Abstract
Forskning i biomaterialer og tissue engineering omfatter ofte cellebaserede in vitro undersøgelser, som kræver indledende kendskab til start celletal. Mens forskere almindeligvis henvise deres seeding tæthed dette betyder ikke nødvendigvis, det faktiske antal celler, som har tiltrådt det pågældende materiale. Dette er især tilfældet for materialer, eller stilladser, der ikke dækker bunden af standard cellekultur brøndsplader. Denne undersøgelse undersøger den oprindelige binding af humane mesenkymale stamceller podet ved et kendt antal på elektrospindes poly (ε-caprolacton) garn efter 4 timer i kultur. Elektrospundne garn blev holdt inden for flere forskellige opsætninger, herunder bioreaktor fartøjer roterende på 9 rpm, cellekultur skær placeret i lave bindende brønde og polytetrafluorethylen (PTFE) trug placeret inden petriskåle. De to sidstnævnte blev udsat for enten statiske betingelser eller anbringes på et rysteapparat (30 37 ° C, 5% CO 2 blev placeringen af sederede celler bestemt ved celle-DNA-assay. Stilladser blev fjernet fra deres containere og placeres i lysisbuffer. Fraktion Mediet blev ligeledes fjernet og centrifugeret - supernatanten blev kasseret og pellet brudt op med lysisbuffer. Lysis buffer blev tilsat til hver beholder, eller godt, og skrabet for at frigøre eventuelle celler, der kan være til stede. Den celle-DNA-assay bestemmes procentdelen af celler til stede i stilladset, medier og godt fraktioner. Cellebinding var lav for alle eksperimentelle set-ups, med størst tilknytning (30%) for garn, der holdes inden cellekultur skær og underkastet ryste bevægelse. Denne undersøgelse skaber opmærksomhed til det faktiske antal af celler knyttet til stilladser uanset den angivne cellepodning tæthed.
Introduction
Stilladser rutinemæssigt udvikles og forsket i biomateriale og vævsmanipulering applikationer. Som sådan er de sædvanligvis podet med celler og deres in vitro adfærd kendetegnet via assays, der bestemmer celleproliferation og celleantal, f.eks. For eksperimenter som disse, er det bydende nødvendigt, at den oprindelige celle nummer er kendt og forskere ofte angiver koncentrationen såning med hensyn til antallet af celler pr ml eller cm2. Mens dette er god praksis, især til opskalering formål, betyder det ikke højde for det faktiske antal celler, som klæber til stillads overflade (som også er afhængig af klæbeegenskaber biomaterialeoverfladen 1). Dette er især sandt for stillads, som ikke dækker hele bunden af cellekultur brøndsplade som celler kan falde væk fra konstruktionen, og på grund af den ofte statiske karakter af eksperimentet, kan aldrig komme tilbage i kontakt med materialet af intehvile. Elektrospundne fibergarner er et godt eksempel på et stillads, der ikke dækker bunden af brønden (figur 1A). I dette tilfælde bør lave bindende brøndsplader som ikke har været overfladebehandlet anvendes til at forhindre celler i at hæfte på pladens overflade og dermed fordreje resultaterne af en godt assay.
Brøndsplader let anvendes til cellepodning på stilladser, men de er ikke den eneste metode til rådighed. Rotary celledyrkningssystemer, en type bioreaktor udviklet af Life Sciences Division at NASA i slutningen af 1980, kan ligeledes anvendes til at pode stilladser inden for en tre-dimensionelle (3D) miljø med simuleret vægtløshed. Denne type bioreaktor er stadig et populært valg med forskere fra hele verden og er blevet indarbejdet i undersøgelser for celle signalering 2,3 stamceller 4,5 og tissue engineering 6,7. Hvad gør roterende bioreaktor foretrække at brøndsplader er opretholdelsenaf et 3D-miljø, som hjælper med at forhindre differentierede celler fra dedifferentiating, som det ofte er tilfældet, når de dyrkes i konventionelle 2D betingelser 8.
Dette papir undersøger forskellige teknikker til podning humane mesenchymale stamceller på elektrospundet poly (ε-caprolacton) fibergarner som fremstillet i Bosworth et al., 9 for at maksimere det oprindelige antal af celler knyttet til disse scaffolds inden for en 4 timers periode. For 2D kultur blev garn holdes sikkert i brønde eller skræddersyet poly (tetrafluorethylen) (PTFE) trug og holdes under statiske betingelser, eller rystet ved 30 rpm. For 3D kultur blev garn og celler holdes inden bioreaktor fartøjer roterende på 9 rpm.
Protocol
1.Scaffold Fabrikation og Sterilisation
- Opløs PCL i 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol at give en 10% w / v koncentration. Som beskrevet i Bosworth et al, 9 electrospin polymeropløsningen (parametre: 20 kV, 1 ml / time, 20 cm). Og indsamle justeret fibre på kanten af en roterende dorn (600 rpm). Med en skalpel fjerne båndet af indsamlet fiber og derefter skåret i kortere længder - 3 cm (for trug og roterende fartøjer) og 4 cm (for cellekultur indsætter) længder.
- Brug af fine pincet dykke enkelte strimler i destilleret vand og fjern.
- Holding begge ender mellem tommel- og pegefinger; manuelt sno båndet, indtil den ligner tråd.
- Kort oversvømme denne tråd-lignende stillads i destilleret vand og sted på ren, der ikke er fibre kort til tørre.
- Når det er tørt, sted individuelt i rene mikrocentrifugerør og der tilsættes 1 ml 50% v / v ethanol i destilleret vand. Luk låg og henstår i 24 timer.
Bemærk: Udfør følgende trin under laminar flow: - Placer mikrocentrifugerør i en laminar strømning opsuges 50% v / v opløsning. Udskift med 1 ml 70% v / v ethanol i destilleret vand, tæt låg og henstår i 24 timer.
- Gentag for 90% og 100% v / v ethanol i destilleret vand (1 ml volumener).
- Wash scaffolds to gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS), 24 timers per vask (2 x 1 ml).
- Fjern PBS og erstatte med 1 ml cellekultur medier. Bemærk: Stilladser er klar til brug efter 24 timer.
2. Bestemmelse Stillads areal og Antal Celler
- Ved hjælp af et lysmikroskop og imaging software, måle diameteren af garnet elektrospundet langs sin længde for at bestemme en middelværdi.
- Antag garnet til at være en cylindrisk stav og tilnærme overfladearealet med:
- Hvor A = Areal, r = radius og h = længde
Bemærk: Overfladearealet blev beregnet til 18.902800 um 2. Endvidere skal det bemærkes, at den faktiske overfladeareal vil være større end denne beregning som garnet består af hundredvis af fine fibre, hvilket vil øge overfladearealet. Derfor et større antal celler skal kunne knytte til skafottet. Det betyder dog ikke påvirke en direkte sammenligning mellem testgrupper, der gøres. - Bestem den maksimale antal celler, der kan fastgøres til den eksponerede stillads overflade ved:
Bemærk: Brug af et lysmikroskop og billedbehandlingssoftware blev diameteren af humane mesenkymale stamceller bestemt til at være 20 pm (under forudsætning af celler er runde), derfor i denne sag, antal celler = 60.200.
3. Scaffold Set-up - Cell Culture Inserts (figur 1A)
- Under laminar strømning, åbne sterile 6 brønde cellekultur indsætter og adskille kortere ringe med tænder fra bredere ringmærket organer.
- Tag ringen med tænderne pegende opad. Drapere enaf de 4 cm stilladser over midten af ringen at sikre den overlapper på begge sider. Tag omgivet legeme og position over tandkransen og stillads og skub nedad at sikre stilladset forbliver i position og ligger gennem centrum af celledyrkningsinsert.
- Placer celledyrkningsinsert med stillads i brønden af en 6-brønds, lav binding plade.
- Der tilsættes 10 ml dyrkningsmedier til skafottet.
4. Stillads opsætning - Trough (figur 1B)
- Under laminar strømning, sted poly (tetrafluorethylen) (PTFE) trug i individuelle petriskåle og der tilsættes 10 ml af dyrkningsmedier til truget.
- Brug pincet drapere en af de 3 cm stilladser i truget, og sørg for dens længde ligger parallelt med truget er længere kant.
5. Stillads Opsætning - bioreaktor Vessel (Figur 1C)
- Under laminar flow, dispensere 10 ml sterilt PBS gennem bioreaktoren fartøjetsvigtigste havn, og lad i 10 minutter.
- Fjern PBS og erstatte med 8 ml dyrkningsmedier.
- Ved hjælp af en pincet, indsætte en af de 3 cm stilladser ind i beholderen via den vigtigste havn.
- Luk ud for den vigtigste havn.
6. celletælling
- Kultur humane mesenchymale stamceller (hMSC) afledt fra knoglemarv ifølge producentens protokol op til passagen 4 før høst.
- Aspirer mediet fra en 75 cm 2-kolbe indeholdende hMSC'er afledt af knoglemarv (passage 4, 80% konfluens).
- Vask cellerne med 10 ml sterilt PBS og aspirat.
- Tilsæt 3 ml trypsin og inkuberes kolben ved 37 ° C, 5% CO 2, indtil cellerne er løsnet fra kolben overflade.
- Tilføj 7 ml dyrkningsmedier for at inaktivere enzymet og overføre denne samlede mængde (10 ml) til et centrifugerør.
- Denne cellesuspension Resuspender ved pipettering op og ned flere gange for at homogent at dispergere celler imedier og begrænse celle agglomerater (10 ml pipette).
- Fjern 20 pi cellesuspension og overførsel til et hæmocytometer.
- Placer hæmocytometer under et lysmikroskop og billedet på x10 objektiv.
- Fokus gitterlinjer og tælle antallet af celler i de 4 x 4 firkanter i hvert hjørne af nettet, og som falder ind under det firkantede og dem, der krydser højre eller nederste grænse linje. Tæl for hvert sæt af 4 x 4 firkanter (4 tællinger pr gitter).
- Gentag resuspension og celletal tre gange (trin 6,6-6,9).
- Beregn den gennemsnitlige celletal og bestemme mængden af medier, der er nødvendige for celle resuspension (celle koncentration 60.200 i 200 ul). For eksempel bestemme den gennemsnitlige celletal fra hæmocytometer og derefter bestemme den samlede gennemsnitlige antal af celler fra de tre separate tællinger. Multipliceres med 1 x 10 4 til opnåelse antal celler pr ml og derefter gange med det samlede volumen af cellesuspension at givetal antallet af celler. Brug følgende ligning til at bestemme mængden af medier, der er nødvendige for resuspension:
- Centrifugeres cellesuspensionen ved 241 xg i 5 min.
7. cellepodning
- Aspirer mediet fra den centrifugerede rør forlader cellepelleten og erstatte med medierne volumen beregnes.
- Resuspender cellerne og mediet for en endnu blandes.
- Ved hjælp af en P200 Gilson pipette langsomt dispensere 200 pi cellesuspension på hver stillads ved at køre spidsen af pipetten langs stilladset længde og under medierne væskeoverfladen. Henstår i 20 min.
- For bioreaktor fartøjer, dispensere 200 pi cellesuspension gennem den vigtigste havn. Top-up de resterende 2 ml dyrkningsmedier via sprøjte havne for at give et totalt volumen på 10 ml.
8. Eksperimentel Start
- Overfør bioreaktoren fartøjer til RCCS-4DQ bioreaktor og indstillet til at rotere med 9 rpm.
- TranSfer de brønde med cellekultur skær og trug til shaker plade og sat til at rotere med 30 rpm.
- Overfør brøndsplader med cellekultur skær og trug til hylden af en celle inkubator indstillet til 37 ° C, 5% CO 2 (statisk kultur).
9. DNA-analyse
- Forbered løsninger - lysis buffer, 1x TE-buffer, DNA standarder og celle-DNA arbejdsopløsning - i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Efter 4 timer, fjerne prøverne fra inkubatoren og sted under laminar strømning.
- Fjern mediet fraktioner fra alle prøver og placere i særskilt mærkede centrifugerør. Centrifuger rørene 241 xg. Fjern supernatanten og tilsæt 3 ml lysisbuffer. Resuspender opløsningen til at bryde op cellepelleten.
- Brug pincet fjerne stilladser og sted i centrifugerør indeholdende 3 ml lysisbuffer (for stilladser i bioreaktoren fartøjer, fjerne stilladset før opsugning af migdia). For stilladser holdes inden cellekultur skær, først frigøre stilladset ved at skære stilladset tæt til indsatsen kant ved hjælp af en skalpel.
- Tilsæt 3 ml lyseringsbuffer til hver stillads beholderen og skrabe overfladen (kraftigt agitere for bioreaktoren skibe). Fjern lysisbuffer og placere i særskilt mærkede centrifugerør.
- Vortex hver centrifugerør til ca. 1 min for at sikre tilstrækkelig omrøring af cellerne og buffer og til at fremme lyse af cellemembranen.
- I en sort plade med 96 brønde tilsættes 100 pi lysisbuffer for hver fraktion prøve - stillads, medier og godt (dobbelt).
- I mørke tilsættes 100 pi celle DNA-opløsning til alle brønde indeholdende lyseringsbuffer og blandes forsigtigt.
- Inklusive brønde med lysepuffer indeholdende intet DNA og celle DNA-opløsning for at tilvejebringe en negativ og positiv kontrol for brønde.
- Ved hjælp af en fluorescens pladelæser, måles absorbansen af brøndens Brug 485 nm excitation og 520 nm emission.
- Sammenligne data med standardkurve genereret fra DNA standarder i henhold til fabrikantens anvisninger.
10. Scanning Electron Microscope (SEM) Fiksering
- Udfør følgende trin under laminar strømning: Efter 4 timer, fjerne alle stilladser fra deres beholdere og inden for en ny 6-brønds plade (separate brønde).
- Vask scaffolds to gange med PBS.
- Udfør følgende trin på den åbne bænken: Til hver brønd, tilsættes 2 ml 1,5% v / v glutaraldehyd i PBS for at sikre fuldstændig dækning af stilladset.
- Lad pladen i mindst 30 minutter ved 4 ° C for celle fiksering.
- Fjern fikseringsopløsning og vask scaffolds to gange med PBS.
- Dehydrer stilladser med stigende koncentrationer af ethanol i destilleret vand begyndende med 50% v / v, efterfulgt af 70% v / v og 90% v / v. For hver koncentration, fuldt submerse stilladser i opklaringn (2 ml) og henstår i 3 min. Kassér opløsningen og gentage.
- Dehydrer i 100% ethanol ved fuldt nedsænke stilladser i opløsning (2 ml) og forlader for 5 min. Kassér opløsningen og gentage.
- Kemisk tørre stilladser ved hjælp af hexamethyldisilazan (HMDS) inden et stinkskab. Fordyb stilladser i HMDS (2 ml) og henstår i 5 min. Fjern HMDS og gentag.
- Fjern HMDS og lade scaffolds tørre. Monter stilladser på kommercielt tilgængelige SEM stubbe (i dette tilfælde rustfrit stål stubbe med selvklæbende carbon faner).
- For at lette visning i SEM, at belægge prøverne ved hjælp af en guld-pådampningsbelægningsmaskine i 2 min sikre en tynd og jævn dækning.
- Anbring prøverne i SEM og visualisere celle-podede scaffolds ved anvendelse af en 5 keV elektronstråle.
Representative Results
Resultaterne fremhæve placeringen af celler efter 4 timer efter podning for hver forsøgsopstilling undersøgt. Figur 2A viser procentdelen af celler, som har bundet til stillads overflade i løbet af denne tid. En omregningsfaktor på 8,5 pg / celle blev anvendt til at omdanne den målte DNA-indhold i celle nummer og derved bestemme den procentdel af cellerne 10. For alle seeding set-ups undersøgt, procentdelen af cellebinding er relativt lav, med størst celle vedhæftning (30%) for stilladser holdes inden cellekultur skær og rystet ved 30 rpm (Insert Shaker). Laveste tilslutning (15%) var for stilladser afholdt inden for cellekultur skær og holdes under statiske betingelser (Insert statisk).
Et stort antal celler var til stede i medierne fraktion (figur 2B), navnlig for cellekultur skær holdes inden lave bindende plader (Insert statisk) og roterende fartøjer bliver 50% og 51%henholdsvis. Stilladser holdes inden trugene demonstrerede en hævet antal celler til stede i holderen selv - 48% af cellerne for Trough Shaker og 50% for Trough Static.
Scanning elektronmikroskopi have en visuel vurdering af celle-podede scaffolds (figur 3). Repræsentative billeder fremhævet en begrænset tilstedeværelse af celler på den fibrøse overflade, uanset såning set-up. Men et større antal celler og celle agglomerater var til stede på stilladser afholdt inden for cellekultur indsætter og rystet ved 30 rpm (Insert Shaker).
Figur 1. forsøgsopstillinger, hvor elektrospundne Garn holdes indenfor; (A) cellekultur skær og lav binding brøndsplade (B) poly (tetrafluorethylen) (PTFE) trug og petriskål; og (C) bioreaktor fartøj. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Placering Celler 4 timer efter såning onto PCL elektrospundne Garn Brug af forskellige Seeding set-ups. (A) viser procentdelen af celler, som har knyttet til PCL scaffold (middelværdi ± standardafvigelse), (B) viser den procentvise spredning af celle placering inden for tre fraktioner - medier, godt og stillads (n = 4, data præsenteres som middelværdier). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Repræsentant skanningselektronmikrografer for PCL elektrospundne Garn med humane mesenchymstamceller, 4 timer efter første Seeding Brug af forskellige forsøgsopstillinger. (Alle billeder på 1.000X forstørrelse, skala bar = 130 um.) Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Elektrospundne fiber matricer fremstillet af biopolymerer regelmæssigt anvendes til at støtte cellebinding og proliferation for biomateriale og / eller vævsdyrkningsapplikationer 11,12. I disse tilfælde, matricerne er ofte tynde plader af fibre, der let dækker hele bunden af en cellekultur brøndplade og dermed er i fuldstændig kontakt med podet celler, som forbedrer cellebinding. Men hvis biomateriale stillads ikke fuldt ud dækker bunden af brønden plade, er der en stor chance for, at en stor del af de podede celler vil ikke forblive i kontakt med stilladset og i sidste ende vil ikke være i stand til at vedhæfte. Denne undersøgelse undersøgte flere forskellige metoder til at pode celler på stilladser, der ikke dækker bunden af brønden plade, for at bestemme en optimeret teknik, der kan anbefales til fremtidige cellebaserede forsøg.
Fem forskellige opsætninger blev undersøgt (figur 1): scaffoLDS (elektrospundet garn) holdt ved hjælp af cellekultur indsatser indenfor lave bindende brøndplader og enten holdt under statiske forhold eller rystet ved 30 rpm; stilladser placeret inden for snævre PTFE trug og holdt statisk eller rystet ved 30 rpm; og stilladser anbragt inde bioreaktor fartøjer roterende 9 rpm. Bestemmelse af antallet af celler, der var klæbet til elektrospundne garner ved DNA analyse viste en lav procentdel af udlæg for alle seeding opsætninger (figur 2); og dette blev yderligere bekræftet fra skanningselektronmikrografer (SEM) (figur 3). Største cellebinding - 30% eller ~ 18.060 celler -blev observeret for garn, der blev afholdt inden for cellekultur skær og udsat for kontinuerlig bevægelse. Interessant nok blev laveste cellebinding (15%) opnået for garn, som cellekultur skær men holdes under statiske forhold, der tyder på, at inddragelsen af radial bevægelse har en positiv effekt på at holde celler i kontakt med stilladset. ImidlertidDet skal bemærkes, at kontinuerlig cirkelbevægelser af mediernes flow kan være ansvarlig for celle agglomerater observeret fra SEM billeder. Den shaker pladen blev sat på sit laveste indstilling - 30 rpm - som kunne være en begrænsning for denne opsætning. Ved hjælp af en langsommere radial bevægelse kan bidrage til at forebygge eller reducere celle agglomerering og kan også forbedre cellebinding som celler vil opleve mindre kraft. Fremtidige forsøg bør fokusere på at optimere den ideelle shaker hastighed for forbedret vedhæftning celle. Omfattende beslutningsforslag garn holdes inden trugene resulterede ikke i en lignende tendens, med begge scenarier giver 18% vedhæftet fil (~ 10.836 celler); selvom dette kan skyldes den delvise flotation af stilladser i renderne (observeret for trug placeret på rysteapparatet plade), da de ikke blev forankret til basen. Delvis flydende af stilladset vil forhindre eventuelle celler, der er sunket til bunden af truget kommer i kontakt med materialet og vedhængende. For thans særlige opsætning blev trug anbragt i en petriskål og et totalt volumen på 10 ml medie tilsat. De små dimensioner af truget betyder, at størstedelen af medierne er til stede i petriskålen, og hvis der er nogen bevægelse kan celler glider væk fra truget ind i den petriskål og forblive helt utilgængeligt for stilladset. For at overvinde disse begrænsninger, bør yderligere eksperimenter indeholde et ekstra trin i protokollen, hvorefter enderne af stilladser er fastgjort til bunden af trugene anvendelse af sterile fine-nåle, da dette skulle forhindre deres flydeevne og bevægelse (især for stillads udsættes for radial bevægelse), som i sidste ende fører til et øget antal celler, der er knyttet til stilladset. 16% af cellerne var fastgjort til garner til stede i de roterende fartøjer. Trods en veletableret teknik til 3D kultur, var der opstå problemer med fjernelse af stilladser fra skibenes vigtigste havn, hvilket kan have resulteret i løst AttacHED celler går tabt. Fartøjer, der kan åbnes helt vil eliminere dette problem; disse er tilgængelige til at købe, men er betydeligt dyrere end de disponible fartøjer, som anvendes i denne undersøgelse.
Denne undersøgelse viser de aktuelle problemer med såning stilladser, der ikke dækker hele bunden af standard cellekultur brøndplader. Seeding et kendt celletal resulterede i mindre end en tredjedel knyttet til skafottet, på trods af stillads overfladeareal giver mulighed for alle celler til at klæbe. Dette kunne have skadelige konsekvenser i andre cellebaserede assays, der kan vurdere biokompatibilitet og celle-materiale / celle-celle adfærd og interaktion med stilladset som et potentielt fremtidigt medicinske udstyr. Yderligere begrænsninger af undersøgelsen kan omfatte 4 timer tid-point - trods lang nok til at sikre indledende cellepodning (celler er blevet vist at fast tillægger substrater inden for tredive minutter 13,14,15), kan det være rimeligt at ivestigate senere tidspunkter levere celler ikke formere sig i løbet af en længere tidsramme, da dette ellers ville forvrænge den begyndende celle nummer. At reducere mængden af medier, i dette tilfælde 10 ml, også kan forbedre kontakten mellem cellerne og stillads og i sidste ende øge cellevedhæftning. Fremtidige studier bør også overveje cellelevedygtighed som processen med cellepodning kan forårsage cellebeskadigelse og / eller celledød 16. Celle-DNA analyser skelner ikke mellem levedygtige og ikke-levedygtige celler, som sådan en levende / død assay, for eksempel, ville fremhæve omfanget af levedygtighed.
Denne undersøgelse skaber opmærksomhed til det faktiske antal celler, der lægger til skafottet trods såning en kendt mængde. For undersøgelser, der er afhængige af start antal celler, er det meget vigtigt, at forskerne ved præcis, hvor mange af dette tal rent faktisk holde sig til underlaget af interesse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke og anerkende Medical Research Council for at finansiere denne forskning - MRC-DPF tilskud kode G1000788-98812.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water | in-house supply | n/a | |
| Ethanol | Merck | 1117271000 | |
| Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
| MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
| Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
| Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
| Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 °C before use |
| Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
| Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
| 6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
| Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
| PTFE troughs | in-house production | n/a | |
| Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
| 4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
| Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
| Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
| Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
| Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
| Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
| Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
| Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 - P1000 |
| Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
| Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
| Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
| Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
| Glutaraldehyde 25% | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
| Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
| Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
| Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |
References
- Jauregui, H. O. Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells. ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).
- Puca, A., Russo, G., Giordano, A. Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's. Oncotarget. 3 (4), 426 (2012).
- Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway. Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).
- Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).
- Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).
- Wang, Y., et al. Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).
- Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering. Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).
- Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).
- Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).
- Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels. Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).
- Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro. Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).
- Yavin, E., Yavin, Z. Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface. The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).
- Chen, H. Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).
- Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell. 58 (5), 933-943 (1989).
- Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).
