Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52121

Abstract

En svækket West Nile virus (WNV), en ikke-strukturelle (NS) 4B-P38G mutant inducerede højere medfødte cytokin og T-celle responser end vildtype-WNV i mus. For nylig myeloid differentiering faktor 88 (MyD88) signalering blev vist at være vigtig for den indledende T-celle-priming og hukommelse T-celleudvikling i WNV NS4B-P38G mutant infektion. I denne undersøgelse to flowcytometri-baserede metoder - en in vitro T-celle-priming assay og en intracellulær cytokin-farvning (ICS) - blev anvendt til at vurdere dendritiske celler (DC'er) og T-celle-funktioner. I T-celle priming assay blev celleproliferation analyseret ved flowcytometri efter co-kultur af DC'er fra begge grupper af mus med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - mærket CD4 + T-celler fra OTII transgene mus. Denne fremgangsmåde gav en nøjagtig bestemmelse af den procentvise andel af prolifererende CD4 + T-celler med væsentligt forbedret samlet følsomhed end traditionenal assays med radioaktive reagenser. Et mikrocentrifugerør blev anvendt i procedurer ICS protokollen både cellekultur og cytokin-farvning. Sammenlignet med den traditionelle vævskulturplade-baseret system, denne modificerede procedure var lettere at udføre på biosikkerhed niveau (BL) 3 faciliteter. Desuden blev WNV- inficerede celler behandlet med paraformaldehyd i begge analyser, som gjorde det muligt yderligere analyse uden BL3 faciliteter. Samlet set kan disse in vitro immunologiske assays anvendes til effektivt at vurdere cellemedierede immunresponser under WNV infektion.

Introduction

West Nile virus (VNV), en neurotropisk, plus-affølte flavivirus, er en ny trussel mod folkesundheden. I øjeblikket er der ikke vacciner er godkendt til human brug 1. En svækket WNV stamme, som har en P38G substitution i ikke-strukturelle (NS) 4B protein, er kendt for at inducere nogen letalitet hos mus, men højere medfødte cytokiner og T-celle-responser hos mus end vildtype WNV NY99-stammen 2. Mus immuniseret med NS4B-P38G mutant blev alle beskyttet fra en sekundær udfordring med dødelig vildtype WNV. Dette antyder, at NS4B-P38G mutant er udstyret med passende funktioner til en ideel vaccine kandidat. De mekanismer, som NS4B-P38G mutant inducerer høj beskyttende adaptiv immunitet er ikke klart endnu. Toll-lignende receptorer (TLRs), som genkender patogen-associeret molekylære mønstre, spiller en væsentlig rolle i iværksættelsen af ​​medfødte immunitet til virusinfektion. Kernen TLR signalvej udnytter myeloid differentiering primært respons GEne 88 (MyD88) som den primære adapter 3,4. I en nylig undersøgelse blev MyD88 signalering vist sig at spille en vigtig rolle i udviklingen af cellemedieret immunitet under VNV NS4B- P38G mutant infektion i mus 5. Dendritiske celler (DC'er) er en af de vigtigste antigenpræsenterende celler, der udviser den unikke evne til at indlede primære T-celle-responser under virusinfektion 6,7. CD4 + og CD8 + T-celler begge bidrager til langvarig beskyttende immunitet og er vigtige for værten overlevelse efter vildtype WNV infektion 8,9. To immunologiske assays blev anvendt i denne undersøgelse for at vurdere de funktioner af disse celler i NS4B-P38G mutant-inficerede mus.

Først blev en in vitro T-celle-priming assay anvendes til at sammenligne antigenpræsenterende evne af DC'er af VNV-inficerede vildtype- og MyD88 - / - mus. For at øge assayets følsomhed, naive CD4 <sup> + T-celler blev isoleret fra OTII transgene mus, som udtrykker en Vα2 / Vd5 TCR specifikke for kyllingeovalbumin (OVA) peptid 323 - 339. DC'er af VNV inficerede mus blev oprenset, og co-dyrket med carboxyfluorescein succinimidyl påske (CFSE ) -mærket CD4 + T-celler i nærvær af OVA-peptid. Efter 5 dages co-kultur blev celler høstet og fikseret med paraformaldehyd (PFA) og analyseret ved flowcytometri. Proliferative analyser har traditionelt været udført gennem inkorporering af 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) eller tritieret thymin deoxyribosid (3HTdR) 10. Ikke desto mindre er disse analyser er enten radioaktive og / eller har behov for særlige udstyr på biosikkerhed niveau (BL) 3 anlæg, hvor VNV forsøg udføres. Den flowcytometrisk analyse af lymfocytproliferation ved seriel halvering af fluorescensintensiteten af ​​vitalfarvestoffet CFSE er blevet mere almindeligt anvendes i immunologiske assays, som farvestoffet er mere stabiltog jævnt inkorporeret i celler, påvises let ved flowcytometri, og er ikke-radioaktiv 11. Assayet har også evnen til at vurdere antallet af celledelinger. En væsentlig fordel ved anvendelse af dette assay i WNV undersøgelser er, at fiksering af de inficerede celler med 1-2% PFA kunne inaktivere WNV 12, som vil gøre det muligt erhvervelse prøve med et flowcytometer i et BL2 laboratorium.

Dernæst blev en modificeret intracellulær cytokin-farvning (ICS), der anvendes til at undersøge den rolle, MyD88 signalering i regulering af WNV specifikke T-celle-responser i NS4B-P38G mutant-inficerede mus. I dette assay blev splenocytter isoleret fra inficerede mus behandlet in vitro med WNV specifikke peptider. Brefeldin A blev tilsat til at opretholde de cytokiner i cellen. Efter 5 timers inkubering blev cellerne høstet, vasket og farvet for T-celle delmængder. Cellerne blev derefter fikseret i PFA, permeabiliseret og farvet for interferon (IFN) -γ og analyseret ved flowcytometri.Som med andre flowcytometri-baseret assay, når cellerne behandles med fiksering og permeabilisering puffer indeholdende PFA inficerede prøver kan overføres til en BL2 laboratorium til yderligere behandling og analyse. I adskillige publicerede undersøgelser har vi anvendt ICS at måle T-celle-effektorfunktioner i WNV-inficerede mus 13,14. Selvom det godt er etableret, en væsentlig ulempe ved denne analyse er, at proceduren er meget langsommelig og kunne være mere tidskrævende, når de udføres inde BL3 faciliteter. Her blev en mikro-centrifugerør baseret ICS metode vist sig at være mere realistisk, lettere at fortsætte og mindre tidskrævende, når de udføres i en BL3 laboratorium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg ved University of Texas Medical Branch.

1. Isolering af DC'er fra ikke-inficerede og VNV-inficerede mus

  1. Alders- og køns- match 6-10 uger gamle, vildtype C57BL / 6 (B6) og MyD88 - / - mus. Podes intraperitonealt (ip) med 500 plaquedannende enhed (PFU) af VNV NS4B- P38G mutant. På dag 3 efter infektion, aflive B6 og MyD88 - / - mus med CO 2. Anvend ikke-inficerede mus af begge grupper som kontroller. Brug tre mus fra hver gruppe.
  2. Våd pels på venstre side af ofret mus ved hjælp af 70% ethanol og skåret væk pelsen langs venstre side af musen, om halvvejs mellem for- og bagben. Skar legemshulrum. Fjern milten ved hjælp af pincet. Placer milten i en petriskål med RPMI.
  3. Isoler milt DC'er ved hjælp af anti-CD11c magnetiske perler ifølgeproducentens anvisninger.

2. Oprensning og mærkning af T-celler fra OTII transgene mus

  1. Harvest en milt fra en naiv OTII mus som beskrevet i trin 1.2 ovenfor og homogenisere milten mellem de frosne ender af to objektglas. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør, tilsættes RPMI-medium op til 14 ml. Lad suspensionen sidde i 5 minutter og overføres 13 ml af den til en ny 15 ml konisk rør.
  2. Isoler milt CD4 + -T-celler ved hjælp af en CD4 + T-celle-isolation kit ifølge producentens anvisninger.
  3. Overfør celler i en 50 ml konisk rør, vaskes to gange med PBS. Resuspender celler i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) ved 1 x 10 6 celler pr ml og tilsættes 0,5 pmol / ml CFSE. Der inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter beskyttet mod lys.
  4. Tilsæt 5 ml kold komplet medium (RPMI-1640 med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 1/100 volantibiotika / antimykotika, 1/100 vol L-glutamin og 1 / 1.000 vol 1.000 x 2-mercaptoethanol).
  5. Inkuber på is i 5 min. Vask cellerne én gang med PBS, fix 0,2 x 10 6 mærkede CD4 + T-celler i 2% PFA og erhverve på et flowcytometer. Brug denne prøve for at bestemme det basale niveau af CFSE. Resuspender resten af ​​mærkede celler i komplet medium.

3. Co-kultur OTII T celler med DC'er af VNV-inficerede mus

  1. Kultur 2 x 10 5 oprensede CD4 + T-celler fra OTII mus alene eller med renset DC'er af vildtype eller MyD88 - / - mus (2 x 10 4) i en 24-brønds plade med eller uden OVA rest 323-339 (1 g / ml) i 1 ml komplet medium per brønd.
  2. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 5 dage. Harvest celler vaskes to gange i FACS buffer (PBS med 1% FBS) og fastsætte i 0,25 ml 2% PFA. Vortex straks.

4. Flowcytometrianalyse af in vitro </ Em> T cellepriming

  1. For køb, skal du dobbeltklikke på flowcytometri software ikon. For en tæthed plot af lineær FSC-A vs. lineær SSC-A, skal du vælge kanaler 0 til 200.000 om FSC-A og 0 til 200.000 om SSC-A. Derefter oprette en port på levende celler (P2, se figur 1A).
  2. For at analysere fluorescens intensitet CFSE Åbn histogram for FL1 kanal og erhverve 20.000 hændelser på gated befolkning. Opsætning af en markør på prøver til OTII celler dyrket alene (Figur 1A).
  3. Acquire prøver til OTII celler co-dyrket med vildtype DC'er (figur 1b) eller MyD88 - / - DC'er (figur 1C) på en lignende måde.

5. Isolering og stimulering af Splenocyter for cytokinassays

  1. Infect B6 og MyD88 - / - mus med WNV NS4B-P38G mutant ved hjælp af den samme procedure som beskrevet i Step 1.1. På dag 30 efter infektion, re-udfordring overlevende mus med 2000 PFU af vildtype WNV stammen ip På dage 8 og 21 efter primær WNV infektion eller på dag 4 efter sekundær infektion, aflive mus med CO 2 for indsamling af milt .
    BEMÆRK: Vi brugte 2-3 mus pr gruppe for hvert tidspunkt.
  2. Lav en enkelt cellesuspension af splenocytter som beskrevet ovenfor i trin 1.2 & trin 2.2. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og re-suspendere dem i 10 ml komplet medium.
  3. Fortynd celler med komplet medium til 2,5 x 10 6 celler / ml. Der tilsættes 1 ml splenocytter i et 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
  4. For at simulere CD8 + T-celler, fortyndet WNV-specifikke NS4B og E peptider (SSVWNATTA og IALTFLAV) til 1 mg / ml i DMSO. Til stimulering af CD4 + T-celler, fortyndet WNV-specifik NS3 og E peptider (RRWCFDGPRTNTILE og PVGRLVTVNPFVSVA) til 1 mg / ml i DMSO. Tilsæt 10 pi af peptider til cellerne followed med 1 pi Brefeldin en løsning. Brug celler uden peptider behandling som kontrol. Bland cellerne.
  5. Punch to huller med en 18 G nål i hætten af ​​røret. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 5 timer.

6. Intracellulær cytokin farvning

  1. Overfør celler til en ny mikro-centrifugerør. Spin celler i 5 minutter ved 300-400 xg og hæld supernatant. Tilsæt 1 ml FACS buffer, centrifugering i 5 minutter ved 300-400 xg og re-suspendere celler ved pipettering med 120 pi FACS buffer.
  2. Tilsæt 2 pi Fc blokker og inkuber cellerne ved stuetemperatur i 10 min. Tilsæt 1 ml FACS buffer til hvert rør. Spin 5 min ved 300-400 x g.
  3. Resuspender celler i 300 pi FACS buffer og opdele dem i tre rør (ca. 0,8 x 10 6 celler pr rør). Som vist i tabel 1, forbeholder det første rør af hver kultur betingelse for rotte IgG-PE-farvning. For det andet rør, tilsættes 3 pi anti-CD4 APC til CD4 peptider-behandlede celler, 3 μl anti-CD8 FITC til CD8 peptider-behandlede celler eller begge antistoffer til celler uden peptider behandling. Brug det tredje rør for kompensation farvning. For hver kultur tilstand, bruge tre rør af celler farvet med APC-konjugeret CD4, FITC-konjugeret CD8 eller PE-mærket CD3-antistoffer alene (3 pi pr rør) som kontroller for FL1, FL2 og FL4 kanaler kompensation.
  4. Vortex celler kortvarigt. Lad på is i 20 min og beskytte mod lys. Tilføj 1,4 ml FACS buffer. Spin 5 min ved 300-400 xg og hæld supernatant.
  5. Ryst at forstyrre cellepellet (eller kortvarigt vortex). Re-suspendere cellepellet i 250 ul fiksering / permeabilization solutionby pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter og beskytte mod lys.
  6. Tilsæt 1,2 ml FACS buffer. Spin 5 min ved 300-400 xg og resuspender cellerne i 300 pi FACS buffer.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt, kan cellerne overføres til en BL2 laboratorium til videreforarbejdning eller opbevares i køleskab og beskyttet mod lys for up til tre dage.
  7. Tilføj 500 pi FACS buffer. Spin 5 min ved 300-400 xg og resuspender cellerne i 500 pi 1x permeabilisering / vaskepuffer. Spin 5 min ved 300-400 x g.
  8. Resuspender celler i 100 pi 1x Perm / Wash tilsættes 3,5 pi anti-IFNy-PE til røret tidligere tilsat antistoffer for CD4 og / eller CD8-T-celle-markører i trin 6.3 og 3.5 pi rotte IgG-PE i røret forbeholdt for IgG kontrol i 25 min på is og beskytte mod lys. Vask cellerne ved tilsætning af 1,4 ml 1X permeabilisering / vaskepuffer. Spin 5 min ved 300-400 x g. Gentag vasketrinet ved tilsætning 1,4 ml 1x permeabilisering / vaskepuffer.
  9. Spin 5 minutter ved 300-400 xg og dekanter supernatanten. Vask cellerne ved tilsætning af 1,4 ml FACS buffer og re-suspendere 400 pi FACS buffer til endelig overtagelsen.

7. Flowcytometrianalyse af intracellulære Cytokine Staining

  1. Brug de samme indstillinger erhvervelse som i trin 4.1. Create en gate på levende celler (P2, se figur 2A). Juster spændinger ved hjælp af kompensation rør til hver gruppe.
  2. Åbne to nye dot plots, at man vise data indsamlet for FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), og den anden er at vise data indsamlet for FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Erhverve 50.000 begivenheder for gated befolkningstal for hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I T-celle priming assay CFSE mærkede CD4 + T-celler blev dyrket med oprensede DC'er fra NS4B-P38G mutant-inficerede vildtype- og MyD88 - / - mus i nærvær eller fravær af OVA peptider. Mærkede T-celler dyrket alene med eller uden OVA i 5 dage blev anvendt som negative kontroller. Som vist i figur 1A, blev de samlede T-celler gated for analyse af fluorescensintensitet på FL1-kanalen. Markøren blev oprettet baseret på frisk mærkede CD4 + T-celler på dag 0 for at bestemme proliferationshastigheden uden co-kultur af DC'er. Der var et lavt niveau af proliferation rate (1,6%) under denne kultur tilstand. Den samme markør blev anvendt til at bestemme proliferationshastigheden af CD4 + T-celler co-dyrket med DC'er ved et 10: 1 ratio. På grund af deres høje forhold i co-kultur og deres proliferative natur, kan T-celler gates på blandede populationer uden yderligere fænotypisk staining. Som vist i figur 1B, var der en 87,0% proliferationshastighed i vildtype-gruppe som vist i en repræsentant for tre prøver behandlet under de samme betingelser. Endvidere CFSE-mærkede T-celler co-dyrket med DC'er af MyD88 - / - mus i nærvær af OVA havde en proliferationshastighed 74,5% (figur 1C). Således spredning på OT II CD4 + T-celler co-dyrket med DC'er af NS4B-P38G mutant-inficerede MyD88 - / - mus var lavere end af de co-dyrket med DC'er fra vildtypemus. Disse resultater tyder på, at en mangel i MyD88- signalvejen fører til en forringet antigenpræsenterende kapacitet af DC'er i NS4B-P38G mutant infektion.

For at analysere ICS resultater, vi gated på de samlede splenocytter isoleret fra vildtypemus på dag 8 efter infektion (figur 2A), den procentvise andel af dobbelt-positive populationer (CD4 <sup> + IFNy + og CD8 + IFNy +) i en repræsentativ prøve var 0,4% og 1,7%. De procentdele af CD4 + IFNy + og CD8 + IFNy + af den samlede splenocytter gated i en repræsentativ prøve af MyD88 - / - mus var 0,2% og 0,6% (figur 2B). Der blev ikke fundet forskelle i dobbelt-positive populationer af de to grupper af splenocytter uden peptider behandling (data ikke vist). Tilsvarende analyser blev udført med splenocytter isoleret fra ikke-inficerede, vild-type og MyD88 - / - mus (figur 2C & 2D). Procentdelen af dobbelt-positive populationer (CD4 + IFNy + og CD8 + IFNy +) mellem de to grupper ikke var forskellige. Endvidere i figur 2A, de enkelte positive populationer af CD4+ Og CD8 + T-celler var 21% og 13,3% af de samlede gated splenocytter. Betragtninger, blev de vist sig at være 15,9% og 11,2% af MyD88 - / - splenocytter (figur 2B). Sammenlignet med de inficerede grupper forskellene i procentdelen af enkelt positiv populationer mellem to ikke-inficerede vildtype- og MyD88 - / - mus var meget mindre (19,1% vs. 18,4% for CD4 + -T-celler, 15,7% vs. 13,3% for CD8 + T-celler). Kombineret sammen, blev både CD4 + og CD8 + T celle responser reduceres MyD88 - / - mus sammenlignet med vildtype-gruppen på dag 8 efter NS4B- P38G mutant infektion. En tilsvarende analyse blev udført for prøver indsamlet på dag 21 efter infektion. Som vist i figur 3A og 3B, procentdelen af CD4 + IFNy + af den samlede splenocytter i MyD88 <sup> - / - gruppe (0,1%) var lidt lavere end vildtype-gruppen (0,2%). Den enkelte positive population af CD4 + T-celler i MyD88 - / - gruppe (17%) var også lavere end for vildtype-gruppe (20,6%). I sammenligning hverken den procentdel af CD8 + IFNy + eller procentdelen af enkelt positiv population af CD8 + T-celler var forskellige mellem de to grupper. På dag 4 post-sekundær infektion, de procentdele af dobbelte positive populationer (CD4 + IFNy + og CD8 + IFNy +) i en repræsentativ prøve af vildtype gruppen var 0,3% og 0,5% (figur 4A). Procentsatserne af CD4 + IFNy + og CD8 + IFNy + af de samlede splenocytter gated i en repræsentativ prøve af MyD88 - / - gruppen var 0,1% og 0,2% (Figur 4B). Endvidere var den eneste positive population af CD4 + og CD8 + T-celler 18,7% og 15,8% af de samlede splenocytter fra vildtypemus. Betragtninger, denne procentdel blev reduceret som 12,1% og 12,3% i MyD88 - / - mus (figur 4B). I sammendrag af disse resultater er MyD88 signalering involveret i den indledende T-celle-aktivering af begge populationer og bidrager til CD4 + T-celle respons på et senere tidspunkt for infektion. Det er også involveret i hukommelse CD4 + og CD8 + T-celle responser.

Figur 1
Figur 1:. DC antigenpræsenterende evne vildtype- og MyD88 - / - mus under NS4B- P38G infektion CFSE mærket CD4 + T-celler blev co-dyrket alene (A) eller med DC'er af VNV-NS4B-P38G mutant- inficeret vildtype (B) og MyD88 - / - mus (C) i nærvær af OVA 323-339. Celler blev høstet på dag 5, gated på T celler baseret på FSC / SSC (venstre paneler) og analyseret for deres spredning satser (højre paneler). En repræsentant for tre prøver i hver gruppe blev vist. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
. Figur 2: T-celle responser på et tidligt tidspunkt af VNV NS4B-P38G infektion Splenocytter blev isoleret fra VNV NS4B-P38G mutant- smittet vildtype (A) og MyD88 - / - mus (B) på dag 8. Som kontroller splenocytter blev høstet fra non-inficerede vildtype (C) og MyD88 - / - mus (D). Celler blev dyrket ex vivo med WNV peptider i 5 timer, høstet og farvet for IFNy og CD4 eller CD8. Total splenocytter fra hver gruppe blev gated (P2) og analyseret. De dot plots vises er en repræsentant for tre prøver i hver gruppe. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
. Figur 3: T-celle responser på sent tidspunkt i VNV NS4B-P38G infektion Splenocytter blev isoleret fra VNV NS4B-P38G mutant- smittet vildtype (A) og MyD88 - / - mus (B) på dag 21. Celler blev dyrket ex vivo med WNVpeptider i 5 timer, der er høstet, og farvet for IFN-γ og CD4 eller CD8. Total splenocytter fra hver gruppe blev gated (P2) og analyseret. En repræsentant for tre prøver i hver gruppe blev vist. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4: T-celle-responser under sekundær udfordring med vildtype-WNV Mus, der overlevede fra en primær infektion med WNV NS4B-P38G mutant blev re-inficeret med en LD 100 af vildtype WNV.. På dag 4 post-sekundær infektion blev splenocytter isoleret fra VNV NS4B-P38G mutant- smittet vildtype (A) og MyD88 - / - mus (B). Celler blev dyrket ex vivo med VNV peptider i 5 timer, harvePlacering og farvet for IFN-γ og CD4 eller CD8. Total splenocytter fra hver gruppe blev gated (P2) og analyseret. En repræsentant for tre prøver i hver gruppe blev vist. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

WNV er en BL3 patogen. På grund af sikkerhedsreglerne, der immunologiske assays med VNV-inficerede prøver ofte begrænset af tilgængeligheden af ​​udstyr på BL3 faciliteter eller mere langvarig og trættende at udføre. I en nylig undersøgelse anvendte vi to flowcytometri-baserede metoder til at studere celle-medierede immunresponser under WNV infektion 5. I begge assays blev WNV-inficerede celler behandlet med 1-2% PFA direkte eller med fiksering / permeabilisering opløsning indeholdende 4% PFA. Det er kendt, at 1% PFA fiksering af virusinficerede celler effektivt kan reducere antallet af infektiøse partikler under detektionsgrænsen 12. Derfor har begge metoder væsentligt reduceret ydeevne tid inde BL3 faciliteter. Der er mange etablerede assays til måling T-celleproliferation, herunder gennem inkorporering af BrdU eller radioaktiv thymidin, det flowcytometri-baserede in vitro T-celle priming under anvendelse CFSE mærkede OTII T-celler har givet more nøjagtig bestemmelse af den procentvise andel af prolifererende CD4 + T-celler med væsentligt forbedret samlet følsomhed. Her, 10: blev 1 ratio DCS og T-celler, der anvendes til effektivt at definere antigenpræsenterende kapacitet i WNV infektion. Der anbefales en dosistitrering at studere DC funktioner under infektion med et andet patogen, da dette forhold kan variere. ICS er en almindeligt anvendt flowcytometri-baseret assay at undersøge antigenspecifikke T celle responser. Alligevel er proceduren langvarig, og omfatter cellekultur og flere trin af vask og farvning af celler. Det er potentielt besværligt, når du udfører på BL3 faciliteter. Vi har ændret protokollen, således at cellerne blev oprindeligt stimuleret med VNV specifikke peptider i en mikro-centrifugerør i stedet for en cellekultur plade. Dernæst blev cellerne vasket og farvet inden for mikro-centrifugerør i stedet for koniske rør. Disse ændringer har gjort det muligt for hele processen, der udføres i et biosikkerhed kabinetved hjælp af en mikro-centrifuge maskine, som har elimineret desinficerende procedure for centrifugering celler uden for biosikkerhed kabinet. Celler blev også købt i mikro-centrifugerør med et flowcytometer. Samlet havde mikro-centrifugerør systemet sparet tid og indsats (ca. 2 timer) i ICS forhold til den traditionelle vævskulturplade baseret assay. Endelig kan de mikrocentrifugerør metoden ikke har særligt instrument krav, som er økonomisk og giver større fleksibilitet i udførelsen. Desuden var det lettere at udføre og mindre tidskrævende, hvilket i sidste ende var steget cellelevedygtighed (data ikke vist). Der er en mindre sikkerhedsrisiko på grund af brugen af ​​18 G nål i oprettelsen cellekultur for ICS.

Undersøgelse af den mekanisme, hvormed VNV NS4B-P38G mutant inducerer højere beskyttende immunitet kan udnyttes som et paradigme til at støtte i en rationel udvikling af andre effektive levende svækkede flavivirus vacciner. Ved hjælp af ICS og in vitro T-celle-priming assays har vi vist, at MyD88 signalering er vigtig for udviklingen af cellemedieret adaptiv immunitet under WNV NS4B-P38G mutant infektion. Hverken assay er specifik designet til WNV. De kan også anvendes til at vurdere DC'er og T-cellefunktioner med prøver inficeret med andre BL3 midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875 warm up at 37 °C
anti-CD11c magnetic beads Miltenyi Biotec 130-052-001 follow the manufacturer’s instructions
anti-CD4 magnetic beads Miltenyi Biotec 130-095-248 follow the manufacturer’s instructions
CFSE Invitrogen C34554
OVA residue 323-339 Genscript Corporation RP10610
Peptides Proimmune PC0AD-D
Brefeldin A solution BD Bioscience 555029
Mouse Fc Blocker e-Bioscience 14-0161-85
APC-conjugated CD4 e-Bioscience 17-0041-81
FITC-conjugated CD8 e-Bioscience 11-0081-82
Fixation/Permeabilization Solution BD-Bioscience 554722
Permeabilization/wash buffer BD-Bioscience 554723
anti-IFNγ-PE e-Bioscience 12-7311-82
Accuri flow cytometer BD Bioscience

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
  2. Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
  3. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
  4. Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
  5. Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
  6. Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
  7. Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
  8. Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
  9. Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
  10. Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
  11. Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
  12. Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
  13. Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
  14. Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).

Tags

Immunologi West Nile Virus dendritiske celler T-celler cytokin spredning,
<em>In vitro</em> analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, G., Whiteman, M. C., Wicker, J. More

Xie, G., Whiteman, M. C., Wicker, J. A., Barrett, A. D. T., Wang, T. In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection. J. Vis. Exp. (93), e52121, doi:10.3791/52121 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter