Abstract
Aquí presentamos una serie de protocolos de investigación a fondo probados y bien estandarizados adaptados para su uso en ambientes marinos remotos. Los protocolos de muestreo incluyen la evaluación de los recursos a disposición de la comunidad microbiana (carbono orgánico disuelto, la materia orgánica particulada, nutrientes inorgánicos), y una descripción completa de las comunidades virales y bacterianas (a través de los recuentos microbianos y virales directos, la enumeración de los microbios autofluorescentes, y construcción de metagenomes virales y microbianas). Utilizamos una combinación de métodos, que representan un campo disperso de las disciplinas científicas que comprenden protocolos ya establecidos y algunas de las técnicas más recientes desarrollados. Técnicas de secuenciación metagenómica Especialmente utilizados para la caracterización viral y bacteriana de la comunidad, se han establecido sólo en los últimos años, y por lo tanto están todavía sometidos a la mejora continua. Esto ha conducido a una variedad de procedimientos de muestreo y procesamiento de las muestras Currentemente en uso. El conjunto de métodos que aquí se presenta ofrece un enfoque hasta la fecha para recoger y procesar muestras ambientales. Parámetros tratados con estos protocolos producen el mínimo de información esencial para caracterizar y comprender los mecanismos subyacentes de la dinámica de la comunidad virales y microbianas. Da fácil de seguir las directrices para llevar a cabo estudios amplios y discute los pasos críticos y advertencias potenciales pertinentes para cada técnica.
Introduction
Los ecosistemas marinos son sometidos a una amplia gama de perturbaciones que resultan en cambios con respecto a la disponibilidad de nutrientes a la biomasa de los depredadores. Durante la última década, varios estudios han demostrado la importancia de las comunidades microbianas en los ecosistemas marinos 1.4. Es evidente que los cambios en la comunidad bacteriana y viral están estrechamente asociados con la degradación general de los entornos marinos 5. Estos cambios pueden ser facilitadas por la geoquímica de alteración en la columna de agua, tales como la disponibilidad de oxígeno o 6,7 remineralización de carbono. Como resultado de la interdependencia entre el macroorganismos, la química del agua y ciclos de retroalimentación de actividad microbiana puede acelerar la tasa de degradación de los ecosistemas 8.
En los años 1970 y 80 se hicieron múltiples intentos de desentrañar los ciclos biogeoquímicos en los ecosistemas marinos 9.11. Uno de los principales retos para estos primeros estudios fue la faltade enfoques estandarizados para medir los parámetros biogeoquímicos evaluados. Aunque hubo protocolos disponibles, principalmente en los nutrientes del agua de mar 12,13, la evaluación de la dinámica del carbono y la estructura de la comunidad microbiana fueron limitados por las herramientas y métodos disponibles. Con la comparación de métodos JGOFS EQPac, Sharp et al. 14 sugirió por primera vez un protocolo fiable y estandarizado para las evaluaciones de concentración (DOC) de carbono orgánico disuelto. A principios de la década de 2000 los retos analíticos para determinar los recursos disponibles para la comunidad microbiana se habían resuelto de este modo en gran medida y enfoques para caracterizar las comunidades microbianas en ambientes de cultivo controladas se había establecido (ver DeLong 15). Los métodos de secuenciación tradicionales de la época se basaban en gran medida en cultivos clonales cultivadas. La secuenciación de genes ambiental adelantado de muestras naturales reveló, sin embargo, que la mayoría de la biodiversidad microbiana se había perdido por cultivmétodos basados en la ación 16. En 2002, Breitbart et al. 17 utiliza la secuenciación escopeta para la primera vez para describir la comunidad viral en muestras de agua de mar ambientales se establece un método para secuenciar el genoma completo de comunidades virales uncultured marinos.
Dentro de las evaluaciones microbianas existentes, los virus siguen siendo particularmente bajo estudiada, ya que la mayoría son difíciles de cultivar y que carecen de un marcador universalmente conservada como el 16S ARN ribosomal (rRNA) genes normalmente utilizados para la evaluación de la diversidad y el perfil de la comunidad. El enfoque de secuenciación metagenómica ofrece una alternativa a los métodos de cultivo y dependiente de genes orientados para el análisis de comunidades virales complejos. Mientras que los primeros metagenomes virales generados a partir de agua de mar se secuenciaron usando secuenciación de Sanger 17, el desarrollo de tecnologías de secuenciación de próxima generación y mejora de las técnicas moleculares ha llevado a un rápido aumento en los estudios de metagenómica 18 19-21.
Para avanzar en el conocimiento existente sobre viral, microbiano y el funcionamiento bioquímico en los ecosistemas acuáticos, la comparación de conjuntos de datos en los diferentes sistemas en todo el mundo es esencial. Sin embargo, los protocolos establecidos en gran parte han sido desarrollados para entornos cercanos a la costa con instalaciones de laboratorio de fácil acceso. Por lo tanto, la falta de métodos de campo estandarizados dificulta estas comparaciones entre ecosistemas. Aquí presentamos probado a fondo y bien estandarizado adaptaciones de estado de los protocolos de investigación técnica para su uso en lugares remotos de campo. Estos métodos han sido probados con éxito en múltiples estudios sobre el transcurso de la última década 5,22 y se utilizan en la actualidad por diversos laboratorios marinos, así como en el de NOAAEvaluación y Programa de Monitoreo de Arrecifes (RAMP) en todo el Océano Pacífico 4. Los protocolos de muestreo incluyen parámetros de química de agua (concentraciones de carbono inorgánicos y orgánicos, concentración de nutrientes inorgánicos), la abundancia viral y microbiana (recuentos bacterianos directos, recuentos directos virales, y citometría de flujo para evaluar autotroph vs proporciones heterótrofos), y estructura de la comunidad microbiana y viral y potencial metabólico a través de análisis de metagenómica (para una visión general véase la figura 1). Los resultados obtenidos a partir de los métodos descritos aquí son necesarios con el fin de dilucidar los parámetros de fondo biogeoquímicos clave necesarios para caracterizar exhaustivamente los ecosistemas acuáticos.
Protocol
1. Preparación de Instrumentos
- Preparación de la instalación de filtración
- Preparar una solución al 5% de ácido clorhídrico (HCl) (0,5-0,6 M, añadir 250 ml 32-36% de HCl a 4,75 L de agua destilada para hacer 5 L de solución final). Almacenar esta solución en un polietileno de alta densidad de contenedores (HDPE) para un máximo de 2 semanas.
- Deje todas las partes que entrarán en contacto con la muestra (excepto los filtros) para las 24 horas en la solución de HCl al 5% a sanguijuela a cabo (DOC) posibles contaminantes de carbono orgánico disuelto. Después de cada evento de muestreo enjuagar todas las piezas y líneas de lavado con aproximadamente 30 ml de solución de HCl al 5% para evitar la contaminación de carbono (por ejemplo, a partir de vapores de gasolina, aceite, botes de spray de mosquitos).
- Mantenga todos los elementos de muestreo envueltos en papel de aluminio pre-combustión o tapados hasta que inmediatamente antes de su uso.
- Precombust 25 mm de filtros GF / F envueltos en papel de aluminio en un horno de mufla a 550 ° C durante 12 horas para volatilizan de todo el carbono y los almacenan en un lugar limpio y secocolocar hasta su uso. El uso de fórceps y se lavó ácido, guantes no en polvo estériles para manejar los filtros precombusted en todo momento.
- Preparación de viral metagenoma Materiales de muestreo
- Lávese bien las cuatro bombonas de 20 L plegables de polietileno de baja densidad y cuatro cubos de polietileno de alta densidad de 20 L y tapas con lejía al 10%.
- Posteriormente enjuague todos los artículos 3 veces con agua destilada y se muestra a continuación, y resellar bombonas con la espita.
- Filtros de lavado de flujo tangencial (TFF) después de cada uso de acuerdo con el siguiente protocolo, y limpio preventivamente si el filtro no se ha utilizado en los últimos 5 días.
- Disolver 50 g de gránulos de NaOH en 5 L de agua en un cubo de lavado.
- Adjuntar un TFF húmedo para el tubo y montar de acuerdo con la Figura 3.
- Ejecute bomba peristáltica a ~ 30 rpm sin contrapresión para mover algunos de la solución de lavado de NaOH a través del sistema. Una vez lavado fluye desde la línea de retorno, mover la transferencia de lavar cubopara completar la circulación de la solución.
- Aplicar la contrapresión en el sistema mediante la colocación de una pinza en la línea de retorno aguas abajo de la TFF. Esto obligará a la solución de lavado fuera de la línea de filtrado. Tiempo excesivo (5 min) para inundar el exterior de la TFF y producir filtrado es indicativo de una TFF degradado.
- Ejecutar el sistema hasta que toda la solución de NaOH es en las líneas. A continuación, retire la contrapresión, la solución de gestión del sistema y desechar.
- Enjuague la TFF por el agua que corre bajo contrapresión hasta que el pH del agua que fluye de las líneas de retorno y de filtrado es de pH 7-8.
- Retire la tubería de la bomba peristáltica y TFF. Vuelva a sellar TFF para el almacenamiento. Asegúrese de que la TFF se mantiene húmedo hasta el siguiente uso.
2. Recogida de muestras
NOTA: Durante el transporte de todas las muestras recogidas se deben almacenar fresco (si es posible 4 ° C) y no exponerse a la luz solar directa hasta su posterior procesamiento.
- Muestreode carbono, nutrientes, microscopía, citometría de flujo, y microbianos metagenómica
- Tome dos unidades Hatay Niskin por evento de muestreo (que resulta en 4 L de agua de la muestra). Abra los recipientes de muestreo justo antes de la inmersión (aire atrapado de otro modo evitará descendente).
- En el sitio correspondiente, lave el interior del recipiente de muestreo con el agua de la muestra mediante la apertura de ambos extremos y moviendo el cilindro a lo largo del eje polar a través del agua.
- Tomar la muestra y cierre con cuidado el recipiente de muestreo. Asegúrese de que el sitio de muestreo es aguas arriba del barco y buzos para evitar la contaminación.
- Muestreo para virales metagenómica
- En el sitio de destino de montaje de la bomba de sentina de 20 L bombona.
- Llenar bombona apuntando entrada de la bomba de achique en el cada área y el sello bombona apuntado con el grifo correspondiente.
- Suma 4 garrafones de agua de mar sin filtrar (todos juntos 80 L) de cada sitio de muestreo.
3. Samppreparación le
NOTA: El proceso de las muestras en el orden que aquí se presenta, a partir de DOC para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación. Utilice guantes sin polvo durante todo el procedimiento.
- Carbono orgánico disuelto (COD)
- Monte una de las dos unidades alícuotas Hatay Niskin en ranura respectiva del conjunto de filtración. Conectar el tubo de salida que conduce a el soporte del filtro respectivo. Conecte el tubo de aire a presión (0,2 bar) a la unidad de Hatay Niskin (Ver Figura 2).
- Enjuague todas las líneas con 100 ml de agua de la muestra antes de la inserción de filtros en los soportes de los filtros. Coloque 25 mm pre-combustión GF / F filtro en el soporte del filtro utilizando el ácido lava fórceps. Enjuague cada botella DOC y la tapa 3 veces con aproximadamente 20 ml de agua con filtro de muestreo.
- Llene la botella con unos 40 ml (~ 2/3 lleno) de agua de muestreo. Recoge al menos duplicados de muestras DOC para tener una copia de seguridad en caso de contaminación o pérdida potencial durante el transporte.
- Fbotellas de muestreo reeze de pie en posición vertical a -20 ° C hasta su análisis.
- Partículas de Materia Orgánica (POM)
- Después las muestras se han recogido DOC siguen filtrado hasta un total de 500 ml de haber pasado el filtro GF / F, incluyendo lo que pasó a través, mientras que la recogida de muestras DOC.
- Soporte del filtro en línea Desenrosque.
- Quite el filtro de análisis POM utilizando fórceps y filtro lugar dentro de un cuadrado de papel de aluminio pre-combustión, doble-lado superior giró sobre sí mismo, y envolver.
- Congelar filtros a -20 ° C para el almacenamiento hasta sometido a análisis elemental e isotópica.
- Los nutrientes inorgánicos
- Coloque un filtro de 0,2 micras Track-grabados en cada soporte del filtro. Vuelva a colocar los cartuchos de filtro.
- Enjuague cada botella de plástico de centelleo de 20 ml tres veces con agua de muestreo. Llene cada botella para el hombro (~ 18 ml).
- Congelar a -20 ° C hasta su análisis posterior.
- Microscopy (SYBR Gold y DAPI)
- Quítese soporte del filtro.
- Recoger 1 ml de agua en cada uno de dos tubos de microcentrífuga.
- Añadir 66 l 32% de paraformaldehído a una de las alícuotas (para la tinción de oro SYBR más adelante). Añadir 12 l 25% de glutaraldehído a la correspondiente otro (para más tarde la tinción DAPI).
- Mezclar suavemente, y permiten muestras para "arreglar" por lo menos durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Citometría de Flujo
- Publicar un filtro de policarbonato de 8,0 micras en uno de los soportes de filtro para excluir los desechos y grandes células eucariotas.
- Pasar a través de un muestreo de agua para llenar 2 crioviales de cada sitio de muestreo con 1 ml de muestra.
- Añadir 5 l de 25% de glutaraldehído a cada criovial (concentración final = 0,125%).
- Invierta los frascos para mezclar.
- Permita que la muestra para fijar durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. No exceda de 30 minutos.
- Muestras de congelación flash en nitrógeno líquido.
- Guardar las muestras a -80 ° C o en liquid nitrógeno cargador seco hasta su análisis en un citómetro de flujo.
- Muestra Metagenomic Microbiana
- Retire en soportes de los filtros de línea.
- Directamente montar un filtro cilíndrico de 0,22 m sobre la línea respectiva.
- Filtrar el agua restante de la muestra de las dos unidades de Hatay Niskin de cada sitio (por un total de 3-4 litros por filtro) a través de un filtro.
- Después de la filtración empujar el agua restante de cada filtro usando una jeringa de 10 ml limpio lleno de aire.
- Coloque el filtro nuevo en su embalaje original y sellar el paquete con cinta laboratorio.
- Guarde filtros empaquetados individualmente a -20 ° C.
- Muestra Metagenomic Viral
- Transferir muestras metagenome virales inmediatamente en los cubos lava para garantizar que no se muestra se pierde o contaminada por el medio ambiente.
- Pre-filtro con poros grandes de malla de nylon tamaño (25-100 micras) para eliminar los desechos y el material celular antes de la concentración 19.
- Configurar el TFF como se muestra en la Figura 3, la colocación de la tubería de transporte en un cubo de muestra, y dejando las líneas de retorno y el filtrado se ejecutan en un fregadero.
- Encienda la bomba peristáltica y líneas de lavado con 1.2 L de agua de la muestra.
- Coloque la línea de retorno en el cubo de la muestra para completar el ciclo, añadir 0,7 bar de contrapresión.
- Mientras que la concentración del agua de mar, la parte superior de la muestra hasta el depósito como el nivel baja. Cuando el nivel de agua cae por debajo de la línea de admisión en el cubo, concentrado de transferencia en un blanqueador-lavado, enjuagado tres veces tripour vaso de precipitados y seguir concentrando.
- Si vaso depósito está vacío, retire la contrapresión, aumentar la velocidad de la bomba y empuje toda la muestra a través de las líneas, la recuperación en la tripour.
- Pase el concentrado a través de filtros de 0,45 micras cilíndricas para eliminar la mayoría de las bacterias, mientras que no se discrimine contra cualquier linajes virales.
- Cambiar 0,45 micras filtros cilíndricos después de cada 150 ml. Recoger el 0,45 micras-filconcentrado viral cados en tubos de 50 ml.
- Añadir 250 l de cloroformo a cada alícuota de 50 ml de concentrado viral se filtró para eliminar las bacterias residuales. Invertir para mezclar y almacenar, en posición vertical a 4 ° C hasta su procesamiento posterior.
- Seque las 0,45 micras filtros y guardarlos como se describe en los pasos 3.6.5 y 3.6.6.
4. El tratamiento de muestras Microscopía
NOTA: Enjuague torres de filtro con lejía al 10%, seguido de etanol al 95% para evitar que la mancha potencial o residuos biológicos entre carreras. Muestras de microscopio proceso dentro de 1 hora y evitar las manchas que exponen y filtros teñidos a luz, si es posible.
- Monte
- Añadir 100 l de ácido ascórbico 10% a 4,9 ml de PBS 1x, y mezclar bien.
- Añadir 5 ml de 100% de glicerol, y mezclar bien.
- Montaje de filtro usando un 0,02 micras matriz de alúmina filtro de jeringa desechable, alícuota y almacenar a -20 ° C.
- SYBROro tinción
- Pipetear una alícuota de 500 l de cada muestra se fijaron con paraformaldehído al 2% de concentración final en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 0,5 l de SYBR Gold 1,000x solución a cada una de las alícuotas.
- Mezclar la muestra suavemente y lo puso en la oscuridad durante 10 min.
- Coloque un filtro de matriz de alúmina de 0,02 micras con anillo de soporte de polipropileno anular en cada soporte del filtro del sistema de bomba de vacío y conectar las torres de filtro (Figura 4). Asegúrese de que el filtro de 0,02 micras se coloca en el soporte de filtro de plástico del lado de arriba, ya que estos filtros tienen una doble porosidad.
- Con la bomba de vacío apagado, añadir los 500 l de SYBR manchado muestra, junto con 2 ml de 0,02 micras virus se filtra agua libre para asegurarse de que la muestra se distribuye uniformemente a través del filtro.
- Encienda la bomba de vacío para crear una presión negativa de no más de 1 bar para evitar los virus y microbios dañinos que se filtra.
- Permita que la muestra entera para ira través.
- Con unas pinzas (no el mismo par que el usado para DOC), retire cuidadosamente cada filtro de la torre de filtrado, y pasar por encima de una tarea delicada limpie para asegurar el filtro esté seco.
- Pipeta de 10 l de montaje sobre un portaobjetos y colocar el filtro seco que contiene la muestra teñida en la gota de montaje.
- Añadir 10 l de montaje a la parte superior de cada filtro antes de añadir un cubreobjetos.
- Presione suavemente hacia abajo cubreobjetos. Trate de eliminar las burbujas de aire si es posible y evitar el movimiento lateral del cubreobjetos.
- Ponga los portaobjetos en un slidebox y almacenar a -20 ° C.
- La tinción DAPI
- Coloque un filtro de matriz de alúmina de 0,2 micras con anillo de soporte de polipropileno anular en cada soporte del filtro y conectar las torres de filtro.
- Con la bomba de vacío apagado, añadir 2 ml de 0,02 micras agua filtrada libre de virus para cada torre utilizada.
- Pipeta de 1 ml de la muestra de glutaraldehído-fijo en cada torre, lo que resulta en un volumen total de of 3 ml en cada torre filtro.
- Encienda la bomba de vacío para crear una presión negativa de no más de 1 bar.
- Filtra toda la muestra sobre el filtro de matriz de alúmina 0,2 micras.
- Retire con cuidado el filtro de la torre de filtrado utilizando pinzas (no el mismo par que el usado para DOC).
- Coloque el filtro en una solución de DAPI 100 l gota [25 g / ml] en una placa de Petri mantener el filtro de lado derecho hacia arriba y dejar que la mancha de la muestra durante 15 minutos. Evite la luz durante el proceso de tinción.
- Después de que el 15 minutos, retire el filtro de la mancha, pasar por encima de una tarea delicada toallita para secar y transferir a una caída de 100 l de agua libre de 0,02 m virus filtrada, de nuevo manteniendo el filtro de lado derecho hacia arriba, para lavar restante DAPI mancha durante 1 min. Repita este lavado una vez.
- Filtro Montar en portaobjetos de microscopio de la manera idéntica como se describe para las muestras SYBR Gold.
5. Extracción de ADN
- ADN Metagenomic Microbiana
- Descongelar los filtros cilíndricos durante al menos 20 min a TA.
- Eliminar cualquier agua de mar remanente en el filtro utilizando una jeringa de 10 ml. Se tapa el extremo inferior del filtro cilíndrico utilizando un casquillo de blanqueado y tratado en autoclave.
- Para cada filtro, mezclar 360 l T1 "pre-lisis" buffer y 50 l de proteinasa K, y luego pipetear la mezcla en el filtro. Tape el extremo abierto.
- Incubar la reacción de lisis en un horno de O / N (o al menos 2 hr) que gira a 55 ° C.
- Quite uno de la tapa y añada 200 l B3 "lisis" buffer en el filtro de la muestra antes de la lisis. Re-tapa del filtro y se incuba la mezcla en un horno giratorio durante 10-20 min a 70 ° C.
- Extraer todo el volumen del filtro cilíndrico utilizando una jeringa de 3 ml por succión el líquido con el filtro al revés.
- Expulsar la muestra lisada en un nuevo tubo de microcentrífuga, y añadir 200 l de etanol al 100%.
- Mezclar bien, cargar toda la muestra en el girocolumna, y proceder como se indica por el protocolo del fabricante.
- Cuantificar ADN usando un ensayo basado en fluorescencia.
- Marina Viral metagenómica
- Purificar y concentrar las partículas de fagos (modificado de Thurber et al. 19)
- Disolver en agua de mar CsCl para preparar soluciones de 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1.35 g / ml, 1,2 g / ml (calibrado pesando 1 ml de solución). Filtrar cada fracción con 0,02 micras filtro antes de su uso.
NOTA: Asegúrese de que la densidad de cada fracción tiene una precisión de tres cifras significativas antes de utilizar las soluciones y filtrar todas las soluciones con un filtro de 0,02 micras antes de su uso. El uso de agua de mar o agua de mar saturados con CsCl para bajar o aumentar la densidad, respectivamente. - Hacer un portaobjetos de microscopio de 1 ml de reactivos combinados como se describe en la sección 4.2 para asegurar que todos los reactivos están desprovistos de virus antes de proceder.
- Añadir 9 g de CsCl a 45 ml de concentrado de TFF viraluna densidad final de 1,12 g / ml. Refrigere durante la configuración de la etapa de gradiente de CsCl.
- A partir de la g / ml de solución 1,7 agregar sucesivamente 1 ml de cada fracción menos densa secuencialmente lentamente en cada tubo usando pipetas serológicas. Marque el nivel de cada menisco individuo y asegurar que los pycnoclines entre fracciones no son perturbados. Para más detalles, véase el documento complementario (Lim et al. 2014).
- Con una carga pipeta serológica de 7,5 ml de la muestra en cada uno de 6 tubos, y centrifugar a ~ 83.000 xg, 4 ° C durante 2 horas.
- Sin interrumpir los gradientes de densidad descargan el rotor y perforar el tubo justo debajo de la 1,5 g / ml capa de densidad previamente marcada (Figura 5) con un 18 G aguja en una jeringa de 3 ml. Trasvasar 1,5 ml de VLP purificadas y transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga. Repita el procedimiento para todas las muestras.
- Añadir 0,2 volumen de cloroformo a las VLPs purificadas, mezclar vigorosamente, se incuba a TA durante 10 min.
- Añadir 150 y# 181; l de 10x tampón de ADNasa a cada tubo de microcentrífuga.
- Haz girar a 16.000 xg durante 5 min, y recoger la fase acuosa. Si el cloroformo no agregada en la parte inferior del tubo de microcentrífuga, añadir más tampón de ADNasa, mezclar y repetir.
- Añadir DNasa I (concentración final = 2,5 unidad / l) y se incuba a 37 ° C durante 2 h, después inactivar la actividad ADNasa mediante la incubación a 65 ° C durante 15 min.
- Disolver en agua de mar CsCl para preparar soluciones de 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1.35 g / ml, 1,2 g / ml (calibrado pesando 1 ml de solución). Filtrar cada fracción con 0,02 micras filtro antes de su uso.
- Extracción de ADN a partir de partículas virales (VLP)
- Uniformemente en común las VLP purificadas de cada muestra en dos tubos de Oak Ridge limpiados y esterilizados en autoclave.
- Añadir 0,1 volúmenes M Tris-HCl 2 (pH 8,5) con 0,2 M EDTA, 0,01 volumen de 0,5 M EDTA, 1 volumen de formamida, 10 l de glucógeno (10 mg / ml). Mezclar bien e incubar a TA durante 30 min.
- Refiriéndose al nuevo volumen, añadir 2 volúmenes RT 100% de etanol. Mezclar e incubar a 4 ° C durante más de 30 minutos.
- ADN Pellet haciendo girar los tubos de Oak Ridge a 17.200 xg durante 60 minutos, a las 4 y #176; C.
- Eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento de ADN dos veces con etanol al 70% enfriado con hielo usando pipetas serológicas.
- Retire todo el etanol (re-girar brevemente si es necesario), la cubierta, y permitir pellet secar al aire a temperatura ambiente durante> 15 min.
- Resuspender el sedimento de ADN para> 15 min en 567 l de tampón 1X TE (pH 8,0). Transfiera los 567 l de ADN resuspendido en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 30 l de SDS al 10% (pre-caliente a 65 ° C antes de su uso) y 3 l de proteinasa K (20 mg / ml), mezclar bien e incubar durante 1 hora a 56 ° C.
- Añadir 100 l de NaCl 5 M y mezclar bien. Añadir 80 l de solución de pre-calentado CTAB NaCl, vórtice, y se incuba durante 10 min a 65 ° C.
- Añadir 0,2 partes de volumen de cloroformo, vórtice, y centrifugado a 16.000 xg durante 2 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir un volumen igual de fenol cloroformo isoamílico 25: 24: 1 solución, vortex para mezclar,y girar a 16.000 xg durante 2 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir un volumen igual de cloroformo, vórtice, y centrifugado a 16.000 xg durante 2 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 0,7 volumen de isopropanol a la fracción sobrenadante y se incuba a -20 ° C durante al menos 30 min para precipitar el ADN.
- Sedimentar el ADN por centrifugación a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Pipetear el sobrenadante y lavar el sedimento dos veces con 500 l de etanol al 70% enfriado con hielo.
- Giran a 16.000 xg y eliminar el etanol restante del tubo. Aire secar el sedimento durante 15 min.
- Resuspender sedimento de ADN con 50 l de tampón de elución (Tris 5 mM, pH 7,5) o Tris-EDTA pH 8,0 durante al menos 5 min a TA.
- Cuantificar el ADN usando un ensayo basado en la fluorescencia de alta sensibilidad.
- Purificar y concentrar las partículas de fagos (modificado de Thurber et al. 19)
Representative Results
Microscopía
Muestras Microscopía pueden y deben analizarse de inmediato para asegurarse de que son de la calidad deseada. Para medir la abundancia y la distribución de tamaños de la comunidad bacteriana, diapositivas DAPI serán examinadas por microscopía de epifluorescencia (excitación / emisión: 358/461 nm, ver McDole et al 2012). (Figura 6A). Condes y dimensiones celulares pueden ser recolectados a través de software de imagen (por ejemplo, ImagePro o ImageJ). A partir de los volúmenes de medidas de longitud y ancho de la celda (V) son derivados al hacer la suposición de que todas las células tienen la forma de cilindros con tapas hemisféricas utilizando la siguiente ecuación:
V = π / 4 × w 2 (L - w / 3)
donde L es la longitud y W es la anchura de cada 23,4 celular. Biomasa microbiana puede entonces estimarse utilizando relaciones dependientes del tamaño previamente establecidos for comunidades microbianas marinas 24. Generalmente las bacterias marinas varían en longitud desde 0,1 hasta 4 m, pero van hasta ~ 8 m en algunos lugares.
Mientras que los filtros (0,2 M) teñidas con DAPI sólo mostrarán las bacterias, los filtros utilizados para la tinción SYBR Gold (0,02 micras) contienen bacterias y virus. La medición de la abundancia de los virus sigue el mismo protocolo que para los microbios, sin embargo una excitación de 325-375 nm se utilizará y el máximo de emisión es a 537 nm (Figura 6B).
Con el fin de generar datos cuantitativos puede necesitar ser ajustado dependiendo de la abundancia viral en la muestra original del volumen de muestreo. El volumen correcto de filtro es mejor determinado empíricamente para una masa de agua determinada. Ejemplos de micrografías que contienen muestras con concentraciones variables virales se ilustran en la Figura 7.
Los resultados de estudios anteriores sugieren que el virus de Microbioratios (VMR) generalmente van de 1 a 50 en los sistemas acuáticos 25-29, y entre 3 y 20, con una media de aproximadamente 6 en los sistemas de arrecifes de coral (Knowles datos no publicados).
Citometría de Flujo
Además de los recuentos directos y la estimación del tamaño de la comunidad microbiana, las evaluaciones de la relación de autótrofa a los microbios heterotróficos a través de citometría de flujo más pueden ser extraídos de las muestras recogidas (citometría de flujo ejemplar de salida dado en la Figura 8). Para determinar el número total de células de bacterias, las muestras se tiñeron con SYBR Green I y un tubo fotomultiplicador con un filtro de paso de banda 530/30 se utiliza para la detección. Un canal para la clorofila (de nuevo a los espejos LP espalda que resultan en un rango de 675 a 735 nm) y (filtro de paso de banda 585/42) ficoeritrina se utiliza para contar la abundancia de autótrofos en muestras no teñidas. Para determinar la abundancia de microbios heterotróficos, los recuentos de autótrofos de la noparte manchada continuación, se resta de la cuenta SYBR-manchado total (McDole et al. presentado).
La metagenómica viral
Metagenómica viral utiliza un enfoque molecular cultura independiente a la ecología viral, utilizando la información total de la secuencia genómica para determinar la estructura y la función de la comunidad. La metagenómica ha ido avanzando nuestra comprensión de la complejidad y diversidad de las comunidades virales a nivel local 17 a escala mundial 30. El reciente desarrollo de una amplia gama de herramientas bioinformáticas para el análisis de los datos de metagenómica viral ha disminuido los cuellos de botella de cómputo, lo que permite una visión más completa de la de la virosphere través de la lente de la metagenómica.
Los métodos aquí presentados ponen de relieve el aislamiento y enriquecimiento de las partículas virales del agua de mar usando una combinación de pre-filtración con un gran tamaño de poro de malla de nylon para eliminar los desechos y el material celular, concentración demuestras con TFF (Figura 3) y una subsiguiente 0,45 micras de filtración para eliminar las células más grandes. Este método produce más o menos una muestra concentrada 100x (Figuras 5B-5E), que nos permite realizar procesos posteriores en volúmenes más pequeños. Con el fin de evitar el crecimiento de las células microbianas restantes en el lisado viral y por lo tanto cambios en la abundancia viral de la muestra durante el tiempo de tránsito de largo entre la estación de campo y de laboratorio, cloroformo menudo se añade a una concentración final de 2% para el almacenamiento. Tras el aislamiento y la purificación de las VLP, la microscopía de epifluorescencia con colorantes ácidos nucleicos tales como SYBR Gold se utilizan para verificar la presencia y la pureza de las partículas virales (Figuras 5B-5E).
A continuación, presentamos dos metagenomes virales de los arrecifes de coral Isla Sur de la Línea, en concreto, el Starbuck (STAR7) y Millennium (CAR9; anteriormente conocida como Caroline) islas. Un volumen total de 120 L samagua PLE se recogió de cada sitio, a una profundidad de 10 metros y procesada como se describe en la sección 3.7 y 5.2. Las VLPs purificadas a partir de la centrifugación en gradiente de cloruro de cesio eran 3,3 x 10 8 partículas / ml para CAR9 (Figura 5D) y 2,9 x 10 9 partículas por ml para STAR7 como verificada de acuerdo con el método descrito en el párrafo 4 (Figura 5B). La cantidad total de ADN aislado de estas muestras fueron alrededor de 400 ng basa en la medición Nanodrop. ADN fue amplificado utilizando Phi29 polimerasa y se secuenció por la instalación Ambiental Genómica en 2011. Las características de la secuencia de datos se presentan en la Tabla 1. Sobre la base de similitud búsquedas utilizando las bases de datos existentes, la mayoría (> 70%) de las secuencias terminó a menudo hasta , es decir, de origen desconocido no caracterizados y funciones. Del mismo modo, los dos viromes presentados aquí presentan más de 97% de secuencias desconocidas. Como resultado, no la base de datosSe utilizó el análisis dependiente para el análisis y abrió un nuevo brazo de oportunidades de investigación sobre la "materia oscura" en la metagenómica virales (Seguritan et al. en prensa).
Microbiana metagenómica
El análisis de metagenomes microbianos permite la caracterización de la comunidad microbiana presente y la descripción funcional de estas comunidades. Los ejemplos incluyen las estimaciones de la presencia de agentes patógenos y la virulencia 5,22 o comparaciones entre los cambios en la estructura de la comunidad macrobial o nutrientes disponibles y abundancia de las especies y sus vías metabólicas predominantes (Figura 9; Kelly et al 2014)..
Química del Agua
Parámetros químicos del agua generalmente toman extensa procesamiento analítico para generar los datos deseados; las muestras para el análisis de COD se medirán por medio de alta temperatura 31,3 oxidación catalítica2, la materia orgánica particulada (POM) a través de la espectrometría de masas de relación isotópica acoplado a un analizador elemental 33-35, y los nutrientes inorgánicos por inyección de flujo Análisis 36,12,37. Después de la finalización con éxito de todos los análisis, la información como se muestra en la Tabla 1 estará disponible para complementar la caracterización de la microbiana y comunidades virales. Esta información puede ser complementado con proporciones de isótopos estables de las muestras de carbono y nitrógeno orgánico (véase Haas et al. 35) y las proporciones entre autótrofos y heterótrofos (McDole et al., Presentado).
Figura 1. Descripción general de los métodos descritos en la sección de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figure.
Figura instalación de procesamiento de plataforma 2. Muestra. La configuración de la filtración introducido aquí (dibujo esquemático a la izquierda, la imagen real del panel derecho) no se requiere necesariamente para generar muestras pero acelerará el proceso de manera significativa. La configuración consiste en una placa posterior, en la que se montan las unidades de Hatay Niskin (1). En la salida hacia abajo, las unidades de Hatay Niskin están conectados con un tubo de silicona a los titulares de filtro en línea (2). Estos permiten el paso del agua a través del filtro de la muestra respectiva en los viales de muestreo HDPE (3) montado justo debajo. El proceso de filtración se acelera a través de aire a presión (4), que y regulada por un medidor de presión (5). Un dique de contención evita que se derrame el agua durante el cambio de los viales de polietileno de alta densidad o filtración POM. Por favor,haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Agua de la muestra la figura 3. tangencial alineación filtro de flujo (modificado de Thurber et al. 19). Nylon con malla filtrada se bombea desde el depósito (1) a través de una bomba peristáltica (2) a un filtro de flujo tangencial (3). Los retornos de agua a la muestra el depósito (1) a lo largo de la línea de retorno (4), en ausencia de contrapresión. Cuando se aplica contrapresión a través de una abrazadera de la manguera (5) en la línea de retorno, el agua pasa a través del filtro y se desecha o se entrega al depósito de filtrado (6). El agua de la muestra se sustituye, ya que se concentra fuera de la línea de filtrado hasta que todo el agua de la muestra se concentra en las líneas de tubería.
Figura 4. Microscopio configuración filtración de diapositivas.Para distribuir uniformemente DAPI y SYBR Gold muestras teñidas en el filtro de matriz de alúmina respectiva (1), los filtros necesitan ser colocados en entre la torre de filtro (2) y el vástago del colector de filtración y se fija con una abrazadera (4). Un vacío regulado de presión (5) acelerará el proceso de filtración (arriba dibujo esquemático, imagen real panel inferior). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 5. La purificación y la concentración de partículas de fago. Un total de 1 ml de cada gradiente de densidad de cloruro de cesio se coloca sobre la parte superior de uno al otro antes de dirigir la muestra pretratada (A). Cada capa debe ser marcado fuera del tubo para facilitar la extracción después de la ultracentrifugación. Marcas de flechas rojas donde el tubo será perforado a exTracto la fracción VLP. (BE) Micrografías de concentrados virales: micrografías epifluorescencia de 0,45 micras filtrados-concentrados virales representativas de STAR7 (B) y CAR9 (D). Las partículas grandes, incluyendo células bacterianas eran visibles desde las 0,45 micras-filtrados de ambos STAR7 (B) y (D) CAR9 muestras, mientras que sólo VLPs (flechas blancas) permanecen después de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio; Estrella 7 (C) y CAR9 (E). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 6. Ejemplo de DAPI y análisis micrografía SYBR Gold. Captura de pantalla del análisis de (A) y DAPI oro manchado ejemplo de la diapositiva (B) SYBR. (A) Longitud y anchura (m) de todos destacaron partículas(= Microbios) pueden ser evaluadas con la ayuda de un programa de formación de imágenes. Nota la agregación en el centro de la imagen. Estas agrupaciones deberán ser excluidos del análisis posterior. (B) Durante los virus y las bacterias de análisis deberá ser desechado por los umbrales de tamaño en VLP y rangos de tamaño celular (VLP rojo, verde celular). Tenga en cuenta que por lo general hay algunos VLP débiles Uncategorized por el programa de imagen respectiva. Estas VLP que aparecen como puntos blancos débiles deben ser contados y se añaden a los conteos virales automatizados manualmente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 7. Las concentraciones de SYBR Gold manchado muestras. Micrografías de un filtro de 0,02 matriz de alúmina que contiene diversas cantidades de muestras de virus SYBR manchado. El panel A muestra afILTER que contiene una cantidad adecuada de agua de mar filtrada, mientras que las concentraciones en el filtro que se muestran en B son demasiado altos y en C demasiado bajo para los recuentos fiables. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 8. Resultados de citometría de flujo de salida de análisis de una muestra de agua de arrecife. Panel (A) muestra de agua de grado molecular sólo con microesferas de color amarillo-verde fluorescente (0,75 M), que se utilizan para verificar fondo mínimo con los ajustes del instrumento. Panel (B) representa la salida de la carrera muestra de agua de arrecife con valores idénticos y el diseño como en A. Tenga en cuenta que las cuentas aún se pueden ver en el mismo lugar, junto con varias poblaciones de autótrofos. (C) (B), que se utiliza para realizar copias de puerta el citómetro de flujo, apuntando a eventos positivos SYBR (autótrofos + recuento de heterótrofos) y el fondo de la minimización. (D) La muestra representativa de agua arrecife manchado con SYBR Green I. Uso la compuerta establecida en (C), se generaron los recuentos totales de microbios y microorganismos heterótrofos y autótrofos divididas por autofluorescencia clorofila (ver McDole et al. 4). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 9. Ejemplo de datos metagenome microbianas. Patrones entre los datos de la secuencia metagenómica microbianas y las variables dependientes del sitio. Aquí, la abundancia relativa de Synechococcus Pelagibacter spp. no fue (paneles de la izquierda). La vía metabólica para la transferencia por conjugación se correlacionó positivamente con las concentraciones de nitratos, mientras que la vía metabólica para la reparación del ADN fue consistente entre todos los metagenomes (paneles de la derecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
| Estrella 7 | CAR9 | |
| Número total de Lee | 939311 | 591600 |
| Número de preprocesado Lee | 579664 | 360246 |
| Secuencia de longitud media (pb) | 395 ± 131 | 451 ± 159 |
| Secuencias anotado (%) | 42,218 (7.3%) 9.117 (2,5%) | |
| Desconocido (%) | 537.446 (92,7%) | 351 129 (97,5%) |
Tabla 1. Características de los datos de dos viromes generados a partir de las Islas de la Línea Sur, Starbuck y del Milenio. El grado de anotación se basa en Blat utilizando el servidor de MG-RAST.
Tabla 2. Los resultados representativos que muestran los datos de varios sitios durante una expedición. Los parámetros evaluados aquí incluyen mediciones de la química del agua combinados con abundancia microbiana y viral. La tabla contiene más nombres de los archivos que se refieren a los respectivos datos de metagenómica para cada lugar de muestreo. Concentraciones de carbono y nutrientes inorgánicos se dan en mmol / L. Por favor,haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Discussion
Los métodos presentados aquí proporcionan una herramienta para generar una evaluación exhaustiva de la dinámica viral y microbiana en los ecosistemas acuáticos. Están dirigidos a cuantificar la biomasa de los recursos orgánicos e inorgánicos disponibles para las comunidades microbianas y para caracterizar la composición de la comunidad microbiana y viral presente. Junto a la cuantificación de la abundancia viral y la abundancia de biomasa microbiana y, información de la secuencia genómica revela su estructura y función de la comunidad. Todos los métodos han sido desarrollados o modificados para permitir la aplicación de campo en lugares remotos. Sin embargo, la falta de ajustes de laboratorio controladas crea inherentemente alguna posibilidad de errores. Aquí hablamos de algunas advertencias asociadas a cada uno de los parámetros evaluados. Junto al potencial de contaminación durante la manipulación de muestras algunos de los parámetros también el potencial de rendimiento para el error en el proceso analítico.
Carbono orgánico disuelto
La contaminación de carbono puede ocurrir durante los procedimientos de muestreo (muestreo de aguas abajo, o en las proximidades de un barco o un buceador), durante la preparación de la muestra (contaminación del equipo o la manipulación inadvertida), e incluso durante el almacenamiento de la muestra (otras muestras en el congelador que contiene orgánica disolventes volátiles /). Para evitar las diversas fuentes de contaminación conducta tan pocos pasos de manipulación como sea posible, ya que cada muestra de reubicación plantea una fuente adicional de contaminación. La muestra no debe ponerse en contacto con cualquier elemento no ácido se lava o se quema. Por último, la designación de un congelador de almacenamiento exclusivamente para muestras que no contengan sustancias orgánicas volátiles se asegurará la integridad de las muestras durante períodos de almacenamiento más largos. Si las muestras no pueden mantenerse congeladas durante un periodo de tiempo prolongado acidificación de las muestras de DOC con HCl concentrado (como se describe 38-41) puede ser una alternativa aplicable. Para verificar los materiales de referencia DOC consenso exactitud de medición se deben utilizar regcialmente durante la medición DOC ejecuta. Especialmente de agua de mar profundo (> 2.000 m) las referencias son valiosos para evaluar el rendimiento de la máquina analítica, ya que es muy estable en su contenido DOC 42.
Materia orgánica particulada
Además de evitar la contaminación de carbono orgánico, el muestreo POM requiere una atención especial para garantizar la exactitud del volumen filtrado. Si el volumen específico de 500 ml debería desviarse por cualquier razón potencial que este necesita ser observado para relacionar la cantidad de POM capturado en el filtro para el filtrado de los cuales se deriva.
Los nutrientes inorgánicos
Al igual que con el muestreo de carbono orgánico, se debe prestar atención a la posible contaminación de la muestra de nutrientes generada por diversas fuentes como barcos o descargas de aguas residuales 12. Los filtros utilizados para el muestreo de carbono orgánico con un valor nominal de tamaños de poro de 0,8 micras, no pueden excluir toda la biomasa microbiana y shpor lo tanto, ould ser cambiado a 0,2 micras filtros para esta etapa de filtración. Además, los límites de detección plantean un problema con muestras de nutrientes; especialmente en las aguas superficiales oligotróficas alrededor de muchos lugares de arrecifes de coral (por ejemplo, Cotner et al., 43). Los límites de detección son más o menos alrededor de 0,1, 0,2, y 0,1 mol / L para el amonio, nitrato y nitrito, y orto-fosfato, respectivamente (ver 36,12,37)
Microscopía
Además de las variaciones en la concentración de análisis de imágenes de microscopía de muestras a partir de diapositivas aún más los rendimientos potencial de errores. Por ejemplo, las imágenes pueden estar fuera de foco en algunas zonas del campo de visión, y en el enfoque en otros. Como un filtro de matriz de alúmina de alta pureza es un tipo de filtro muy rígido, cualquier residuo bajo el filtro puede hacer que todo el filtro para sentarse en un ángulo a la diapositiva. Como resultado, las imágenes pueden ser consistentemente fuera de foco en diversas partes del campo de visión para un filtro dado, reindependientemente de la alineación microscopio. Volver a montar los filtros, asegurando la parte inferior del filtro está limpio, puede mejorar esta si se observa. También, en algunos casos puede haber dos planos focales en los que los virus y los microbios se pueden encontrar. Este es el resultado de los objetos manchados se desprenda desde el filtro al montar, y que flotan hasta la parte inferior de la hoja de la cubierta que puede hacer que los recuentos de poco fiable. Por lo tanto siempre es recomendable para comprobar la calidad de las muestras durante el proceso.
Citometría de Flujo
Al igual que con las muestras de microscopía, puede ser de origen natural diferencias entre las muestras de citometría de flujo que requieren ajustes del proceso analítico. Por ejemplo, dependiendo de la sensibilidad del instrumento, débilmente las células fluorescentes Prochlorococcus pueden estar por debajo del nivel de ruido y no serán cuantificados. Beads sirven como un control interno de la muestra (por ejemplo, para confirmar que resp del instrumentoOnse a las señales fluorescentes es consistente día a día (y se mantiene estable durante el mismo plazo). Si se añade a la muestra a concentraciones conocidas, también pueden servir como un control interno para verificar el funcionamiento volumen de muestra. Sin embargo, se recomienda ejecutar siempre una parte alícuota de una muestra de agua de mar previamente congelado "estándar" que se descongeló y se tiñeron junto con las muestras de interés para proporcionar un control biológico adicional para el manejo de entre las corridas de placa de 96 pocillos de muestra. Dependiendo de la ubicación, las muestras de agua de mar puede parecer muy diferentes entre sí. Clasificación poblaciones "representativas" y luego ver bajo un microscopio de epifluorescencia (EM) puede ser una buena manera de verificar rápidamente las poblaciones de fitoplancton, ya sea como Synechococcus sp. O eucariotas fotosintéticos. Prochlorococcus células normalmente no son visibles bajo EM porque se desvanecen demasiado rápido. Además de clorofila a, Synechococcus sp. Contener también el phphycoeurythrin otopigment (PE), que emite luz en longitudes de onda más cortas (540 a 630 nm) que la clorofila A (660-700 nm). Cuando las células Synechococcus se excitan con luz azul / verde (470-490 nm), aparecerán de oro si se observa bajo un filtro de emisión que elimina todas las longitudes de onda de la luz por debajo de 510 nm. En comparación, la fracción eucariótica se verá de color rojo, cuando se excitan con la misma longitud de onda de la luz.
La metagenómica viral
Es importante señalar que el proceso de concentración y el almacenamiento VLP influye en la comunidad recuperado. Pérdida partícula viral puede ocurrir en cada paso en el proceso, y por lo tanto, la selección de los protocolos de purificación y enriquecimiento virales puede afectar en última instancia la composición taxonómica observada y la diversidad de los metagenomes virales resultantes 44,45,18. Concentración de las muestras se puede hacer usando TFF 19 o basada en productos químicos de floculación 20. En el enfoque de base química, positvamente cargada iones de hierro se unen las partículas virales, naturalmente, con carga negativa que forman (> 8 micras) complejos de hierro viral grandes que floculan de la solución y pueden ser recuperados utilizando 8 micras filtros. Posteriormente, el hierro está quelado fuera de las partículas virales y re-disolvió utilizando magnesio, ácido ascórbico, y EDTA, dejando partículas virales concentradas para la extracción de ácido nucleico 20. Después de la comparación de estos dos métodos actuales, llegamos a la conclusión de que el método del cloruro de hierro es menos tiempo que la concentración viral TFF, pero puede producir algunas advertencias. Se encontró que la disociación y la disolución del hierro-viral requiere una dos veces solución de magnesio-ácido ascórbico-EDTA más concentrada que informaron 20 con el fin de proceder para la disolución antes de que se degrada el ácido ascórbico. Aparte de esta cuestión, el protocolo purifica partículas virales por tamaño-fraccionamiento solo, la eliminación de contaminantes microbianos utilizando 0,2 micras de filtración. Virus grandes no pasan por el filter (por ejemplo, Yang et al. 46) y que por lo tanto no ser detectado en el metagenoma, mientras que algunas bacterias hacen (McDole, datos no publicados). Esto da lugar a la contaminación bacteriana, mientras que discriminar a los grandes virus.
Esta cuestión específica sin embargo, también es relevante para la eliminación de microbios en relación con la concentración de TFF. Como se ha demostrado el tratamiento cloroformo para eliminar virus-cloroformo sensible con las membranas lipídicas externas 47 algunos estudios sugieren que 0,22 micras de filtración puede ser utilizado para eliminar la mayoría de las bacterias. También hay que señalar que el método presentado se dirige principalmente a bacteriófago, el más abundante portador de material genético en ambientes marinos. Debido a fagos se piensa generalmente que no contienen lípidos comúnmente 48 que son más resistentes al tratamiento cloroformo. A nuestro entender un método "catch-all" no existe hasta la fecha. El método que aquí se presenta es una adaptación del ouexperiencia de campo r en los últimos 10 años en diversos ambientes marinos tropicales que abarcan a los sistemas árticos.
Microbiana metagenómica
La construcción de bibliotecas metagenomic para los microbios (es decir, bacterias y arqueas) es más sencillo que metagenomes virales, ya que es más fácil de generar las concentraciones mínimas de ADN necesarios para la preparación de la biblioteca. Linker amplificación escopeta bibliotecas (LASLs) amplificación 17,49,50 y todo el genoma basado en la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) son los dos métodos más comúnmente utilizados para generar suficiente ADN para la secuenciación. El uso de MDA para obtener concentraciones más altas de ADN en metagenomes microbianas veces es necesario. Sin embargo, esto puede causar artefactos en los datos de secuencia, como la sobreamplificación de minicircles de dinoflagelados. Métodos de MDA son conocidos para amplificar preferentemente ADN monocatenario y circular, resultando en resultados no cuantitativos 51,52. Los LASLs optimizados se acercan a 50 puede por lo tanto sirve como una alternativa mejor en la amplificación de tanto microbiana y el ADN viral metagenomic para la secuenciación. Es importante señalar que el enfoque LASLs tiene múltiples pasos, requiere un equipo sofisticado, y se limita a plantillas de ADN de doble cadena. Además, el kit de extracción de ADN de tejidos se ha demostrado para extraer el ADN de ambos filos negativa Gram positivas y Gram, pero no ha sido verificada a taxones microbianos efectivamente lisis recalcitrante o sus estructuras asociadas (por ejemplo, seguro de arqueas, endosporas, o esporas de hongos) . Por lo tanto, puede ser necesario un paso paliza de cuentas para obtener el ADN de ciertos microbios.
Estas evaluaciones completas se traducirá en una mejor comprensión del funcionamiento del ecosistema microbiano y viral. Aunque pocos estudios han llevado a cabo el esfuerzo de evaluar todos los parámetros propuestos, muchos han estado investigando los seleccionados. Nelson et al. 53 sugiere una conexión between hábitats de arrecifes específica y agotamientos en ambas concentraciones de DOC y bacterioplancton relativos a las aguas en alta mar. Estos cambios de concentración fueron acompañados por distintas diferenciaciones de bacterioplancton. Dinsdale et al. 5 mostró que el aumento de impacto antropogénico fue acompañado por 10x mayor abundancia de células microbianas y partículas similares a virus. Las comunidades microbianas en las aguas marinas que rodean las islas habitadas también tenían fracciones más grandes de heterótrofos y potenciales patógenos 5. Finalmente McDole et al. 4 mostró, mediante la introducción de la puntuación microbialization, que las actividades humanas están cambiando energía a los microbios, a expensas de los macrobios. Estos estudios, se centraron en los parámetros microbiológicos y químicos del agua específicos, proporcionan nuevos conocimientos sobre la estructura bioquímica de los ecosistemas marinos. La combinación de datos tradicionales de los esfuerzos de monitoreo de ecosistemas - como valores de temperatura y pH, la biomasa de peces y diversidad, la cubierta bentónica, o la exposición al impacto humano - con la química del agua y evaluaciones microbianas, probablemente como resultado de los esfuerzos de monitoreo ambiental más sensibles, que pueden llevar a los esfuerzos de conservación más específicamente dirigidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
| Filtration setup | Figure 1 | ||
| 32-36% Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
| High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
| Combustion oven (550 °C) | |||
| 60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
| 25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
| Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
| Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
| Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
| 20 L collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
| Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
| Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
| Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
| 0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
| 8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
| 0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
| 0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
| Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
| 20 ml Plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
| Clean bucket (10-20 L) | |||
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
| 25% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
| Liquid nitrogen | |||
| 0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
| 0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
| 10,000x SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
| DAPI solution 25 µg/ml | Invitrogen | D1306 | |
| Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
| Ascorbic acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
| Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
| Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
| Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
| Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
| Slide station with vacuum pump | Figure 3 | ||
| DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Lifetechnologies | AM2546 | |
| 200-proof Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
| Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
| Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
| 60 ml Syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
| 0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
| DNase I (100 units/µl) | Calbiochem | 260913 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
| Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
| Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
| 1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
| 20 μg/ml Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
| Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
| Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
| 50 ml Oak Ridge tube | Fisher Sci | 05-562-16B |
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