Abstract
Her introducerer vi en serie af gennemtestede og godt standardiserede forsøgsprotokoller tilpasset til anvendelse i fjerntliggende marine miljøer. De prøveudtagningsprotokoller omfatte en vurdering af ressourcer til rådighed for den mikrobielle samfund (opløst organisk kulstof, partikulært organisk stof, uorganiske næringsstoffer), og en omfattende beskrivelse af de virale og bakterielle samfund (via direkte virale og kimtal, optællinger af autofluorescerende mikrober, og konstruktion af virale og mikrobielle metagenomes). Vi bruger en kombination af metoder, der udgør en spredt felt af videnskabelige discipliner, der omfatter allerede etablerede protokoller og nogle af de nyeste teknikker udviklet. Især metagenomisk sekventering teknikker, der anvendes til viral og bakteriel samfund karakterisering, kun er udarbejdet i de seneste år, og er således stadig udsat for konstant forbedring. Dette har ført til en række prøvetagning og prøve behandlingsprocedurer currently i brug. Det sæt metoder præsenteret her tilvejebringer en opdateret fremgangsmåde til at indsamle og behandle miljøprøver. Parametre behandlet med disse protokoller give det minimum af oplysninger afgørende for at karakterisere og forstå de underliggende mekanismer i virale og mikrobielle samfund dynamik. Det giver let at følge retningslinjer for at foretage omfattende undersøgelser og diskuterer kritiske trin og potentielle forbehold relevante for hver teknik.
Introduction
De marine økosystemer er udsat for en bred vifte af forstyrrelser, der resulterer i ændringer fra næringsstof tilgængelighed til biomassen af spids rovdyr. I løbet af det sidste årti, har flere undersøgelser vist betydningen af de mikrobielle samfund i marine økosystemer 1-4. Det er indlysende, at ændringer i bakteriel og viral samfund er tæt forbundet med den generelle nedbrydning af marine miljøer 5. Disse ændringer kan lettes ved ændret geokemi i vandsøjlen, såsom ilt tilgængelighed eller carbon remineralisering 6,7. Som et resultat af den indbyrdes afhængighed mellem makroorganismer, vand kemi og mikrobiel aktivitet feedback-loops kan accelerere hastigheden af forringelse af økosystemet 8.
I 1970'erne og 80'erne flere forsøg blev gjort for at optrævle biogeokemiske kredsløb i marine økosystemer 9-11. En af de største udfordringer for disse tidlige undersøgelser var manglenaf standardiserede metoder til at måle de vurderede biogeokemiske parametre. Selvom der var tilgængelige protokoller, primært på havvand næringsstoffer 12,13, blev vurderingen af kulstof dynamik og den mikrobielle samfunds struktur begrænset af de værktøjer og metoder til rådighed. Med JGOFS EqPac metoder sammenligning, Sharp et al. 14 foreslået for første gang en pålidelig og standardiseret protokol for opløst organisk kulstof (DOC) koncentrationslejre vurderinger. Ved begyndelsen af 2000'erne de analytiske udfordringer for at afgøre ressourcer til rådighed for det mikrobielle samfund var således stort set blevet løst og tilgange til at karakterisere mikrobielle samfund i kontrollerede kultur miljøer var fastsat (se DeLong 15). De traditionelle sekventeringsmetoder dengang stort set påberåbt dyrkede klonale kulturer. Tidlig miljømæssige gensekvensering af naturlige prøver viste imidlertid, at hovedparten af mikrobiel biodiversitet havde været savnet af Kulturplanteration-baserede metoder 16. I 2002 Breitbart et al. 17 shotgun-sekventering for første gang til at beskrive den virale samfund i miljøprøver havvand prøver etableres en metode til at sekventere hele genomet af ukultiverede marine virale samfund.
Inden for de eksisterende mikrobielle vurderinger vira stadig især under studeret, da de fleste er svære at kultur og de mangler et universelt konserveret markør, såsom 16S ribosomale RNA (rRNA) gener, der typisk anvendes til at vurdere mangfoldighed og fællesskab profilering. Den metagenomisk sekventering tilgang giver et alternativ til kultur-afhængige og gen-målrettede metoder til analyse af komplekse virale samfund. Mens de første virale metagenomes genereret fra havvand blev sekventeret under anvendelse Sanger sekventering 17, har udviklingen af næste generation sekventering teknologier og forbedrede molekylære teknikker har ført til en hurtig stigning i metagenomisk studier 18 19-21.
For at fremme den eksisterende viden om viral, mikrobielle og biokemiske funktion i akvatiske økosystemer, hvis man sammenligner datasæt i forskellige systemer rundt omkring i verden er afgørende. Imidlertid har stort set blevet udviklet de etablerede protokoller for kystnære miljøer med let tilgængelige laboratoriefaciliteter. Dermed manglen på standardiserede feltmetoder hindrer disse cross-økosystemfunktioner sammenligninger. Her introducerer vi gennemtestet og godt standardiserede tilpasninger fra state of the art forskning protokoller til brug i fjerntliggende lokale steder. Disse metoder har vist sig succesfuld i flere undersøgelser, der spænder over de sidste ti år 5,22 og er i øjeblikket bruges af forskellige maritime laboratorier samt på NOAAReef vurdering og overvågning Program (rampe) i hele Stillehavet 4. De prøveudtagningsprotokoller omfatter kemiparametrene vand (uorganiske og organiske kulkoncentrationer, koncentration uorganisk næringsstof), virale og mikrobielle overflod (direkte kimtal, direkte virale tæller, og flowcytometri at vurdere autotrof vs heterotrof nøgletal), og viral og mikrobiel samfunds struktur og metaboliske potentiale gennem metagenomisk analyse (for en oversigt se figur 1). De opnåede resultater fra de metoder, der er beskrevet her, er nødvendige for at belyse de vigtigste biogeokemiske baggrund parametre er nødvendige for at omfattende karakterisere akvatiske økosystemer.
Protocol
1. Fremstilling af instrumenter
- Fremstilling af Filtration Setup
- Forbered en saltsyre (HCl) 5% (0,5-0,6 M, tilsæt 250 ml 32-36% HCI til 4,75 L destilleret vand for at lave 5 liter endelige løsning). Opbevar opløsningen i en high-density polyethylen beholder (HDPE) i op til 2 uger.
- Lad alle dele, der kommer i kontakt med prøven (undtagen filtre) i 24 timer i 5% HCI-opløsning til leech ud potentielle opløst organisk carbon (DOC) kontaminanter. Efter hver prøveudtagning begivenhed skylle alle dele og skyl linjer med ca. 30 ml 5% HCI-opløsning for at forhindre kulstof forurening (f.eks fra gas dampe, olie, både, mosquito spray).
- Hold alle prøveudtagning varer indpakket i pre-forbrændt aluminiumsfolie eller loft indtil til umiddelbart før brug.
- Precombust 25 mm GF / F-filtre indpakket i aluminiumsfolie i en muffelovn ved 550 ° C i 12 timer for at fordampe fra alle kulstof og gemme dem i en ren, tørplaceres før brug. Brug syrevaskede pincet og sterile, ikke-pudrede handsker til at håndtere de precombusted filtre på alle tidspunkter.
- Fremstilling af Viral metagenomet Sampling Materials
- Vaskes fire 20 L sammenklappelige low-density polyethylen dunke og fire 20 L polyethylen med høj densitet spande og låg med 10% blegemiddel.
- Efterfølgende skylles alle elementer 3x med destilleret og derefter prøve vand og forsegle dunke med studs.
- Vask Tangential Flow Filter (TFF) efter hver anvendelse ifølge den følgende protokol, og ren preemptively hvis filteret ikke er blevet anvendt i de sidste 5 dage.
- 50 g NaOH-pellets opløses i 5 l vand i en vask spand.
- Vedhæft en våd TFF på slangen og samle ifølge figur 3.
- Kør peristaltisk pumpe ved ca. 30 rpm uden modtryk at flytte nogle af NaOH vaskeopløsning gennem systemet. Når vask strømmer fra returledningen flytte overførsel til vaske spandat fuldføre cirkulation af opløsningen.
- Anvend modtryk til systemet ved at placere en klemme på returledningen nedstrøms for TFF. Dette vil tvinge vaskeopløsning ud filtratet linje. Overdreven tid (5 min) at oversvømme ydersiden af TFF og producere filtratet er indikativ for et forringet TFF.
- Køre systemet, indtil alt NaOH-opløsning er i linjerne. Derefter fjerne modtryk, køre opløsning ud af systemet og kasseres.
- Skyl TFF ved rindende vand under modtryk indtil pH af det vand, der flyder fra retur- og filtratprøverne linjer er pH 7-8.
- Fjern slangen fra den peristaltiske pumpe og TFF. Reseal TFF til opbevaring. Sørg for, at TFF forbliver våd indtil næste brug.
2. Prøvetagning
BEMÆRK: Under transport bør opbevares alle indsamlede prøver køligt (hvis det er muligt 4 ° C) og ikke udsat for direkte sollys indtil yderligere behandling.
- Samplingfor Carbon, Næringsstoffer, Microscopy, flowcytometri, og mikrobiel Metagenomics
- Tag to Hatay Niskin enheder pr sampling event (hvilket resulterer i 4 l prøve vand). Åbn prøvetagning fartøjer lige før nedsænkning (ellers fanget luft vil forhindre faldende).
- På det pågældende anlæg, skylle indersiden af prøveudtagning fartøj med prøven vand ved at åbne begge ender og bevæger cylinderen langs den polære akse gennem vandet.
- Tag prøven og omhyggeligt beholderen lukkes prøveudtagning. Sørg for, at webstedet prøvetagning er opstrøms fra båd og dykkere at undgå forurening.
- Stikprøver af Viral Metagenomics
- På målområdet mount lænsepumpe på 20 L ballon.
- Fyld carboy sigter lænsepumpe indløb ved hver målområde og segl ballon med den tilsvarende tap.
- Saml 4 dunke af ufiltreret havvand (alle sammen 80 L) fra hver prøveudtagning site.
3. Sample forberedelse
BEMÆRK: Behandl prøverne i den rækkefølge, der præsenteres her, startende med DOC for at minimere risikoen for forurening. Anvend pudderfri handsker til hele proceduren.
- Opløst organisk kulstof (DOC)
- Montér en af de to aliquote Hatay Niskin enheder i respektive spalte af filtrering sæt. Tilslut udløbsslangen som fører til den respektive filterholderen. Tilslut trykluft (0,2 bar) slange til Hatay Niskin enhed (se figur 2).
- Skyl alle linjer med 100 ml af prøven vand, før du sætter filtre i filterholderne. Anbringes 25 mm pre-forbrændt GF / F filter i filterholderen ved hjælp af syrevaskede pincet. Skyl hver DOC flaske og hætte 3 gange med ca. 20 ml filtreret vand prøveudtagning.
- Fyld flasken med ca. 40 ml (~ 2/3 fuld) vand prøveudtagning. Opsamles mindst dubletter af DOC prøver at have en backup i tilfælde af potentiel forurening eller tab under transport.
- Freeze prøveudtagning flasker står oprejst ved -20 ° C indtil analyse.
- Particulate organisk materiale (POM)
- Efter DOC prøver er blevet indsamlet fortsætte filtrering indtil i alt 500 ml har bestået GF / F-filter, herunder hvad der passerede igennem samtidig med at indsamle DOC prøver.
- Skru inline filterholderen.
- Fjern filteret for POM analyse ved hjælp af pincet og sted filter inde i en firkant af præ-forbrændt aluminiumsfolie, fold top-side slået om sig selv, og wrap.
- Frys filtre ved -20 ° C til opbevaring indtil udsættes til elementært og isotopanalyse.
- Uorganiske Næringsstoffer
- Placer en 0,2 um ætsede spor filter i hver filterholderen. Re-vedhæfte filterkassetter.
- Skyl hver 20 ml plast scintillation flaske tre gange med vand prøveudtagning. Fyld hver flaske til skulderen (~ 18 ml).
- Fryser ved -20 ° C indtil senere analyse.
- Mikroskopety (SYBR Gold og DAPI)
- Tag filterholderen.
- Saml 1 ml vand i hver af to mikrocentrifugerør.
- Tilføje 66 pi 32% paraformaldehyd til en af portioner (til senere SYBR Gold farvning). Tilføj 12 pi 25% glutaraldehyd til det tilsvarende andet (for senere DAPI farvning).
- Bland forsigtigt, og lad prøver at "pynte" i mindst 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Flowcytometri
- Placer en 8,0 um polycarbonatfilter i en af filterholderne at udelukke snavs og store eukaryote celler.
- Passere vand sampling gennem at fylde 2 kryoglas fra hver prøveudtagning site med 1 ml prøve.
- Tilsæt 5 pi 25% glutaraldehyd til hver cryovial (slutkoncentration = 0,125%).
- Inverter hætteglas blandes.
- Lad prøven fastsætte i 15-30 minutter ved stuetemperatur. Må ikke overstige 30 min.
- Flash fryse prøver i flydende nitrogen.
- Opbevar prøver ved -80 ° C eller i LIQUId nitrogen tør afsender indtil analyse på et flowcytometer.
- Mikrobiel metagenomisk Sample
- Fjern i line filterholderne.
- Direkte montere et 0,22 um cylindrisk filter på den pågældende linje.
- Filter resterende prøve vand af både Hatay Niskin enheder fra hvert sted (i alt 3-4 l pr filter) gennem et filter.
- Efter filtrering skubbe det resterende vand ud af hvert filter ved hjælp af en ren 10 ml sprøjte fyldt med luft.
- Placer filteret tilbage i original emballage og forsegle pakken med lab tape.
- Opbevar individuelt pakkede filtre ved -20 ° C.
- Viral metagenomisk Sample
- Overfør virale metagenom prøver straks ind i de vaskede spande til at sikre, at ingen prøve er tabt eller er forurenet med miljøet.
- Pre-filter ved hjælp stor porestørrelse nylon mesh (25-100 um) for at fjerne snavs og cellulært materiale forud for fusionen 19.
- Opsæt TFF som vist i figur 3, anbringelse tilførselsledningen i en prøve spand, og forlader retur- og filtratprøverne linjer kører i en vask.
- Tænd peristaltisk pumpe og skyl linjer med 1-2 l prøve vand.
- Placer returledning i prøven spand til at fuldføre cyklus, tilsæt 0,7 bar modtryk.
- Mens koncentrere havvandet, top op prøve reservoir som niveauet falder. Når vandstanden falder under indtagelsen linje i spanden, overførsel koncentrat i en blegemiddel-vaskes, triple skyllet tripour bæger og fortsætte koncentrationsbesvær.
- Hvis reservoir bæger er tom, skal du fjerne modtryk, øge pumpens hastighed og skubbe hele prøven gennem linjerne, inddrive den i tripour.
- Passere koncentratet gennem 0,45 um cylindriske filtre til at fjerne de fleste bakterier, mens ikke diskriminere nogen virale afstamninger.
- Skift 0,45 um cylindriske filtrene efter hver 150 ml. Indsamle 0,45 um-filstreret viral koncentrat i 50 ml rør.
- Tilsættes 250 pi af chloroform til hver 50 ml portion af filtreret viral koncentrat for at fjerne tilbageværende bakterier. Inverter at blande, og butik, opretstående ved 4 ° C indtil efterfølgende behandling.
- Tør 0,45 um filtre og gemme dem som beskrevet i trin 3.6.5 og 3.6.6.
4. Behandling af mikroskopi Prøver
BEMÆRK: Skyl filtrer tårne med 10% blegemiddel, efterfulgt af 95% ethanol for at forhindre potentiel plet eller biologiske rester mellem kørsler. Proces mikroskop prøver inden for 1 time og undgå at udsætte pletter og farvede filtre til at lyse, hvis muligt.
- Mount
- Tilsæt 100 pi 10% ascorbinsyre til 4,9 ml 1X PBS, og bland grundigt.
- Der tilsættes 5 ml 100% glycerol, og bland grundigt.
- Filterholderen under anvendelse af en 0,02 um aluminiumoxid matrix engangssprøjte filter, alikvot og opbevares ved -20 ° C.
- SYBRGuld Farvning
- Pipetteres en 500 ul aliquot af hver prøve fikseret med 2% slutkoncentration paraformaldehyd i et mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 0,5 pi 1.000 x SYBR Gold opløsning til hver af de udtagne.
- Bland prøven forsigtigt og sætte det i mørke i 10 min.
- Placer en 0,02 um aluminiumoxid matrix filter med ringformede støtte polypropylen ring på hver filter bevoksning af vakuumpumpen, og fastgør filtrer tårne (Figur 4). Sørg 0,02 um filter er placeret på filter stand plast-side op, da disse filtre har en dobbelt porøsitet.
- Med vakuumpumpen slukkes, tilsæt 500 ul SYBR farvede prøve, sammen med 2 ml 0,02 um filtreret virus frit vand for at sikre, at prøven er jævnt fordelt over filteret.
- Tænd vakuumpumpen til at skabe et negativt tryk på højst 1 bar for at undgå at beskadige virus og mikrober, der filtreres.
- Tillad hele prøven for at gåigennem.
- Brug pincet (ikke det samme par som anvendes til DOC), forsigtigt fjerne hvert filter fra filtrering tårn, og passere over en delikat opgave tørre for at sikre, at filteret er tørt.
- Afpipetteres 10 pi mount på et objektglas og placere tørt filter, der indeholder den farvede prøve på drop af mount.
- Tilsæt 10 pi mount til toppen af hvert filter, før du tilføjer et dækglas.
- Tryk forsigtigt dækglasset ned. Prøv at fjerne luftbobler hvis det er muligt og undgå sidelæns bevægelse af dækglasset.
- Placer dias i en slidebox og opbevares ved -20 ° C.
- DAPI farvning
- Placer en 0,2 um aluminiumoxid matrix filter med ringformede støtte polypropylen ring på hvert filter stativ og vedhæfte filtrer tårne.
- Med vakuumpumpen slukket, tilsættes 2 ml 0,02 um filtreret virus frit vand til hvert tårn brugt.
- 1 ml af glutaraldehyd-fikserede prøve i hvert tårn, hvilket resulterer i et samlet volumen of 3 ml i hver filter tårn.
- Tænd vakuumpumpen for at skabe et negativt tryk på højst 1 bar.
- Filtrere hele prøven på 0,2 um aluminiumoxid matrix filter.
- Fjern forsigtigt filteret fra filtrering tårn med en pincet (ikke det samme par som anvendes til DOC).
- Placer filteret på en 100 ul dråbe DAPI opløsning [25 ug / ml] i en petriskål holde filteret højre side op og lad prøven farves for 15 min. Undgå lys under farvning processen.
- Efter 15 minutter, fjern filteret fra pletten, passerer det over en delikat opgave Udvisk at tørre og overføres til en 100 gi dråbe 0,02 um filtreret virus frit vand, igen holder filteret højre side op, for at vaske resterende DAPI farvning for 1 min. Gentag denne vask én gang.
- Mount filter på mikroskop skubbe identisk måde som beskrevet for SYBR Gold prøver.
5. DNA Extraction
- Mikrobiel metagenomisk DNA
- Optø cylindriske filtrene i mindst 20 minutter ved stuetemperatur.
- Fjerne eventuelle resterende havvand i filteret ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Cap den nederste ende af det cylindriske filter ved hjælp af en bleget og autoklaveret hætte.
- For hvert filter, bland 360 pi T1 "pre-lysis" buffer og 50 pi proteinase K, og derefter pipette blandingen i filteret. Cap åbne ende.
- Inkubér lysis reaktion i en roterende ovn O / N (eller mindst 2 timer) ved 55 ° C.
- Tag en af hætten og tilsættes 200 pi B3 "lyse" buffer ind i filteret til pre-Lyse prøve. Re-cap filter og inkubere blandingen i en roterende ovn i 10-20 minutter ved 70 ° C.
- Uddrag hele mængden fra det cylindriske filter ved hjælp af en 3 ml sprøjte ved at suge væsken ud med filteret på hovedet.
- Udvise den lyserede prøve i et nyt mikrofugerør, og der tilsættes 200 pi 100% ethanol.
- Bland godt, indlæse hele prøven på spinkolonne, og fortsæt som anvist af producentens protokol.
- Kvantificere DNA under anvendelse af en fluorescerende-baseret assay.
- Marine Viral Metagenomics
- Oprensning og koncentrering af fagpartikler (modificeret fra Thurber et al. 19)
- Opløs CsCl i havvand til fremstilling af opløsninger af 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (kalibreret ved afvejning af 1 ml opløsning). Filtrere hver fraktion med 0,02 um filter før brug.
BEMÆRK: Sørg for, at tætheden af hver fraktion er nøjagtig til tre betydende cifre, før du bruger de løsninger og filtrere alle løsninger med et 0,02 um filter før brug. Brug havvand eller havvand mættet med CsCl til at sænke eller øge tætheden hhv. - Lav et objektglas fra 1 ml kombinerede reagenser som beskrevet i afsnit 4.2 for at sikre, at alle reagenser er blottet for virus, før du fortsætter.
- Tilføj 9 g CsCl til 45 ml af viral TFF koncentraten endelig densitet på 1,12 g / ml. Opbevares i køleskab, når du installerer CsCl tringradient.
- Startende med g / ml opløsning i 1,7 successivt tilsættes 1 ml af hver sekventielt mindre tæt fraktion langsomt i hvert rør ved hjælp af serologiske pipetter. Markér niveauet for hver enkelt menisk og sikre, at pycnoclines mellem fraktioner, ikke forstyrres. For flere detaljer se følgesvend papir (Lim et al. 2014).
- Med en serologisk pipette belastning 7,5 ml prøve i hver af 6 rør og centrifugeres ved ~ 83.000 xg, 4 ° C i 2 timer.
- Uden at forstyrre de densitetsgradienter losse rotoren og gennembore røret lige under tidligere markerede 1,5 g / ml densitet lag (figur 5) med en 18 G nål på en 3 ml sprøjte. Tegn off 1,5 ml oprensede VLP'er og overføre til et nyt mikrocentrifugerør. Gentag for alle prøver.
- Tilsæt 0,2 rumfang chloroform til de oprensede VLP'er, der blandes grundigt, inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
- Tilsæt 150 &# 181; l 10x DNAse buffer til hver mikrocentrifugerør.
- Spin ved 16.000 xg i 5 minutter, og den vandige fase opsamles. Hvis chloroform ikke samlet i bunden af mikrocentrifugerør, tilføje flere DNAse buffer, blandes og gentage.
- Tilføj DNase I (slutkoncentration = 2,5 enhed / ul) og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer, derefter inaktivere DNase-aktivitet ved inkubering ved 65 ° C i 15 minutter.
- Opløs CsCl i havvand til fremstilling af opløsninger af 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (kalibreret ved afvejning af 1 ml opløsning). Filtrere hver fraktion med 0,02 um filter før brug.
- DNA ekstraktion fra Viral-lignende partikler (VLP'er)
- Jævnt samle de oprensede VLP'er fra hver prøve i to rengjorte og autoklaveres Oak Ridge rør.
- Tilføj 0,1 volumen 2 M Tris-HCl (pH 8,5) med 0,2 M EDTA, 0,01 volumen 0,5 M EDTA, 1 volumen formamid, 10 pi glycogen (10 mg / ml). Bland godt, og der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Med henvisning til ny volumen, tilsættes 2 volumener RT 100% ethanol. Blandes og inkuberes ved 4 ° C i mere end 30 min.
- Pellet DNA ved at dreje Oak Ridge rør ved 17.200 xg i 60 minutter, ved 4 & #176; C.
- Fjern supernatanten. Vask DNA pellet to gange med iskold 70% ethanol under anvendelse af serologiske pipetter.
- Fjern alle ethanol (re-spinning kortvarigt, hvis nødvendigt), dække, og lad pillen lufttørre ved stuetemperatur i> 15 min.
- Resuspender DNA-pelleten for> 15 min i 567 ul 1X TE-puffer (pH 8,0). Overfør 567 ul resuspenderet DNA i en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 30 pi 10% SDS (pre-varm ved 65 ° C før brug) og 3 pi proteinase K (20 ug / ml), blandes og inkuberes i 1 time ved 56 ° C.
- Tilsæt 100 pi af 5 M NaCl og bland grundigt. Tilføje 80 pi forvarmet CTAB NaCl-opløsning, vortex, og der inkuberes i 10 minutter ved 65 ° C.
- Tilføj 0,2 dele volumen chloroform, vortex, og centrifugering ved 16.000 xg i 2 min. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj lige så stort volumen phenol chloroform isoamylalkohol 25: 24: 1 opløsning, vortex at blande,og spin ved 16.000 xg i 2 min. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj lige så stort volumen chloroform, vortex, og centrifugering ved 16.000 xg i 2 min. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj 0,7 volumen isopropanol til supernatantfraktionen og inkuberes ved -20 ° C i mindst 30 minutter for at udfælde DNA.
- Pelletere DNA'et ved centrifugering ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Pipetteres supernatanten og vask pellet to gange med 500 pi iskold 70% ethanol.
- Spin ved 16.000 xg og fjerne resterende ethanol fra røret. Air-tørre pellet i 15 min.
- Resuspender DNA-pelleten med 50 pi elueringspuffer (5 mM Tris, pH 7,5) eller Tris-EDTA, pH 8,0 i mindst 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kvantificere DNA'et ved hjælp af høj følsomhed fluorescens-baseret assay.
- Oprensning og koncentrering af fagpartikler (modificeret fra Thurber et al. 19)
Representative Results
Microscopy
Mikroskopi prøver kan og bør analyseres straks for at sikre, at de er af den ønskede kvalitet. At måle overflod og størrelsesfordelingen af den bakterielle samfund, vil DAPI slides blive behandlet af epifluorescensmikroskopi (excitation / emission: 358/461 nm, se McDole et al 2012.) (Figur 6A). Kan opsamles celletal og dimensioner skal bruge imaging software (f.eks ImagePro eller ImageJ). Fra længde og bredde målinger cellevolumener (V) er afledt ved at gøre den antagelse, at alle celler har form af cylindre med halvkugleformede hætter ved hjælp af følgende ligning:
V = π / 4 × w 2 (L - w / 3)
hvor L er længden og w er bredden af hver celle 23,4. Mikrobiel biomasse kan derefter estimeres ved hjælp af tidligere etablerede størrelse afhængige relationer for marine mikrobielle samfund 24. Generelt marine bakterier varierer i længde fra 0,1 til 4 pm, men gå op til ~ 8 um nogle steder.
Mens filtrene (0,2 um) farvet med DAPI kun vil vise bakterier, de filtre, der anvendes for SYBR Gold farve (0,02 um) indeholder bakterier og vira. Måling af overflod af virus følger den samme protokol som for mikrober dog en excitation af 325-375 nm vil blive anvendt, og den maksimale emission er ved 537 nm (figur 6B).
For at generere kvantitative data kan være nødvendigt at justere afhængigt af den virale overflod i den oprindelige prøve prøvevolumenet. Den korrekte mængde for at filtrere bedst bestemmes empirisk for en given vandmasse. Eksempler på mikrofotografier med prøver med varierende virale koncentrationer er illustreret i figur 7.
Resultater fra tidligere undersøgelser tyder på, at virus til Microbenøgletal (VMR) varierer generelt fra 1 til 50 i akvatiske systemer 25-29, og i mellem 3 og 20, med et gennemsnit på ca. 6 i koralrev systemer (Knowles upublicerede data).
Flowcytometri
Ud over de direkte tællinger og størrelse estimering af mikrobielle samfund, yderligere kan udvindes vurderinger af forholdet mellem autotrofe til heterotrofe mikroorganismer via flowcytometri fra de indsamlede prøver (eksempel flowcytometri output givet i figur 8). At bestemme det samlede antal bakterier celler der prøver farvet med SYBR Green I og et fotomultiplikatorrør med en 530/30 båndpasfilter anvendes til påvisning. En kanal for klorofyl (tilbage til tilbage LP spejle resulterer i en række 675-735 nm) og phycoerytherin (585/42 båndpasfilter) bruges til at tælle den overflod af autotrofe i ufarvede prøver. At bestemme den overflod af heterotrofe mikroorganismer, de autotrofe tællinger fra ikke-farvede portion derefter trækkes fra SYBR bejdset samlet optælling (McDole et al. indsendt).
Viral Metagenomics
Viral metagenomics anvender en kultur-uafhængig molekylær tilgang til viral økologi, ved hjælp af total genomisk sekvens information til at bestemme samfunds struktur og funktion. Metagenomics har været fremme vores forståelse af kompleksitet og mangfoldighed af virale fællesskaber på lokalt 17 til global skala 30. Den seneste udvikling af en bred vifte af bioinformatiske værktøjer til analyse af virale metagenomisk data er faldet beregningsmæssige flaskehalse, der giver mulighed for en mere omfattende opfattelse af virosphere gennem linsen af metagenomics.
De metoder, der præsenteres her fremhæve isolering og berigelse af viruspartikler fra havvand under anvendelse af en kombination af præ-filtrering med stor porestørrelse nylonnet for at fjerne snavs og cellulært materiale, koncentrationen afprøver med TFF (figur 3) og en efterfølgende 0,45 um filtrering for at fjerne større celler. Denne metode frembringer omtrent en 100x koncentrerede prøve (5B-5E), som giver os mulighed for at udføre downstream-processer i mindre mængder. For at forhindre væksten af eventuelle resterende mikrobielle celler i viruslysatet og derfor ændringer i virale overflod af prøven under den lange transittid mellem felt station og laboratorium, er chloroform ofte tilsat til en endelig koncentration på 2% til opbevaring. Efter isolering og oprensning af VLP'er er epifluorescensmikroskopi med nukleinsyre farvestoffer, såsom SYBR Gold anvendes til at bekræfte tilstedeværelsen og renheden af de virale partikler (figurerne 5B-5E).
Her præsenterer vi to virale metagenomes fra den sydlige linje Island koralrev, specifikt Starbuck (STAR7) og Millennium (CAR9, tidligere kendt som Caroline) øer. Et samlet volumen på 120 L sample vand blev opsamlet fra hvert sted i en dybde på 10 meter og behandles som beskrevet i afsnit 3.7 og 5.2. VLP'er oprenset fra cæsiumchloridgradient centrifugering var 3,3 x 10 8 partikler / ml for CAR9 (figur 5D) og 2,9 x 10 9 partikler pr ml for STAR7 som verificeret i henhold til den i punkt 4 (figur 5B) metode. Den totale mængde af DNA isoleret fra disse prøver var omkring 400 ng baseret på NanoDrop måling. DNA blev opformeret ved anvendelse Phi29 polymerase og sekventeret ved Environmental Genomics Core facilitet i 2011. De karakteristiske træk af sekvensen data er præsenteret i tabel 1. Baseret på lighed søgninger ved hjælp af eksisterende databaser, de fleste (> 70%) af sekvenserne ofte endte karakteriserede, dvs., ukendte oprindelser og funktioner. Tilsvarende de to viromes præsenteres her præsenteret mere end 97% af ukendte sekvenser. Som et resultat, ikke-databaseafhængig analyse blev anvendt til analyse og åbnet en ny gren af forskningen lejlighed på "dark matter" i virale metagenomics (Seguritan et al. i trykken).
Mikrobiel Metagenomics
Analysen af mikrobielle metagenomes tillader karakterisering af mikrobielle samfund til stede, og den funktionelle beskrivelse af disse samfund. Eksempler omfatter skøn over forekomsten af patogener og virulens 5,22 eller sammenligninger mellem ændringer i macrobial samfunds struktur eller tilgængelige næringsstoffer og overflod af arter og deres fremherskende metaboliske veje (figur 9; Kelly et al 2014.).
Water Chemistry
Vandkemiske parametre generelt tager omfattende analytisk behandling for at generere de ønskede data; prøver til DOC-analyse vil blive målt via høj temperatur katalytisk oxidation 31,32, partikler organisk materiale (POM) via isotop-ratio massespektrometri koblet til en grundstofanalysator 33-35, og uorganiske næringsstoffer af Flow Injection Analysis 36,12,37. Efter en vellykket gennemførelse af alle de analyser, vil oplysningerne som vist i tabel 1 være til rådighed for at supplere karakteriseringen af mikrobielle og virale samfund. Denne information kan komplimenteres med stabile isotopforhold af organisk kulstof og kvælstof prøver (Se Haas et al. 35) og forholdet mellem autotrofer og heterotrofer (McDole et al. Indsendt).
Figur 1. Oversigt over metoder beskrevet i protokollen sektionen. Klik her for at se en større version af denne figure.
Figur 2. Prøve behandling rig setup. Filtreringseffektiviteten setup introduceret her (skematisk tegning til venstre, faktiske billede højre panel) er ikke nødvendigvis påkrævet at generere prøver, men vil fremskynde processen betydeligt. Opsætningen består af en bagplade, hvorpå Hatay Niskin enheder (1) er monteret. På udløb nedad, er Hatay Niskin enheder forbundet med silikone slange til in-line filter holdere (2). Disse lad vandet passerer gennem den respektive filter ind i HDPE prøveudtagning hætteglas samplet (3) monteret lige nedenunder. Filtreringsprocessen accelereres gennem trykluft (4), som og reguleret af en trykmåler (5). En opstemningsbassin forhindrer spilde vand under de skiftende af HDPE hætteglas eller POM filtrering. Venligstklik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. tangential flow filter opstilling (modificeret fra Thurber et al. 19). Nylonnet filtrerede prøve vand pumpes fra reservoiret (1) via en peristaltisk pumpe (2) til en tangential flow filter (3). Vandprøven vender tilbage til reservoiret (1) langs returledningen (4) i fravær af modtrykket. Når modtryk påføres gennem en slange klemme (5) på returledningen, vand passerer gennem filteret og kasseres eller leveres til filtratet reservoir (6). Prøve vand erstattes med den koncentreres ud filtratet linje, indtil al prøve vand koncentreres i slangesættet linjer.
Figur 4. Microscope slide filtrering setup.At fordele DAPI og SYBR Gold farvede prøver på den respektive aluminiumoxid matrix filter (1), filtre skal placeres mellem filteret tårn (2) og stammen af filtreringsmanifold og fastgjort med en klemme (4). Et tryk reguleret vakuum (5) vil fremskynde filtreringsprocessen (skematisk tegning top, faktiske billede nederste panel). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Rensning og koncentration af fag-partikler. I alt 1 ml af hver caesiumchlorid densitetsgradient lag oven på hinanden, før der fører den forbehandlede prøve (A). Hvert lag skal mærkes uden for røret for at fremme ekstraktion efter ultracentrifugering. Rød pil markerer, hvor røret vil blive gennemboret til extarmkanalen fraktionen VLP. (BE) Mikrografier af virale koncentrater: epifluorescens mikrografier af 0,45 um-filtreret repræsentative virale koncentrater af STAR7 (B) og CAR9 (D). Store partikler, herunder bakterieceller var synlig fra 0,45 um-filtrater fra begge STAR7 (B) og CAR9 (D) prøver, mens kun VLP'er (hvide pile) forbliver efter cæsiumchlorid ultracentrifugering; Stjerne 7 (C) og CAR9 (E). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Eksempel på DAPI og SYBR Gold mikrograf analyse. Screenshot fra analysen af (A) DAPI og (B) SYBR Gold farvede slide eksempel. (A) Længde og bredde (um) af alle markerede partikler(= Mikrober) kan vurderes ved hjælp af et billedbehandlingsprogram. Bemærk sammenlægning i midten af billedet. Disse klynger vil skulle udelukkes fra efterfølgende analyse. (B) under analyse vira og bakterier har brug for at være myndighed ved størrelsestærskler i VLP og cellulære størrelsesintervaller (VLP rød, cellulær grøn). Bemærk, at der som regel nogle svage VLP Uncategorized af den respektive imaging program. Disse VLP'er optræder som svage hvide prikker skal manuelt tælles og lægges til de automatiserede virale tæller. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Koncentrationer af SYBR Gold farvede prøver. Mikrografer af en 0,02 aluminiumoxid matrix filter, der indeholder forskellige antal af SYBR farves virusprøver. Panel A viser ofilter indeholdende en passende mængde havvand filtreres, mens koncentrationerne på filteret vist i B er for høje og i C for lav for pålidelige tællinger. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 8. Resultaterne af flowcytometri analyse produktion af et rev-vandprøve. Panel (A) viser molekylærbiologisk kvalitet kun vand med gul-grønne fluorescerende mikrosfærer (0,75 um), anvendes til at kontrollere minimal baggrund med instrumentets indstillinger. Panel (B) viser produktionen af revet vandprøven køre med samme indstillinger og layout som i A. Bemærk at perlerne stadig kan ses på det samme sted, sammen med flere populationer af autotrofe. (C) (B), bruges til at sikkerhedskopiere-gate flowcytometeret, målretning SYBR positive begivenheder (autotroft + heterotrof count) og minimering af baggrund. (D) Det repræsentative Reef-vandprøve farves med SYBR Green I. Brug gatingen etableret i (C), blev de samlede mikrobe tællinger genereret, og heterotrofe og autotrofe mikrober partitioneret af klorofyl autofluorescens (se McDole et al. 4). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 9. Eksempel på mikrobielle metagenom data. Mønstre mellem de mikrobielle metagenomisk sekvensdata og site afhængige variable. Her, den relative forekomst af Synechococcus Pelagibacter spp. blev ikke (venstre paneler). Den metaboliske vej for konjugative overførsel var positivt korreleret med nitratkoncentrationer, mens den metaboliske vej for DNA-reparation var konsistent mellem alle metagenomes (højre paneler). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Stjerne 7 | CAR9 | |
| Samlet antal Læser | 939.311 | 591.600 |
| Antallet af forbehandlede Læser | 579.664 | 360.246 |
| Mean Sekvenslængde (bp) | 395 ± 131 | 451 ± 159 |
| Kommenterede Sekvenser (%) | 42.218 (7,3%) 9117 (2,5%) | |
| Ukendt (%) | 537.446 (92,7%) | 351.129 (97,5%) |
Tabel 1. Data karakteristika to viromes genereret fra de sydlige Linje-øerne, Starbuck og Millennium. Graden af anmærkning er baseret på BLAT hjælp af MG-RAST-serveren.
Tabel 2. Repræsentative resultater, der viser data fra forskellige steder i løbet af en ekspedition. De her vurderede parametre omfatter vandkemiske målinger parret med mikrobielle og virale forekomster. Tabellen indeholder endvidere filnavne, der henviser til de respektive metagenomisk data for hver målestedet. Carbon og uorganisk næringsstofkoncentrationer er givet i pmol / l. Venligstklik her for at se en større version af denne tabel.
Discussion
De metoder, der præsenteres her, vil give et værktøj til at generere en samlet vurdering af virale og mikrobielle dynamik i akvatiske økosystemer. De er målrettet til at kvantificere stående bestand af organiske og uorganiske ressourcer til rådighed for mikrobielle samfund og til at karakterisere makeup af virale og mikrobielle samfund til stede. Næste for at kvantificere viral overflod og mikrobiel overflod og biomasse, genomisk sekvens information afslører deres samfunds struktur og funktion. Er blevet udviklet eller modificeret til at tillade anvendelse i fjerntliggende lokale steder Alle metoder. Men manglen på kontrollerede laboratorieforhold indstillinger sagens natur skaber nogle muligheder for fejl. Her diskuterer vi nogle advarsler i forbindelse med hvert af de parametre vurderes. Ved siden af muligheden for forurening under håndtering af prøver nogle af de parametre også give muligheder for fejl i den analytiske proces.
Opløst organisk kulstof
Carbon forurening kan opstå under prøveudtagningsprocedurerne (prøveudtagning nedstrøms, eller i nærheden af en båd eller dykker), under forberedelsen prøven (forurening af udstyr eller utilsigtet håndtering), og selv under opbevaring af prøven (andre prøver i fryseren, der indeholder organisk opløsningsmidler / flygtige). For at undgå de forskellige kilder til adfærd forurening så få håndteringstrin som muligt, da hver prøve flytning udgør en yderligere kilde til forurening. Prøven må ikke komme i kontakt med ethvert element ikke syre vaskes eller forbrændes. Endelig vil udpegning af et storage fryser udelukkende til prøverne ikke indeholder flygtige organiske stoffer sikre integriteten af prøverne i længere perioder opbevaring. Hvis prøverne ikke kan holdes frossen under en udvidet rejseperiode forsuring af DOC prøver med koncentreret HCI (som beskrevet 38-41) kan være et relevant alternativ. At kontrollere de målenøjagtighed DOC konsensus referencematerialer bør anvendes regmæssigt under DOC målingen kører. Især dybe hav vand (> 2.000 m) referencer er værdifuld ved vurdering af den analytiske maskine, da det er meget stabilt i sin DOC-indhold 42.
Partikulære organiske Matter
Ud over at undgå kulstof forurening organisk, kræver POM sampling særlig opmærksomhed for at sikre nøjagtigheden af den filtrerede volumen. Hvis målrettet volumen på 500 ml, bør afvige for enhver potentiel grund til dette skal bemærkes at relatere mængden af POM fanget på filteret til filtratet, som den blev afledt.
Uorganiske Næringsstoffer
Som med organisk kulstof prøveudtagning, skal man være opmærksom på eventuel næringsstof prøvekontaminering genereret af forskellige kilder som både eller spildevandsudledninger 12. Filtre anvendes til organisk kulstof prøvetagning med en nominel porestørrelse på 0,8 um, kan ikke udelukke alle mikrobielle biomasse og shOuld derfor ændres til 0,2 um filtre til dette filtreringstrin. Endvidere detektionsgrænser udgøre et problem med prøver næringsstoffer; især i den næringsfattige overflade omkring mange koralrev steder (f.eks Cotner et al. 43) vand. Detektionsgrænser er nogenlunde omkring 0,1, 0,2 og 0,1 mmol / l for ammonium, nitrat og nitrit, og ortho-fosfat henholdsvis (se 36,12,37)
Microscopy
Udover variationer i koncentrationen af prøver billedanalyse fra mikroskopi slides yderligere giver muligheder for fejl. For eksempel kan billederne være ude af fokus på nogle områder af synsfeltet, og i fokus i andre. Som en høj renhed aluminiumoxid matrix filter er en meget stiv filtertype kan eventuelle rester under filteret forårsage hele filter til at sidde på en vinkel til objektglasset. Som et resultat, kan billederne være konsekvent ude af fokus i forskellige dele af synsfeltet for en given filter, rehængigt af mikroskop tilpasning. Genmontering filtre sikrer undersiden af filteret er rent, kan forbedre dette, hvis det iagttages. I nogle tilfælde kan der være to brændplaner hvor vira og mikroorganismer kan findes. Dette er resultatet af farvede objekter løsnes fra filteret ved montering og flydende op til undersiden af dækglasset, som kan gøre tæller upålidelige. Derfor er det altid anbefales at kontrollere kvaliteten af prøverne i løbet af processen.
Flowcytometri
Som med mikroskopi prøver, der kan være naturligt forekommende forskelle mellem flowcytometri prøver, som kræver justering af den analytiske proces. For eksempel, afhængigt af følsomheden af instrumentet, kan svagt fluorescerende Prochlorococcus celler være under støjniveauet og vil ikke kvantificeres. Perler tjene som en intern prøve kontrol (fx at bekræfte, at instrumentets hhvonse til fluorescerende signaler er konsistent fra dag til dag (og forbliver stabil under kørslen selv). Hvis tilsat til prøven ved kendte koncentrationer, kan de også tjene som en intern kontrol for at verificere prøvevolumen løb. Det anbefales dog, at altid køre en portion af en tidligere frosset "standard" havvand prøve, der er optøet og farvet sammen med prøver af interesse at give en ekstra biologisk kontrol for håndtering af prøver mellem 96 brønde løber. Afhængigt af placering, kan havvand prøver se meget forskellige fra hinanden. Sortering "repræsentant" befolkninger, og derefter ser under et epifluorescensmikroskop (EM), kan være en god måde til hurtigt at kontrollere planteplankton populationer som enten Synechococcus sp. Eller fotosyntetiske eukaryoter. Prochlorococcus celler er typisk ikke synlige under EM, fordi de falmer alt for hurtigt. Ud over klorofyl a, Synechococcus sp. Også indeholde photopigment phycoeurythrin (PE), som udsender lys ved kortere bølgelængder (540-630 nm) end klorofyl A (660-700 nm). Når Synechococcus celler ophidset med blå / grønt lys (470-490 nm), vil de blive vist gylden, hvis det ses under en emission filter, der fjerner alle bølgelængder af lys under 510 nm. Til sammenligning vil den eukaryote fraktion se rød, når den exciteres med den samme bølgelængde af lys.
Viral Metagenomics
Det er vigtigt at bemærke, at processen med VLP koncentration og opbevaring påvirker samfundet udvundet. Viral tab partikel kan forekomme på hvert trin i processen, og dermed kan udvælgelsen af virale til rensning og berigelse protokoller i sidste ende påvirke den observerede taksonomiske sammensætning og mangfoldighed af de resulterende virale metagenomes 44,45,18. Koncentrationen af prøver kan gøres ved hjælp TFF 19 eller kemisk-baserede flokkulering 20. I den kemiske tilgang, positlukkende ladet jernioner binder naturligt negativt ladede viruspartikler danner store (> 8 pm) Jern-virale komplekser, flokkulerer ud af opløsning og kan udvindes ved hjælp af 8 um filtre. Efterfølgende jern er chelateret fra de virale partikler og genopløses anvendes magnesium, ascorbinsyre, og EDTA, forlader koncentrerede virale partikler til nukleinsyre ekstraktion 20. Efter at have sammenlignet disse to nuværende metoder, konkluderede vi, at jern chlorid metoden er mindre tidskrævende end TFF viral koncentration, men kan give nogle advarsler. Vi fandt, at dissociation og opløsning af jern-viral kræver en to gange mere koncentreret magnesium-ascorbinsyre-EDTA-opløsning end rapporteret 20, for opløsning at fortsætte før ascorbinsyre nedbrydes. Bortset fra dette spørgsmål, protokollen renser viruspartikler efter størrelse-fraktionering alene fjerne mikrobielle forureninger anvender 0,2 um filtrering. Store vira ikke passere gennem filtis (f.eks Yang et al. 46) og vil således ikke blive detekteret i metagenomet, mens nogle Bakterier gøre (McDole, upublicerede data). Dette resulterer i bakteriel forurening, samtidig diskriminere store vira.
Det specifikke problem er imidlertid også relevant for fjernelse af mikrober i forbindelse med TFF koncentration. Som chloroform behandling har vist sig at fjerne chloroform-sensitive vira med eksterne lipidmembraner 47 nogle undersøgelser tyder på, at 0,22 um filtrering kan anvendes til at fjerne størstedelen af bakterier. Det skal også bemærkes, at den foreliggende fremgangsmåde først og fremmest er rettet mod bakteriofag, den mest udbredte bærer af genetisk materiale i marine miljøer. Fordi fag generelt menes ikke almindeligvis indeholder lipider 48 de er mere modstandsdygtige over for chloroform behandling. Til vores viden en "catch-all" metode ikke findes til dato. Metoden præsenteres her er tilpasset fra our felt erfaring over de sidste 10 år i forskellige marine miljøer spænder tropiske til arktiske systemer.
Mikrobiel Metagenomics
Opførelsen af metagenomisk biblioteker for mikrober (dvs. bakterier og archaea) er mere ligetil end virale metagenomes da det er lettere at generere minimale DNA-koncentrationer, der kræves for bibliotek forberedelse. Linker forstærkning shotgun biblioteker (LASLs) 17,49,50 og hele genomamplifikation baseret på forstærkning multiple deplacement (MDA) er de to mest almindeligt anvendte metoder til at generere tilstrækkelig DNA til sekventering. Er nogle gange nødvendigt at anvende MDA at opnå højere DNA-koncentrationer i mikrobielle metagenomes. Dette kan imidlertid medføre artefakter i sekvensdata, såsom overforstærkning af dinoflagellat minicircles. MDA fremgangsmåder er kendt for fortrinsvis at amplificere enkeltstrengede og cirkulært DNA, hvilket resulterer i ikke-kvantitative resultater 51,52. De optimerede LASLs nærmer 50 kan således fungerer som et bedre alternativ i en uddybning af både mikrobiel og viral metagenomisk DNA til sekventering. Det er vigtigt at bemærke, at LASLs fremgangsmåde har flere trin, kræver avanceret udstyr og er begrænset til dsDNA templates. Endvidere har vævet DNA-ekstraktion kit vist sig at udvinde DNA fra både Gram positive og Gram negative phyla, men det er ikke blevet bekræftet til effektivt lysere genstridig mikrobiel taxa eller deres tilknyttede strukturer (fx visse archebakterier, endosporer eller svampesporer) . Derfor kan det være nødvendigt en perle bankende skridt til at opnå DNA fra visse mikrober.
Disse omfattende vurderinger vil resultere i en bedre forståelse af viral og mikrobiel økosystemernes funktion. Selv om nogle undersøgelser har påtaget sig for at vurdere alle de foreslåede parametre, har mange været at undersøge udvalgte dem. Nelson et al. 53 foreslog en forbindelse betwEen specifik revhabitater og udtynding i både DOC og bacterioplankton koncentrationer i forhold til offshore-farvande. Disse koncentrationsgrænser ændringer blev ledsaget af forskellige opdelinger af bacterioplankton fællesskaber. Dinsdale et al. 5 viste, at øget virkning menneskeskabte blev ledsaget af 10x højere mængderne af mikrobielle celler og viruslignende partikler. Mikrobielle samfund i havområderne omkring beboede øer havde også større fraktioner af heterotrofer og potentielle patogener 5. Endelig McDole et al. 4 viste, ved at indføre microbialization score, at menneskelige aktiviteter er ved at skifte energi til mikrober, på bekostning af de macrobes. Disse undersøgelser, der fokuserer på specifikke mikrobielle og vandkemiske parametre, tilvejebringe nye indsigter i den biokemiske struktur marine økosystemer. Ved at kombinere de traditionelle data for overvågning af økosystemer indsats - ligesom temperatur- og pH-værdier, fisk biomasse og diversity, bundlevende dækning, eller udsættelse for menneskets påvirkning - med vand kemi og mikrobielle vurderinger, vil sandsynligvis resultere i mere følsomme miljøovervågning indsats, der kan føre til mere målrettet bevarelse indsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
| Filtration setup | Figure 1 | ||
| 32-36% Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
| High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
| Combustion oven (550 °C) | |||
| 60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
| 25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
| Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
| Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
| Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
| 20 L collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
| Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
| Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
| Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
| 0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
| 8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
| 0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
| 0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
| Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
| 20 ml Plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
| Clean bucket (10-20 L) | |||
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
| 25% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
| Liquid nitrogen | |||
| 0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
| 0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
| 10,000x SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
| DAPI solution 25 µg/ml | Invitrogen | D1306 | |
| Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
| Ascorbic acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
| Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
| Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
| Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
| Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
| Slide station with vacuum pump | Figure 3 | ||
| DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Lifetechnologies | AM2546 | |
| 200-proof Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
| Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
| Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
| 60 ml Syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
| 0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
| DNase I (100 units/µl) | Calbiochem | 260913 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
| Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
| Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
| 1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
| 20 μg/ml Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
| Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
| Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
| 50 ml Oak Ridge tube | Fisher Sci | 05-562-16B |
References
- Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399 (6736), 541-548 (1999).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318 (5847), 97-100 (2007).
- McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7 (9), (2012).
- Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3 (2), (2008).
- Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7 (5), 962-979 (2013).
- Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
- Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9 (7), 835-845 (2006).
- Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52 (6), 1571-1584 (1988).
- Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33 (4), 725-749 (1988).
- Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41 (11), 1565-1574 (1977).
- Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. , Weinheim and New York. (1976).
- Strickland, J. D. Practical handbook of seawater analysis. Bulletin Fisheries Research Board of Canada. 167, (1968).
- Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48 (2), 91-108 (1995).
- DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5 (5), 520-524 (2002).
- Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180 (18), 4765-4774 (1998).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
- Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
- Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
- Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6 (3), 638-649 (2012).
- Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
- Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51 (3), 201-213 (1989).
- Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145 (1), 269-277 (1996).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48 (4), 1457-1465 (2003).
- Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53 (6), 1090-1100 (2008).
- Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2 (9), 924-936 (2008).
- Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4 (11), (2006).
- Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263 (266), (1998).
- Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57 (16), 1433-1445 (2010).
- Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19 (6), 984-989 (1974).
- Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
- Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389 (1), 53-60 (2010).
- Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45 (6), 1213-1223 (2000).
- Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
- Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24 (1), 17-26 (2001).
- De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52 (6), 2608-2617 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43 (3), 375-386 (1998).
- Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23 (5), 611-620 (2000).
- Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (1), 4547-4553 (2011).
- Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18 (6), 709-712 (2006).
- Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 736-738 (1961).
- Ackermann, H. W. The Bacteriophages., Second Edition. Calendar, R. , Oxford University Press. New York. 8-16 (2006).
- Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5 (2), (2010).
- Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
- Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
- Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
- Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5 (8), 1374-1387 (2011).
- Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10227-10232 (2014).
- Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. , (2014).
