Abstract
형광 계 프라이머 신장 (FPE)는 전사 시작점 또는 RNA 분자의 프로세싱 사이트를 결정하기 위해 분자 방법이다. 이것은 특정 형광 표지 된 프라이머 및 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 변성하여 수득 된 cDNA 단편의 후속 분석을 이용하여 관심있는 RNA의 역전사에 의해 달성된다. 동시에, 전통적인 생거 시퀀싱 반응은 자신의 정확한 해당 기지의 cDNA 단편의 단부를 매핑 겔상에서 실행된다. 제품은 복제되어야 복수 후보 서열 5'-RACE (cDNA를 엔드 신속한 증폭), 대조적으로, 프라이머 신장에 의해 생성 된 cDNA 단편의 대부분은 동시에 하나 겔 실행에서 검출 할 수있다. 또한, (결과를 최종 분석에 역전사에서) 모든 절차는 하나의 작업 일에 완료 할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이머를 사용함으로써, 유해 방사성 동위 원소의 사용은 표지 된 시약을회피 할 수 있고, 제품은 전기 영동 과정에서 검출 될 수 있기 때문에 처리 시간이 감소된다.
다음의 프로토콜에서는 확실하고 신속 S.에서 (예를 들어, 독소 항독소 시스템 구성 요소) 시작점 및 RNA 프로세싱 사이트 전사을 추론의 RNA의 5 '말단을 검출하는 생체 내 형광 프라이머 신장 방법을 서술 구균, E. 대장균 및 기타 세균.
Introduction
프라이머 신장도 1은 하나의 기본 해상도까지 특정 RNA 분자의 5 '말단을 결정하기 위해 분자 방법이다. 이러한 5'-RACE (cDNA의 신속한 증폭이 종료 됨) 같은 다른 방법의 장점은 빠른 처리 시간을 용이 RNA 분자의 서로 다른 길이의 혼합물을 분석 할 수있는 능력이다.
이 방법은 RNA 분자가 특정 길이의 cDNA 단편을 생성하는 특정 형광 프라이머를 사용하여 전사 반응을 반대로 실시함으로써 작동한다. 이들의 cDNA 분자 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔에 전통적인 생거 시퀀싱 반응이 함께 실행 의한 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 그 형광을 검출 할 수있다. 된 cDNA 단편의 길이는 5 '말단 RNA의 맵핑을 허용 시퀀싱 사다리 비교에 의해 평가된다.
전통적으로, 프라이머 신장 반응을 함께 사용방사성 동위 원소와 X 선 필름에의 cDNA 분자들을 검출한다. 그들의 감도가 약간 낮다이라도 인해 건강 위험, 폐기물 처리 문제 및 취급의 용이성, 새로운 프로토콜은 자동화 된 시퀀서와 프라이머 신장의 검출을위한 형광을 이용한다. 형광 프라이머 (로모 손 년 이상) 장기간 안정적으로 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 무선 표지 반복 절차가 생략 될 수있다.
우리는 여기에서 설명하는 방법은 자동화 겔 시퀀서를 이용하지만, 약간의 수정과, 모세관 시퀀서는 cDNA의 분리 및 검출 3에 사용될 수있다. 겔 분석 병렬 특성은 가능한 RNA 절단 또는 프로세싱 심지어 적은 양을 검출 할 수있다. 또 다른 이점은 검출 될 수 단말 절단 또는 심지어 하나의베이스 처리로서,이 방법의 고해상도이다.
RNA 절단 또는 가공, t의 검출에 관련하여프라이머 확장 ypically 두 가지 종류가 구별된다. 다른 경우에, 처리가 생체 내에서 수행하고, 생성 된 RNA 정제 반면 한 경우, 효소 처리, 정제 된 RNA 정제 효소를 사용하여 시험 관내에서 수행된다. 프라이머 신장 시험 관내에서 수행에 두 경우 RNA가 RNA의 소스에 따라, 그러나, 실시되고, 상기 방법은 시험 관내 또는 생체 내 프라이머 신장이라고 하나. 여기 제시 프로토콜에서는 때문에 사용 용이성 (정제없이 필요한 단백질)과 동시에 전사 시작점 및 처리를 결정하는 가능성 단독 생체 프라이머 신장에 초점. 그러나, 시험 관내 프라이머 확장은 동일한 방법으로 설정 원칙적으로,이 프로토콜은 시작점을 제공 할 수있다.
여기에 예시 된 방법은 그것들이 높은 의무만큼 많은 세균 종에 적용될 수있다핵산의 순도 높은 수율 준비.
우리 실험실 연구 독소 항독소 (맞대기) 시스템 4,5, 프라이머 신장 방법은 광범위하게 사용되는 필드의 규정 범위에 초점을 맞춘다. TA-시스템은 안정적이고 내생 활성 독성 단백질과 독성 6,7 중화 대부분 불안정한 단백질 또는 RNA 항독소로 구성 원핵 생물의 게놈에 존재하는 작은 유전 적 요소입니다. 독소 활성은 때때로하는 RNase 활성 8,9 의해 대부분 복제, 세포벽 합성 또는 다른 메커니즘의 억제에 의해 발휘되지만. 일반적으로, RNA 분해 효소 특이성 프라이머 신장 방법 중 하나는 다른 테스트를 수행하여 결정된다. 벽개 및 전체 길이 단편의 혼합물을 동시에 그들의 5 '끝나는 결정하기 위해 분석 될 수있는 프라이머 신장 반응,이 애플리케이션에 매우 적합하다. 시험 관내 및 생체 프라이머 확장에 믹스를 사용하여,특정 독소의 RNase 절단은, 예를 들어, 서열 특이성 10-13 결정될 수있다.
. 프라이머 확장 절차 1. 개요 그림 세균 배양 실험의 필요에 따라 배양 및 처리됩니다. 총 RNA는 세포의 cDNA를 수득 대상 특정 형광 DNA 프라이머를 사용하여 역전사 반응에 DNA의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리하고 실시로부터 추출된다. 게놈 DNA 또는 플라스미드를 추출하여 이후의 cDNA 조각과 크기 비교를 위해 형광 생거 시퀀싱 반응에 사용된다. 프라이머 신장 산물은 변성 우레아 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 생거 시퀀싱 제품을 함께 실행하고 자동화 레이저 현미경으로 분석한다. 라 cDNA를 밴드와 함께 선까지입니다 시퀀싱베이스세인트 5 '의 cDNA 끝 (파란색 화살표)의 기본. Fekete 추가 정보, 등. (3) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전체 프라이머 신장 절차의 개요는도 1에서 발견 될 수있다. 요약하면, 박테리아 세포 수확, 배양, 세포 펠렛을 용해 및 RNA 추출. 정제 된 RNA이어서 역전사 템플릿으로 동작 할 수있다 DNA 분자의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리된다. 특정 형광 프라이머는 관심 영역에 교배와 이후 단일 가닥 보완 DNA (cDNA를) 결과, 전사 역, RNA에 추가됩니다. 시퀀싱 사다리 형광 프라이머를 이용하는 전통적인 생거 시퀀싱에 의해 생성 및 프라이머 신장 된 cDNA 단편의 나란히 변성 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 분리된다. 결과겔은 관심의 5 '말단의 식별을 허용 형광 밴드를 비교하여 분석된다. 전사 시작 지점 및 처리 사이트는 다음 서열 비교에 의해 개별적으로 평가된다.
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Protocol
1. 고수익 RNA 준비
- RNA 분리
참고 : 총 RNA의 높은 농도는 프라이머 확장 반응에 필요하다. 스핀 컬럼 키트는 대개 필요한 RNA의 양을 생성하지 않는 (~ 5-16 μg의 5 ㎕의 부피). 따라서 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 방법을 사용하여 정제는 아래에 설명, 권장합니다.
참고 : 페놀, 발암 독성 및 부식성. 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호 흄 후드를 이용하세요!- 원하는 수확 4,600 × g에서 10 분 원심 분리 및 4 ℃로 같은 박테리아 세포 (이 예에서는 황색 포도상 구균이나 대장균)을 성장 또는 치료. 참고 : 일반적으로 우리는 20의 600 총 OD 수확 - 70 세포 펠렛은 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다.
- 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 용액을 1 ml의 세포 펠렛을 재현 탁하고 편입2 ml의 0.1 mm 유리 지르코늄 / 실리카 비드 0.5 ㎖의 컵을 포함하는 스크류.
- 를 Lyse 세포 각 실행 한 후 5 분 동안 얼음에 샘플을 냉각 3 라운드 30 초 동안 6.5 m / 초에서 빠른 준비 / 비드 비터에 세 번. 주의 : 샘플을 균질화 몇 주 동안 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
- RT에서 5 분 동안 해물을 품어 다음 클로로포름 200 μL를 추가합니다.
- 흔들어 또는 RNA를 추출하기 위해 30 초 동안 샘플을 소용돌이.
- 15,000 × g에서 4 ° C - 후 13,000에서 15 분 동안 원심 분리하여 3 분 동안 실온에서 품어. 참고 : 용제 (흰색 DNA를 포함), (핑크, 단백질을 포함) 낮은 유기 상에 계면 분리 및 상부 수상 (클리어, RNA를 포함)입니다.
참고 :이 단계에서 사용 만의 RNase 무료 시약 및 플라스틱 제품! - 적절하게 신선한의 RNase가없는 1.5 ml의 반응 튜브, 라벨을 준비하고 거의 같은 VO를 사용 (100 %의 RNase 무료 이소프로판올 각의 약 500 μl를 추가LUME) 이전에 튜브 성상 등.
- 각도로 튜브를 잡고의 RNase에게 무료 정보를 사용하여 제조 한 튜브 수성 상 (약 500 μL)을 전송. 간기를 방해하지 마십시오.
- 수회 반전하고 RT에서 10 분 동안 인큐베이션하여 RNA를 침전.
- 15,000 × g에서 4 ℃, 피펫 또는 흡인 (워터 제트 펌프와 먹이 병)에 의해 뜨는을 제거 - 13,000에서 15 분 동안 원심 분리. 맨 아래에있는 흰색 투명 RNA 펠렛을 방해하지 마십시오.
- 씻어 70-80%의 RNase 무료 에탄올 (하지 소용돌이)의 1 ML을 추가합니다. 주 : 에탄올 RNA는 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수있다.
- 7,500 × g에서 5 분, 4 ° C 원심 분리 피펫 또는 바람직하게 흡인하여 상층 액을 제거한다.
- 흄 후드에서 30 분 - 15 공기 건조 RNA 펠렛. overdry하지 마십시오, 그렇지 않으면 펠렛 재용하기 어려울 수 있습니다.
- (5)의 펠렛을 재현 탁된 RNase 자유 DDH 2 O 또는 RNA 저장 버퍼 0 μL.
- microvolume 자외선 - 마주 분광 광도계 또는 석영 큐벳 (기존 광도계)와 RNA 농도를 측정하고 DNase의 I 소화를 진행합니다.
- RNA의 DNase의 I 소화 DNA의 흔적을 제거합니다
NOTE : DNA는 역전사 (프라이머 신장) 반응에서 스퓨리어스 주형으로서 작용할 수 있기 때문에,이 샘플로부터 제거되어야한다. RNA 솔루션에서 DNA를 제거하기위한 다양한 방법은 일반적으로 DNase의 소화에 의존하는 수 있습니다. DNA 제거를위한 간단하지만 효과적이고 비용 효율적인 방법은 아래에 설명되어 있습니다.- 37 ℃로 예열 물 목욕.
- 1.5 ml의 반응 관에, 표 1에 나열된 화합물을 섞는다.
- 수욕에서 37 ° C에서 1 시간 동안 혼합물을 인큐베이션하고, 페놀 / 클로로포름 추출로 직접 진행. 참고 :의 DNase I의 열 불 활성화하지 않는 것이 좋습니다,이 RNA를 저하 될 수있다.
- DNase의 I 소화 후 RNA의 페놀 / 클로로포름 추출
참고 : RNA를 DNase의 I 소화에서 무료로 뉴클레오티드, DNA 조각과 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 정제해야합니다. 페놀 / 클로로포름 추출 RNA 샘플의 높은 회복과 집중이 가능하기 때문에 아래에 설명되어 있습니다. 그들은 이러한 요건을 만족하는 경우 RNA 정제하는 다른 방법도 사용될 수있다.- 내가 소화 500 μL의 DNase를 2 ml의 반응 튜브에서 두 250 μL 샘플로 혼합 분할합니다.
- 산성 P / C가 / I 솔루션의 1 볼륨 (250 μL) (: 24 : - 5 (1), pH를 4.5 물 포화 페놀, 클로로포름, 펜탄에, 25의 비율)를 추가합니다.
참고 : P / C / I 솔루션, 발암 독성과 부식성. 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호 흄 후드를 이용하세요! - 3 분 - 1 소용돌이로 교반 플랫폼에 적극적으로 소용돌이 또는 장소.
- 15,000 ×의 g 및 4 ℃ - 13,000에서 30 분 동안 원심 분리기.
- 상단 (수성) 단계를 수집하고 신선한 튜브 (250 μL)에 전송합니다.
- 3 M 아세트산 나트륨의 pH 5.2의 1/9 용량 (28 μL)를 추가합니다.
- 순수 에탄올 (700 μL)의 2.5-3 볼륨을 추가합니다.
- 3 시간 - 30 분 동안 또는 2 -20 ° C에서 -80 ° C에서 곧 제자리로 소용돌이로 섞는다. 필요한 경우, -20 ° C에서 RNA O / N를 저장합니다.
- 15,000 ×의 g 및 4 ℃ - 13,000에서 60 분 - 30 원심 분리기.
- 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 펠렛에 70 % 에탄올 1 ㎖를 첨가하여 워시 펠릿. 소용돌이 샘플하지 마십시오.
- 15,000 × g에서 4 ° C - 13,000에서 5 분 동안 원심 분리기 샘플.
- 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 흄 후드 아래 공기 건조 펠렛. 필요 -20 ° CO에서 / N 경우 펠렛을 저장합니다.
- 2 분 동안 볼 텍싱에 의해 H 2 O 처리 30 μL의 DEPC에서 펠렛을 용해하고, 체육을 용해하기 위해이 솔루션을 사용샘플 당 대응하는 제 2 튜브의 llet (하나 추출 쌍 당 30 μL 용액).
- RNA 농도를 측정하고,이 평균적으로 표현의 mRNA의 프라이머 확장에 사용되는 1 ㎍ / μL를 초과 달성 할 수 있도록 지원합니다.
- 필요한 경우, 몇 달까지 몇 주 동안 -20 ° C에서 RNA를 저장합니다.
2. 뇌관 확장 반응
- 프라이머 디자인
참고 : 프라이머 확장 실험을 위해 프라이머를 설계 할 때, (수동은이 문서에서 더 많은 정보와 토론 섹션에 대한 자동화 된 젤 시퀀서를 동반 참조) PCR 프라이머 디자인의 일반 지침을 준수하십시오.- 즉, 프라이머는 (i) 염기의 런을 포함하지 않도록, (ii) 상기 3 '말단에 G 또는 C, 소지 (ⅲ) 균형 GC있다 : 비로, (ⅳ) 약의 어닐링 온도를 가지고 55 - 관심 영역의 하류 60 ° C 및 (V) 바인드 적어도 50 BP, 더 나은 100 BP는 선명한 이미지를받을 수 있습니다.
- 프라이머 확장 반응
참고 : 프라이머 확장 반응 (cDNA 합성은) 템플릿 RNA의 높은 금액을 필요로한다. 사용 된 RNA의 양은 로우로 선택되는 경우, 신호를 감지하기에 너무 낮을 수있다! 상기 한 바와 같이 따라서 우리는 RNA의 정화를 추천합니다.
참고 :주의 : 사용 된 RNase 무료 시약 및 플라스틱 제품을!- 95 ° C의 온도로 열 사이 클러를 데우고 사용 및 재현성 쉽게 열 사이 클러 모든 상기 배양 단계를 수행한다.
- 각각의 RNA 시료에 대한 PCR 튜브에 표 2에서 화합물을 혼합.
- 95 ° C에서 1 분 동안 샘플을 변성.
- RNA는 프라이머를 교배 5 분 동안 얼음과 진정에 튜브를 놓습니다.
- 47 ° C에 PCR 기계를 설정합니다.
- 표 3에 기재된 바와 같이 한편 역전사 마스터 믹스를 제조.
- 각각의 혼성 RNA에 역전사 마스터 믹스 4 μl를 추가샘플.
- 47 ° C에서 1 시간 동안 튜브를 품어. 주 : AMV RT위한 최적 온도는 42 ° C이며, 그러나보다 높은 온도는 RNA 분자의 이차 구조를 극복하는 데 도움.
- 2 분 동안 95 ° C로 샘플을 가열하여 반응을 정지.
참고 : 포름 아미드, 부식성 독성 및 태아에 유해 할 수 있습니다. 재료 안전 데이터 시트를 읽을 취급에주의하고 적절한 보호구를 착용하십시오! - 어둠 속에서 -20 ° C에서 O / N 및 저장 2 주 (/ V) 브로 모 페놀 블루 W 0.05 % (95 % (V / V) 탈 포름 아미드, 10 mM의 EDTA) 포름 아미드 로딩 염료의 6 μl를 추가합니다.
연속 사다리 3. 준비
참고 : 순서 사다리 반응은 플라스미드 또는 게놈 DNA의 많은 양의 적당한 양의를 필요로한다. 가능하다면, 시퀀스 반응에서 플라스미드의 사용으로 인해 단리 및 높은 SIG의 용이성 권장최종 강도. 다른 경우에, 우리는 일상적 E.로부터 게놈 DNA를 제조 Marmur 5,14에서 채택한 방법을 사용 대장균과 S. 필요없이 구균 세포는 페놀을 사용한다. 원칙적으로 높은 양의 게놈 DNA의 순도를 얻을 수있는 방법이 사용될 수있다.
- 게놈 DNA 분리
- E. 10 ml의 성장 대장균 또는 S. 구균 세포 O / LB, BM 5 또는 TSB 배지에서 N.
- 15 ㎖의 팔콘 튜브에 4,600 × g에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 세포.
- 일부 미니 준비 키트에 발견 2 ml의 버퍼 (P1)에 재현 탁 펠렛 (50 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 10 mM의 EDTA, 100 ㎍ / ㎖의의 RNase A).
- 40 μL의 lysostaphin (-20 ° C에서 0.5 ㎎ / ㎖, 저장) - (20) 60 분 - 45를 Lyse 세포. 참고 : E. 들어 콜라이 세포 효소 전처리를 생략 할 수 있거나, 라이소자임 사용.
- 서스펜션과 incubat에 (45 % 에탄올) 포화 SDS-용액 100 μl를 추가37 ℃에서 5 분 동안 전자.
- 650 ㎕의 5 M 차아 염소산 나트륨 4 간략 소용돌이 세포를 추가합니다.
NOTE : 클로로포름 발암 잠재력이다. 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호 흄 후드를 사용하십시오! - 혼합물에 (1 비율 24)과 적어도 60 초 동안 흔들어 클로로포름 / 펜탄의 3 ML을 추가합니다. 참고 : 액체가 균일 한 화이트 에멀젼으로 설정해야합니다.
- 상을 분리하기 위해 10 분에서 4,600 ×의 g 및 RT에 대한 샘플을 원심 분리기.
- 조심스럽게 새로운 튜브에 명확한 상단 (수성) 단계를 전송할 수 있습니다. 용액이 혼탁이면, 클로로포름 / 펜탄 추출을 반복한다. DNA 용액의 부피를 측정하고 에탄올 (100 %)의 2 볼륨으로 신선한 튜브를 준비한다.
- 천천히 캔트 또는 튜브를 함유하는 에탄올로 DNA 용액을 피펫. 참고 : DNA가 바닥하거나 완전히 탈수 떠있는 하얀 클러스터와에 투명, 조밀 한 코일을 침전한다.
- D 검색NA 유리 파스퇴르 피펫 (그림 2)에서 만든 후크를 사용하여 1 ml의 70 % 에탄올의 개별 튜브에 담가 두 번 각각의 샘플을 씻는다.
- 랙에 똑바로 후크를 놓고 공기를 60 분 동안 펠렛을 건조. 필요한 경우, 실온에서 며칠 동안 건조 된 DNA를 저장합니다.
- 500 μL의 DDH 2 O - DNA 커버 유리 고리를 끊고 (100)를 포함하는 2.0 ml의 반응 관에 배치하여 DNA를 용해 1500 NG / μL - 1000의 최종 DNA 농도에 볼륨을 조정합니다. 게놈 DNA의 18 μg의 - 하나의 염기 서열 반응의 경우, 10을 사용합니다.
그림 DNA 낚싯대를 만드는 방법 2. 명령어. 분젠 버너의 불꽃에 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 잡고. 이 t에 작은 고리를 만들어, 몇 초 후에 녹는 시작하는 유리의 원인그는 끝. 신속하게 불꽃에서 제거하고 1 분 동안 식힌다.
- 플라스미드 분리
- 표준 미니 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 준비하고 용출 버퍼 (10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5)에 용해. 하나 시퀀싱 사다리 대해 500 ng의 플라스미드 - 플라스미드 크기에 따라, 100을 사용.
- 생거 시퀀싱 반응
참고 : 프라이머 확장의 목적을 위해 잘 작동 7 아자 dGTP를 가진 형광 표지 된 프라이머 시퀀싱 키트를 사용하는 간단한 프로토콜 아래에서 보라. 자세한 내용은 시퀀싱 키트 설명서를 참조하십시오. 시퀀싱 반응이 동일한 길이의 제품을 만들기위한 프라이머 확장 반응과 동일한 프라이머를 사용하셔야합니다.- 1 μL DMSO 1 μL 형광 표지 된 프라이머 (/ μL 2 pmol의)와 - (15 μg의 ~ 10) 게놈 DNA의 12 μl를 섞는다.
- 네 개의 염기 서열 반응 혼합물 (A, C, G 또는 T)의 각 1 μL로, DNA / DMSO / 프라이머 믹스의 3 μl를 추가합니다. PCR 기계로 샘플을 놓고, 다음과 같은 PCR 프로그램을 실행시킵니다 2 분 동안 95 ° C를; 20 초, 20 초 동안 54 ° C, 30 초 동안 70 ° C, 95 ° C의 35주기; 4 ° C에서 영원히 유지.
- 실행 후, 컴퓨터에서 샘플을 제거 주에 몇 일 동안 얼음 (단기) 또는 -20 ° C에서에 로딩 염료 및 저장의 6 μl를 추가합니다.
4. 젤 설정 및 장치 실행
NOTE : 시퀀싱 겔 장치의 조립 방법에 관한 상세 정보는, 겔을 제조하는 방법과 겔이 실행은 제조사 프로토콜에서 찾을 수있다.
- 준비
- 표 4에 표시된대로 10 배 TBE를 준비합니다.
- 겔 런의 날 초순수 DDH 2 O.와 1X TBE 완충액 1 L를 조제
- 10 % (W / V) APS를 준비합니다. 주 : 몇 달 동안 -20 ° C에서 200 ㎕의 분취 액에 저장 될 수 있지만, 시간이 지남에 따라 활성이 저하 될 <./ 리>
- 겔 주조 챔버 어셈블리
- 유리판 사이에 먼지와 보풀을 피하십시오. 물티슈를 사용 따라서 철저하게 청소 작업 표면.
- 유리판의 내측에 대해 이소프로판올 후 양측에 일회용 종이 타월과 증류수를 사용하여 25cm의 유리판 쌍을 청소하고.
- (그림 3) 후면 유리 접시에 0.25 mm 스페이서를 배치하고 상단에있는 노치 유리판을 낮 춥니 다.
- 홈 부분을 유리판 위를 향 레일 항목 조종사의 양쪽에 젤 레일을 부착하고 가볍게 손잡이를 조입니다.
도 3은 겔 전기 영동 유리판 분해도. 유리 플레이트 방향성으로 사용되어야한다. 내측 유리판의 내측과 외측을 향하도록 조심바깥쪽으로.
도 4 겔 조립 장치의보기. 겔 용액을 주입 한 후, 포켓 스페이서 유리판 사이의 용액에 배치된다. 주조 플레이트는 전면 유리판과 겔 사이에서 슬라이드 레일과 레일 손잡이를 조임으로써 고정된다.
- 젤을 캐스팅
주 : 비 중합 된 아크릴 아마이드는 신경 독성입니다! 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호하고 사용하십시오!- 비커에 표 5에 열거 된 화합물을 추가하고 교반 막대와 자석 교반기를 이용하여 혼합한다.
- 즉시 APS와 TEMED를 추가 한 후, 50 ML의 주사기에서 겔 용액을 차지 끝에 0.45 nm의 필터를 배치합니다.
- 어느 한 손으로 유리 기판의 위쪽 가장자리를 잡거나 sandwic를 배치20 ° - 젤 캐스팅 시간 10 기울어 진 경사를 만들 서있다.
- 천천히 연속적으로 다른 한쪽에서 주사기 팁을 이동시키면서 유리 플레이트 사이 겔 용액을 조제하고, 겔 용액 하단부를 만족하면 정지.
- 측면으로 이동하거나 완전히 거품 후크를 사용하여 형성된 거품을 제거합니다.
- 홈 부분에서 유리판 사이 겔 포켓 스페이서 (0.25 mm)를 밀어, 겔 용액에 담그고 주조 플레이트를 장착하여 고정한다.
- 고정시킵니다 상부 레일 나사를 가볍게 (완전 조립 장치에 대한 그림 4 참조).
- 2 시간 - 1 젤 세트를 보자.
- 캐스팅 판과 주머니 스페이서를 제거하고 소금과 젤 잔류 물에서 주머니를 청소합니다.
- DDH 2 O 헹군 후 조직의 논문 과잉 솔루션을 닦아주십시오.
- 실행과 젤을 시각화
NOTE : 시퀀싱 겔 직접하면서 이미 저 겔에서 전기 영동을 실시형광 동시에 레이저 현미경에 의해 검출된다. 겔을 먼저 실행 한 후 염색 가시화 종래의 겔 전기 영동, 대조적으로, 상기 검출 유닛은 고정되고들이 레이저 통과 실시간 대역을 스캔한다. 최신 버전으로 채택 될 수 개략되어 OS / 2 ImagIR 데이터 수집 소프트웨어에 대한 절차 이하. 자세한 내용은 사용자 설명서를 참조하십시오.- 전면 유리 접시에 젤 레일에 버퍼 탱크 홀더를 밀어 넣고 손잡이를 조입니다.
- 가열 플레이트에 대한 자동화 된 젤 화상 카메라의 하단 젤 탱크에 젤을 놓고 장치 브래킷에 레일 항목 파일럿을 밀어 고정합니다.
- 전원 코드를 사용하여 전력 상부 버퍼 챔버 하부 버퍼 챔버를 닫고 연결 하부 및 상부 겔 버퍼 챔버로 1X TBE 버퍼를 채운다.
- 존재하는 경우, 반복적으로 주머니에 버퍼를 피펫 팅에 의해 소금 잔류 물에서 젤 주머니를 청소합니다.
- 상부 버퍼를 사용하여 뚜껑 상부 버퍼 탱크 챔버를 닫고.
- 기계의 문을 닫고 열 화상 카메라와 컴퓨터를 켜고 자료 ImagIR 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.
- 새 프로젝트 파일 (파일 -> 새로 만들기 ...)을 작성, 프로젝트 파일 이름을 입력 적절한 레이저 범위 (700 또는 800 nm의)를 선택하고 OK 버튼을 눌러 확인합니다.
- 옵션 -> 자동 이득 ... 상단 이미지 메뉴에서를 선택, 자동 이득 측정을 시작하고 확인을 클릭하여 설정을 적용하려면 자동을 클릭합니다.
- 초점 ... 스캐너 제어 메뉴에서 자동 버튼을 클릭하고 확인을 클릭하여 설정을 승인 -> 옵션을 선택하여 레이저 초점을 맞 춥니 다.
- 새로 초점 영역으로 조정하는 자동 이득의 절차를 반복합니다.
- 설정이 설정에 따라 스캐너 제어 : 2,000 V, 35mA, 45 W, 45 ° C, 검색 필터 : 3, 스캔 속도 : 3.
- 20 분 동안 빈 젤 (선택 전압 ON하고 Enter 키를 누릅니다 Prerun <ENTER>
). - 한편, 후, 90 ° C로 2 분 동안 PCR 기계에서 시퀀싱 사다리와 프라이머 신장 산물을 가열 얼음 냉각.
- , 전기 영동을 중지 자동화 젤 시퀀서를 열고 상단 버퍼 탱크 덮개를 제거합니다.
- 유리판 사이에 상어 치아 빗를 삽입하고 약간 상어 이빨을 가진 젤을 관통 (그림 5 참조).
그림 5. 확대 상어 치아 빗과 젤의보기. 샘플 (보라색)는 상어 이빨 사이에 적용된다.
- 피펫 중 1 - (상어 이빨에 의해 형성) 각 젤 주머니에 확장 제품 또는 순서 사다리 반응 프라이머의 2 μL.
- 모든 포켓이 필요한 경우에 방지하기 위해 로딩 염료 빈 주머니를 채우기일관된 실행 동작.
- 겔 시퀀서의 버퍼 탱크와 문을 닫습니다.
- 전기 영동을 시작하고 레이저 (선택 전압 및 레이저 ON를 눌러 켭니다
) <Enter> 키를 누르십시오. - 관심의 영역은 레이저를 통과하면 전기를 중지합니다.
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Representative Results
도 6에 도시 된 바와 같이, 프라이머 신장 반응 관심 사체의 전사 시작 포인트를 결정하는데 사용될 수 있고 (통상적으로 -10 -35 원소로 식별 됨) 프로모터 영역을 추론 할 수 있습니다. 최상위 (가장 긴)의 cDNA 단편의 mRNA의 5 '말단을 나타내며, 따라서 시퀀싱 사다리에 비해 용이하게 매핑 될 수있다.
프라이머 확장 반응의 그림 6. 대표 결과. 왼쪽에서 E. 전체 생체 프라이머 신장 겔 다양한 플라스미드와 대장균이 표시됩니다. 관심의 개별 영역이 확대됩니다. 상단 (A)에있어서, 전사로 ompA 시작점의 판정이 도시되어있다. 역전사는의 mRNA의 5 '말단에서 중지되므로 공업 (전체 길이의 RNA 밴드를 만들어) 화살표로 icated. 첨부 된 시퀀스에 도시 한 바와 같이 시퀀싱 사다리의 cDNA 밴드를 정렬함으로써, mRNA를 5 '말단을 결정할 수있다. 하부 부분 (B)에서, YoeB-seq2 RNA 분해 효소에 의해로 ompA 사체의 절단이 도시되어있다. 레인 - 1 부재와의 cDNA 제품의 존재와 일치, (5) 활성의 RNase와 샘플을 나타냅니다 - 3 4 차선 반면 독소 YoeB-seq2가 없거나 비활성화되어있는 샘플을 나타냅니다. 화살표로 표시된 바와 같이 두 가지 주요 절단 제품이 만들어집니다. 각 레인과 시퀀싱 사다리의 해당 RNA베이스에 사용 된 ddNTP가 표시됩니다. 성적 증명서 부품은 마젠타 글꼴로 코돈 블루 글꼴, 프로모터 요소와 8 월 시작으로 표시됩니다. 자세한 내용은; Nolle 등 알에서 원래 연구 문서를 참조하십시오., 미생물학 159, 1575-1585 (2013). 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.
도 6에 도시 된 예에서,로 ompA mRNA를 TSP는 (겔 아래 서열에서 화살표로 표시) G를베이스로 측정되었다. 이 15 전에 발표로 ompA TSP과 일치한다. 주제는 각각의 합의 시퀀스 (각각 TTGACA 및 TATAAT)에서 두 기지를 각각 다르기 때문에 프로모터의 -35과 -10 요소 TTGTAA과 TAGACT (16)로 추론 할 수있다.
이러한 5 'RACE 같은 다른 방법과는 대조적으로, 프라이머 신장 반응을 정확하게 결정하고 RNA 분자의 절단을 정량화하는데 사용될 수있다. RNA 분자의 쪼개짐 동시에 겔에서 cDNA를 밴드로 검출 할 수없는 5 '말단을 생성한다. 여러 개의 PCR 산물이 절단 제품을 얻기 위해 서열화되어야하기 때문에 하나의 mRNA를 여러 절단 제품 식별은, 5 'RACE 실험에서 더 어렵다만 총 (미처리) RNA 대량의 작은 분율을 나타낸다.
도 6의 하부에서의 RNase 의한 절단의 RNA 매핑이 도시된다. 앞서도 5의 RNase YoeB-seq2, S.에서 TA-시스템의 일부를 기술 한 바와 같이 17 equorum, 개시 코돈에 가까운 절단의 mRNA를. 이 절단은 동족 항 독소 YefM-seq2에 의해 억제 될 수있다. 된 RNase YoeB가 (레인 1 - 3)이 존재하지 않거나 비활성화 인 경우, 어떤 프라이머 신장 산물 가까이 개시 코돈에 형성되지 않는다. RNA 분해 효소 활동은 곧 하류 코돈이 나타 시작의 존재 (레인 4 & 5), 두 개의 강력한 밴드 때마다. 이 방법을 사용하여, 절단 패턴은 쉽게 식별 될 수있다.
그림 7은 실패 프라이머 확장 실험을 보여줍니다. 역전사 반응에 과량으로 RNA, cDNA를 발생량 같은 강한 신호를 생성으로 인해, 그 개인의 cDNA 밴드들과 구별 될 수 없다. 이는 5 'RNA 종료 판정이 불가능하게 만든다.
(도 7에 도시 된 바와 같이) 그러한 리보솜 RNA로서 프라이머 신장 반응에서 고도로 발현의 RNA를 사용하는 경우, 과다 노출 된 영역이 증가의 위험. 따라서, 총 주형 RNA의 양은 관심 RNA의 풍부함으로 조정되어야한다. 관심 사체 만 총 RNA의 소량을 구성 할 때 반대로, 역전사 반응의 양은 달리 신호가 너무 약한 것, 증가되어야한다 (미도시). 이것은 또한 더 강한 신호를 발생 (예 rRNA 유전자 또는 유전자 플라스미드 인 코드하는 유전자)를 셀당 다중 복제 템플릿으로, 생거 시퀀싱 반응에 적용된다.
그림 7에서 실패한 프라이머 확장의 대표 결과 NG> S. 구균. 16S RNA는 박테리아 세포에 매우 풍부하다. 총 RNA의 적당한 양을 사용하는 경우에 강한 역전사 신호에 리드. 여기에 도시 된 경우에는, 강한 cDNA를 밴드의 정확한 5 '말단을 방지하고, 따라서 5'마스크 매핑. 또한, 리보솜 RNA를 매우 구조화되어 있으므로 전체 길이 조각을 나타내지 않는 짧은 cDNA의 제품을 생산, 조기 역전사을 종료 할 수 있습니다. 내열성 역 전사 효소와 함께 역전사 승온이 경우에는 쉽게 과거 보조 구조물을 합성 할 수있다. 때문에 게놈 DNA의 시퀀스의 여러 사본에, 생거 시퀀싱 사다리 단일 복사본 유전자보다 강하다. 겔 영상을 향상시키기 위해, RNA 및 DNA는 역전사 금액 및 생거 반응은 감소되어야하고 / 이하인 제품이 겔에 적용._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : RNA의 DNase의 I 소화.
| 물질 | 양 |
| 위의 단계에서 RNA | 70-100 μg의 |
| 10 배의 DNase I 완충액 (100 mM 트리스, pH가 7.5, 25 mM의의 MgCl 2, 2 5mM의 염화칼슘) | 50 μL |
| DNase의 I,의 RNase 무료 (2 U / μL) | 10.0 μL (RNA의 최대 10 μg의의 DNase I의 1 μL 당) |
| DDH 2 O 500 μL에 볼륨을 가져와 (DEPC 치료) | |
DNase의의 반응 부피와 양이 나는 양의 O에 따라 스케일 업 또는 다운 될 수있다F RNA를 사용합니다.
표 2 : RNA-프라이머 하이브리드.
| 화합물 | 하나의 반응에 대한 금액 |
| RNA | 5-15 μg의 |
| 형광 표지 된 프라이머 | 2 pmol의 |
| DDH 6 μL로의 볼륨을 가져와 2 O (DEPC가 처리) | |
RNA 샘플 및 프라이머 당 하나의 반응을 설정합니다.
표 3 : 프라이머 확장 마스터 믹스.
| 화합물 | 하나의 반응에 대한 금액 |
| DDH 2 O (DEPC 치료) | 1.3 μL |
| AMV RT 버퍼 (10 배) | 1.0μL |
| 의 dNTPs (10 mM의,의 RNase 무료) | 1.0 μL |
| 의 RNase 억제제 | 0.2 μL |
| AMV 역전사 효소 (RT) (20-25 U / μL) | 0.5 μL |
필요한 반응의 수까지 확장 할 수 있습니다.
표 4 : 10 배 TBE 레시피.
| 물질 | 양 |
| 트리스 자료 | 107.8 g |
| 붕산 | 55.0 g |
| EDTA | 7.4 g |
| 먼지와 보풀을 제거하는 고순도 DDH 2 O 및 필터 1,000 ml의 볼륨을 가져와 | |
4 °에서 먼지와 보풀 및 저장소를 제거하기 위해 필터C.
표 5 : 시퀀싱 젤 레시피.
| 화합물 | 양 |
| 요소 | 10.5 g |
| DDH 2 O (MilliQ를) | 13.0 ml의 |
| 10 배 TBE | 2.5 ml의 |
| XL 빠른 젤 솔루션 | 5.0 ml의 |
| TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane -1,2- 디아민) | 25 μL |
| APS (황산 암모늄, 10 %) | 175 μL |
신속 TEMED 및 APS의 첨가 후 프로세스 겔 용액.
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Discussion
형광 프라이머 신장은 TSP- 또는 RNA 이차 가공 식별 어느 쪽의 RNA의 5 '말단을 결정하기위한 간단하고 신속한 방법이다. 때문에 형광 프라이머의 사용, 반응이 설정 될 수 있으며, (방사성 표지 된 프라이머 경우와 달리) 추가 보안 조치없이 실행합니다. 샘플은 형광으로 검출되는 바와 같이 전기 영동 X 선 필름은 일반적으로 사용되는 방사성 방법에 비해 신속한 분석을 허용 진행되는 동안, 이들은 이미징 될 수있다.
일반적으로, 프라이머 신장 반응의 품질 등급과 프라이머의 결합 능력에 크게 의존한다. 결합 부위가 관심 영역에 너무 가깝게 선택되면, 프라이머 도말 표본 신호를 마스크 할 수있다, 결합 부위 반면 너무 멀리 (> 300 염기쌍) 5 '말단에서 신호 불량이 발생할 수있다.
형광 염료는 공유 결합으로 연결되어 있어야합니다합성 올리고 뉴클레오티드 중 커스텀 DNA 올리고 뉴클레오티드의 5 '말단 잔류 염에 의해 역전사 반응으로 간섭을 방지하기 위해 HPLC로 정제한다. 적절한 염료 수정 (호환 염료에 대한 자세한 내용은 시약 목록 표 참조) 올리고 뉴클레오티드는 가장 올리고 뉴클레오티드 합성 회사에서 주문할 수 있으며, 어두운 곳에서 보관해야합니다. 방사성 동위 원소를 뉴클레오티드 가능합니다 불행하게도, 우리는 기존의 올리고 뉴클레오티드에 염료를 부착하는 효소 기술을 인식하지 못하고있다.
여기에 설명 시퀀싱 시스템에서, 두 개의 서로 다른 형광 염료들은 여기 같이 동시에 두 샘플을 검출하기 위해 (700 및 800 ㎚)를 사용하고 발광 스펙트럼은 구별 될 수있다. 별개 원래 제조업체 염료에서, 이러한 시약리스트에 표시된 다른 염료는 우수한 결과를 생산하는 데 사용될 수있다.
홍보를위한 또 다른 중요한 요소IMER 연장 반응은 RNA의 질과 양이다. 케어 그러한 AMV RT로서 역전사가 주형 (18)으로 DNA를 사용할 수 있으므로, DNA의 오염 물질을 제거하기 위해주의를 기울여야한다.
도 7에 도시 된 바와 같이, 겔 런 밴드의 검출 된 신호 강도는 역전사 반응에 사용 된 RNA 양에 의존한다. 이것은 샘플 내의 관심 존재 RNA의 비례 양에 따라, 총 RNA의 양을 조절하는 것이 필수적이다. 낮은 발현 RNA를 검출하기 어려울 수 있으므로,이 방법의 낮은 민감성도 단점 중 하나이다. 어떤 신호가 전혀 검출 할 수없는 경우, 총 RNA의 양이 증가 될 수 있거나 관심 RNA는 인위적 플라스미드에서 과발현 될 수있다.
프라이머 확장을 기반으로 형광 젤의 검출 감도는 프라이머 확장 (19)을 기반으로 32 P 33 P 방사성 동위 원소보다 낮은 요인 약 10 인. 그러나,이 단점은 겔 또는 역전사 반응에 사용되는 RNA 템플릿의 양을 증가시켜에로드 된 cDNA의 양을 조정함으로써 보상 될 수있다. 대부분의 경우, 감도가 양호한 결과 4,5- 충분히 높다. 짧은 노출 시간의 이점, 모세관 시퀀서 (3)와 조합하여 형광 프라이머를 사용하는 경우 방사성 프라이머 확장 비슷한 민감도보고되었다.
그들은 가용 기계, 프라이머, 사다리 반응, 가용성, 방사성 물질, 방사성 폐기물, 교육 및 개인 건강 보험의 폐기 작업을위한 실험실의 유지 보수 등 여러 가지 요인에 따라 달라로 프라이머 확장 기반의 형광 및 방사능 사이의 비교가 어려운 비용 . 형광 프라이머는 비 표지 된 표준 프라이머 (20 염기쌍)보다 약 5-10 배 더 비싸다. 그러나 이러한 프라이머는 적어도 사용될 수있다올해 훨씬 짧은 반감기를 가지고 32 P 표지 프라이머에 비해 (가능성이 몇 년). 다시 라벨 프라이머의 잦은 간격으로 새로운 방사성 물질의 필요성, 많은 시간과 비용이 소요된다. 프라이머의 동일한 세트가 장시간에 걸쳐 사용되는 경우, 형광 프라이머는 일반, 방사성 표지 된 프라이머보다 저렴하다. 주요 선정 된 포인트는 그러나 형광 시퀀서 또는 이미 저와 비용 효과되지 않을 수 있습니다 프라이머 확장의 목적으로 만이 장치를 구입을 할 것이다. 여기에 설명 된 방법은, 소지 또는 그러한 시스템에 대한 액세스 권한이 그룹보다는 흥미 롭다.
자동화 겔 시퀀서가없는 경우, 형광 검출을위한 다른 방법도 사용될 수있다. 이 경우에, 겔이 필요한 경우 건조시키고, 그 다음 형광 이미 저로 전송 표준 전기 영동 장치에서 실행할 수 (모델 FL 유사한있는 사용할atbed 스캐너). 실행 중에 젤을 가시화하는 장점이 손실 되더라도, 방사성 동위 원소의 사용은 실험자에 대해이 방법으로, 중요한 이점을 회피 할 수있다. 또한, 가능하다면, 모세관 시퀀서는 감도를 증가시키는 것이 도움이 될 수 분리 및 실시간 검출을 위해 사용될 수있다.
다양한 방법이 있지만이 방법은 종종 19 (불순물 제거) 샘플을 집중 cDNA의 침전 단계를 필요로 자동화 된 젤 시퀀싱 기계 또는 모세관 시퀀서와 형광 프라이머 확장자를 사용하는 방법에 대한 발표되었다. 여기에 제시된 방법에서, DNA 침전 따라서 준비 시간을 줄일 필요가 없다. 침전 절차의 불일치를 해소 할 수있는 반 - 정량적 샘플에서 RNA 분자의 양을 결정하기 위해 더 중요하지만,이 단계를 생략하는 것이 가능하다.
그것은 지적하지만 그되어야한다RNA 분자의 5 '말단, 프라이머 신장 반응에 맵핑 처리 차 단부 (전사 시작점)가 용이하게 구별 할 수는 없습니다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 적절한 컨트롤 실험의 세심한 계획이 필수적이다. 명백한 프로모터 서열은 전사의 시작점의 존재를 나타낼 수 있으며, 돌연변이 또는 삭제 프로모터 요소들은 다음의 cDNA 밴드를 폐지한다. 이러한 서열이 없거나 특정 컨센서스 서열이있는 경우 한편, 밴드 RNA의 처리에 의해 야기 될 수있다. 처리 효소가 알려져 정제 할 수 있으면, 시험 관내 프라이머 확장 전사로서, 명확화를 가져올 수 있고, 처리는 분리 될 수있다. 또한, (미처리 RNA 분자의 효소 보충 포함) 다른 방법 예를 들면 5 'RACE는 RNA 처리에서의 전사 개시 사이트를 구별하는 프라이머 확장을 보완 할 수있다.
목즉 프라이머 신장 방법은 종종 5 'RACE 및 S1 뉴 클레아 제 보호 어 세이, 따라서 그 유용성 때로는 심문 같은 다른 방법과 비교된다. 예를 들어 차세대 시퀀싱과 함께 RNAseq 기술 그러나 필요한 재정 부담과 bioinformatical 작업이 관심의 단일 RNA를위한 오히려 비 경제적 만들기의 TSP와 병렬로 RNA를 여러 처리 사이트를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 반면에, 5'-RACE은 저렴하고 결과를 분석하기 쉽지만 RNA를 여러 가지 또는 여러 전사 시작점으로 존재되어 처리되는 경우에, 제품은 복제되어야하며 후보 다량으로 시퀀싱 될 필요 관심의 RNA를 대표보기를 얻을 수 있습니다.
새로운 방법에도 불구하고 지난 몇 년 동안 제기하는 데에 따라서, 오늘날에도 프라이머 확장으로 인해 더욱 그러하다 사용, 저렴한 비용과 짧은 처리 시간의 용이성, 자신의 존재 이유가여기에 제시된 형광 기반의 방법.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I (RNase free) | Ambion (life technologies) | AM2222 | |
| FastPrep-24 Instrument | MPBio | 116004500 | |
| Fluorescently labeled primers | Biomers | n/a | 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna. |
| Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software | Li-Cor | Product discontinued | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Nuclease free water | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
| Plasmid mini preparation kit | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% Concentrate | USB | US75863 | |
| RNA STORAGE BUFFER | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720) |
| SUPERase•In RNase Inhibitor | Ambion (life technologies) | AM2696 | |
| Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol reagent | life technologies | 15596-026 | |
| Zirconia/Silica Beads 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
References
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