Summary
De MATLAB-gebaseerde, open source software pakket, plusTipTracker, kan worden gebruikt voor het analyseren afbeelding reeks van fluorescent gelabelde + tips om dynamiek van microtubuli kwantificeren.
Abstract
Microtubuli (MT) plus-eind volgen eiwitten (+ tips) te lokaliseren aan de groeiende plus-uiteinden van MT's en reguleren MT dynamiek 1,2. Een van de meest bekende en algemeen gebruikte + filtreren voor het analyseren MT dynamiek de End-bindingseiwit, EB1, waarbij alle groeiende MT plus-uiteinden bindt, en dus is een merker voor MT polymerisatie 1. Veel studies van EB1 gedrag binnen de groei kegels zijn tijdrovend en vooringenomen computerondersteunde, met de hand bijhouden methoden gebruikt om individuele MT 1-3 analyseren. Onze aanpak is om globale parameters van MT dynamiek met behulp van het softwarepakket, plusTipTracker 4, na de overname van een hoge resolutie, live beelden van gelabeld EB1 in gekweekte embryonale groei kegels 5 kwantificeren. Deze software is een MATLAB-gebaseerde, open-source, gebruiksvriendelijk pakket dat geautomatiseerde detectie, tracking, visualisatie en analyse voor films van fluorescent-gelabelde + TIP's combineert. Hier presenteren we het protocol voor het gebruik van plusTipTracker voor de analyse van fluorescent-gelabelde + TIP kometen in gekweekte Xenopus laevis groei kegels. Echter kan deze software ook worden gebruikt om MT dynamiek karakteriseren verschillende celtypen 6-8.
Introduction
Het doel van deze methode is kwantitatieve informatie over microtubuli (MT)-plus-end volgen proteïne (+ TIP) dynamiek in levende groei kegels verkrijgen. MT + TIP's zijn een groep van eiwitten die lokaliseren aan de plus-uiteinden van MT 9,10. Zij voeren een groot aantal functies om de parameters van MT dynamische instabiliteit 11, met inbegrip van de tarieven van de polymerisatie, catastrofe, en redding te reguleren. Een veel gebruikte werkwijze voor het analyseren MT dynamiek het gedrag van de + TIP EB1, dat specifiek bindt aan groeiende MT plus 1,12 details volgen. EB1 is bekend dat een aantal andere eiwitten te werven om aan de groeiende MT plus-ends 13,14, en is onlangs opgericht als een MT rijping factor 15, het bevorderen van zowel MT groei en catastrofe frequentie 15,16.
Veel studies van MT dynamiek binnen de groei kegels zijn hand volgen methoden om veranderingen in EB1-GFP dynamiek in de tijd 1-3 te meten gebruikt, zoals EB1 localizatiop MT plus-uiteinden kunnen worden gebruikt als een marker voor MT polymerisatie. Een belangrijk voordeel voor de behandeling EB1-GFP kometen als een proxy voor de MT groei is dat MT dynamiek kan worden gemeten, zelfs in regio's van belangrijke MT overlap. Hoewel de werkwijze hand bijhouden EB1-GFP kometen nuttige inzichten voorziet in MT gedragingen 1-3, is tijdrovend en kan worden voorgespannen. Bovendien, als afwijkende groei kegel gedrag waarschijnlijk het gevolg van minuut verschuivingen in het cytoskelet dynamiek, het analyseren van slechts een klein deel van de MT's (meestal nodig bij de hand-opsporing) belangrijke informatie kunnen missen.
Zo meten we globaal MT dynamiek parameters met behulp van het softwarepakket, plusTipTracker 4, na de overname van een hoge resolutie, live beelden van gelabeld EB1 in gekweekte embryonale groei kegels 5. Deze software, ontwikkeld in de Danuser Lab, is gebruikt in verscheidene studies karakteriseren MT dynamiek in verschillende celtypen 6-8. Het is een open-source, onser-vriendelijke, MATLAB-gebaseerde pakket dat geautomatiseerde detectie, opsporing, visualisatie en analyse voor films van fluorescent-gelabelde + TIP's omvat. Een lange lijst van specifieke parameters van MT dynamiek wordt berekend door deze software (zie referentie 4 voor details), maar voor de analyse van MT dynamiek in de groei kegels, de meest bruikbare parameters MT groeipad snelheid (in microns / minuut), de groei spoor Levensduur (in seconden) en de groei baanlengte (in microns). De software kan rechtstreeks vanaf de website Danuser Lab te downloaden (onder 'Software'). Terwijl de Danuser Lab ondersteunt momenteel een nieuwere interface voor + TIP bijhouden analyse, die is opgenomen in een software pakket genaamd u-spoor 2.0, de oorspronkelijke, stand-alone software zal beschikbaar blijven. De onderliggende algoritmes tussen beide programma's hetzelfde (althans 2014), met slechts een verschil interface en analyse outputs. Voor de beginnende gebruiker met weinig MATLAB en / of geautomatiseerde analyse experirentie, plusTipTracker heeft meer gebruiksvriendelijke functies, waaronder automatische statistische parameter uitgangen.
Hier beschrijven we de stappen voor het analyseren van beelden van EB1-GFP dynamiek in gekweekte Xenopus laevis groei kegels. Dit protocol werd gebruikt in een recente paper MT dynamiek 17 onderzoeken. Zie ook Lowery et al. 2012 5 voor gedetailleerde instructies over het kweken groei kegels uiten EB1-GFP. Hoewel dit document vooral gericht op EB1-GFP dynamica in groei kegels behandeling kan hetzelfde protocol worden gebruikt voor andere celtypes 17. Voor alle celtypen, moet het tijdsinterval tussen frames tussen 0,5-2 seconden voor optimale + TIP tracking. Een tijdsinterval van maximaal 4 seconden tussen frames mogelijk, maar deze verhoogde interval leidt tot extra spoorvolgfouten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol en de video zijn bedoeld om te dienen als een aanvulling op de oorspronkelijke papieren beschrijving van het softwarepakket in meer detail 4, alsmede het technisch rapport dat wordt geleverd met de software te downloaden op de website Danuser Lab. Lezers worden aangemoedigd om deze documenten zorgvuldig te beoordelen of er extra vragen over het gebruik van de software.
1 Voorafgaand aan beeldanalyse
- Convert elke time-lapse film in een reeks van TIFF (Tagged Image File Format) beeldbestanden. Als er meerdere groei kegels / cellen in een bepaalde film, eerste oogst elk groeikegel / cel om zijn eigen reeks beelden te creëren.
Opmerking: Dit is niet nodig, als afzonderlijke regio-of-interest (ROI) kunnen worden geselecteerd binnen plusTipTracker. Het gebruik van kleinere afmetingen beeld verhoogt de snelheid van de rekenkundige bewerking, dus deze stap wordt aanbevolen als er aanzienlijke lege ruimte in het beeld. - Sla elke TIFF-serie in zijn eigenmap met de naam "beelden" in een pad dat MATLAB is ingesteld op toegang (merk op dat "beelden" is hoofdlettergevoelig). Om een nieuw pad toe te voegen, gaat u naar het desbetreffende bestand directory in het venster "Huidige map", klik met de rechtermuisknop op het pictogram van de map en selecteer "Toevoegen aan Path - Geselecteerde mappen en sub-mappen". Belangrijk is dat de software map plusTipTracker worden toegevoegd aan het pad, ook.
2 plusTipGetTracks
Opmerking: De eerste stap in de beeldanalyse is om de EB1-GFP kometen op te sporen, te koppelen van de kometen in tracks, en het bepalen van de parameters van de dynamiek van microtubuli. Dit wordt verkregen met het commando "plusTipGetTracks" 4.
- Tot analyse, geopend MATLAB applicatie beginnen en typ "plusTipGetTracks" in het commando venster. Dit zal leiden tot een nieuw dialoogvenster weergegeven.
- Klik op "Set Up New Projects" en kies een (of more) van de vorige TIFF afbeelding serie door de juiste "images" map (of mappen met "beelden" mappen) te selecteren. Na voltooiing van deze stap, een bestandsmap (roi_1) zal worden gemaakt (in dezelfde map die "beelden" houdt) dat zal de toekomst gegevensbestanden bevatten. Let op: de "Set Up New Projects" stap kan van tevoren worden afgerond, tijdens een aparte sessie.
- Een nieuw venster zal verschijnen: "Selecteer een veelhoek, klik met de rechtermuisknop op de laatste punt, en klik op 'Create Mask'". Klik op "OK". Het eerste beeld van de geselecteerde afbeelding serie wordt dan weergegeven. Gebruik de muis te klikken en maak een polygoon die het geheel van de groei kegel omvat. Dubbel klik op de muis om de veelhoek te sluiten.
- Zodra de veelhoek is gesloten, zal een dialoogvenster verschijnen: "Wilt u nog een ROI te kiezen?" Heeft het beeld een andere groeikegel te analyseren, "Ja"; anders suitverkorenen "Nee".
- Selecteer de projecten die onmiddellijk zullen worden geanalyseerd. Klik op "Selecteer Projects" en selecteer de map (roi_X) te analyseren.
- Een listSelectGUI scherm verschijnt. Selecteer het project (s) vanaf de linkerzijde van het scherm en verplaatsen ze naar de rechterkant van het scherm. Klik op "OK". Kies een locatie aan de lijst project op te slaan en klik op "Opslaan".
- Selecteer "Detectie", "Tracking" en "Post-Processing". Zodra deze selecties zijn gemaakt, zal de rechterkant van het dialoogvenster geconfigureerd worden. Configureer elke optie.
- Deze parameters worden gebruikt om gedetecteerd kometen verwijzen naar MT tracks. Details voor de keuze van deze controle parameters voor het bijhouden van zijn opgenomen op de pagina's 9-10 van het Technisch Rapport PDF die het softwarepakket te downloaden begeleidt; Lees dit verslag of de problemen worden ondervonden. Voor de toepassing van het bijhouden EB1-GFP kometen in Xenopons laevis groei kegels, gebruikt u de volgende Tracking Instellingen: Zoeken in een straal van Range (pixels) 5-12, Minimum Sub-Track Lengte (frames) 3; Max Gap Lengte (frames) 8; Max Krimp Factor 0.8, Max hoek Voorwaarts 50, Max hoek achteruit 10, Fluctuation Radius 2.5. Deze instellingen worden getoond in figuur 1.
Opmerking: Max Krimp Factor ingesteld op het aantal "backward gaps" gedetecteerd, want een "backward gaten" niet bruikbaar te analyseren in de context van groei kegels, gezien de overvolle omstandigheden die fouten in spoor bindingen. Bovendien, zowel Max doorgeven hoek en fluctuatie Omgeving liggen relatief hoog, zoals groeikegel MT vertonen kleine frequent translocaties naast groei en krimp, en verhogen deze besturingsinstellingen maakt deze verhoogde beweging in de koppeling stap.- Vul in het Post-Processing Instellingen, afhankelijk van de gewenste specifieke beeldaanwinst instellingen.
- Zodra de instellingen zijn geconfigureerd, klikt u op "Start". De software zal draaien welke instellingen zijn geselecteerd. Dit kan minuten tot uren, afhankelijk van het aantal geselecteerde projecten en hun grootte. De Command Window geeft de geschatte resterende tijd voor elke functie. Wanneer de plusTipGetTracks stap is voltooid, zal het Command venster weer te geven "Klaar!"
Opmerking: Een lange lijst van specifieke parameters van MT dynamiek zijn nu berekend door deze software (zie referentie 4 voor details), maar voor de analyse van MT dynamiek in de groei kegels, de meest bruikbare parameters te onderzoeken zijn MT groeipad snelheid (in microns / minuut), groeispoor levensduur (in seconden) en de groei baanlengte (in microns).
3 plusTipSeeTracks
Opmerking: Nu de microtubuli tracks zijn gedefinieerd, de functie "plustipSeeTracks" wordt gebruikt voor het spoor visualisatie 4. Deze functiekan bieden meerdere uitgangen voor visualisatie, inclusief ruimtelijke MT dynamiek kaarten en speed films, maar hier ligt de focus uitsluitend op het gebruik van "Track Movies" naar MT tracks bovenop de groeikegel beelden weer te geven. Terwijl plusTipGetTracks kan analyseren meerdere films op een moment, kan plusTipSeeTracks alleen analyseren een film tegelijk.
- Typ "plusTipSeeTracks" in het commando venster.
- Na het dialoogvenster wordt geladen, klik op "Select Project". Selecteer de bovenliggende map met het project te visualiseren en klik op "Select Folder". Een nieuw venster wordt weergegeven: "Selecteer het project dat u wilt visualiseren". Kies het bestand om te visualiseren en klik op "OK".
- Vervolgens klikt u op "Selecteer Opgeslagen ROI". Navigeer naar dezelfde roi_X map als de in de vorige stap een en selecteer het bestand met de naam "roiYX".
- Klik op "Select Output Directory 'voor de omschrijving whier MATLAB zal de baan visualisatie bestanden op te slaan. Opmerking: Wij raden het gebruik van dezelfde map met de rest van de gegevens bevat.
- Selecteer "Maak Track Movie" en een scherm zal verschijnen met alle tracks plusTipGetTracks berekend op basis van de + TIP kometen. Deze stap slaat de bijgehouden tijdreeksen in een film formaat, in het bestand "allTracks_X_X_X". Er is een optie voor het opslaan van de film als AVI, anders is de standaard indeling is als een Quicktime.mov bestand.
4 plusTipGroupAnalysis
Opmerking: Deze laatste functie wordt gebruikt om groepen van films te maken voor analyse en vergelijking van hun MT spoor parameters.
- Typ "plusTipGroupAnalysis" in het commando venster. Om de groepen handmatig te selecteren om te vergelijken, eerst de-selecteer "Auto groep van hiërarchie". Klik vervolgens op "Select projecten". Navigeer naar de bovenliggende mappen met daarin alle roi_X mappenanalyseren.
- Een listSelectGUI scherm verschijnt. Selecteer alle projecten in de groepen op te nemen vanaf de linkerkant van het scherm en beweeg ze over naar de rechterkant van het scherm. Klik op "OK". Kies een locatie aan de lijst project op te slaan en klik op "Opslaan".
- Er verschijnt een venster: "Selecteer de eerste groep in de lijst". Klik op "OK". Het venster listSelectGUI zal opnieuw weer te geven. Deze keer, selecteer alleen de bestanden die overeenkomen met de eerste groep die samen moeten worden samengevoegd. Klik op "OK".
- Voer vervolgens de naam van de groep, en klik op "OK". Er verschijnt een venster: "Kies een andere groep?" Antwoord dienovereenkomstig en blijven selecteren van groepen. Er verschijnt een venster: "Selecteer een locatie om uw groep lijst op te slaan". Navigeer naar de locatie en klik op "Opslaan".
- Klik op "Select Output Directory" om te kiezen waar de output mappen zal zijnopgeslagen.
- Kies welk type groep analyse uit te voeren - of de MT wegen moeten worden gebundeld per groep of per cel analyse moet worden uitgevoerd. De aanbevolen statistische tests reeds aangeduid. Om alle nummers in de analyse, inclusief de selectie "Verwijder tracks aan het begin / einde van de film". Anders, met dit vakje geselecteerd verwijdert alle MT groei tracks die aan de gang zijn als de film begint of eindigt.
- Na de Groep Analyse selectie is gemaakt, selecteert u "Vergelijk groepen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze software zoals hier beschreven zal meerdere bestanden van de informatie die + TIP dynamiek kwantificeren in levende cellen.
De functie plusTipGetTracks identificeert de tracks (met behulp van bijvoorbeeld de instellingen weergegeven in figuur 1), en dan geeft de parameters met betrekking tot de + TIP tracks. Om de informatie die de software heeft verkregen bekijken, ga in de roi_X directory die is gemaakt in stap 2.2. De "prestatie" map bevat "overlayImages", dat is een reeks van beelden met de gedetecteerde kometen. Onderzoek van deze beelden met behulp van beeldanalyse-software kan de nauwkeurigheid van de komeet detectie te tonen. De "meta" map bevat ook gedetailleerde informatie over + TIP komeet statistieken, met inbegrip van de "projData" bestand, evenals de "Stats" bestand. Om de "Stats" bestand te bekijken, sleept u het naar een open werkblad van een spreadsheet-applicatie. Dit bestand bevat het berekenend microtubule parameters voor elke film (figuur 2). Zoals hierboven vermeld, zijn een lange lijst van specifieke parameters van MT dynamiek berekend door deze software (zie referentie 4 voor details), met inbegrip van MT groeipad snelheid (in microns / minuut), de groei spoor levensduur (in seconden), en de groei tracklengte (in microns).
De functie plusTipSeeTracks scheelt een filmpje van de bijgehouden kometen, die kan worden beoordeeld door het openen van het bestand "allTracks_X_X_X" (Figuur 3).
De functie plusTipGroupAnalysis combineert meerdere individuele datasets in groepen en creëert mappen (genoemd perCell of pooledData, afhankelijk van de analyse is gekozen) die parameter groep gegevens, met inbegrip van histogrammen, plots en spreadsheets voor groepen en individuele parameters te vergelijken binnen elke groep bevatten (Figuur 4).
Figuur 1 PlusTipGetTracks instellingen voor EB1-GFP kometen in Xenopus laevis groei kegels. Deze figuur toont de instellingen voor "Detection", "Tracking" en "nabewerking" stappen die kunnen worden gebruikt voor de analyse van EB1-GFP kometen in Xenopus laevis groei kegels. De plusTipParamSweepGUI gereedschap binnen het plusTipTracker pakket kan worden gebruikt voor het bijhouden instellingen voor andere model organismen en / of celtypen 7 optimaliseren.
Figuur 2 Screenshot van MT parameters verkregen uit plusTipGetTracks analyse. De "meta" map, gemaakt door het uitvoeren van plusTipGetTracks, bevat informatie over + TIP comet statistiek. Door de "Stats" bestand te slepen naar een spreadsheet-applicatie, kan de dynamica van microtubuli parameters worden onderzocht.
Figuur 3 Screenshot van MT spoor film verkregen uit plusTipSeeTracks analyse. PlusTipSeeTracks zorgt niet alleen voor microtubuli spoor visualisatie, maar dient ook als een controle-instrument doordat de gebruiker om de geldigheid van de verworven van plusTipGetTracks gegevens te bekijken.
Figuur 4 Screenshot van MT parameters verkregen uit plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis biedt de gebruiker een eenvoudige methode voor het vergelijken van groepen en individuele parameters between binnen elke groep door het combineren van meerdere individuele datasets en het genereren van statistische output, die in een spreadsheet-applicatie kan worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PlusTipTracker verschaft een eenvoudige grafische user interface voor vrijwel alle zichtbare EB1-GFP kometen snel en automatisch te detecteren in een cel of groeikegel koppelen kometen in sporen en bereken MT parameters. Andere publicaties is het ontwerp van soortgelijke software gerapporteerd (bijvoorbeeld Marx et al. Ook gebruikt kwantitatieve analyse van gemerkte EB1 dynamica in groei kegels 18). Maar lijkt deze software uniek in het gemak van toegang tot, als hij vrij is te downloaden van de website van de Danuser Lab, dat gespecialiseerd is in het ontwerpen van open-source, turn-key software nuttig om de celbiologische gemeenschap. Hoewel de toegang tot MATLAB nodig, men hoeft volledig vertrouwd zijn met deze aanvraag computer om de software te gebruiken zijn. Er zijn echter een aantal punten die moeten voor gebruiksgemak worden aangepakt.
Allereerst, een van de meest voorkomende problemen die ontstaan bij gebruik van de software en computer applicatie voor de eerste keer is gerelateerd aan het pad. Als deze fout optreedt (met de prompt "Fout bij gebruik van cd -. Argument moet een string Fout in formatPath ... bevatten"), dan is de makkelijkste oplossing is dat de plusTipTracker software, evenals de map met alle van de "beelden" te verzekeren submappen, zijn allebei in de zelfde "MATLAB" pad. Het is het beste als deze niet in de "Program Files", zoals is gesuggereerd dat de ruimte in de "Program Files" name een probleem zijn. In verband hiermee is het van belang op te merken dat plusTipTracker slaat het bestand pad dat werd gebruikt toen de plusTipGetTracks analyse eerste berekenen, en als zodanig moet dit pad worden gehandhaafd wanneer deze gegevens worden benaderd en in dienst van een ander onderdeel van de software. De functies plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks en plusTipGroupAnalysis al gebruik maken van de originele opgeslagen bestand pad, en dus proberen te cal deze functies voor een bepaalde film, na het verplaatsen van de bestanden naar een ander pad, zal resulteren in een fout.
Een andere veel voorkomende fout optreden tijdens de analyse is wanneer Tracking faalt tijdens de plusTipGetTracks stap. Dit gebeurt wanneer een frame in het beeld reeks bevat geen detecteerbare kometen. Dit zal de analyse volledig te stoppen en geen post-verwerking zal plaatsvinden. Een eenvoudige oplossing voor dit probleem te omzeilen en laat de analyse over te gaan, is om een mock komeet op het beeld te creëren in een gebied waar het niet verkeerd zal worden gekoppeld aan een werkelijke tracks. Dit zal geen invloed hebben op de laatste track parameters, zoals elke komeet die niet bestaat in een minimum aantal opeenvolgende frames worden gefilterd uit de uiteindelijke analyse.
Een ander probleem dat kan ontstaan is defect komeet detectie. Dit kan meestal worden vastgesteld door het verbeteren van de selectie-regio of-interest in stap 2.3. Het is belangrijk om het interessegebied voet trekken rond de cel en om geen awider gebied dan noodzakelijk. De software gebruikt deze regio de achtergrond tijdens komeet detectie bepalen. Als komeet opsporing is nog steeds niet optimaal met de standaard instellingen, kunnen de instellingen worden aangepast in de plusTipGetTracks venster (tijdens stap 2.7).
Na de analyse, is het essentieel om de automatische nummer bindingen valideren door oog, met plusTipSeeTracks. Tracking instellingen moet mogelijk worden aangepast om het aantal vals-positieve of vals negatieve komeet verbanden te verminderen. Zie de originele plusTipTracker documentatie 4 evenals de Technical Report PDF die de software te downloaden voor meer informatie over het optimaliseren van de instellingen begeleidt. De prestaties van deze software vergeleken met de hand tracking eerder getest in niet-neuronale cellen 4. Groei kegels vormen een iets andere uitdaging is echter de groei cone MT vertonen frequent translocaties in alle richtingen 17, naast MT groei en krimp. Een issuee dat niet bleek een groot probleem te zijn is de vraag of de dicht opeengepakte MT's in de groei kegels vormen volgen moeilijkheden 17. Aangezien slechts een subset van MT in de groeifase, met EB1-GFP op de uiteinden, oplossen en volgen individuele EB1-GFP kometen niet problematisch. Er moet echter worden opgemerkt dat deze eerdere studies gebruikt Xenopus laevis groei kegels, die specifiek werden gekozen vanwege hun relatief grote groeikegel formaat (ongeveer 10 micron), vergeleken met andere gewervelde groei kegels. Met behulp van deze grotere groei kegels zorgt voor meer accurate EB1-GFP komeet analyse.
Om het nut en de juistheid van deze software voor het analyseren van EB1-GFP tracks in Xenopus laevis groei kegels beoordelen, vergeleken we de ervaring van het gebruik plusTipTracker met hand-volgen van een identieke gegevens serie (gegevens niet getoond). De tijd die nodig was om de hand-sporen EB1-GFP kometen in een gemiddelde groei kegel van 39 komeet tracks (in een 1 minuut time-lapse-series, met 2 seconden tussen elk frame) was meer dan twee uur, in vergelijking met twee minuten met de software. De parameters verkregen met de twee methoden waren vergelijkbaar voor MT groeisnelheid (7,4 micron per minuut voor geautomatiseerde bijhouden versus 7,0 micron per minuut voor de hand bijhouden). Voor groei levensduur en lengte software analyse leidt tot significant korter tracks (ongeveer de helft van de tijd en afstand). Dit komt door groei titels worden gesplitst door de software als een komeet gaat in en uit focus tijd. Het menselijk oog kan gemakkelijk vaststellen dat het hetzelfde Comet, de software niet. Dit probleem is geen probleem maar, als men met behulp van de software om meerdere voorwaarden te vergelijken. Sinds identieke volgen parameters worden gebruikt voor alle omstandigheden (en in de veronderstelling dat kometen gaan in en uit focus in hetzelfde tempo in meerdere voorwaarden), dan is de relatieve levensduur en lengtes zijn nog steeds zeer bruikbaar metingen ter vergelijking. Als voor geautomatiseerde analyse fout rates, deze zijn sterk afhankelijk van de kwaliteit van de beelden. In hoge signaal-ruis films, het percentage misjoined of onjuiste tracks in de enkele cijfers. Zelfs in lagere kwaliteit films (waar individuele kometen zijn nog duidelijk zichtbaar met het blote oog, maar het achtergrondgeluid is groter), de fout nog altijd laag genoeg is (5-15%), dat het veel tijd bespaard door het gebruik van de software is de moeite waard de kosten in de fout. Dit is vooral het geval bij het analyseren van honderden groei kegels (60-8 groei kegels per conditie werden in een eerdere studie 17 geanalyseerd).
Het is belangrijk op te merken dat deze software is ontworpen voor het opsporen + TIP kometen die alleen binden aan de groeiende MT uiteinden, zoals EB1-GFP. Aangezien de verbinding en het volgen algoritmen verwachten dat kometen betreffen slechts polymeriseren MTS, deze software om de dynamiek van een fluorescent gemerkte + TIP dat bindt aan krimpen MT analyseren eindigt naast groeiende einden tot foutieve informatiebetrekking berekend MT groei snelheden.
Een van de unieke eigenschappen van deze software vergeleken met andere enkel-particle-tracking software, dat het rekening houdt bekend MT gedrag niet alleen polymerisatie parameters, maar ook krimp parameters berekenen. Het doet dit door het koppelen van een EB1-GFP comet die verdwenen die nieuw gevormd direct achter in hetzelfde traject (dit wordt een backgap of bgap track). Hoewel dit algoritme werkt voor bepaalde celtypes, zoals HeLa-cellen 4, is een minder effectieve functie bij de analyse MT dynamiek in groei kegels. Dit komt omdat MT sporen vaak elkaar opvolgen langs exact hetzelfde pad groei kegels (vaak na langs F-actine bundels), en dus is het meestal niet mogelijk om te zeggen of bgap bindingen correct zijn. Daarom wordt afgeraden het bgap data uitgangen groei kegels gebruiken.
Ondanks deze kleine kanttekeningen en vraagstukkendie in aanmerking moeten worden genomen bij het gebruik plusTipTracker (en meest geautomatiseerde beeldverwerking-programma), kan deze software een zeer nuttig hulpmiddel voor het analyseren van duizenden EB1-GFP kometen in een relatief korte tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
