Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn

doi: 10.3791/52135 Published: April 10, 2015

Abstract

Forskning på biomaterialer og vevsteknologi ofte inneholder cellebasert in vitro undersøkelser, som krever innledende kjennskap til startcellenummer. Mens forskere ofte referere deres seeding tetthet dette betyr ikke nødvendigvis at det faktiske antall celler som har levd opp til det aktuelle materialet. Dette gjelder særlig for materialer, eller stillaser, som ikke dekker bunnen av standard cellekultur brønners plater. Denne studien undersøker til å feste seg av menneskelige stamceller seeded på et kjent nummer på elektrospunnede poly (ε-kaprolakton) garn etter fire timer i kultur. Elektrospunnede garn ble holdt innenfor flere forskjellige oppsett, inkludert bioreaktor fartøy roterende på 9 rpm, cellekultur inserts plassert i lav bindende brønners plater og polytetrafluoretylen (PTFE) trau plassert innenfor petriskåler. De to sistnevnte ble utsatt for enten statiske betingelser eller plassert på en risteplate (30 ° C, 5% CO2, ble plasseringen av de kimsatte celler bestemt ved celle DNA-analyse. Stillasene ble fjernet fra sine beholdere og plassert i lyseringsbuffer. Mediene fraksjonen ble likeledes fjernet og sentrifugert - supernatanten kastet og pellet brutt opp med lysisbuffer. Lyseringsbuffer ble tilsatt til hver beholder, eller i tillegg, og skrapet for å frigjøre eventuelle celler som kan være til stede. Cellen DNA-analyse bestemmes prosentandelen av celler som er tilstede i stillaset, media og brønn fraksjoner. Celleadhesjon var lav for alle eksperimentelle oppsett, med størst feste (30%) for garn holdes innenfor celledyrkningsinnsatser og utsatt for ristebevegelse. Denne studien øker bevisstheten til det faktiske antall celler som knytter seg til stillaser uavhengig av den angitte cellen seeding tetthet.

Introduction

Stillasene er rutinemessig blir utviklet og forsket for biomateriale og vev-tekniske applikasjoner. Som sådan, er de som vanligvis podet med celler og deres in vitro oppførsel karakterisert via assayer som bestemmer celleproliferasjon og cellenummeret, for eksempel. For eksperimenter som disse, er det viktig at den første celle nummer er kjent og forskere ofte oppgi seeding konsentrasjon i form av antall celler per ml eller cm2. Selv om dette er god praksis, spesielt for oppskalering formål, betyr det ikke høyde for det faktiske antall celler som holder seg til skafottet overflaten (som også er avhengig av klebende egenskaper biomateriale overflate 1). Dette gjelder spesielt for stillaser som ikke dekker hele undersiden av cellekultur brønn plate som cellene kan falle bort fra konstruksjonen, og, på grunn av den ofte statisk natur av forsøket, kan aldri komme tilbake i kontakt med materialet av interesten. Elektrospunnede fiberen garn er et godt eksempel på et stillas som ikke dekker bunnen av brønnen (figur 1A). I dette tilfellet bør lave bindings brønners plater som ikke er overflatebehandlet brukes til å forhindre celler fra å feste seg på platens overflate og følgelig forvrenger resultatene av en hvilken som helst godt basert assay.

Brønners plater er gjerne brukes for celle poding på stillasene, men de er ikke den eneste metode tilgjengelig. Roterende cellekultursystemer, en type bioreaktor utviklet av Life Sciences Division hos NASA i slutten av 1980-tallet, kan tilsvarende brukes til frø stillas innenfor en tredimensjonal (3D) miljø med simulert vektløshet. Denne typen bioreaktor er fortsatt et populært valg med forskere over hele verden og har blitt innlemmet i studier for cellesignale 2,3, stamceller 4,5 og tissue engineering 6,7. Det som gjør den roterende bioreaktor å foretrekke å brønners plater er vedlikeholdav en 3D-miljø, noe som bidrar til å hindre differensierte celler fra dedifferentiating, som ofte er tilfellet når de dyrkes i konvensjonelle 2D forhold 8.

Dette papiret undersøker forskjellige teknikker for poding humane stamceller på elektrospunnede poly (ε-kaprolakton) fibergarn som fremstilt i Bosworth et al., 9 for å maksimere den innledende antall celler som knytter seg til disse stillaser i en 4 timers periode. For 2D kultur, ble det garn sikkert avholdes innen brønnplater eller skreddersydde poly (tetrafluorethylen) (PTFE) trau og holdt under statiske forhold, eller ristes ved 30 rpm. For 3D-kultur, ble garn og celler avholdes innen reaktor fartøy roterende på 9 rpm.

Protocol

1.Scaffold Fabrikasjon og Sterilisering

  1. Oppløs PCL i 1,1,1,3,3,3-heksafluorisopropanol for å gi en 10% vekt / volum konsentrasjon. Som beskrevet i Bosworth et al, 9 electrospin polymerløsningen (parametere: 20 kV, 1 ml / time, 20 cm). Og samle innrettet fibre på kanten av en roterende dor (600 rpm). Med en skalpell fjerne båndet av innsamlet fiber og deretter kuttet i kortere lengder - 3 cm (for trau og roterende fartøy) og 4 cm (for cellekultur inserts) lengder.
  2. Ved hjelp av fine tang senk individuelle strimler i destillert vann og fjern.
  3. Holder begge ender mellom tommel og pekefinger; manuelt vri stripen inntil det ligner tråden.
  4. Kort senk denne tråden lignende stillas i destillert vann og legg på ren, ikke-fiberkort til tørk.
  5. Når det er tørt, enkeltvis i rene mikrosentrifugerør og tilsett 1 ml av 50% volum / volum etanol i destillert vann. Lukke lokkene og la stå i to4 timer.
    Merk: Utfør følgende trinnene under laminærstrømning:
  6. Plasser mikrosentrifugerør i en laminær strømningsskap og suge 50% v / v-løsning. Bytt ut med 1 ml 70% v / v etanol i destillert vann, nære lokk og la stå i 24 timer.
  7. Gjenta for 90% og 100% volum / volum etanol i destillert vann (1 ml volum).
  8. Vask Stillas to ganger med fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS), 24 hr per vask (2 x 1 ml).
  9. Fjern PBS og erstatte med en ml cellekulturmedier. Merk: Stillas er klar til bruk etter 24 timer.

2. Bestemme Stillas Surface Area og Antall Celler

  1. Ved hjelp av et lysmikroskop og bildebehandling, måle diameteren av elektrospunnede garnet langs sin lengde for å bestemme en middelverdi.
  2. Anta garnet til å være en sylindrisk stang og tilnærmet overflatearealet ved hjelp av:
  3. Hvor A = areal, r = radius og h = lengde
    Merk: flateareal ble beregnet til å være 18 902800 mikrometer to. Videre bør det bemerkes at den faktiske overflatearealet vil være større enn denne beregningen som garnet består av hundrevis av fine fibre, som vil øke overflatearealet. Følgelig et større antall celler skal kunne knytte til skafottet. Men dette påvirker ikke en direkte sammenligning mellom testgruppene blir gjort.
  4. Bestemme det maksimale antall celler som kan festes til den eksponerte overflaten av stillaset:
    Bemerk: Ved hjelp av et lysmikroskop og bildebehandling, ble diameteren av humane stamceller bestemt til å være 20 um (forutsatt at cellene er runde), og derfor i dette tilfelle antall celler = 60.200.

3. Stillas Set-up - Cell Culture Setter (figur 1A)

  1. Under laminær, åpne sterile 6-brønners cellekultur inserts og skille de kortere ringer med tenner fra de bredere ring organer.
  2. Ta ringen med tennene pekende oppover. Drapere ettav 4 cm stillasene over midten av ringen slik at den overlapper på begge sider. Ta ring kropp og posisjon over tann ring og stillaset og presse nedover gjør at stillaset holder seg i posisjon og ligger gjennom sentrum av innsatsen cellekultur.
  3. Plasser cellekulturinnsats med stillaset i brønnen av en 6-brønn, lav bindingsplaten.
  4. Tilsett 10 ml dyrkningsmedier til skafottet.

4. Stillas Oppsett - Trough (figur 1B)

  1. Under laminær strømning, sted poly (tetrafluoretylen) (PTFE) renner i individuelle petriskåler og tilsett 10 ml av kulturmedium til trauet.
  2. Bruk pinsett drapere en av de 3 cm stillasene i bunnen, slik at lengden ligger parallelt med bunnen er lengre kant.

5. Stillas Oppsett - bioreaktor Vessel (figur 1C)

  1. Under laminær strømning, dispensere 10 ml steril PBS gjennom bioreaktoren fartøyetshovedporten og la stå i 10 min.
  2. Ta av PBS og erstatte med 8 ml kulturmedier.
  3. Bruk pinsett, sette inn ett av de 3 cm stillasene inn i skipet via hovedporten.
  4. Steng av hovedporten.

6. Celletelling

  1. Kultur menneskelige stamceller (HMSC) stammer fra benmargen i henhold til produsentens protokoll opp til passering 4 før høsting.
  2. Aspirer media fra en 75 cm 2 kolbe inneholder hMSCs avledet fra benmarg (passasje 4, 80% confluency).
  3. Vask cellene med 10 ml steril PBS og aspirer.
  4. Tilsett 3 ml trypsin og inkuber i kolben ved 37 ° C, 5% CO2 inntil cellene har løsnet fra kolben overflate.
  5. Legg 7 ml dyrkningsmedier for å inaktivere enzymet og overføre denne totale volum (10 ml) i et sentrifugerør.
  6. Resuspender denne cellesuspensjon ved å pipettere opp og ned flere ganger for å homogent dispergere cellene innenformedia og begrense celle agglomerater (10 ml pipette).
  7. Fjern 20fil cellesuspensjon og overføring til en hemocytometer.
  8. Plasser hemocytometer under et lysmikroskop, og bildet på x10 objektiv.
  9. Fokus rutenettlinjene og telle antall celler i de 4 x 4 ruter i hvert hjørne av nettet og som faller i firkanten og de som krysser høyre eller nederste grenselinje. Teller for hvert sett av 4 x 4 ruter (4 tellinger per rutenett).
  10. Gjenta resuspensjon og celletall tre ganger (trinn 6.6 til 6.9).
  11. Beregne gjennomsnittlig celletall og bestemme volumet av mediet som er nødvendige for celle resuspensjon (cellekonsentrasjon 60 200 i 200 ul). For eksempel, bestemme gjennomsnittlig celletall fra hemocytometer og så bestemme det totale gjennomsnittlige antall celler fra de tre separate punkter. Multiplisere dette med 1 x 10 4 for å gi antallet av celler pr ml, og deretter multiplisere med det totale volum av cellesuspensjon for å gital antall celler. Bruk følgende ligning for å bestemme volumet av media som kreves for resuspensjon:
  12. Sentrifugere cellesuspensjonen ved 241 xg i 5 min.

7. Cell Seeding

  1. Aspirer media fra sentrifugert tube forlate cellen pellet og erstatte med den beregnede medievolumet.
  2. Resuspender cellene og mediet for en jevn blanding.
  3. Ved hjelp av en P200 Gilson pipette, langsomt dispensere 200 ul cellesuspensjon til hver stillaset ved å kjøre spissen av pipetten langs stillaset lengde og under media væskeoverflaten. La uforstyrret i 20 min.
  4. For bioreaktor fartøy, dispensere 200 ul cellesuspensjon gjennom hovedporten. Fyll opp de resterende 2 ml kulturmedium via sprøyte porter for å gi et totalt volum på 10 ml.

8. Experimental start

  1. Overfør bioreaktor fartøy til RCC-4DQ bioreaktor og satt til å rotere på 9 rpm.
  2. Transfer brønnplatene med celledyrkningsinnsatser og fordypninger på risteplaten og satt til å rotere ved 30 rpm.
  3. Overfør brønners plater med celledyrkningsinnsatser og fordypninger til sokkelen av en celle inkubator innstilt på 37 ° C, 5% CO2 (statisk kultur).

9. DNA-analyse

  1. Forberede løsninger - lysis buffer, 1x TE buffer, DNA-standarder og celle DNA arbeidsløsning - i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Etter 4 timer, fjerne prøvene fra inkubatoren og plassere under laminær strømning.
  3. Fjern medie fraksjoner fra alle prøvene og plasser i separat merket sentrifugerør. Sentrifuger rørene 241 xg. Fjern supernatanten og tilsett 3 ml lysisbuffer. Resuspender oppløsningen for å bryte opp celle-pellet.
  4. Bruk pinsett fjerne stillasene og sted i sentrifugerør som inneholder 3 ml lysisbuffer (for stillasene innenfor bioreaktor fartøy, fjerne stillaset før aspirere til megdia). For stillaser holdt innenfor cellekultur inserts, først frigjøre stillaset ved å kutte stillaset nær innsatsen kanten ved hjelp av en skalpell.
  5. Tilsett 3 ml lysisbuffer til hver stillas mottaket og skrape overflaten (kraftig agitere for bioreaktor fartøy). Ta av lysisbuffer og plasser i separat merket sentrifugerør.
  6. Vortex hvert sentrifugerør i omtrent 1 min for å sikre tilstrekkelig omrøring av cellene og bufre og å fremme lysis av cellemembranen.
  7. I en svart 96 brønners plate, tilsett 100 mL av lysis buffer for hver prøve brøkdel - stillaset, media og godt (duplisere).
  8. I mørke, tilsett 100 ul av celle DNA-løsningen til alle brønner inneholdende lyseringsbuffer, og bland forsiktig.
  9. Omfatte brønner med lysis buffer som inneholder ikke DNA og celle-DNA-løsningen for å tilveiebringe en negativ og positiv kontroll for brønnplate.
  10. Ved anvendelse av en fluorescens plateleser, måle absorbansen av brønns ved 485 nm eksitasjon og 520 nm utslipp.
  11. Sammenligne data med standard kurve generert fra DNA-standarder i henhold til produsentens instruksjoner.

10. elektronmikroskop (SEM) Fiksering

  1. Utfør følgende trinn i henhold laminærstrømning: Etter 4 timer, fjerne alle stillasene fra sine beholdere og sted innenfor en ny seks-brønns plate (separate brønner).
  2. Vask stillasene to ganger med PBS.
  3. Utfør følgende trinn på den åpne benk: Til hver brønn, tilsett 2 ml 1,5% v / v glutaraldehyd i PBS for å sikre full dekning av stillaset.
  4. La platen for minst 30 min ved 4 ° C i cellefiksering.
  5. Fjern fiksativ løsningen og vask stillasene to ganger med PBS.
  6. Dehydrere stillasene med økende konsentrasjoner av etanol i destillert vann som starter med 50% volum / volum, etterfulgt av 70% volum / volum og 90% volum / volum. For hver konsentrasjon, fullt submerse stillasene i løsning;n (2 ml) og la stå i 3 min. Kast løsningen og gjenta.
  7. Dehydrerer i 100% etanol ved fullt oppslukt stillasene i løsning (2 ml) og forlater for 5 min. Kast løsningen og gjenta.
  8. Kjemisk tørke stillasene ved hjelp heksametyldisilasan (HMDS) innenfor et avtrekksskap. Fordype stillasene i HMDS (2 ml) og la stå i 5 min. Fjerne HMDS og gjenta.
  9. Fjerne HMDS og la stillasene tørke. Montere stillasene på kommersielt tilgjengelige SEM stubber (i dette tilfellet rustfritt stål stubber med selvklebende karbon tabs).
  10. For å lette visning i SEM, for å belegge prøvene ved hjelp av en gull-frese coater for 2 min sikre en tynn og jevn dekning.
  11. Plasser prøver innen SEM og visualisere cellen foret stillas ved hjelp av en 5 KeV elektronstråle.

Representative Results

Resultatene markere plasseringen av celler etter 4 timer etter såing for hver eksperimentelle oppsettet undersøkt. Figur 2A viser prosentandelen av celler som har festet til stillaset overflaten i løpet av denne tiden. En omregningsfaktor på 8,5 pg / celle ble benyttet for å omdanne den målte DNA-innhold i celletall og dermed bestemme prosentandelen av celler 10. For alle seeding set-ups etterforsket, er prosentandelen av cellebinding relativt lav, med størst celle etterlevelse (30%) for stillaser holdes innenfor cellekultur inserts og ristet på 30 rpm (Sett Shaker). Laveste etterlevelse (15%) var for stillaser holdt innenfor cellekultur inserts og holdt under statiske forhold (Sett Statiske).

Et stort antall celler som var til stede i medie fraksjon (figur 2B), særlig for celledyrkningsinnsatser holdes innenfor lave bindingsplater (Sett Statiske) og roterende fartøy som er 50% og 51%henholdsvis. Stillasene holdes innenfor trauene vist en hevet antall celler som er tilstede i selve holderen - 48% av cellene for gjennomgangs Shaker og 50% for gjennomgangs Statisk.

Scanning elektronmikroskopi tillot en visuell vurdering av celle foret stillas (figur 3). Representative bilder markert en begrenset tilstedeværelse av celler på den fibrøse overflaten, uavhengig av seeding oppsett. Men et større antall celler og celle agglomerater var tilstede på stillasene holdes innenfor celledyrkningsinnsatser og ristet ved 30 rpm (Sett Shaker).

Figur 1
Figur 1. Eksperimentelle Set-ups, hvor elektrospunnede Garn holdes innenfor; (A) celledyrkningsinnsatser og lav bindings brønn plate, (b) poly (tetrafluoretylen) (PTFE) rennen og petriskål; og (C) bioreaktor fartøy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Plassering av Cells 4 timers Post-seeding over på PCL elektrospunnede Garn bruke forskjellige Seeding Set-ups. (A) påviser prosentandelen av celler som har festet til PCL stillaset (gjennomsnitt ± standardavvik), (B) belyser den prosentvise spredning av celle plassering i de tre fraksjoner - medier, vel og stillaset (n = 4, data presentert som gjennomsnittsverdier). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3

Figur 3. Representative Scanning elektronmikroskopi for PCL elektrospunnede Garn med menneskelige stamceller, 4 timer etter Initial Seeding bruker forskjellige forsøksoppsett. (Alle bildene på 1,000X forstørrelse, skala bar = 130 mikrometer.) Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

Elektrospunnede fiber matriser fabrikkert fra biopolymerer blir jevnlig brukt til å støtte cellebinding og spredning for biomateriale og / eller vev tekniske applikasjoner 11,12. I disse tilfellene matrisene er ofte tynne ark av fibre som lett dekker hele undersiden av en cellekultur brønn plate og således er i fullstendig kontakt med seeded celler som forbedrer cellefesting. Men hvis biomaterialet stillaset ikke fullt ut dekker bunnen av brønnen plate, er det en høy sannsynlighet for at en stor andel av de kimsatte celler ikke vil være i kontakt med stillaset, og til slutt vil ikke være i stand til å feste. Denne studien undersøkte flere forskjellige metoder for såing av cellene på stillaser som ikke dekker bunnen av brønnplaten, for å bestemme en optimalisert teknikk som kan være anbefalt for fremtidige cellebaserte forsøk.

Fem forskjellige oppsett ble undersøkt (figur 1): scaffolds (elektrospunnede garn) holdt ved hjelp av cellekultur inserts innen lave bindende brønners plater og enten holdt under statiske forhold eller ristes ved 30 rpm; stillasene plassert innenfor trange PTFE trau og holdt statisk eller rystet ved 30 rpm; og stillaser plassert inne bioreaktor fartøy roterende på 9 rpm. Bestemme antall celler som hadde levd opp til de elektrospunnede garn av DNA-analysen viste en lav prosentandel av vedlegg for alle seeding set-ups (figur 2); og dette ble ytterligere bekreftet i scanning elektronmikrografer (SEM) (figur 3). Greatest celle vedlegg - 30% eller ~ 18 060 celler -ble observert for garn som ble holdt innenfor cellekultur inserts og utsatt for kontinuerlig bevegelse. Interessant nok var laveste cellebinding (15%) oppnådde for garn holdt av cellekultur inserts men holdt under statiske forhold, noe som skulle tilsi at inkludering av radial bevegelse har en positiv effekt på å holde cellene i kontakt med stillaset. ImidlertidDet bør bemerkes at kontinuerlig sirkle av medienes flyt kan være ansvarlig for celle agglomerater observert fra SEM bilder. Shaker plate ble satt på sitt laveste innstilling - 30 rpm - noe som kan være en begrensning til dette oppsettet. Ved hjelp av en tregere radial bevegelse kan bidra til å forebygge eller redusere celle tettbebyggelse og kan også forbedre celle vedlegg som celler vil oppleve mindre kraft. Fremtidige eksperimenter bør fokusere på å optimalisere den ideelle shaker hastighet for økt celle vedlegg. Innlemming bevegelse for garn holdes innenfor rennene resulterte ikke i en lignende trend, med begge scenarier som gir 18% vedlegg (~ 10 836 celler); selv om dette kan være på grunn av den partielle flyte av stillasene innenfor rennene (observert for trau plassert på risteplaten) som de ikke var forankret til bunnen. Delvis flytende av stillaset vil hindre eventuelle celler som har sunket til bunnen av rennen fra å komme i kontakt med materialet og klebende. For tsin spesielle oppsett, trauet ble plassert i en petriskål og et totalt 10 ml volum av mediet tilsatt. De små dimensjoner av trauet betyr at størstedelen av mediet er til stede i petriskålen, og hvis det ikke er noen bevegelse, kan cellene drive bort fra rennen inn i petriskål og forblir fullstendig utilgjengelig for stillaset. For å overvinne disse begrensningene, bør ytterligere eksperimenter er et ekstra trinn i protokollen, hvorved endene av stillasene er festet til bunnen av trauene ved hjelp av sterile fine nåler, da dette skal hindre deres flyteevne og bevegelighet (særlig for stillaser utsatt for radial bevegelse), som til slutt skal føre til et økt antall celler som knytter seg til skafottet. 16% av cellene hadde festet til trådene er tilstede i de roterende fartøy. Til tross for at et veletablert teknikk for 3D kultur, problemer gjorde oppstå med fjerning av stillas fra fartøyenes hovedhavn, som kan ha resultert i løst AttacHed celler går tapt. Fartøy som kan åpnes helt ville eliminere dette problemet; disse er tilgjengelig for kjøp, men er betydelig mer kostbart enn den kasserbare fartøy som brukes i denne undersøkelsen.

Denne studien viser de aktuelle problemstillinger med seeding stillaser som ikke dekker hele bunnen av standard cellekultur brønners plater. Seeding en kjent celle nummer resulterte i mindre enn en tredjedel feste til skafottet, til tross for stillaset areal slik at for alle celler for å overholde. Dette kan ha uheldige konsekvenser i andre cellebaserte analyser som kan vurdere den biokompatibilitet og celle-materiell / celle-celle atferd og interaksjoner med stillaset som en potensiell fremtidig medisinsk enhet. Ytterligere begrensninger av studien kan omfatte fire timers tidspunkts - til tross for å være lang nok til å sikre innledende celle seeding (celler har vist seg å fast feste til substrater i løpet av tretti minutter 13,14,15), kan det være rimelig å ivestigate senere tidspunkter som gir cellene ikke sprer under en lengre tidsramme som dette ellers ville forskyve startcellen nummer. Å redusere volumet av mediet, i dette tilfelle 10 ml, kan også forbedre kontakt mellom cellene og stillaset, og til slutt øke cellefesting. Fremtidige studier bør også vurdere celle levedyktighet som prosessen med celle seeding kan forårsake celleskader og / eller celledød 16. Celle DNA-analyser ikke skiller mellom levedyktige og ikke-levedyktige celler, som en slik levende / døde assay, for eksempel, vil markere nivået av levedyktighet.

Denne undersøkelsen øker bevisstheten til det faktiske antall celler som festes til stillaset tross seeding en kjent mengde. For studier som er avhengige av start antall celler, er det svært viktig at forskerne vet nøyaktig hvor mange av at figuren gjør faktisk holder seg til underlaget av interesse.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke og erkjenne Medical Research Council for finansierer denne forskningen - MRC-FAP stipend kode G1000788-98812.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water in-house supply n/a
Ethanol Merck 1117271000
Phosphate Buffered Saline solution Life Technologies 70013016
Human mesenchymal stem cells PromoCell GmbH C-12974
MSC culture media PromoCell GmbH C-28010B Warmed to 37 oC before use
Supplement mix PromoCell GmbH C-39810 Add to culture media
Antibiotic/antimyotic mix Sigma-Aldrich A5955 Add to culture media
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) Sigma-Aldrich 59417C Warmed to 37 °C before use
Cell culture flasks (T75) Becton Dickinson Ltd 353110
Low binding 6-well plates Costar Corning 3471
6-well CellCrowns Scaffdex C00003S
Petri-dish 50 ml deep Sterilin 124
PTFE troughs in-house production n/a
Disposable RCCS vessels 10 ml Synthecon D-410
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor Synthecon RCCS-4DQ
Shaker plate Stuart SSM1 Mini Orbital Shaker
Haemocytometer Digital Bio DHC-F01 Disposable C-Chip
Centrifuge tube Deltalab 352096, 429901 15 ml and 50 ml
Centrifuge Hettich Rotafix 32 A
Syringe 3 ml Shield Medicare Ltd 3039820
Pipettes Sterilin 40305, 47310, 40125 5, 10 and 25 ml
Gilson pipettes SLS F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 P2 - P1000
Pipette tips SLS PIP7852, PIP7834, PIP7840
Micro test tube 1.5 ml Eppendorf 30125.15
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
PicoGreen Assay Invitrogen P7589 Assay set-up in the dark
Black 96-well plate Greiner Bio One 655086
Fluorescent plate-reader BGM Labtech FLUOstar Optima
Glutaraldehyde 25% TAAB Laboratories G002 Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 999-97-3
Aluminium stubs (SEM) Agar Scientific G301
Carbon tabs (SEM) Agar Scientific G3347N
Gold sputter coater Edwards S150B
Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom World Phenom Pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jauregui, H. O. Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells. ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33, (2), 66-74 (1986).
  2. Puca, A., Russo, G., Giordano, A. Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's. Oncotarget. 3, (4), 426 (2012).
  3. Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway. Annals of biomedical engineering. 33, (10), 1405-1410 (2005).
  4. Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Cellular Reprogramming. 15, (5), 443-458 (2013).
  5. Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Molecular biotechnology. 54, (2), 331-336 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (21-22), 2376-2385 (2012).
  7. Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering. Clinical Orthopaedics and Related Research. 471, (8), 2422-2433 (2013).
  8. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281, (1), F12-F25 (2001).
  9. Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24, (6), 1605-1614 (2011).
  10. Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (7-8), 757-767 (2011).
  11. Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels. Biomaterials. 35, (9), 2713-2719 (2014).
  12. Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro. Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).
  13. Yavin, E., Yavin, Z. Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface. The Journal of cell biology. 62, (2), 540-546 (1974).
  14. Chen, H. Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91, (21), 10148-10152 (1994).
  15. Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell. 58, (5), 933-943 (1989).
  16. Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnology and bioengineering. 64, (5), 580-589 (1999).
Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).More

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter