est potentiellement dangereux lors de l'exécution dans les installations BL3. Nous avons modifié le protocole pour que les cellules ont d'abord été stimulées avec VNO peptides spécifiques dans un tube de micro-centrifugeuse à la place d'une plaque de culture tissulaire. Ensuite, les cellules ont été lavées et colorées à l'intérieur des tubes de micro-centrifugeuse à la place de tubes coniques. Ces modifications ont permis à l'ensemble du processus en cours d'exécution dans une enceinte de sécurité biologiqueen utilisant une machine de micro-centrifugeuse, qui ont éliminé la procédure de désinfection pour la centrifugation des cellules en dehors de l'enceinte de sécurité biologique. Les cellules ont également été acquis dans les tubes micro-centrifugeuse par un cytomètre de flux. Dans l'ensemble, le système de tube de micro-centrifugeuse a un gain de temps et d'effort (environ 2 heures) dans ICS par rapport à l'essai traditionnel à base de plaques de culture de tissus. Enfin, la méthode du tube à centrifuger n'a pas obligation d'instrument spécial, qui est économique et offre plus de souplesse dans l'exécution. En outre, il est plus facile à réaliser et moins de temps, ce qui a finalement augmentation de la viabilité cellulaire (données non présentées). Il ya un problème de sécurité mineur en raison de l'utilisation de l'aiguille 18 G dans la mise en place de la culture cellulaire pour ICS.
Enquête sur le mécanisme par lequel le VNO NS4B-P38G mutant induit une immunité protectrice supérieure peut être utilisé comme un paradigme pour aider à la mise en valeur rationnelle des autres vaccins efficaces à flavivirus vivants atténués. En utilisant ICS et T dans des tests in vitro d'amorçage de cellules, nous avons montré que la signalisation de MyD88 est important pour le développement de l'immunité à médiation cellulaire adaptative pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Ni essai est spécifique conçu pour le VNO. Ils peuvent également être utilisés pour évaluer les fonctions cellulaires DCS et T avec des échantillons-infectés avec d'autres agents BL3.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
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