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Bioengineering

पाली (ε-caprolactone) Electrospun सूत पर मानव mesenchymal स्टेम सेल की कुर्की का अनुकूलन

doi: 10.3791/52135 Published: April 10, 2015

Abstract

Biomaterials और ऊतक इंजीनियरिंग में रिसर्च अक्सर शुरू करने सेल नंबर का प्रारंभिक ज्ञान की आवश्यकता होती है जो कोशिका आधारित इन विट्रो जांच भी शामिल है। शोधकर्ताओं सामान्यतः उनके बोने घनत्व का संदर्भ जबकि यह जरूरी सवाल में सामग्री का पालन किया है कि कोशिकाओं की वास्तविक संख्या का संकेत नहीं है। यह विशेष रूप से मानक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से प्लेटों के आधार कवर नहीं है कि सामग्री, या scaffolds के लिए मामला है। इस अध्ययन संस्कृति में 4 घंटे के बाद electrospun पाली (ε-caprolactone) यार्न पर एक ज्ञात संख्या में वरीयता प्राप्त मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की प्रारंभिक लगाव की जांच। Electrospun यार्न 9 RPM, पेट्री डिश के भीतर रखा कम बंधन में अच्छी तरह प्लेटें और polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs में तैनात सेल संस्कृति आवेषण पर घूर्णन बायोरिएक्टर जहाजों सहित कई अलग सेट-अप के भीतर आयोजित की गई। बाद के दो एक प्रकार के बरतन प्लेट पर स्थिर शर्तों या तो अधीन करने के लिए या तैनात थे (30 ओ सी पर चार घंटा ऊष्मायन, 5% सीओ 2 के बाद, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के स्थान सेल डीएनए परख द्वारा निर्धारित किया गया था। Scaffolds उनके कंटेनरों से हटा दिया है और lysis बफर में रखा गया था। मीडिया अंश इसी तरह हटा दिया है और centrifuged था - सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया और गोली lysis बफर के साथ टूट गया। Lysis बफर प्रत्येक गोदाम में जोड़ा, या अच्छी तरह से, और उपस्थित हो सकता है कि किसी भी कोशिकाओं को मुक्त करने scraped किया गया था। सेल डीएनए परख पाड़ के भीतर मौजूद कोशिकाओं, मीडिया और अच्छी तरह से अंशों का प्रतिशत निर्धारित की। सेल लगाव यार्न सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित की और गति झटकों के अधीन के लिए सबसे बड़ा लगाव (30%) के साथ, सभी प्रयोगात्मक सेट अप के लिए कम था। इस अध्ययन पर ध्यान दिए बिना कहा सेल बोने घनत्व के scaffolds के लिए संलग्न कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के लिए जागरूकता उठाती है।

Introduction

Scaffolds नियमित तौर पर विकसित किया है और biomaterial और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए शोध किया जा रहा है। जैसे, वे आमतौर पर उदाहरण के लिए, सेल प्रसार और सेल नंबर निर्धारित कि assays के माध्यम विशेषता कोशिकाओं और उनके इन विट्रो व्यवहार के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। जैसे कि इन प्रयोगों के लिए, यह प्रारंभिक सेल नंबर से जाना जाता है कि जरूरी है और शोधकर्ताओं अक्सर मिलीलीटर या 2 सेमी प्रति कोशिकाओं की संख्या के मामले में बोने की एकाग्रता राज्य है। यह विशेष रूप से बड़े पैमाने अप प्रयोजनों के लिए अच्छा अभ्यास है, जबकि, यह (भी biomaterial सतह एक के चिपकने वाला गुणों पर निर्भर है) पाड़ सतह का पालन करना है कि कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के लिए खाते में नहीं है। कोशिकाओं के निर्माण से दूर गिर सकता है और, की वजह से प्रयोग की अक्सर स्थिर प्रकृति के कारण, बौद्धिक अत्याधुनिक की सामग्री के साथ संपर्क में वापस आने के लिए कभी नहीं हो सकता क्योंकि यह सेल संस्कृति में अच्छी तरह से थाली के पूरे बेस कवर नहीं है कि scaffolds के लिए विशेष रूप से सच हैबाकी। Electrospun फाइबर यार्न अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए) के आधार कवर नहीं करता है कि एक चबूतरा का एक अच्छा उदाहरण है। इस मामले में, सतह का इलाज नहीं किया गया है कि कम से बाध्यकारी अच्छी तरह प्लेटें थाली की सतह के लिए संलग्न है और इसलिए किसी भी अच्छी तरह से आधारित परख के परिणामों विकृत से कोशिकाओं को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

अच्छी तरह प्लेटें आसानी से scaffolds के पर सेल बोने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वे उपलब्ध एकमात्र तरीका नहीं कर रहे हैं। रोटरी सेल संस्कृति सिस्टम, देर से 1980 में नासा में जीवन विज्ञान प्रभाग द्वारा विकसित बायोरिएक्टर का एक प्रकार है, इसी तरह नकली microgravity के साथ एक तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण के भीतर scaffolds के बीज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बायोरिएक्टर इस प्रकार का दुनिया भर में शोधकर्ताओं के साथ एक लोकप्रिय विकल्प रहता है और, कोशिकाओं 4,5 और ऊतक इंजीनियरिंग 6,7 स्टेम सेल 2,3 संकेतन के लिए अध्ययन में शामिल किया गया है। क्या अच्छी तरह से प्लेटों के लिए बेहतर रोटरी बायोरिएक्टर बनाता रखरखाव हैअक्सर मामला है, dedifferentiating से विभेदित कोशिकाओं को रोकने में मदद करता है जो एक 3 डी वातावरण, की जब पारंपरिक 2D शर्तों 8 भीतर सुसंस्कृत।

यह पत्र एक 4 घंटे की अवधि के भीतर इन scaffolds के लिए संलग्न कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या को अधिकतम करने के क्रम में बोसवर्थ एट अल।, 9 में गढ़े रूप electrospun पाली (ε-caprolactone) फाइबर यार्न पर मानव mesenchymal स्टेम सेल बोने के लिए विभिन्न तकनीकों की जांच। 2D संस्कृति के लिए, यार्न सुरक्षित रूप से अच्छी तरह प्लेटें या कस्टम बनाया पाली (tetrafluoroethylene) (PTFE) troughs के भीतर आयोजित की गई और स्थिर शर्तों के तहत रखा है, या 30 rpm पर हिल। 3 डी संस्कृति के लिए, यार्न और कोशिकाओं 9 rpm पर घूर्णन बायोरिएक्टर वाहिकाओं के भीतर आयोजित की गई।

Protocol

1.Scaffold निर्माण और बंध्याकरण

  1. एक 10% डब्ल्यू / वी एकाग्रता देने के लिए 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol में PCL के भंग। । बहुलक समाधान (पैरामीटर: 20 केवी, 1 मिलीग्राम / घंटा, 20 सेमी) electrospin बोसवर्थ एट अल, 9 में वर्णित है और एक घूर्णन खराद का धुरा (600 आरपीएम) के किनारे पर फाइबर गठबंधन लीजिए। (Troughs और रोटरी जहाजों के लिए) 3 सेमी और लंबाई (सेल संस्कृति आवेषण के लिए) 4 सेमी - एक स्केलपेल के साथ कम लंबाई में काट तो एकत्र फाइबर का रिबन निकालें।
  2. ठीक संदंश आसुत जल में व्यक्तिगत स्ट्रिप्स डूब और निकालें का उपयोग।
  3. अंगूठे और तर्जनी के बीच दोनों छोर पकड़े; यह धागा जैसा दिखता है जब तक मैन्युअल रूप से पट्टी मोड़।
  4. संक्षेप में आसुत जल में इस धागे की तरह पाड़ डूब और सुखाने के लिए स्वच्छ, गैर रेशेदार कार्ड पर जगह है।
  5. एक बार सूखा, व्यक्तिगत रूप से साफ microcentrifuge ट्यूब में जगह और आसुत जल में 50% वी / वी इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें। पलकों को बंद करें और 2 के लिए छोड़ दें4 घंटा।
    नोट: लामिना का प्रवाह के अंतर्गत निम्न चरणों का पालन:
  6. एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में microcentrifuge ट्यूब प्लेस और 50% वी / वी समाधान aspirate। आसुत जल, बंद पलकों में 1 मिलीलीटर 70% वी / वी इथेनॉल के साथ बदलें और 24 घंटे के लिए छोड़ दें।
  7. 90% और आसुत जल (1 मिलीलीटर मात्रा) में 100% वी / वी इथेनॉल के लिए दोहराएँ।
  8. धो फॉस्फेट बफर खारा समाधान (पीबीएस), धोने प्रति 24 घंटा (2 एक्स 1 मिलीलीटर) के साथ दो बार scaffolds।
  9. पीबीएस निकालें और 1 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया के साथ बदलें। नोट: Scaffolds उपयोग के बाद 24 घंटे के लिए तैयार हैं।

2। पाड़ भूतल क्षेत्र और कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण

  1. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक मतलब मूल्य निर्धारित करने के लिए इसकी लंबाई के साथ electrospun यार्न के व्यास को मापने।
  2. एक बेलनाकार छड़ी हो सकता है और का उपयोग कर सतह क्षेत्र लगभग करने के लिए सूत की कल्पना:
  3. कहाँ एक = सतह क्षेत्र, आर = त्रिज्या और ज = लंबाई
    नोट: सतह क्षेत्र 18,902 होने की गणना की गई थी800 माइक्रोन दो। इसके अलावा, यह धागा सतह क्षेत्र में वृद्धि होगी जो ठीक फाइबर, के सैकड़ों से बना है के रूप में वास्तविक सतह क्षेत्र इस गणना से अधिक हो जाएगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए। नतीजतन कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या पाड़ को संलग्न करने के लिए सक्षम होना चाहिए। हालांकि, इस परीक्षण के समूहों के बीच एक सीधी तुलना बनाया जा रहा है को प्रभावित नहीं करता है।
  4. द्वारा उजागर पाड़ की सतह के लिए देते सकता है कि कोशिकाओं की अधिकतम संख्या निर्धारित करें:
    ध्यान दें: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग, मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के व्यास होने के लिए निर्धारित किया गया था 20 माइक्रोन (संभालने कोशिकाओं गोल कर रहे हैं), इसलिए इस मामले में, कोशिकाओं = 60,200 की संख्या।

3. पाड़ सेट अप - सेल संस्कृति आवेषण (चित्रा 1 ए)

  1. लामिना का प्रवाह के तहत, बाँझ 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण खोलने के लिए और व्यापक चक्राकार निकायों से दांत के साथ छोटे कद के छल्ले अलग।
  2. दांत के ऊपर की तरफ इशारा करते हुए के साथ अंगूठी ले लो। एक कपड़ाबनाने की अंगूठी के केंद्र पर 4 सेमी scaffolds के यकीन है कि यह दोनों पक्षों पर overlaps। दांतेदार अंगूठी और पाड़ अधिक चक्राकार शरीर और स्थिति को लो और पाड़ की स्थिति में रहता है और सेल संस्कृति डालने के केंद्र के माध्यम से झूठ सुनिश्चित करते हुए नीचे की ओर धक्का।
  3. 6 अच्छी तरह से, कम से बाध्यकारी थाली के कुएं में पाड़ के साथ सेल संस्कृति डालने रखें।
  4. पाड़ के लिए संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।

4. पाड़ सेट अप - गर्त (चित्रा 1 बी)

  1. लामिना का प्रवाह के तहत, जगह पाली (tetrafluoroethylene) (PTFE) व्यक्तिगत पेट्री डिश में troughs और गर्त में संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. यकीन है कि इसकी लंबाई, जिससे संदंश गर्त में 3 सेमी scaffolds के एक कपड़ा का प्रयोग गर्त की अब किनारे करने के लिए समानांतर निहित है।

5. पाड़ सेट अप - बायोरिएक्टर पोत (चित्रा 1C)

  1. लामिना का प्रवाह के तहत, बायोरिएक्टर पोत के माध्यम से 10 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस बांटनामुख्य बंदरगाह और 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
  2. पीबीएस निकालें और 8 मिलीग्राम संस्कृति मीडिया के साथ बदलें।
  3. संदंश का प्रयोग, मुख्य बंदरगाह के माध्यम से पोत में 3 सेमी scaffolds के एक डालें।
  4. मुख्य बंदरगाह बंद।

6. सेल गिनती

  1. ऊपर कटाई करने से पहले पारित होने से 4 निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न संस्कृति मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSC)।
  2. एक 75 सेमी से अस्थि मज्जा (बीतने के 4, 80 confluency%) से ली गई hMSCs युक्त दो कुप्पी मीडिया aspirate।
  3. 10 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस और महाप्राण के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  4. 3 मिलीलीटर trypsin जोड़ें और कोशिकाओं कुप्पी की सतह से उखाड़ फेंकना है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कुप्पी सेते हैं।
  5. एंजाइम निष्क्रिय और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब इस कुल मात्रा (10 एमएल) स्थानांतरित करने के लिए 7 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया जोड़ें।
  6. समान के भीतर कोशिकाओं को फैलाने के लिए ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे इस सेल निलंबन Resuspendमीडिया और सीमा सेल agglomerates (10 एमएल पिपेट)।
  7. एक रुधिरकोशिकामापी सेल निलंबन और स्थानांतरण के 20 μl निकालें।
  8. X10 उद्देश्य में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और छवि के तहत रुधिरकोशिकामापी रखें।
  9. ग्रिडलाइनें फोकस और ग्रिड के प्रत्येक कोने में 4 एक्स 4 चौकों में कोशिकाओं की संख्या गिनने और जो वर्ग में आते हैं और दाहिने हाथ या नीचे सीमा रेखा को पार करते हैं। 4 एक्स 4 चौकों (ग्रिड प्रति 4 मायने रखता है) के प्रत्येक सेट के लिए गणना।
  10. मेजबान और सेल गिनती तीन बार (6.6-6.9 कदम) दोहराएँ।
  11. औसत सेल गिनती की गणना और सेल मेजबान (200 μl में सेल एकाग्रता 60,200) के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा का निर्धारण। उदाहरण के लिए, रुधिरकोशिकामापी से औसत सेल गिनती का निर्धारण और उसके बाद तीन अलग-अलग मायने रखता से कोशिकाओं के समग्र औसत संख्या निर्धारित करते हैं। को देने के लिए सेल निलंबन की कुल मात्रा से गुणा तो मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या और देने के लिए एक 10 x 4 द्वारा इस गुणाकोशिकाओं की ताल संख्या। मेजबान के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
  12. 5 मिनट के लिए 241 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।

7. सेल बोने

  1. सेल गोली छोड़ने Centrifuged ट्यूब से मीडिया Aspirate और गणना की मीडिया की मात्रा के साथ की जगह।
  2. यहां तक ​​कि मिश्रण एक के लिए कोशिकाओं और मीडिया Resuspend।
  3. एक P200 गिल्सन विंदुक का प्रयोग, धीरे-धीरे पाड़ लंबाई के साथ और मीडिया तरल सतह के नीचे पिपेट की नोक चलाकर प्रत्येक पाड़ पर सेल निलंबन के 200 μl बांटना। 20 मिनट के लिए अछूता छोड़ दें।
  4. बायोरिएक्टर जहाजों के लिए, मुख्य बंदरगाह के माध्यम से सेल निलंबन के 200 μl बांटना। सिरिंज बंदरगाहों के माध्यम से टॉप-अप शेष 2 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा देने के लिए।

8. प्रायोगिक प्रारंभ करें

  1. आरसीसी-4DQ बायोरिएक्टर को बायोरिएक्टर जहाजों स्थानांतरण और 9 rpm पर बारी बारी से करने के लिए निर्धारित किया है।
  2. ट्रॅनप्रकार के बरतन प्लेट के लिए सेल संस्कृति सम्मिलित करता है और troughs के साथ अच्छी तरह प्लेटें sfer और 30 rpm पर बारी बारी से करने के लिए निर्धारित किया है।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 (स्थिर संस्कृति) पर सेट एक सेल इनक्यूबेटर की शेल्फ को सेल संस्कृति सम्मिलित करता है और troughs के साथ अच्छी तरह प्लेटें स्थानांतरण।

9. डीएनए परख

  1. Lysis बफर, 1x ते बफर, डीएनए मानकों और सेल डीएनए काम समाधान - - निर्माता के निर्देशों के अनुसार समाधान तैयार करें।
  2. 4 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से नमूने को हटाने और लामिना का प्रवाह के तहत जगह है।
  3. सभी नमूनों से मीडिया अंशों निकालें और अलग-अलग लेबल वाले सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में जगह है। ट्यूब 241 XG अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 3 मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें। तोड़-अप करने के लिए सेल गोली समाधान Resuspend।
  4. संदंश बायोरिएक्टर वाहिकाओं के भीतर scaffolds के लिए 3 मिलीलीटर lysis बफर (युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब में scaffolds और जगह निकालें का उपयोग, पहले मुझे aspirating करने के पाड़ को दूरव्यास)। सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित scaffolds के लिए, पहले एक स्केलपेल का उपयोग कर डालने के किनारे के करीब पाड़ काटने से पाड़ मुक्त।
  5. प्रत्येक पाड़ संदूक को lysis बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें और सतह परिमार्जन (सख्ती बायोरिएक्टर वाहिकाओं के लिए आंदोलन)। Lysis बफर निकालें और अलग-अलग लेबल वाले सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में जगह है।
  6. भंवर लगभग 1 मिनट के लिए प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं की पर्याप्त आंदोलन को सुनिश्चित करने और बफर और कोशिका झिल्ली के lysis को प्रोत्साहित करने के लिए।
  7. पाड़, मीडिया और अच्छी तरह से (डुप्लिकेट) - एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली में, प्रत्येक नमूना अंश के लिए lysis बफर के 100 μl जोड़ें।
  8. अंधेरे में, lysis बफर युक्त सभी कुओं को सेल डीएनए समाधान के 100 μl जोड़ने और धीरे मिश्रण।
  9. अच्छी तरह से थाली के लिए एक नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करने के लिए कोई डीएनए और कोशिका के डीएनए समाधान युक्त lysis बफर के साथ कुओं को शामिल करें।
  10. एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग कर, अच्छी तरह से absorbance के उपाय485 एनएम उत्तेजना और 520 एनएम उत्सर्जन का उपयोग कर रहा है।
  11. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए मानकों से उत्पन्न मानक की अवस्था के साथ डेटा की तुलना करें।

10 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) फिक्सेशन

  1. लामिना का प्रवाह के अंतर्गत निम्न चरणों का पालन: 4 घंटे के बाद, एक नया 6 अच्छी तरह से थाली (अलग कुओं) के भीतर अपने पात्र और जगह से सभी scaffolds के हटा दें।
  2. पीबीएस के साथ दो बार scaffolds के धोएं।
  3. खुला बेंच पर निम्न चरणों का पालन: प्रत्येक अच्छी तरह से, पाड़ की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस में 1.5% वी / वी glutaraldehyde के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए।
  4. सेल निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए थाली छोड़ दें।
  5. लगानेवाला समाधान निकालें और पीबीएस के साथ दो बार scaffolds के धो लो।
  6. 70% वी / वी और 90% वी के द्वारा पीछा किया, 50% वी / वी के साथ शुरू आसुत जल में इथेनॉल की सांद्रता में वृद्धि के साथ scaffolds के निर्जलीकरण / वी। प्रत्येक एकाग्रता के लिए, पूरी तरह से solutio में scaffolds डुबोनाएन (2 मिलीलीटर) और 3 मिनट के लिए छोड़ दें। समाधान त्यागें और दोहराएँ।
  7. पूरी तरह से समाधान में scaffolds (2 मिलीलीटर) submersing और 5 मिनट के लिए छोड़ कर 100% इथेनॉल में निर्जलीकरण। समाधान त्यागें और दोहराएँ।
  8. रासायनिक एक धूआं अलमारी के भीतर hexamethyldisilazane का उपयोग कर scaffolds के (HMDS) सूखी। HMDS में scaffolds (2 मिलीलीटर) को विसर्जित कर दिया और 5 मिनट के लिए छोड़ दें। HMDS निकालें और दोहराएँ।
  9. HMDS निकालें और scaffolds के शुष्क करने की अनुमति देते हैं। (इस मामले चिपकने वाला कार्बन टैब के साथ स्टेनलेस स्टील स्टब्स में) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध SEM के आधार पर scaffolds के माउंट।
  10. SEM के भीतर देखने को कम करने के लिए, 2 मिनट के लिए एक सोने का धूम coater का उपयोग कर कोट नमूने एक पतली और भी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए।
  11. और SEM के भीतर जगह नमूने एक 5 कीव इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग सेल वरीयता प्राप्त scaffolds के कल्पना।

Representative Results

परिणामों की जांच की प्रत्येक प्रयोगात्मक सेट अप के लिए 4 घंटे के बाद बोने निम्नलिखित कोशिकाओं के स्थान पर प्रकाश डाला। 2A चित्रा इस समय के दौरान पाड़ सतह से जुड़ी है कि कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है। 8.5 स्नातकोत्तर / सेल के एक रूपांतरण कारक सेल नंबर में मापा डीएनए सामग्री को परिवर्तित करने और इस प्रकार की कोशिकाओं को 10 का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सभी बोने सेट-अप की जांच के लिए, सेल लगाव का प्रतिशत सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित की और 30 आरपीएम (सम्मिलित करें शेखर) में हिल scaffolds के लिए सबसे बड़ी सेल पालन (30%) के साथ, अपेक्षाकृत कम है। न्यूनतम पालन (15%) सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित scaffolds के लिए गया था और स्थिर शर्तों (सम्मिलित करें स्टेटिक) के तहत रखा।

कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या मीडिया अंश (चित्रा 2B) के भीतर मौजूद थे, सबसे विशेष रूप से 50% और 51% किया जा रहा है कम से बाध्यकारी प्लेट (सम्मिलित करें स्थिर) और रोटरी वाहिकाओं के भीतर आयोजित सेल संस्कृति आवेषण के लिएक्रमशः। गर्त शेखर के लिए कोशिकाओं का 48% और गर्त स्टेटिक के लिए 50% - troughs के भीतर आयोजित scaffolds धारक के भीतर ही मौजूद कोशिकाओं के एक उठाया संख्या का प्रदर्शन किया।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेल वरीयता प्राप्त scaffolds के एक दृश्य मूल्यांकन (चित्रा 3) की अनुमति दी। प्रतिनिधि छवियों पर ध्यान दिए बिना सेट-अप बोने की, रेशेदार सतह पर कोशिकाओं के एक सीमित मौजूदगी पर प्रकाश डाला। हालांकि, कोशिकाओं और सेल agglomerates की एक बड़ी संख्या सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित की और 30 आरपीएम (सम्मिलित करें शेखर) में हिल scaffolds पर उपस्थित थे।

चित्र 1
Electrospun यार्न के भीतर आयोजित किया जाता है, जहां चित्रा 1. प्रयोगात्मक सेट-अप,; (ए) सेल संस्कृति सम्मिलित करता है और कम से बाध्यकारी अच्छी तरह से थाली, (बी) पाली (tetrafluoroethylene) (PTFE) गर्त और पेट्री डिश; और (सी) बायोरिएक्टर पोत। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
विभिन्न सीडिंग सेट अप का उपयोग कर PCL Electrospun सूत पर कोशिकाओं 4 घंटा पोस्ट-बोने की चित्रा 2. स्थान। मीडिया, (अच्छी तरह से और पाड़ एन = 4, डेटा के रूप में प्रस्तुत किया - (ख) तीन अंशों भीतर सेल स्थान का प्रतिशत प्रसार पर प्रकाश डाला गया, (ए) (मानक विचलन ± मतलब है) PCL के पाड़ संलग्न करने के लिए है कि कोशिकाओं का प्रतिशत दर्शाता ) मान मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन

चित्रा 3. प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के साथ PCL Electrospun सूत, 4 प्रारंभिक सीडिंग विभिन्न प्रयोगात्मक सेट अप का उपयोग करने के बाद घंटा। के लिए (1,000X बढ़ाई सभी छवियों, पैमाने बार = 130 माइक्रोन।) एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

Discussion

बायोपॉलिमरों से गढ़े Electrospun फाइबर matrices के लिए नियमित रूप से biomaterial और / या ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 11,12 के लिए सेल लगाव और प्रसार का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन मामलों में, matrices के आसानी से एक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से थाली की पूरी आधार को कवर किया और इस प्रकार सेल लगाव जो सुधार वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के साथ पूर्ण संपर्क में हैं कि फाइबर की पतली शीट अक्सर होते हैं। हालांकि, biomaterial पाड़ पूरी तरह से अच्छी तरह से थाली के आधार कवर नहीं करता है, तो वरीयता प्राप्त कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा पाड़ के साथ संपर्क में नहीं रह जाएगा और अंत में संलग्न करने के लिए सक्षम नहीं होगा कि वहाँ एक उच्च मौका है। इस अध्ययन से भविष्य सेल आधारित प्रयोगों के लिए सिफारिश की जा सकती है कि एक अनुकूलित तकनीक का निर्धारण करने के क्रम में, अच्छी तरह से थाली के आधार कवर नहीं है कि मचान पर कोशिकाओं बोने के लिए कई अलग अलग तरीकों की जांच की।

पांच अलग सेट-अप (चित्रा 1) की जांच की गई: scaffoLDS (electrospun यार्न) कम बंधन में अच्छी तरह से प्लेटों के भीतर सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर आयोजित किया है और या तो स्थिर शर्तों के तहत रखा या 30 rpm पर हिल; 30 rpm पर संकीर्ण PTFE troughs के भीतर रखा जाता है और स्थिर आयोजित या हिल scaffolds के; और scaffolds के 9 rpm पर घूर्णन बायोरिएक्टर वाहिकाओं के अंदर रखे। सभी बोने सेट अप (चित्रा 2) के लिए कुर्की की एक कम प्रतिशत डीएनए परख द्वारा electrospun यार्न का पालन किया था कि कोशिकाओं की संख्या का प्रदर्शन निर्धारण; और यह आगे इलेक्ट्रॉन micrographs (SEM) (चित्रा 3) स्कैनिंग से पुष्टि की गई। महानतम सेल लगाव - 30% या ~ 18,060 कोशिकाओं सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित की और निरंतर गति के अधीन थे कि यार्न के लिए मनाया -was। दिलचस्प है, सबसे कम सेल लगाव (15%) रेडियल गति का समावेश पाड़ के साथ संपर्क में कोशिकाओं रखने पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है सुझाव है कि जो सेल संस्कृति आवेषण द्वारा आयोजित लेकिन स्थिर शर्तों के तहत रखा यार्न, के लिए हासिल की थी। हालांकि,यह मीडिया के प्रवाह के निरंतर चक्कर SEM छवियों से मनाया सेल agglomerates के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रकार के बरतन प्लेट इसकी सबसे कम सेटिंग पर स्थापित किया गया था - 30 RPM - इस सेट अप करने के लिए एक सीमा हो सकता है। एक धीमी रेडियल गति का प्रयोग रोकने के लिए या सेल ढेर को कम करने में मदद मिल सकती है और कोशिकाओं को कम बल का अनुभव करेंगे के रूप में भी सेल लगाव सुधार सकता है। भविष्य प्रयोगों में सुधार सेल लगाव के लिए आदर्श प्रकार के बरतन गति के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। दोनों स्थितियों में 18% लगाव (~ 10,836 कोशिकाओं) उपज के साथ एक इसी तरह की प्रवृत्ति में परिणाम नहीं था troughs के भीतर आयोजित यार्न के लिए प्रस्ताव शामिल; इस troughs के भीतर scaffolds के आंशिक प्रवर्तन के कारण हो सकता है, हालांकि वे आधार करने के लिए लंगर नहीं थे के रूप में (एक प्रकार के बरतन प्लेट पर रखा troughs के लिए मनाया गया)। सामग्री और पालन के साथ संपर्क में आने से गर्त की तह तक डूब चुके हैं कि किसी भी कोशिकाओं को रोकने जाएगा पाड़ की आंशिक चल। टी के लिएअपने विशेष सेट-अप, गर्त एक पेट्री डिश के भीतर रखे था और मीडिया के एक कुल 10 एमएल मात्रा गयी। गर्त के छोटे आयाम मीडिया के बहुमत पेट्री डिश के भीतर मौजूद है और किसी भी आंदोलन है, तो कोशिकाओं पेट्री डिश में दूर गर्त से बहाव और पाड़ की पहुंच से बाहर पूरी तरह से रह सकता है कि इसका मतलब है। इस से अवगत कराया scaffolds के लिए उनके प्रवर्तन और विशेष रूप से आंदोलन (रोकने चाहिए के रूप में इन सीमाओं को पार करने के लिए, आगे के प्रयोगों, scaffolds के सिरों बाँझ ठीक सुइयों का उपयोग troughs के आधार पर टिकी हैं जिससे प्रोटोकॉल में एक अतिरिक्त कदम शामिल होना चाहिए अंततः पाड़ संलग्न करने के लिए कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व चाहिए जो रेडियल गति),। कोशिकाओं के 16% रोटरी वाहिकाओं के भीतर मौजूद यार्न से जुड़ी थी। 3 डी संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक होने के बावजूद, समस्याओं शिथिल attac में हुई है जो हो सकता है 'जहाजों मुख्य बंदरगाह से scaffolds के हटाने के साथ पैदा हुआHED कोशिकाओं को खो दिया जा रहा है। पूरी तरह से इस समस्या को समाप्त होगा खोला जा सकता है कि वेसल्स; इन खरीद के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन काफी इस अध्ययन में इस्तेमाल डिस्पोजेबल जहाजों की तुलना में अधिक महंगे हैं।

इस अध्ययन के मानक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से प्लेटों के पूरे बेस कवर नहीं है कि scaffolds के बोने के साथ वर्तमान मुद्दों को दर्शाता है। एक ज्ञात सेल नंबर सीडिंग पालन करने के लिए सभी कोशिकाओं के लिए अनुमति पाड़ की सतह क्षेत्र होने के बावजूद, पाड़ के लिए एक तिहाई संलग्न की तुलना में कम हुई। यह एक संभावित भविष्य के चिकित्सा उपकरण के रूप में पाड़ साथ biocompatibility और सेल-सामग्री / सेल सेल व्यवहार और बातचीत का आकलन कर सकते हैं कि अन्य सेल आधारित assays में हानिकारक परिणाम हो सकते हैं। अध्ययन के आगे सीमाओं 4 घंटा समय बिंदु शामिल हो सकते हैं - प्रारंभिक सेल बोने सुनिश्चित करने के लिए काफी लंबे समय होने के बावजूद (कोशिकाओं को मजबूती से तीस मिनट 13,14,15 भीतर substrates के लिए संलग्न करने के लिए दिखाया गया है), उस में करने के लिए उचित हो सकता हैबाद में समय-अंक इस अन्यथा शुरू करने सेल नंबर तिरछा होता है के रूप में कोशिकाओं को एक लंबे समय-सीमा के दौरान पैदा करना नहीं है प्रदान करने vestigate। इस मामले में, 10 एमएल मीडिया की मात्रा को कम करने, भी कोशिकाओं और पाड़ के बीच संपर्क में सुधार और अंततः सेल लगाव बढ़ सकते हैं। भविष्य अध्ययनों से यह भी कोशिका क्षति और / या कोशिका मृत्यु 16 पैदा कर सकता है सेल बोने की प्रक्रिया के रूप में सेल व्यवहार्यता पर विचार करना चाहिए। इस तरह के एक लाइव / मृत परख, उदाहरण के लिए, व्यवहार्यता के स्तर पर प्रकाश डाला जाएगा के रूप में सेल डीएनए assays के, व्यवहार्य और अलाभकारी कोशिकाओं के बीच अंतर नहीं है।

यह जांच एक ज्ञात मात्रा बोने के बावजूद पाड़ के लिए देते हैं कि कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के लिए जागरूकता उठाती है। कोशिकाओं की शुरुआती संख्या पर निर्भर है कि अध्ययन के लिए, यह शोधकर्ताओं ने पाया कि आंकड़े के कई तथ्य ब्याज की सब्सट्रेट करने के लिए पालन में क्या वास्तव में कैसे पता है कि अत्यधिक महत्वपूर्ण है।

Acknowledgments

एमआरसी-DPFS अनुदान कोड G1000788-98812 - लेखक इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद को धन्यवाद और स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water in-house supply n/a
Ethanol Merck 1117271000
Phosphate Buffered Saline solution Life Technologies 70013016
Human mesenchymal stem cells PromoCell GmbH C-12974
MSC culture media PromoCell GmbH C-28010B Warmed to 37 oC before use
Supplement mix PromoCell GmbH C-39810 Add to culture media
Antibiotic/antimyotic mix Sigma-Aldrich A5955 Add to culture media
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) Sigma-Aldrich 59417C Warmed to 37 °C before use
Cell culture flasks (T75) Becton Dickinson Ltd 353110
Low binding 6-well plates Costar Corning 3471
6-well CellCrowns Scaffdex C00003S
Petri-dish 50 ml deep Sterilin 124
PTFE troughs in-house production n/a
Disposable RCCS vessels 10 ml Synthecon D-410
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor Synthecon RCCS-4DQ
Shaker plate Stuart SSM1 Mini Orbital Shaker
Haemocytometer Digital Bio DHC-F01 Disposable C-Chip
Centrifuge tube Deltalab 352096, 429901 15 ml and 50 ml
Centrifuge Hettich Rotafix 32 A
Syringe 3 ml Shield Medicare Ltd 3039820
Pipettes Sterilin 40305, 47310, 40125 5, 10 and 25 ml
Gilson pipettes SLS F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 P2 - P1000
Pipette tips SLS PIP7852, PIP7834, PIP7840
Micro test tube 1.5 ml Eppendorf 30125.15
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
PicoGreen Assay Invitrogen P7589 Assay set-up in the dark
Black 96-well plate Greiner Bio One 655086
Fluorescent plate-reader BGM Labtech FLUOstar Optima
Glutaraldehyde 25% TAAB Laboratories G002 Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 999-97-3
Aluminium stubs (SEM) Agar Scientific G301
Carbon tabs (SEM) Agar Scientific G3347N
Gold sputter coater Edwards S150B
Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom World Phenom Pro

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References

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पाली (ε-caprolactone) Electrospun सूत पर मानव mesenchymal स्टेम सेल की कुर्की का अनुकूलन
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Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).More

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).

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