Summary
Die MATLAB-basierte Open-Source-Software-Paket, plusTipTracker, können verwendet werden, um Bild-Serie von fluoreszenzmarkierten + Tricks zu analysieren, um die Dynamik der Mikrotubuli zu quantifizieren.
Abstract
Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Proteine (+ Tips) zu lokalisieren, um den wachsenden Plus-Enden der MTS und regulieren MT Dynamik 1,2. Eine der bekanntesten und weithin genutzte + Tipps für die Analyse MT Dynamik ist die End-bindendes Protein, EB1, die alle wachsenden MT plus-Enden bindet, und somit ist ein Marker für die MT-Polymerisation 1. Viele Studien von EB1 Verhalten innerhalb Wachstumskegel haben zeitaufwendig und voreingenommen computergestützte, Hand-Tracking-Methoden zur Analyse einzelner MTs 1-3. Unser Ansatz ist es, globale Parameter des MT Dynamik mit dem Softwarepaket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb von hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5 quantifizieren. Diese Software ist eine MATLAB-basierte Open-Source-, benutzerfreundlichen Paket, das automatisierte Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Filtern kombiniert. Hier präsentieren wir das Protokoll für die Verwendung plusTipTAufsteller für die Analyse von fluoreszenzmarkierten + TIP Kometen in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Jedoch kann diese Software auch zum MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 charakterisieren.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist, um quantitative Informationen über Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Protein (+ TIP) Dynamik in lebenden Wachstumskegel zu erhalten. MT + Tipps sind eine Gruppe von Proteinen, die an den Enden der plus-MT 9,10 lokalisieren. Sie führen eine Reihe von Funktionen, um die Parameter der MT dynamische Instabilität 11, einschließlich der Sätze der Polymerisation Katastrophe und Rettung zu regulieren. Ein allgemein verwendetes Verfahren zum Analysieren MT Dynamik ist, um das Verhalten des TIP + EB1, die spezifisch an wachsenden MT bindet plus-Enden 1,12 verfolgen. EB1 ist bekannt, dass mehrere andere Proteine zu rekrutieren wachsenden MT plus-Enden 13,14, und wurde kürzlich als ein MT Reifung Faktor 15 festgestellt, die Förderung sowohl MT Wachstum und Katastrophe Frequenz 15,16.
Viele Studien der MT Dynamik in Wachstumskegeln haben Hand-Tracking-Methoden, um Veränderungen in der EB1-GFP Dynamik über die Zeit zu messen 1-3 genutzt, wie EB1 localizatian MT plus-Enden können als Marker für MT-Polymerisation verwendet werden. Ein wesentlicher Vorteil für die Prüfung EB1-GFP Kometen als Proxy für MT Wachstum ist, dass MT Dynamik kann auch in Regionen mit signifikanter MT Überlappung gemessen werden. Während das Verfahren von Hand Verfolgung EB1-GFP Kometen hat nützliche Einblicke in MT vorgesehen Verhaltensweisen 1-3, es ist zeitaufwendig und kann vorgespannt werden. Zusätzlich wird, wie abweichende Wachstumskegel Verhaltensweisen sind wahrscheinlich das Ergebnis von winzigen Verschiebungen im Zytoskelett-Dynamik, die Analyse nur eine kleine Teilmenge von MT (in der Regel notwendig, wenn die Hand-Tracking) kann wichtige Informationen zu verpassen.
So messen wir globale Dynamik MT Parameter mit dem Software-Paket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb der hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5. Diese Software, die im Labor entwickelt Danusers, wurde in mehreren Studien Charakterisierung MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 verwendet. Es ist ein Open-Source, unser-freundlich, MATLAB-basierte Paket, automatische Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Tips enthält. Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik werden von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumskurs Lebensdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern). Die Software kann direkt von der Website Danuser Lab (unter "Software") heruntergeladen werden. Während der Danuser Lab unterstützt derzeit eine neuere Schnittstelle für TIP + Tracking-Analyse, die in einem Software-Paket namens u-Track 2.0, das Original, Stand-alone-Software zur Verfügung stehen aufgenommen wird. Die zugrundeliegenden Algorithmen zwischen den beiden Programmen gleich sind (zumindest 2014), wobei nur ein Unterschied von Schnittstelle und Analyse Ausgänge. Für den Anfänger mit wenig MATLAB und / oder Computeranalyse Erfahrenz hat plusTipTracker benutzerfreundlichen Funktionen, einschließlich automatisierter statistischer Parameter Ausgänge.
Hier beschreiben wir die Schritte zum Analysieren von Bildern von EB1-GFP Dynamik in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Dieses Protokoll wurde in einer aktuellen Arbeit untersucht die Dynamik MT 17 genutzt. Siehe auch Lowery et al. 2012 5 für ausführliche Anweisungen für die Kultivierung Wachstumskegel ausdrücken EB1-GFP. Während dieses Papier in erster Linie auf die Untersuchung EB1-GFP Dynamik in Wachstumskegel konzentriert, kann das gleiche Protokoll für andere Zelltypen, 17 verwendet werden. Für alle Zelltypen, sollte das Zeitintervall zwischen den Rahmen zwischen 0,5-2 sec für optimale + TIP Verfolgungs sein. Ein Zeitintervall von bis zu 4 Sekunden zwischen den Rahmen möglich ist, aber dies erhöht Intervallzeit zu zusätzlichen Spurfehler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Protokoll und Video werden soll als Ergänzung zum ursprünglichen Papier beschreibt das Software-Paket im Detail 4, sowie der Technische Bericht, der mit dem Software-Download auf der Website Danuser Lab kommt zu dienen. Die Leser werden aufgefordert, diese Unterlagen sorgfältig prüfen, ob es weitere Fragen zur Verwendung der Software.
1. Vor der Bildanalyse
- Jedes Zeitraffer-Film zu konvertieren in eine Folge von TIFF (Tagged Image File Format)-Image-Dateien. Wenn es mehrere Wachstumskegel /-Zellen in einem gegebenen Film, um erste Ernte jeder Wachstumskegel / Zelle ihre eigene Bildsequenz zu erstellen.
Hinweis: Dies ist nicht notwendig, da die einzelnen Regionen-of-Interest (ROI) innerhalb plusTipTracker ausgewählt werden. Jedoch mit kleineren Bildabmessungen erhöht die Geschwindigkeit der Rechenverarbeitung, so dass dieser Schritt wird empfohlen, wenn eine signifikante Leerstelle in dem Bild. - Speichern Sie jede TIFF-Serie im eigenenOrdner "Bilder" in einem Pfad, MATLAB, um den Zugang gesetzt (beachten Sie, dass "Bilder" ist case-sensitive). Um einen neuen Pfad im Fenster "Aktueller Ordner" hinzufügen, auf die entsprechende Datei-Verzeichnis zu navigieren, der rechten Maustaste auf das Verzeichnis-Symbol, und wählen Sie "In den Pfad - Ausgewählte Ordner und Unterordner". Es ist wichtig, dass die Software plusTipTracker Ordner auf den Weg gegeben werden, wie gut.
2. plusTipGetTracks
Hinweis: Der erste Schritt in der Bildanalyse ist es, die EB1-GFP Kometen erkennen, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und bestimmen Sie die Parameter der Dynamik der Mikrotubuli. Dies wird mit dem Befehl "plusTipGetTracks" 4 erhalten.
- Um die Analyse, offene MATLAB-Anwendung beginnen und geben Sie "plusTipGetTracks" in das Befehlsfenster. Dies führt dazu, dass ein neues Dialogfeld angezeigt.
- Klicken Sie auf "Neues Projekte" und wählen Sie einen (oder more) der vorigen TIFF-Bild-Serie durch eine entsprechende "Bilder"-Ordner (oder Verzeichnisse mit "Bilder"-Ordner). Nach Abschluss dieser Schritt ein Dateiverzeichnis (roi_1) wird (im selben Ordner, die "Bilder" hält) geschaffen werden, die die zukünftigen Datendateien enthält. Hinweis: Die "Set Up New Projects" Schritt kann vor der Zeit abgeschlossen werden kann, während einer separaten Sitzung.
- Ein neues Fenster wird angezeigt: "Wählen Sie ein Polygon, rechtsklicken Sie auf letzten Punkt, und klicken Sie auf 'Erstellen Maske'". Klicken Sie auf "OK". Das erste Bild der ausgewählten Bildserie werden dann angezeigt. Mit der Maus zu klicken, und erstellen Sie ein Polygon, das die Gesamtheit der Wachstumskegel umfasst. Doppelklicken Sie auf die Maus, um das Polygon zu schließen.
- Sobald das Polygon geschlossen wurde, wird ein Dialogfeld angezeigt: "Möchten Sie eine andere ROI auswählen?" Wenn das Bild hat einen weiteren Wachstumskegel zu analysieren, wählen Sie "Ja"; sonst sAuserwählten "Nein".
- Wählen Sie die Projekte, die sofort analysiert werden. Klicken Sie auf "Wählen Sie Projekte" und wählen Sie den Ordner (roi_X) zu analysieren.
- Ein listSelectGUI Bildschirm erscheint. Wählen Sie das Projekt (e) von der linken Seite des Bildschirms, und verschieben Sie sie auf die rechte Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf "OK". Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste zu speichern und klicken Sie auf "Speichern".
- Wählen Sie "Erkennung", "Verfolgung" und "Post-Processing". Sobald diese Einstellungen vorgenommen wurden, wird die rechte Seite des Dialogfelds werden konfigurierbar. Konfigurieren Sie jede Option.
- Diese Parameter werden verwendet, um erkannt Kometen in MT-Tracks zu verbinden. Details für die Wahl dieser Steuerparameter für die Verfolgung sind auf den Seiten 9-10 des technischen Berichts, der die PDF-Software-Paket herunterladen beiliegt; Lesen Sie diesen Bericht sorgfältig, wenn Probleme auftreten. Für die Zwecke des Tracking-EB1-GFP Kometen in xenopuns laevis Wachstumskegel, verwenden Sie die folgenden Einstellungen Verfolgung: Suche Radiusbereich (Pixel) 5-12, Mindestteilstreckenlänge (Frames) 3; Max Gap Länge (Frames) 8; Max Schrumpffaktor 0,8, Max Winkel vorne 50, Max Winkel rückwärts 10, Fluktuation Radius 2.5. Diese Einstellungen werden in Abbildung 1 dargestellt.
Hinweis: Max Schrumpffaktor ist auf die Anzahl der "rückwärts Lücken" erkannt zu reduzieren, als "rückständig Lücken" sind nicht sinnvoll, im Rahmen der Wachstumskegel zu analysieren, da die überfüllten Bedingungen und wahrscheinlich Fehler in der Spurgestänge. Zusätzlich sowohl Max Vorwärtswinkel sowie Fluktuation Radius relativ hoch eingestellt ist, als Wachstumskegel MTs zeigen häufige kleine Translokationen zusätzlich zu Wucherungen und Schrumpfungen, und die Erhöhung dieser Steuer Einstellungen ermöglicht dieser erhöhten Bewegung während der Verknüpfungsschritt.- Füllen Sie die Post-Processing-Einstellungen abhängig von den gewünschten spezifischen Bildaufnahme-Einstellungen.
- Sobald die Einstellungen konfiguriert wurden, klicken Sie auf "Start". Die Software läuft je nachdem, welche Einstellungen gewählt wurden. Das kann Minuten bis Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der ausgewählten Projekte und ihre Größen. Das Befehlsfenster zeigt die voraussichtliche Rest für jede Funktion. Wenn die plusTipGetTracks Schritt abgeschlossen ist, das Befehlsfenster zeigt "Fertig!"
Hinweis: Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik haben nun von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter zu untersuchen, MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumsspurdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern).
3. plusTipSeeTracks
Hinweis: Nachdem die Mikrotubuli-Tracks definiert wurden, ist die Funktion "plustipSeeTracks" für Spur 4 Visualisierung eingesetzt. Diese Funktionkönnen mehrere Ausgänge für die Visualisierung, einschließlich räumliche Dynamik MT Karten und Geschwindigkeit Filme bieten, aber hier liegt der Fokus ausschließlich auf mit "Track Filme", um MT Spuren auf den Wachstumskegel Bilder überlagert anzuzeigen. Während plusTipGetTracks können mehrere Filme auf einmal zu analysieren, können plusTipSeeTracks nur einen Film analysieren zu einer Zeit.
- Geben Sie "plusTipSeeTracks" in das Befehlsfenster.
- Nachdem das Dialogfeld lädt, klicken Sie auf "Select Project". Wählen Sie das übergeordnete Verzeichnis, das Projekt zu visualisieren und klicken Sie auf "Ordner auswählen". Ein neues Fenster wird angezeigt: "Wählen Sie das Projekt, das Sie visualisieren möchten". Wählen Sie die Datei, um zu visualisieren und klicken Sie auf "OK".
- Als nächstes klicken Sie auf "Wählen Sie Gespeicherte ROI". Navigieren Sie zu dem gleichen Ordner wie die roi_X im vorherigen Schritt ausgewählt und wählen Sie die Datei mit dem Namen "roiYX".
- Klicken Sie auf "Wählen Sie Output Directory" auf w bezeichnenMATLAB hier wird die Track-Visualisierungsdateien zu speichern. Hinweis: Wir empfehlen mit den gleichen Ordner, die den Rest der Daten enthält.
- "Make Track-Film" und ein Fenster angezeigt, die Anzeige alle Titel aus den plusTipGetTracks + TIP Kometen berechnet. Dieser Schritt sichert die verfolgten Zeitreihen in einem Film-Format, in der Datei "allTracks_X_X_X". Es gibt eine Option für das Speichern der Film als AVI, sonst das Standardformat ist als Quicktime.mov Datei.
4. plusTipGroupAnalysis
Hinweis: Diese letzte Funktion wird verwendet, um Gruppen von Filmen für die Analyse und den Vergleich ihrer MT Spurparameter.
- Geben Sie "plusTipGroupAnalysis" in das Befehlsfenster. Manuell wählen Sie die Gruppen zu vergleichen, zuerst de-wählen Sie "Auto-Gruppe aus Hierarchie". Dann klicken Sie auf "Select-Projekte". Navigieren Sie zu den übergeordneten Verzeichnissen alle roi_X Ordner mitzu analysieren.
- Ein listSelectGUI Bildschirm erscheint. Wählen Sie alle Projekte, die in den Gruppen, von der linken Seite des Bildschirms umfassen und verschieben Sie sie auf die rechte Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf "OK". Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste zu speichern und klicken Sie auf "Speichern".
- Ein Fenster wird angezeigt: "Bitte wählen Sie zuerst Gruppe aus der Liste". Klicken Sie auf "OK". Das Fenster listSelectGUI wird erneut angezeigt. Dieses Mal, wählen Sie nur die Dateien, die zu der ersten Gruppe, die zusammengeführt werden sollten übereinstimmen. Klicken Sie auf "OK".
- Geben Sie dann den Namen der Gruppe, und klicken Sie auf "OK". Entsprechend "Wählen Sie eine andere Gruppe?" Antwort und weiter Gruppen auswählen: Ein Fenster wird angezeigt. Es erscheint ein Fenster: "Wählen Sie einen Speicherort für die Gruppenliste speichern". Navigieren Sie zum Speicherort und klicken Sie auf "Speichern".
- Klicken Sie auf "Select Output Directory" zu wählen, wo die Ausgangsordner werdengespeichert.
- Wählen Sie, welche Art von Gruppenanalyse durchzuführen, um - ob die MT-Tracks sollten für jede Gruppe oder pro Zellanalyse durchgeführt werden soll gebündelt werden. Die empfohlenen statistischen Tests sind bereits bezeichnet. Um alle Titel in der Analyse, sind de-select "-Tracks am Anfang / Ende des Film Entfernen". Ansonsten hat dieses Feld gewählt entfernt alle Spuren, die MT Wachstum in der Prozess sind wie der Film beginnt oder endet.
- Nachdem die Gruppenanalyse Auswahl getroffen wird, wählen Sie "Gruppen vergleichen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit dieser Software, wie hier beschrieben wird mehrere Dateien mit Informationen, + TIP Dynamik in lebenden Zellen zu quantifizieren ist.
Die Funktion plusTipGetTracks identifiziert die Tracks (mit Beispiel in Abbildung 1 gezeigten Einstellungen), und stellt Parameter in Bezug auf die + TIP Tracks dann. Um die Informationen, dass die Software erhalten sehen, gehen Sie in das Verzeichnis, in roi_X Schritt 2.2 erstellt wurde. Die "feat" Ordner enthält "overlayImages", die eine Reihe von Bildern, die erkannten Kometen ist. Untersuchung dieser Bilder mit Hilfe der Bildanalyse-Software kann die Genauigkeit der Erkennung Kometen zu demonstrieren. Die "Meta"-Ordner enthält auch detaillierte Informationen zu TIP + Kometen Statistiken, einschließlich der Datei "projData" sowie die Datei "Statistik". Um die Datei "Stats" zu sehen, ziehen Sie es in einem offenen Arbeitsblatt einer Tabellenkalkulation. Diese Datei enthält die berechnend Mikrotubulus-Parameter für jeden Film (Abbildung 2). Wie oben erwähnt, sind eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), einschließlich MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumskurs Lebensdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometer).
Die Funktion plusTipSeeTracks spart einen Film der verfolgten Kometen, die durch Öffnen der Datei "allTracks_X_X_X" (Abbildung 3) überprüft werden können.
Die Funktion kombiniert mehrere plusTipGroupAnalysis einzelnen Datensätzen in Gruppen und erstellt Ordner (benannt PERCELL oder pooledData, abhängig von der Analyse ausgewählt), die Gruppe Parameterdaten, einschließlich Histogramme, Grundstücke, und Tabellen für den Vergleich von Gruppen und einzelnen Parameter innerhalb jeder Gruppe enthalten (Abbildung 4).
Abbildung 1. PlusTipGetTracks Einstellungen für EB1-GFP Kometen in Xenopus laevis Wachstumskegel verwendet. Diese Abbildung zeigt die spezifischen Einstellungen für "Erfassen", "Verfolgung" und "Post-Processing" Schritte, die für die Analyse von EB1-GFP verwendet werden können Kometen in Xenopus laevis Wachstumskegel. Die plusTipParamSweepGUI Werkzeug, erhältlich im plusTipTracker Paket verwendet werden, um Tracking-Einstellungen für andere Modellorganismen und / oder Zelltypen 7 zu optimieren.
Abbildung 2. Screenshot von plusTipGetTracks Analyse erhaltenen MT-Parameter. Die "Meta"-Ordner erstellt, indem Sie plusTipGetTracks, über + TIP c enthält InformationenOmet Statistik. Indem Sie die Datei "Statistik" in ein Tabellenkalkulationsprogramm, kann die Dynamik der Mikrotubuli-Parameter untersucht werden.
Abbildung 3. Screenshot von MT Spur Film von plusTipSeeTracks Analyse erhalten. PlusTipSeeTracks ermöglicht nicht nur Mikrotubuli Spur Visualisierung, sondern dient auch als Überprüfungs-Werkzeug, indem es dem Benutzer, die Gültigkeit der von plusTipGetTracks erfassten Daten anzuzeigen.
Abbildung 4. Screenshot von plusTipGroupAnalysis erhalten MT-Parameter. PlusTipGroupAnalysis bietet dem Benutzer eine einfache Methode für den Vergleich von Gruppen und einzelnen Parameter zwischen in jeder Gruppe durch die Kombination mehrerer Einzeldatensätze und Erzeugen statistischer Ausgabe, die in einem Tabellenkalkulationsprogramm untersucht werden können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PlusTipTracker bietet eine einfache, grafische Benutzerschnittstelle für nahezu alle sichtbar EB1-GFP Kometen schnell und automatisch erkennen in einer Zelle oder Wachstumskegel, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und berechnen MT-Parameter. Andere Veröffentlichungen haben die Gestaltung ähnliche Arten von Software (zum Beispiel Marx et al ebenfalls verwendet quantitative Analyse von markierten EB1 Dynamik in Wachstumskegel 18.) Berichtet. Aber wird dieses Software in seiner einfachen Zugang, einzigartig zu sein, da es frei von der Website des Danuser Lab, das bei der Gestaltung Open-Source-Spezialist heruntergeladen, schlüssel Software nützlich, um die zellbiologischen Gemeinschaft. Während der Zugang zu MATLAB erforderlich ist, braucht man nicht vollständig vertraut mit dieser Computer-Anwendung, um die Software zu nutzen sein. Jedoch gibt es einige Punkte, die für Benutzergangen werden müssen.
Zunächst einmal eine der häufigsten Fragen, die bei der Verwendung der sof entstehentware und Computer-Anwendung zum ersten Mal wird der Dateipfad stehen. Wenn dieser Fehler auftritt (mit der Aufforderung "Fehler mit cd -. Argument muss ein String Fehler in formatPath ... enthalten"), dann die einfachste Lösung ist, dass die Software plusTipTracker sowie das Verzeichnis mit allen "Bildern" zu gewährleisten Unterverzeichnisse, sind beide in der gleichen "MATLAB" Dateipfad. Am besten ist es, wenn diese nicht in das Verzeichnis "Program Files", wie es wurde vorgeschlagen, dass der Raum, in dem "Programme" Name kann ein Thema sein. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu beachten, dass plusTipTracker speichert den Dateipfad, der verwendet wurde, als erstes Berechnen der plusTipGetTracks Analyse, und als solches kann dieses Dateipfad beibehalten wird, wenn diese Daten zugegriffen wird und durch eine andere Komponente der Software verwendet werden. Die Funktionen plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks und plusTipGroupAnalysis alle den ursprünglichen Dateipfad gespeichert, und somit versucht, calle diese Funktionen für einen bestimmten Film, nach dem Umzug die Dateien auf einem anderen Pfad, führt zu einem Fehler führen.
Ein weiterer häufiger Fehler bei der Analyse auftreten, wenn während der Tracking-plusTipGetTracks Schritt fehlschlägt. Dies geschieht, wenn ein Rahmen in der Bildserie enthält keine nachweisbaren Kometen. Dadurch wird die Analyse vollständig zu stoppen und keine Nachbearbeitung auftreten. Eine einfache Lösung, um dieses Problem zu umgehen, und ermöglichen die Analyse zu gehen, ist es, eine Schein Kometen auf das Bild, in einem Gebiet, wo es nicht falsch zu allen aktuellen Tracks verknüpft werden erstellen. Dies hat keine Auswirkung auf die endgültige Gleisparameter, wie einem Kometen, die nicht in einer minimalen Anzahl von aufeinanderfolgenden Frames existiert wird von der endgültigen Analyse gefiltert werden.
Eine andere Frage, die entstehen können fehlerhaft Kometen Erkennung. Dies kann in der Regel durch eine Verbesserung der Region von Interesse Auswahl in Schritt 2.3 festgelegt werden. Es ist wichtig, den Bereich von Interesse eng um die Zelle zu ziehen, und nicht zu zeichnen awider Bereich notwendig ist. Die Software nutzt diese Region, um den Hintergrund während Kometen Erkennung verwendet zu bestimmen. Wenn Kometen Erkennung ist noch nicht optimal mit den Standardeinstellungen, können die Einstellungen in der plusTipGetTracks Fenster (im Schritt 2.7) eingestellt werden.
Nach einer Analyse ist es wichtig, die automatische Spurgestänge mit dem Auge zu überprüfen, unter Verwendung plusTipSeeTracks. Tracking Einstellungen müssen geändert werden, um die Zahl der falsch-positiven oder falsch-negativen Kometen Verbindungen zu reduzieren. Die Original-Dokumentation plusTipTracker 4 sowie den technischen Bericht, der die PDF-Software-Download für Details auf die Optimierung der Einstellungen begleitet. Die Leistung dieser Software im Vergleich zu von Hand Verfolgung vorher in nicht-neuronalen Zellen 4 getestet. Wachstumskegel stellen eine etwas andere Herausforderung besteht jedoch als Wachstumskegel MTs aufweisen häufigen Translokationen in alle Richtungen 17, zusätzlich zu den MT Wachsen und Schrumpfen. Ein issuee, die nicht gefunden wurde, ein wichtiges Anliegen sein, ob die dicht gepackten MTs in Wachstumskegel darstellen Tracking Schwierigkeiten 17. Da nur eine Untergruppe von MTs in der Wachstumsphase mit EB1-GFP an den Enden, die Lösung und Verfolgung einzelner EB1-GFP Kometen nicht problematisch. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß diese früheren Studien verwendeten Xenopus laevis Wachstumskegeln, die speziell wegen ihrer relativ großen Wachstumskegelgröße (ca. 10 Mikron) ausgewählt wurden, im Vergleich zu anderen Vertebraten-Wachstumskegeln. Mit diesen größeren Wachstumskegel ermöglicht genauere EB1-GFP Kometen-Analyse.
Um den Nutzen und die Genauigkeit dieser Software zur Analyse EB1-GFP Spuren in Xenopus laevis Wachstumskegel bewerten, verglichen wir die Erfahrung mit plusTipTracker mit Hand Verfolgung eines identischen Datenreihe (Daten nicht gezeigt). Die Zeit, die zu Hand-Track-EB1-GFP Kometen in einer durchschnittlichen Wachstumskegel von 39 Kometen Spuren (in 1 Minute Zeitraffer-SeriES, mit 2 Sekunden zwischen jedem Rahmen) wurde über zwei Stunden, im Vergleich zu zwei Minuten mit der Software. Die mit den beiden Methoden erhaltenen Parameter waren für MT Wachstumsgeschwindigkeit (7,4 Mikrometer pro Minute für die automatisierte Verfolgung gegenüber 7,0 Mikrometer pro Minute für Hand-Tracking). , Wachstumszeit und Länge führt jedoch Software-Analyse zu deutlich kürzeren Spuren (etwa die Hälfte der Zeit und Geschwindigkeit). Dies ist auf das Wachstum Spuren, die von der Software teilen, wenn ein Komet geht in die und aus der Fokus im Laufe der Zeit. Während das menschliche Auge leicht erkennen können, dass es die gleiche Kometen, die Software nicht. Dieses Problem ist nicht problematisch, aber, wenn man mit der Software, um mehrere Bedingungen zu vergleichen. Da gleiche Tracking-Parameter werden für alle Bedingungen (und unter der Annahme, dass Kometen gehen in die und aus der Fokus mit der gleichen Geschwindigkeit in mehreren Bedingungen), dann ist die relative Lebenszeiten und Längen sind immer noch sehr nützlich Messungen zum Vergleich. Wie für die automatisierte Analyse Fehler RatteES Diese hängen sehr stark von der Qualität der Bilder. In hohen Signal-zu-Rausch-Filme, ist der Prozentsatz der misjoined oder falsche Spuren in den einstelligen Bereich. Selbst in niedriger Qualität von Filmen (wo einzelne Kometen sind immer noch mit dem Auge deutlich sichtbar, aber die Hintergrundgeräusche größer ist), sind die Fehlerraten immer noch niedrig genug ist (5-15%), dass der erhebliche Zeit mit Hilfe der Software gespeichert ist wert Kosten im Irrtum. Dies ist insbesondere der Fall, wenn die Analyse Hunderte von Wachstumskegeln (60-8 Wachstumskegel pro Bedingung wurden in einer früheren Studie analysiert 17).
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Software zum Erfassen + TIP Kometen, die nur auf die wachsende MT Enden, wie EB1-GFP binden gestalten. Da die Verknüpfung und Tracking-Algorithmen erwarten, dass Kometen auf die Polymerisation MTs, mit dieser Software, um die Dynamik eines fluoreszenzmarkierten + TIP, die schrumpfenden MT bindet analysieren existieren nur endet neben wachsenden Enden zu Fehlinformationen führenbezüglich berechnet MT Wachstumsgeschwindigkeiten.
Eines der einzigartigen Merkmale dieser Software im Vergleich zu anderen Ein-Teilchen-Tracking-Software, ist, dass es berücksichtigt bekannt MT Verhaltensweisen nicht nur Polymerisationsparameter, aber auch Schrumpfung Parameter berechnen. Es tut dies, indem eine EB1-GFP Kometen, die mit einer, die neu direkt dahinter in der gleichen Trajektorie gebildet verschwunden ist (dies ist ein backgap oder BGAP Spur bezeichnet). Während dieser Algorithmus arbeitet gut bei einigen Zelltypen, wie zB HeLa-Zellen 4 ist eine weniger wirksame Funktion bei der Analyse MT Dynamik in Wachstumskegeln. Das ist, weil MT-Spuren häufig aufeinander folgen entlang der exakt gleichen Wege in Wachstumskegel (oft entlang F-Actin-Bündel folgenden), und so ist es meist nicht möglich zu sagen, ob BGAP Verbindungen korrekt sind. Aus diesem Grund ist es nicht empfehlenswert, die BGAP Datenausgänge in Wachstumskegeln zu nutzen.
Trotz dieser kleinen Einschränkungen und Problemedie bei der Verwendung plusTipTracker berücksichtigt werden müssen (und die meisten jede automatisierte Bildverarbeitungsprogramm), kann diese Software ein sehr nützliches Werkzeug für die Analyse von Tausenden von EB1-GFP Kometen in einer relativ kurzen Zeit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
