Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Оптимизация пристрастие к мезенхимальных стволовых клеток человека на поли (ε-капролактон) Electrospun пряжи

doi: 10.3791/52135 Published: April 10, 2015

Abstract

Исследование биоматериалов и тканевой инженерии часто включает исследования на основе клеток в пробирке, которые требуют знания начального исходного количества клеток. В то время как исследователи обычно ссылаются их плотность посева это не обязательно указывает на фактическое количество клеток, которые, присоединившимся к материалу вопрос. Это особенно относится к материалам, или лежа, которые не покрывают основание стандартных луночные культуральные планшеты. Это исследование исследует начальное прикрепление человека мезенхимальных стволовых клеток, посеянных на известном числа на electrospun поли (ε-капролактона) нити после 4 ч в культуре. Electrospun нити были проведены в течение нескольких различных наборах, в том числе в биореакторе судов, вращающихся с 9 оборотов в минуту, культура клеток вставками, расположенные в низких пластин обязательных скважин и политетрафторэтилена (ПТФЭ) желобов, размещенных в чашках Петри. Последние два были подвергнуты либо статических условиях или расположены на шейкере пластины (30 ° С, 5% СО 2, расположение посеянных клеток определяли с помощью анализа ДНК клеток. Леса были удалены из их контейнеров и помещали в буфере для лизиса. Носитель фракцию аналогично удаляют и центрифугируют - супернатант отбрасывали и осадок разбиты буфером для лизиса. Лизирующего буфера добавляли в каждый сосуд, или также и соскабливают, чтобы освободить любые клетки, которые могут присутствовать. Анализ ДНК клеток определяли процент клеток, присутствующих в строительных лесов, средства массовой информации и также фракций. Прикрепление клеток был низким для всех экспериментальных установок, с наибольшей привязанности (30%) для нитей, проводимых в рамках культуры клеток вставками и подвергают встряхивания. Это исследование повышает информированность к фактическому числу клеток, присущие Строительные леса независимо от заявленной плотности посева клеток.

Introduction

Строительные леса обычно разрабатываются и исследуются биоматериала и ткани инженерных приложений. Как таковые, они, как правило, засевают клетками и их поведение в пробирке, характеризующихся помощью анализов, которые определяют пролиферацию клеток и количество клеток, например. Для экспериментов, таких, как эти, крайне важно, чтобы исходное число клеток известны и исследователи часто заявляют концентрации посева с точки зрения числа клеток в мл или см 2. Хотя это хорошая практика, особенно для расширения масштабов деятельности целей, не учитывает фактическое количество клеток, которые прилипают к поверхности лесов (которая также зависит от адгезионных свойств поверхности биоматериала 1). Это особенно верно для строительных лесов, которые не покрывают всю базу культуры луночного планшета клеток, клетки могут отпасть от конструкции и, в связи с часто статический характер эксперимента, возможно, никогда не вернется в контакт с материалом интеотдых. Electrospun волокна нити являются хорошим примером эшафот, что не покрывает основание скважины (рис 1а). В этом случае, низкие луночные планшеты связывания, которые не были с обработанной поверхностью должны быть использованы для предотвращения клетки от прикрепления к поверхности пластины и, следовательно, искажающие результаты любого хорошо основе анализа.

Ну пластины легко использовать для посева клеток на строительные леса, но они не являются единственным методом,. Поворотные системы для культивирования клеток, типа биореактора, разработанный Отделом наук о жизни в НАСА в конце 1980-х, так же может быть использован для семян строительных лесов в трехмерном (3D) окружающей среды с имитацией невесомости. Этот тип биореактора остается популярным выбором с исследователями по всему миру и была включена в исследованиях для сотового сигнализации 2,3, стволовые клетки 4,5 и тканевой инженерии 6,7. Что делает поворотный биореактор в удобное для луночных планшетах является обслуживаниеиз 3D-среде, что помогает предотвратить дифференцированные клетки от dedifferentiating, как это часто бывает при культивировании в обычных 2D условиях 8.

Эта статья исследует различные методы для посева мезенхимальных стволовых клеток человека на electrospun поли (ε-капролактон) пряжи волокна, как изготовлены в Босуорт и др., 9, с тем, чтобы максимально начальное число клеток, присущие этим лесов в течение 4 ч. Для 2D культуры, пряжа надежно удерживается в пределах луночных планшетах или на заказ поли (тетрафторэтилена) (PTFE) желобов и выдерживают при статических условиях, или встряхивали при 30 оборотах в минуту. Для 3D культуры, пряжа и клетки проводились в биореакторе судов, вращающихся с 9 оборотов в минуту.

Protocol

1.Scaffold Изготовление и стерилизации

  1. Растворите PCL в 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропаноле, чтобы дать 10% W / концентрацию V. Как описано в Босворте др 9 electrospin полимерного раствора (параметры: 20 кВ, 1 мл / ч, 20 см). Выровнены и собирать волокон на краю вращающегося дорна (600 оборотов в минуту). С помощью скальпеля удалить ленту собранного волокна, а затем разрезать на более короткие отрезки - 3 см (для прогибов и ротационных судов), и 4 см (для культивирования клеток вставки) длины.
  2. Использование тонких щипцов погрузиться отдельные полосы в дистиллированной воде и удалить.
  3. Проведение оба конца между большим и указательным пальцами; вручную крутить полосу, пока это не напоминает резьбу.
  4. Кратко погрузиться эту тему, как эшафот в дистиллированной воде и поместите на чистую, неволокнистого карты, чтобы высохнуть.
  5. После высыхания, место отдельно в чистом микроцентрифужных пробирках и добавить 1 мл 50% объем / объем этаноле в дистиллированной воде. Закройте крышки и оставьте на 24 ч.
    Примечание: Выполните следующие действия в соответствии ламинарного потока:
  6. Поместите микроцентрифужных пробирок в шкафу с ламинарным потоком и аспирации 50% раствор об / об. Замените 1 мл 70% об / об этанола в дистиллированной воде, закройте крышками и оставьте на 24 часов.
  7. Повторите 90% и 100% об / об этанола в дистиллированной воде (1 мл объемы).
  8. Промыть каркасов в два раза фосфатным буферным солевым раствором (PBS), 24 часа в сутки на промывку (2 × 1 мл).
  9. Удалить PBS и заменить среды для культивирования клеток 1 мл. Примечание: Строительные леса будут готовы к использованию после 24 часов.

2. Определение Леса площадь поверхности и число клеток

  1. С помощью светового микроскопа и обработки изображений, измерить диаметр electrospun нити вдоль ее длины, чтобы определить среднее значение.
  2. Предположим, что нить цилиндрический стержень и аппроксимировать поверхность с помощью:
  3. Где = Площадь, г = радиус и ч = длина
    Примечание: площадь поверхности была рассчитана на 18 902800 мкм 2. Кроме того, следует отметить, что фактическая площадь поверхности будет больше, чем в этом расчете нить состоит из сотен тонких волокон, что позволит увеличить площадь поверхности. Следовательно большее количество клеток должно быть в состоянии приложить на эшафот. Тем не менее, это не влияет на прямое сравнение между тестовыми группами делается.
  4. Определите максимальное количество ячеек, которые могут прикрепляться к открытой поверхности лесов по:
    Примечание: с помощью светового микроскопа и обработки изображений, диаметр мезенхимальных стволовых клеток человека было установлено, что 20 мкм (при условии, клетки круглые), поэтому в данном случае, число клеток = 60200.

3. Леса Set-до - Культура клеток Вставки (1А)

  1. Под ламинарного потока, откройте стерильные культуры клеток, вставки 6-а и отделить короткие кольца с зубами от широкого кольчатых органов.
  2. Возьмите кольцо с зубами вверх. Накройте одинКМ лесов 4 на центр кольца, убедившись, что он перекрывает с обеих сторон. Возьмем кольцами тела и положение над зубчатым кольцом и строительные леса и нажать вниз убедившись, что каркас находится в положении, и проходит через центр клеточной культуры вставки.
  3. Поместите клеточной культуры вставку с помоста в лунку 6-луночного, низкой связывающей пластине.
  4. Добавить 10 мл культуральной среды на эшафот.

4. Леса Настройка - желоб (рис 1B)

  1. Под ламинарного потока, место поли (тетрафторэтилена) (PTFE) желоба в отдельных чашках Петри и добавить 10 мл культуральной среды в желобе.
  2. Использование щипцов драпировать один из 3 см лесов в корыто, убедившись, что его длина лежит параллельно длинной стороны желоба в.

5. Леса Настройка - биореактора (рис 1C)

  1. Под ламинарного потока, обойтись 10 мл стерильной PBS через биореактор судовыхГлавный порт и оставить на 10 мин.
  2. Снимите PBS и заменить 8 мл культуральной среды.
  3. Использование щипцов, вставить один из см лесов 3 в сосуд через основной порт.
  4. Закройте главный порт.

6. Cell Counting

  1. Культура человека мезенхимальные стволовые клетки (hMSC), полученных из костного мозга в зависимости производитель протокола до прохода 4 до уборки урожая.
  2. Аспирируйте средств массовой информации из 75 см 2 колбу, содержащую hMSCs, полученные из костного мозга (проход 4, 80% слияния).
  3. Вымойте клеток с 10 мл стерильного PBS и аспирации.
  4. Добавить 3 мл трипсина и инкубируют в колбе при 37 ° С, 5% СО 2 до тех пор, пока клетки не были смещены от поверхности колбы.
  5. Добавить 7 мл питательных сред для инактивации фермента и перенести этот общий объем (10 мл) в центрифужную пробирку.
  6. Ресуспендируют этой клеточной суспензии с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы равномерно рассеять клеток вСМИ и ограничение клеток агломераты (10 мл пипетки).
  7. Удалить 20 мкл суспензии и передачи клеток в гемоцитометра.
  8. Поместите гемоцитометр под световым микроскопом и изображения на x10 цели.
  9. Фокус сетки и подсчитывается количество ячеек в 4 х 4 квадратов в каждом углу сетки и которые подпадают площади, и те, которые пересекают правую руку или нижнюю границу. Граф для каждого набора 4 х 4 квадратов (4 числа на сетке).
  10. Повторите Ресуспендирование и число элементов в три раза (шаги 6.6-6.9).
  11. Рассчитайте среднее число клеток и определения объема средств массовой информации, необходимых для клеток ресуспендирования (концентрация клеток 60200 в 200 мкл). Например, определить среднее количество клеток с гемоцитометра а затем определить общую среднее число клеток из трех отдельных импульсов. Умножьте это на 1 х 10 4, чтобы дать число клеток в мл, а затем умножить на общий объем клеточной суспензии чтобы отдатьTal количество клеток. Используйте следующую формулу для определения объема средств массовой информации, необходимых для взмучивания:
  12. Центрифуга клеточной суспензии в 241 мкг в течение 5 мин.

7. посева клеток

  1. Аспирируйте носитель из центрифугирования трубы оставляя осадок клеток и заменить с расчетного объема средств массовой информации.
  2. Ресуспендируют клетки и средств массовой информации для смешивать.
  3. С помощью пипетки Gilson P200, медленно обойтись 200 мкл клеточной суспензии на каждый помост, выполнив кончик пипетки по длине лесов и ниже поверхности жидкости массовой информации. Оставьте в покое в течение 20 мин.
  4. Для биореактора судов, обойтись 200 мкл клеточной суспензии через основной порт. Пополнение остальные культуральные среды 2 мл с помощью шприца портов, чтобы дать общий объем 10 мл.

8. Экспериментальная Начало

  1. Трансфер в биореактор суда в биореактор RCCS-4DQ и установить, чтобы повернуть на 9 оборотов в минуту.
  2. TranSFER хорошо пластины с клеточной культуры вставками и впадинами в шейкере, пластины и установить, чтобы повернуть на 30 оборотов в минуту.
  3. Передача также таблички с клеточной культуры вставками и впадинами на шельфе мобильный инкубатор при 37 ° С, 5% CO 2 (статическая культура).

9. Анализ ДНК

  1. Готовят растворы - лизис буфера, 1x TE буфера, стандарты ДНК и рабочего раствора ДНК клеток - в соответствии с инструкциями производителя.
  2. После 4 ч, удалить образцы из инкубатора и помещают под ламинарном потоке.
  3. Удалить медиа фракции из всех образцов и поместите в отдельно помечены центрифужные пробирки. Центрифуга трубок 241 XG. Удалить супернатант и добавить 3 мл буфера для лизиса. Ресуспендируют решение ломка осадок клеток.
  4. Использование щипцов удалить каркасов и место в центрифужные пробирки, содержащие 3 мл буфера для лизиса (для строительных лесов в биореакторе сосудов, снять на эшафот до аспирации меняАСВ). Для лесов, проводимых в рамках культуры клеток вставками, сначала освободить эшафот за счет сокращения на эшафот близко к краю вставки, используя скальпель.
  5. Добавить 3 мл буфера для лизиса каждому лесов емкость и царапать поверхность (энергично агитировать за биореакторные сосудов). Снимите буфер для лизиса и поместить в отдельно помечены центрифужные пробирки.
  6. Вихревой друг центрифужную пробирку в течение приблизительно 1 мин, чтобы обеспечить достаточное перемешивание клеток и буфера и стимулировать лизис клеточной мембраны.
  7. В черном 96-луночного планшета, добавить 100 мкл буфера для лизиса для каждого образца фракции - строительные леса, СМИ и хорошо (дубликат).
  8. В темноте, добавить 100 мкл раствора ДНК клеток во все лунки, содержащие буфер для лизиса и аккуратно перемешать.
  9. Включить скважин с буфером для лизиса, не содержащей ДНК и ДНК клеток решение для обеспечения отрицательного и положительного контроля для пластины также.
  10. Использование флуоресценции пластины-ридер, измеряют поглощение скважиныс с помощью 485 нм возбуждение и 520 нм эмиссия.
  11. Сравните данные со стандартной кривой, полученной из ДНК-стандартами, как в соответствии с инструкциями производителя.

10. Сканирующий электронный микроскоп (SEM) Фиксация

  1. Выполните следующие действия в соответствии с ламинарного потока: После 4 часов, удалите все каркасы из своих сосудов и место в новой 6-луночного планшета (отдельные скважины).
  2. Вымойте каркасов дважды PBS.
  3. Выполните следующие действия на открытом скамейке: В каждую лунку добавляют 2 мл 1,5% об / об глутаральдегида в PBS, чтобы обеспечить полный охват эшафот.
  4. Оставьте пластину для минимального 30 мин при 4 ° С для фиксации клеток.
  5. Снимите фиксирующий раствор и промойте каркасов дважды PBS.
  6. Обезвоживают каркасов с возрастающими концентрациями этанола в дистиллированной воде, начиная с 50% об / об, с последующим 70% об / об и 90% об / об. Для каждой концентрации, полностью погрузите строительные леса SOLUTION (2 мл) и оставить на 3 мин. Отменить решение и повторить.
  7. Высушить в 100% -ном этаноле, полностью погружением каркасов в растворе (2 мл) и оставить на 5 мин. Отменить решение и повторить.
  8. Химически сухой строительные леса, используя гексаметилдисилазана (HMDS) в вытяжном шкафу. Погрузитесь строительные леса HMDS (2 мл) и оставить на 5 мин. Снимите HMDS и повторите.
  9. Снимите HMDS и позволяют каркасы для просушки. Установите каркасов на коммерчески доступных SEM ответвлений (в данном случае из нержавеющей стали штыри с клеем углерода вкладок).
  10. Чтобы облегчить просмотр в SEM, пальто образцы с использованием золота дл покрыти распылением в течение 2 мин, чтобы обеспечить тонкую и равномерное покрытие.
  11. Образцы место в РЭМ и визуализировать клеточные семенами каркасов помощью электронно-лучевой 5 кэВ.

Representative Results

Результаты свидетельствуют о местонахождении клеток после 4 ч после посева для каждого экспериментальной установки исследованы. показывает процент клеток, которые, прикрепленный к поверхности лесов в течение этого времени. Коэффициент преобразования 8,5 пг / клетку используют для преобразования измеренного содержания ДНК в числе клеток и, таким образом, определить процент клеток 10. Для всех посева Set-взлеты расследование, процент прикрепление клеток является относительно низким, с наибольшей приверженностью клеток (30%) для строительных лесов, проводимых в рамках культуры клеток вставками и встряхивали при 30 оборотах в минуту (Insert Shaker). Самая низкая приверженность (15%) был для лесов, проводимых в рамках культуры клеток вставками и выдерживают при статических условиях (Вставка Static).

Большое количество клеток присутствовало в медиа-фракции (Фигура 2В), прежде всего для культивирования клеток вставками, проводимых в низких связывания пластин (Вставка статических) и поворотные сосудах на 50% и 51%соответственно. Строительные леса, проводимые в желобах продемонстрировали повышенного числа клеток, присутствующих в самой держателя - 48% клеток для прогиба Shaker и 50% для прогиба Static.

Сканирующая электронная микроскопия позволила визуальной оценки клеточных семенами лесов (рис 3). Типичные изображения выделены ограниченное присутствие клеток на волокнистую поверхность, независимо от посева настройки. Тем не менее, большее количество клеток и клеточных агломератов присутствовали на каркасах, проведенных в культуре клеток вставки и встряхивали при 30 оборотах в минуту (Вставка Shaker).

Фигура 1
Рисунок 1. Экспериментальная установка окон, где Electrospun Пряжа проводится в рамках; (А) клеточных культур вставки и низкого связывания пластины и (б) поли (тетрафторэтилена) (PTFE) и желоба Петри; и (C) биореактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Расположение клеток 4 ч после посева на PCL Electrospun пряжи с использованием различных Сеялки Наладки. (А) демонстрирует процент клеток, которые, прикрепленных к PCL помост (среднее значение ± стандартное отклонение), (б) указывает процент распространение расположения клеток в течение трех фракций - медиа, а каркас и (N = 4, данные, представленные в средние значения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3

Рисунок 3. Типичные сканирующем электронном микроскопе для PCL Electrospun пряжи с мезенхимальных стволовых клеток человека, 4 часа после начальной инициализации, с использованием различных экспериментальных установок. (Все изображения 1,000X увеличения, масштаб бар = 130 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия этой фигуры.

Discussion

Electrospun волокна матрицы, изготовленные из биополимеров регулярно используются для поддержки прикрепление клеток и пролиферацию биоматериала и / или тканевой инженерии 11,12. В этих случаях, матрицы часто тонкие листы волокон, которые легко покрывают всю базу луночного планшета для культивирования клеток и, таким образом, находятся в полном контакте с посеянных клеток, что улучшает прикрепление клеток. Однако, если биоматериал леса не полностью покрыть дно-луночного планшета, есть высокая вероятность того, что большая часть из посеянных клеток не оставаться в контакте с эшафота и в конечном итоге не сможет присоединить. Это исследование исследовали несколько различных методов для посева клеток на каркасах, которые не покрывают основание пластины а, с тем чтобы определить оптимальную методику, что может быть рекомендован для будущих экспериментов на основе клеток.

Пять различных наборах были исследованы (рисунок 1): scaffoLDS (electrospun пряжи), которая состоялась с помощью клеточных культур вставки в низких пластин связывания также и либо хранится в статических условиях или встряхивали при 30 оборотах в минуту; леса, размещенные в узких впадин ПТФЭ и провел статический или встряхивали при 30 оборотах в минуту; и леса расположены внутри биореактора судов, вращающихся с 9 оборотов в минуту. Определение количества клеток, которые присоединились к electrospun нитей на анализе ДНК продемонстрировали низкий процент крепления для всех высева наборах (рисунок 2); и это было дополнительно подтверждено с помощью сканирующего электронного микрофотографии (SEM) (Рисунок 3). Наибольшее привязанность клеток - 30% или ~ 18 060 клеток -был наблюдается нитей, которые были проведены в культуре клеток вставками и подвергаются постоянному движению. Интересно, что низкое прикрепление клеток (15%) была достигнута для нитей, принадлежащих культуре клеток вставок, но хранится в статических условиях, которые бы предположить, что включение радиального движения имеет положительный эффект на сохранение клеток в контакт с помоста. Тем не менее,следует отметить, что непрерывное кружение потока средств массовой информации может быть ответственным за клеточных агломератов, наблюдаемых от изображений SEM. Шейкер плита была установлена ​​на минимальное значение - 30 оборотов в минуту - что может быть ограничение этой установки. Используя более медленный радиальное движение может помочь предотвратить или уменьшить агломерацию клеток, а также может улучшить прикрепление клеток в клетки будут испытывать меньше силы. Дальнейшие эксперименты должны быть направлены на оптимизацию идеальную скорость шейкер для улучшения прикрепления клеток. Включение движение пряжи, проводимых в рамках впадин не привести к аналогичная тенденция, с оба сценария получают 18% вложение (~ 10 836 клеток); хотя это может быть из-за частичного размещения каркасов внутри желобов (наблюдается для желобов, размещенных на пластине шейкера), поскольку они не были прикреплена к основанию. Частичное плавающей строительных лесов позволит предотвратить любые клетки, которые канули на дно желоба от соприкосновения с материалом и придерживаясь. Для тего особенности установка, желоб размещается в чашку Петри и общий объем 10 мл СМИ. Небольшие размеры желоба означает, что большинство СМИ присутствует в чашке Петри, и если есть какое-либо движение, клетки могут отойти от кормушки в чашку Петри и остаются полностью вне досягаемости эшафот. Чтобы преодолеть эти ограничения, дальнейшие эксперименты должны включать дополнительный шаг в протоколе, в котором концы лесов возлагаются на базе желобов, используя стерильные тонкие иглы-как это должно предотвратить их размещения и перемещения (особенно для строительных лесов, подвергающихся радиальное движение), что в конечном итоге должно привести к увеличению числа клеток, присущие эшафот. 16% клеток были прикреплены к нити, присутствующие в поворотных сосудов. Несмотря на то, хорошо разработанный метод 3D культуры, проблемы же возникают с удалением лесов от главного порта судов, которые, возможно, в результате распущенным ATTACHED клетки теряется. Суда, которые могут быть полностью открыты бы устранить эту проблему; они доступны для приобретения, но значительно дороже, чем одноразовых сосудов, используемых в данном исследовании.

Это исследование демонстрирует текущие вопросы с посевом подмости, которые не покрывают всю базу стандартных луночные культуральные планшеты. Сеялки известное число клеток в результате менее трети крепления на эшафот, несмотря на поверхности эшафот, обеспечивающего все клетки придерживаться. Это может иметь негативные последствия в других анализах на основе клеток, которые могут оценить биосовместимости и клеточной материал / клетка-клетка поведение и взаимодействие с эшафота, как потенциального будущего медицинского устройства. Дальнейшие ограничения исследования могут включать в себя 4 ч момент времени - несмотря на то достаточно долго, чтобы обеспечить начальную посева клеток (клетки, как было показано, чтобы прочно прикрепить к подложкам в течение тридцати минут 13,14,15), это может быть целесообразным вvestigate позже временных точках предоставления клетки не размножаются в течение более длительного времени кадра, как это было в противном случае исказить начальный номер ячейки. Уменьшение объемов информации, в данном случае 10 мл, может также улучшить контакт между клетками и строительные леса и в конечном итоге повысить прикрепление клеток. Будущие исследования также должны учитывать жизнеспособность клеток как процесс посева клеток могут привести к повреждению клеток и / или клеточной смерти 16. Анализы ДНК клетки не различать жизнеспособных и нежизнеспособных клеток, как например живой / мертвых анализа, например, хотел бы подчеркнуть уровень жизнеспособности.

Это исследование повышает информированность к фактическому числу клеток, которые прикрепляются к плахе, несмотря посева известное количество. Для исследований, которые полагаются на стартовой числа клеток, это очень важно, что исследователи знают, сколько именно этой цифры действительно фактически придерживаться подложки интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить и признать Совет по медицинским исследованиям за финансирование этого исследования - MRC-ДСФ грант код G1000788-98812.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water in-house supply n/a
Ethanol Merck 1117271000
Phosphate Buffered Saline solution Life Technologies 70013016
Human mesenchymal stem cells PromoCell GmbH C-12974
MSC culture media PromoCell GmbH C-28010B Warmed to 37 oC before use
Supplement mix PromoCell GmbH C-39810 Add to culture media
Antibiotic/antimyotic mix Sigma-Aldrich A5955 Add to culture media
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) Sigma-Aldrich 59417C Warmed to 37 °C before use
Cell culture flasks (T75) Becton Dickinson Ltd 353110
Low binding 6-well plates Costar Corning 3471
6-well CellCrowns Scaffdex C00003S
Petri-dish 50 ml deep Sterilin 124
PTFE troughs in-house production n/a
Disposable RCCS vessels 10 ml Synthecon D-410
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor Synthecon RCCS-4DQ
Shaker plate Stuart SSM1 Mini Orbital Shaker
Haemocytometer Digital Bio DHC-F01 Disposable C-Chip
Centrifuge tube Deltalab 352096, 429901 15 ml and 50 ml
Centrifuge Hettich Rotafix 32 A
Syringe 3 ml Shield Medicare Ltd 3039820
Pipettes Sterilin 40305, 47310, 40125 5, 10 and 25 ml
Gilson pipettes SLS F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 P2 - P1000
Pipette tips SLS PIP7852, PIP7834, PIP7840
Micro test tube 1.5 ml Eppendorf 30125.15
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
PicoGreen Assay Invitrogen P7589 Assay set-up in the dark
Black 96-well plate Greiner Bio One 655086
Fluorescent plate-reader BGM Labtech FLUOstar Optima
Glutaraldehyde 25% TAAB Laboratories G002 Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 999-97-3
Aluminium stubs (SEM) Agar Scientific G301
Carbon tabs (SEM) Agar Scientific G3347N
Gold sputter coater Edwards S150B
Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom World Phenom Pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jauregui, H. O. Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells. ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33, (2), 66-74 (1986).
  2. Puca, A., Russo, G., Giordano, A. Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's. Oncotarget. 3, (4), 426 (2012).
  3. Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway. Annals of biomedical engineering. 33, (10), 1405-1410 (2005).
  4. Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Cellular Reprogramming. 15, (5), 443-458 (2013).
  5. Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Molecular biotechnology. 54, (2), 331-336 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (21-22), 2376-2385 (2012).
  7. Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering. Clinical Orthopaedics and Related Research. 471, (8), 2422-2433 (2013).
  8. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281, (1), F12-F25 (2001).
  9. Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24, (6), 1605-1614 (2011).
  10. Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (7-8), 757-767 (2011).
  11. Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels. Biomaterials. 35, (9), 2713-2719 (2014).
  12. Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro. Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).
  13. Yavin, E., Yavin, Z. Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface. The Journal of cell biology. 62, (2), 540-546 (1974).
  14. Chen, H. Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91, (21), 10148-10152 (1994).
  15. Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell. 58, (5), 933-943 (1989).
  16. Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnology and bioengineering. 64, (5), 580-589 (1999).
Оптимизация пристрастие к мезенхимальных стволовых клеток человека на поли (ε-капролактон) Electrospun пряжи
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).More

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter