Abstract
En attenuert West Nile virus (WNV), en ikke-bærende (NS) 4B-P38G mutant, induserte høyere iboende cytokin og T-celle-responser enn villtype WNV i mus. Nylig, myeloid differensiering faktor 88 (MyD88) signale ble vist å være viktig for første T-celle priming og minne T-celle utvikling under WNV NS4B-P38G mutant infeksjon. I denne studien ble to flowcytometri-baserte metoder - en in vitro T-celle-priming-analyse og en intracellulær cytokin farging (ICS) - ble anvendt for å vurdere dendrittiske celler (DCS) og T-cellefunksjoner. På T-celle-priming-analysen, ble celleformering analysert ved flowcytometri følgende ko-kultur av DC fra begge grupper av mus med karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) - merkede CD4 + T-celler av OTII transgene mus. Denne tilnærmingen gitt en nøyaktig bestemmelse av prosentandelen av prolifererende CD4 + T-celler med betydelig forbedret sensitivitet enn tradisjonenal-analysene med radioaktive reagenser. En mikrosentrifugerør system ble brukt i begge cellekultur og cytokin fargingsprosedyrer i ICS-protokollen. Sammenlignet med den tradisjonelle vevskulturplate-basert system, dette modifisert prosedyre var lettere å prestere på biosikkerhetsnivå (BL) tre anlegg. Videre ble WNV- infiserte celler behandlet med paraformaldehyde i begge analysene, som gjorde ytterligere analyse utenfor BL3 fasiliteter. Samlet kan disse in vitro-immunologiske analyser anvendes til effektivt å evaluere cellemedierte immunresponser i løpet av WNV-infeksjon.
Introduction
West Nile-viruset (WNV), en neurotropisk, pluss-senset flavivirus, er en voksende helsetrusselen. Foreløpig har ingen vaksiner er godkjent for bruk på mennesker en. En attenuert WNV-stamme, som har en P38G substitusjon i nonstructural (NS) 4B protein, er kjent for å indusere ingen letalitet hos mus, men høyere iboende cytokiner og T-celleresponser hos mus enn villtype WNV NY99 stamme 2. Mus immunisert med NS4B-P38G mutant ble alle beskyttet fra en sekundær utfordring med dødelig villtype WNV. Dette tyder på at NS4B-P38G mutant har egnede egenskaper for en ideell vaksine kandidat. De mekanismer som NS4B-P38G mutant induserer høy beskyttende adaptiv immunitet er ikke klarlagt ennå. Toll-lignende reseptorer (TLR), som anerkjenner patogen-assosiert molekylære mønstre, spille en viktig rolle i initiering av medfødt immunitet mot virusinfeksjon. Kjernen TLR signalveien benytter myeloid differensiering primære respons gene 88 (MyD88) som primær adapteren 3,4. I en fersk undersøkelse, ble MyD88 signale vist seg å spille en viktig rolle i utviklingen av cellemediert immunitet under WNV NS4B- P38G mutant infeksjon hos mus fem. Dentritic celler (DCS) er en av de viktigste antigenpresenterende celler som oppviser den unike evne til å initiere primære T-celleresponser ved virusinfeksjon 6,7. CD4 + og CD8 + T-celler både bidra til langvarig beskyttende immunitet, og er viktig for verts overlevelse etter villtype WNV infeksjon 8,9. To immunologiske analyser ble anvendt i denne studie for å vurdere de funksjoner av disse celler i NS4B-P38G mutante infiserte mus.
Først ble en in vitro T-celle-priming-analyse anvendt for å sammenligne den antigen-presenterende evne DC av WNV-infiserte vill-type og MyD88 - / - mus. For å øke sensitiviteten for analysen, naive CD4 <sup> + T celler ble isolert fra OTII gene mus som uttrykker en Vα2 / Vβ5 TCR spesifikk for kylling ovalbumin (OVA) peptid 323 - 339. DCs av WNV infiserte mus ble renset, og co-kultivert med karboksyfluorescens succinimidyl påske (CFSE ) -merket CD4 + T-celler i nærvær av OVA peptidet. Etter fem dager med co-kultur ble cellene høstet og festes med paraformaldehyde (PFA) og analysert av flowcytometri. Proliferative assays har tradisjonelt blitt utført ved inkorporering av 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) eller tritiert thymin deoxyriboside (3 HTdr) 10. Likevel, disse analysene er enten radioaktivt og / eller behov for spesialutstyr på biosikkerhetsnivå (BL) 3 anlegg, hvor WNV studier er gjennomført. Den strømningscytometrisk analyse av lymfocytt proliferasjon av serie halvering av fluorescens-intensiteten av den vitale fargestoff CFSE er blitt mer vanlig brukt i immunologiske analyser som fargestoff er mer stabiltog jevnt inkorporert i cellene påvises lett ved flowcytometri, og er ikke-radioaktivt 11. Analysen har også evnen til å vurdere antall celledelinger. En stor fordel ved å bruke denne analysen i WNV studier er at fiksering av de infiserte celler med 1-2% PFA kunne inaktivere WNV 12, som vil gjøre det mulig for prøvetagning med et strømningscytometer i en BL2 laboratorium.
Deretter ble en modifisert intracellulær cytokin farging (ICS) Fremgangsmåten anvendt for å studere rollen til MyD88 signalering i reguleringen av WNV spesifikke T-celle responser in NS4B-P38G mutant-infiserte mus. I denne analysen, ble splenocytter isolert fra infiserte mus behandlet in vitro med WNV spesifikke peptider. Brefeldin A ble tilsatt for å beholde cytokiner i cellen. Etter 5 timers inkubasjon ble cellene høstet, vasket og farget for T-celle-undergrupper. Celler ble deretter fiksert i PFA, permeabilisert og farget for interferon (IFN) -γ og analysert ved flow-cytometri.Som med andre flowcytometri-baserte assay, når cellene blir behandlet med fiksering og permeabilization buffer inneholdende PFA, infiserte prøvene kan overføres til en BL2 laboratorium for ytterligere behandling og analyse. I flere publiserte studier, har vi brukt ICS å måle T celle effektorfunksjoner i WNV-infiserte mus 13,14. Selv om det er godt etablert, en stor ulempe med denne analysen er at framgangsmåten er svært lang og kan være mer tidkrevende når utført inne BL3 anlegg. Her ble et mikro-sentrifugerør basert ICS metoden vist seg å være mer praktisk og lettere å fortsette, og mindre tidkrevende når det utføres innenfor et BL3 laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved University of Texas Medical Branch.
1. Isolering av DCs fra Non-smittet og WNV-infisert Mus
- Alders- og seksual kamp 6-10 uker gamle, villtype C57BL / 6 (B6) og MyD88 - / - mus. Vaksinere intraperitonealt (ip) med 500 plakk dannende enhet (PFU) av WNV NS4B- P38G mutant. På dag 3 post-infeksjon, avlive B6 og MyD88 - / - mus med CO 2. Bruke ikke-infiserte mus av begge gruppene som kontroller. Bruke tre mus fra hver gruppe.
- Våt pels på venstre side av ofret mus med 70% etanol og klippe bort pelsen langs venstre side av musen, omtrent halvveis mellom for- og bakbein. Kutte åpne kroppens hulrom. Fjerne milten ved hjelp av tang. Plasser milt i en petriskål med RPMI.
- Isoler milt DCs ved hjelp av anti-CD11c magnetiske kuler i henhold tilprodusentens instruksjoner.
2. Rensing og merking av T-celler av OTII gene mus
- Høste ett milt fra en naiv OTII mus som beskrevet i trinn 1.2 ovenfor og homogen milten mellom frostet endene av to lysbilder. Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml konisk rør, tilsett RPMI medium opp til 14 ml. La suspensjon sitte i 5 min og overføre 13 ml av det til en ny 15 ml konisk tube.
- Isolere milt-CD4 + T-celler ved hjelp av en CD4 + T-celleisoleringssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Overfør cellene i et 50 ml konisk rør, vaskes to ganger med PBS. Resuspender celler i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) ved 1 x 10 6 celler pr ml og tilsett 0,5 umol / ml av CFSE. Inkuber ved 37 ° C i 10 minutter, beskyttet mot lys.
- Tilsett 5 ml kaldt komplett medium (RPMI-1640 med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum, 1/100 volantibiotika / antimykotika, hundredel vol L-glutamin og 1/1000 vol av 1000 x 2-merkaptoetanol).
- Inkuber på is i 5 min. Vask cellene en gang med PBS, fikse 0,2 x 10 6 merkede CD4 + T-celler i 2% PFA og tilegne seg på et strømningscytometer. Bruke denne prøven for å bestemme den basalnivået CFSE. Re-suspendere resten av merkede celler i fullstendig medium.
3. Co-kultur OTII T celler med DCs av WNV-infisert Mus
- Kultur 2 x 10 5 rensede CD4 + T-celler fra mus OTII alene eller sammen med rensede DC av villtype eller MyD88 - / - mus (2 x 10 4) i en 24 brønns plate med eller uten OVA rest 323-339 (1 g / ml) i 1 ml fullstendig medium per brønn.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 5 dager. Høste celler, vask to ganger i FACS buffer (PBS med 1% FBS) og fikse på 0,25 ml 2% PFA. Vortex umiddelbart.
4. flowcytometrisystemer Analyse av In Vitro </ Em> T Cell Grunning
- For erverv, dobbeltklikker du på flowcytometri programvare ikonet. For en tetthet tomt på lineær FSC-A vs. lineær SSC-A, velger kanaler 0 til 200.000 på FSC-A og 0 til 200.000 på SSC-A. Deretter oppretter du en gate på levende celler (P2, se figur 1A).
- Å analysere fluorescens intensitet av CFSE, åpner histogram for FL1 kanal og erverve 20.000 hendelser på gated befolkningen. Sett opp en markør på prøver for OTII celler dyrket alene (figur 1A).
- Erverve prøver for OTII celler co-dyrket med villtype DC (Figur 1B) eller MyD88 - / - DC (figur 1C) på en lignende måte.
5. Isolasjon og Stimulering av Splenocytter for Cytokine Analyser
- Infect B6 og MyD88 - / - mus med WNV NS4B-P38G mutant ved hjelp av samme fremgangsmåte som beskrevet i step 1.1. På dag 30 etter smitte, re-utfordring overlevende mus med 2000 PFU av villtype WNV belastning ip På dager 8 og 21 post-primær WNV infeksjon og i dag 4 etter sekundær infeksjon, avlive mus med CO 2 for innsamling av spleens .
MERK: Vi brukte 2-3 mus per gruppe for hvert tidspunkt. - Foreta en enkelt cellesuspensjon av splenocytter som beskrevet ovenfor i trinn 1.2 og trinn 2.2. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og re-suspendere dem i 10 ml komplett medium.
- Fortynn cellene med komplett medium til 2,5 x 10 6 celler / ml. Tilsett 1 ml av splenocytter i et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør.
- For å simulere CD8 + T-celler, fortynn WNV-spesifikke NS4B og E peptider (SSVWNATTA og IALTFLAV) til 1 mg / ml i DMSO. For stimulering av CD4 + T-celler, fortynn WNV-spesifikke NS3 og E peptider (RRWCFDGPRTNTILE og PVGRLVTVNPFVSVA) til 1 mg / ml i DMSO. Tilsett 10 pl av peptider til cellene followed ved en ul Brefeldin En løsning. Bruk celler uten peptider behandling som kontroller. Bland cellene.
- Punch to hull med en 18 G nål i hatten av røret. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5 timer.
6. Intracellulær Cytokine Farging
- Overfør cellene til en ny mikro-sentrifugerør. Spinne celler i 5 min ved 300-400 xg og hell av supernatant. Tilsett 1 ml FACS buffer, spin 5 min på 300-400 xg og re-suspendere celler ved pipettering med 120 mL FACS buffer.
- Tilsett 2 ul Fc-blokkering og inkuberes cellene ved romtemperatur i 10 min. Tilsett 1 ml FACS-buffer til hvert rør. Sentrifugering 5 minutter ved 300-400 x g.
- Re-suspendere celler i 300 mL FACS buffer og dele dem inn i tre rør (ca 0,8 x 10 6 celler per tube). Som vist i tabell 1, reservere det første rør i hver dyrkingsbetingelser for rotte-IgG-PE farging. For det andre røret, legger 3 mL av anti-CD4 APC til CD4 peptider-behandlede celler, 3 μl av anti-CD8-FITC til CD8 peptider-behandlede celler eller begge antistoffer mot peptider celler uten behandling. Bruk den tredje tube for kompensasjon farging. For hver kultur tilstand, bruke tre rør av celler farget med APC-konjugert CD4, FITC-konjugert CD8 eller PE-merket CD3 antistoffer alene (3 mL per rør) som kompensasjon kontroller for FL1, FL2 og FL4 kanaler.
- Vortex celler kort stund. La på is i 20 min og beskytte mot lys. Legg 1.4 ml FACS buffer. Spinne 5 min på 300-400 xg og hell av supernatant.
- Agitere for å forstyrre celle pellet (eller kort vortex). Re-suspendere cellepelleten i 250 pl fiksering / permeabilization solutionby pipettering. Inkuber ved romtemperatur i 20 min og beskyttes mot lys.
- Tilsett 1,2 ml FACS buffer. Spin 5 min på 300-400 xg og resuspender celler i 300 mL FACS buffer.
MERK: På dette punkt celler kan overføres til en BL2 laboratorium for ytterligere behandling eller oppbevaring i kjøleskap og beskyttet mot lys i up til tre dager. - Legg 500 mL FACS buffer. Spin 5 min på 300-400 xg og resuspender celler i 500 mL av 1x permeabilization / vaskebuffer. Spin 5 min ved 300-400 x g.
- Re-suspendere celler i 100 mL 1x Perm / Wash, tilsett 3,5 mL anti-IFNy-PE til røret tidligere lagt med antistoffer for CD4 og / eller CD8 T-celle markører i trinn 6,3 og 3,5 mL rotte IgG-PE i røret reservert for IgG kontroll i 25 minutter på isen og beskytte mot lys. Vask cellene ved tilsetning av 1,4 ml 1 x permeabilization / vaskebuffer. Spin 5 min ved 300-400 x g. Gjenta vasketrinn ved å tilsette 1,4 ml 1 x permeabilization / vaskebuffer.
- Spinne 5 min på 300-400 xg og dekanter supernatanten. Vask celler ved å legge 1,4 ml FACS buffer og re-suspendere i 400 mL av FACS buffer for slutt oppkjøpet.
7. flowcytometrisystemer Analyse av Intracellulær Cytokine Farging
- Bruk de samme oppkjøps innstillinger som i trinn 4.1. Create en gate på levende celler (P2, se figur 2A). Justere spenninger ved hjelp av kompensasjon rør for hver gruppe.
- Åpne to nye prikk tomter, til man vise data samlet inn for FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), og den andre er å vise data som er samlet for FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Erverve 50.000 hendelser for gated befolkningen i hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På T-celle-priming-analysen, CFSE merkede CD4 + T-celler ble dyrket med rensede DC fra NS4B-P38G mutant-infiserte vill-type og MyD88 - / - mus i nærvær eller fravær av OVA peptider. Merkede T-celler dyrket alene, med eller uten OVA i 5 dager, ble anvendt som negative kontroller. Som vist i Figur 1A, ble det samlede T-celler gated for analyse av fluorescensintensitet på FL1-kanalen. Markøren ble satt opp på grunnlag av de ferske merkede CD4 + T-celler på dag 0 for å bestemme proliferasjons- hastighet uten ko-kultur av DC. Det var et lavt nivå av spredningshastighet (1,6%) under denne kulturen tilstand. Den samme markør ble brukt for å bestemme proliferasjons- hastighet på CD4 + T-celler ko-dyrket med DC på en 10: 1-forhold. På grunn av deres høye forholdet i ko-kulturen og deres proliferative karakter, kan T-celler bli separert på de blandede populasjoner uten ytterligere fenotypisk staining. Som vist i figur 1B, var det en 87,0% proliferasjonsrate i vill-type gruppe, som vist i en representant for tre prøver som ble behandlet under de samme betingelser. Videre CFSE-merkede T-celler ko-dyrket med DC av MyD88 - / - mus i nærvær av OVA hadde en 74,5% spredningshastighet (figur 1C). Således formeringshastigheten av OT II CD4 + T celler ko-dyrket med DC av NS4B-P38G mutant-infiserte MyD88 - / - mus som var lavere enn for de ko-dyrket med DC fra villtype-mus. Disse resultatene tyder på at en mangel på MyD88- signalveien fører til en nedsatt antigen-presenterende kapasitet på DC under NS4B-P38G mutant infeksjon.
Å analysere ICS resultater, gated vi på total splenocyter isolert fra villtype mus på dag 8 etter infeksjon (Figur 2A), prosenter av dobbel-positive populasjoner (CD4 <sup> + IFNy + og CD8 + IFNy +) i en representativ prøve var henholdsvis 0,4% og 1,7%. Prosentandelene av CD4 + IFNy + og CD8 + + IFNy av totale splenocytter gated i en representativ prøve av MyD88 - / - mus var henholdsvis 0,2% og 0,6% (figur 2B). Ingen forskjeller ble observert i den doble-positive bestander av de to gruppene av splenocytes uten peptider behandling (data ikke vist). Lignende analyser ble utført med splenocytter isolert fra ikke-infiserte, villtype og MyD88 - / - mus (figurene 2C og 2D). Prosentandelene av dobbelt-positive populasjoner (CD4 + IFNy + og CD8 + IFNy +) mellom de to gruppene var ikke forskjellig. Videre er det i figur 2A, de enkle positive populasjoner av CD4+ Og CD8 + T-celler var 21% og 13,3% av de totale gated splenocytter. Mens, ble de vist å være 15,9% og 11,2% av MyD88 - / - splenocytter (figur 2B). Sammenlignet med de infiserte grupper, er forskjellene i prosentandelen av enkle positive populasjoner mellom de to ikke-infiserte vill-type og MyD88 - / - mus som var mye mindre (19,1% vs. 18,4% for CD4 + T-celler, 15,7% vs. 13,3% for CD8 + T-celler). Satt sammen, ble både CD4 + og CD8 + T-celleresponser redusert i MyD88 - / - mus sammenlignet med villtype-gruppen på dag 8 etter NS4B- P38G mutant infeksjon. En lignende analyse ble utført på prøver samlet på dag 21 etter infeksjon. Som vist i figur 3A og 3B, er prosentandelen av CD4 + + IFNy av totale splenocytter i MyD88 <sup> - / - gruppen (0,1%) var noe lavere enn villtype-gruppen (0,2%). Den eneste positive populasjon av CD4 + T-celler i MyD88 - / - (17%) var også lavere enn for villtype-gruppen (20,6%). Til sammenligning, hverken prosenten av CD8 + + IFNy eller andelen av enkelt positive populasjon av CD8 + T-celler var forskjellig mellom de to gruppene. På dag 4 etter sekundær infeksjon, de prosentandeler av doble positive populasjoner (CD4 + IFNy + og CD8 + IFNy +) i en representativ prøve av villtype-gruppen var henholdsvis 0,3% og 0,5% (figur 4A). Prosentandelene av CD4 + IFNy + og CD8 + + IFNy av totale splenocytter gated i en representativ prøve av MyD88 - / - gruppe var 0,1% og 0,2% (Figur 4B). Videre er den eneste positive populasjon av CD4 + og CD8 + T-celler var 18,7% og 15,8% av total splenocytter fra villtype-mus. Mens, ble denne prosentandelen redusert som 12,1% og 12,3% i MyD88 - / - mus (figur 4B). Som en oppsummering av disse resultatene, er MyD88 signalering er involvert i den første T-celle-aktivering av begge populasjoner og bidrar til CD4 + T-cellerespons på et senere stadium av infeksjonen. Det er også involvert i minne CD4 + og CD8 + T celle responser.
Fig. 1: DC antigen-presenterende evne i vill-type og MyD88 - / - mus under NS4B- P38G infeksjon CFSE merkede CD4 + T-celler ble ko-dyrket alene (A) eller med DC av WNV-NS4B-P38G mutant- infiserte vill-type (B) og MyD88 - / - mus (C) i nærvær av OVA 323-339. Cellene ble høstet på dag 5, gated på T-celler basert på FSC / SSC (venstre panel) og analysert for deres spredning priser (høyre panel). En representant for tre prøver i hver gruppe ble vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: T-celleresponser på et tidlig stadium av WNV NS4B-P38G infeksjon Splenocytter ble isolert fra WNV NS4B-P38G mutant- infiserte vill-type (A) og MyD88 - / - mus (B) på dag 8. Som kontroller splenocyter ble høstet fra ikke-infected villtype (C), og MyD88 - / - mus (D). Celler ble dyrket ex vivo med WNV peptider for 5 timer, høstes, og farget for IFNy og CD4 eller CD8. Total splenocytter fra hver gruppe ble gated (P2) og analysert. Dot tomter som vises er en representant av tre prøver i hver gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: T-celle responser ved sent stadium av WNV NS4B-P38G infeksjon Splenocytter ble isolert fra WNV NS4B-P38G mutant- infiserte vill-type (A) og MyD88 - / - mus (B) på dag 21. Celler ble dyrket ex vivo med WNVPeptidene i 5 timer, høstes, og farget for IFN-γ og CD4 eller CD8. Total splenocytter fra hver gruppe ble gated (P2) og analysert. En representant for tre prøver i hver gruppe ble vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: T celle responser under sekundær utfordring med villtype WNV Mus som overlevde fra en primær infeksjon med WNV NS4B-P38G mutant ble re-infisert med en LD 100 av villtype WNV.. På dag 4 etter sekundær infeksjon, ble splenocytter isolert fra WNV NS4B-P38G mutant- infiserte vill-type (A) og MyD88 - / - mus (B). Celler ble dyrket ex vivo sammen med WNV peptider i 5 timer, harveSTED, og farget for IFN-γ og CD4 eller CD8. Total splenocytter fra hver gruppe ble gated (P2) og analysert. En representant for tre prøver i hver gruppe ble vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WNV er en BL3 patogen. På grunn av sikkerhetsforskrifter, er immunologiske analyser med WNV-infiserte prøvene ofte begrenset av tilgjengeligheten av utstyr ved BL3 anlegg eller mer langvarig og kjedelig å utføre. I en fersk studie, brukte vi to flowcytometri-baserte metoder for å studere cellemedierte immunresponser under WNV infeksjon 5. I begge analysene ble WNV-infiserte celler behandlet med 1-2% PFA, direkte eller med fiksering / permeabilization oppløsning inneholdende 4% PFA. Det er kjent at 1% PFA fiksering av virus-infiserte celler kan effektivt redusere antallet infeksiøse partikler under deteksjonsgrensene 12. Derfor har begge metodene betydelig redusert ytelse tid inne BL3 fasiliteter. Det er mange etablerte analyser for å måle T-celle-proliferasjon, inkludert de gjennom inkorporering av BrdU eller radioaktivt tymidin, flowcytometri-basert in vitro T-celle-assay ved å bruke prim CFSE merket OTII T-celler har gitt more nøyaktig bestemmelse av andelen av prolifererende CD4 + T-celler med betydelig forbedret sensitivitet. Her, en 10: ble en ratio for DCS og T-celler som brukes til å effektivt definere antigenpresenterende kapasitet i løpet WNV infeksjon. En dosetitrering anbefales å studere DC funksjoner under infeksjon med en annen patogen, da dette forholdet kan variere. ICS er et vanlig brukt flowcytometri-basert assay for å studere antigen-spesifikke T-celle responser. Likevel er fremgangsmåten omfattende, og det omfatter cellekultur og flere trinn for vasking og farging av cellene. Det er potensielt plagsom når du utfører på BL3 fasiliteter. Vi har modifisert protokoll, slik at cellene først ble stimulert med WNV spesifikke peptider i et mikro-sentrifugerør i stedet for et vev-kulturplate. Deretter ble cellene vasket og farget innenfor mikro-sentrifugerør i stedet for koniske rør. Disse endringene har aktivert hele prosessen blir utført inne i en biosikkerhet kabinettved hjelp av en mikro-sentrifuge maskin, som har eliminert desinfeksjonsfremgangsmåten for å sentrifugere cellene utenfor biosikkerhet skapet. Celler ble også kjøpt i mikro-sentrifugerør med et strømningscytometer. Total, mikro-sentrifugerør systemet hadde spart tid og innsats (ca. 2 timer) i ICS forhold til den tradisjonelle vevskulturplate basert assay. Endelig gjør mikrosentrifugerør metoden ikke har spesielt instrument kravet, som er økonomisk og gir mer fleksibilitet i ytelse. I tillegg var det lettere å utføre og mindre tidkrevende, som hadde til slutt økt celle levedyktighet (data ikke vist). Det er en mindre sikkerhetsproblemer på grunn av bruk av 18 G nål i å sette opp cellekultur for ICS.
Undersøkelse av mekanismen som WNV NS4B-P38G mutant induserer høyere beskyttende immunitet kan benyttes som et paradigme for å hjelpe til rasjonell utvikling av andre effektive levende, svekkede vaksiner flavivirus. Ved å bruke ICS og in vitro T-celle-grunnings analyser har vi vist at MyD88 signalering er viktig for utvikling av cellemediert adaptiv immunitet under WNV NS4B-P38G mutant infeksjon. Verken analysen er spesifikt designet for WNV. De kan også brukes til å vurdere DCS, og T-cellefunksjoner med prøver infisert med andre BL3 midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
