Summary
MATLAB-basert, åpen kildekode programvarepakke, plusTipTracker, kan brukes til å analysere bildeserie av fluorescently-merket + tips for å kvantifisere mikrotubulidynamikk.
Abstract
Mikrotubulus (MT) pluss-end-sporing proteiner (+ spisser) lokalisere til den voksende pluss-endene av MTS og regulere MT dynamikk 1,2. En av de mest kjente og allment utnyttet + tips for å analysere MT dynamikk er slutten-bindende protein, EB1, som binder alle voksende MT pluss-ender, og dermed er en markør for MT polymerisasjon en. Mange studier av EB1 atferd innen vekst kjegler har brukt tidkrevende og partisk IT-baserte, hånd-sporing metoder for å analysere individuelle MTS 1-3. Vår tilnærming er å kvantifisere globale parametere av MT dynamikk ved hjelp av programvarepakken, plusTipTracker 4, etter oppkjøpet av høy oppløsning, levende bilder av merket EB1 i kultiverte embryonale vekst kjegler fem. Denne programvaren er en MATLAB-basert, åpen kildekode, brukervennlig pakke som kombinerer automatisert deteksjon, sporing, visualisering og analyse for filmer av fluorescently-merket + tipsene. Her presenterer vi protokollen for bruk plusTipTRacker for analyse av fluorescently-merket + tips kometer i dyrkede Xenopus laevis vekst kjegler. Imidlertid kan denne programvaren også brukes til å karakterisere MT dynamikken i forskjellige celletyper 6-8.
Introduction
Målet med denne metoden er å innhente kvantitativ informasjon om mikrotubulus (MT) pluss-end-sporing protein (+ TIP) dynamikken i levende vekst kjegler. MT + Tips er en gruppe proteiner som lokalisere til pluss-endene av MTS 9,10. De utfører en rekke funksjoner for å regulere parametere av MT dynamisk ustabilitet 11, inkludert priser av polymerisasjon, katastrofe, og redning. En godt brukt metode for å analysere MT dynamikken er å spore oppførselen til + TIP EB1, som binder seg spesifikt til voksende MT pluss-ender 1,12. EB1 er kjent for å rekruttere flere andre proteiner til voksende MT pluss-ender 13,14, og har nylig blitt etablert som en MT modning faktor 15, fremme både MT vekst og katastrofe frekvens 15,16.
Mange studier av MT dynamikken i vekst kjegler har utnyttet hånd-sporing metoder for å måle endringer i EB1-GFP dynamikk over tid 1-3, som EB1 localizatividere til MT pluss-ender kan brukes som en markør for MT polymerisasjon. En viktig fordel for behandlingen EB1-GFP kometer som en proxy for MT veksten er at MT dynamikk kan måles selv i områder med betydelig MT overlapping. Mens metoden av hånd sporing EB1-GFP kometer har gitt nyttig innsikt i MT atferd 1-3, det er tidkrevende og kan være partisk. I tillegg, som avvikende vekst kjegle atferd er sannsynligvis et resultat av liten skift i cytoskeletal dynamikk, analysere bare en liten undergruppe av MTS (vanligvis nødvendig når hånd-sporing) kan gå glipp av vesentlig informasjon.
Dermed måler vi globale MT dynamikk parametere ved hjelp av programvarepakken, plusTipTracker 4, etter oppkjøpet av høy oppløsning, levende bilder av merket EB1 i kultiverte embryonale vekst kjegler fem. Denne programvaren er utviklet i Danuser Lab, har vært brukt i flere studier som preger MT dynamikk i ulike celletyper 6-8. Det er en åpen-kildekode, osser-vennlig, MATLAB-basert pakke som inkluderer automatisert deteksjon, sporing, visualisering og analyse for filmer av fluorescently-merket + tipsene. En lang liste av spesifikke parametre for MT dynamikk er beregnet av denne programvaren (se Reference 4 for detaljer), men for analyse av MT dynamikken i vekst kjegler, de mest nyttige parametere er MT vekstsporet hastighet (i mikron / minutt), vekstsporet levetid (i sekunder), og vekst sporlengde (i mikron). Programvaren kan lastes ned direkte fra webområdet til Danuser Lab (under "programvare"). Mens Danuser Lab støtter for tiden en nyere grensesnitt for + TIP sporing analyse, som er innlemmet i en programvarepakke kalt u-track 2.0, den opprinnelige, frittstående programvare vil være tilgjengelig. De underliggende algoritmer mellom de to programmer er den samme (i det minste fra og med 2014), med bare en forskjell på grensesnitt og analyse utganger. For nybegynneren med lite Matlab og / eller beregningsorientert analyse opplhet, har plusTipTracker flere brukervennlige funksjoner, inkludert automatiserte statistiske parameter utganger.
Her beskriver vi fremgangsmåten for å analysere bilder av EB1-GFP dynamikk i dyrkede Xenopus laevis vekst kjegler. Denne protokollen ble benyttet i en nyere artikkel undersøke MT dynamikk 17. Se også Lowery et al. 2012 5 for detaljerte instruksjoner om dyrking vekst kjegler uttrykker EB1-GFP. Mens dette papiret først og fremst fokusert på å undersøke EB1-GFP dynamikken i vekst kjegler, kan den samme protokollen brukes til andre celletyper 17. For alle celletyper, bør tidsintervallet mellom rammer være mellom 0,5-2 sek for optimal + TIP sporing. Et tidsintervall på opp til 4 sekunder mellom rammer er mulig, men dette økte tidsintervall resulterer i ytterligere sporingsfeil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen og video er ment å tjene som en følgesvenn til den opprinnelige artikkel som beskriver programvarepakken nærmere fire, samt den tekniske rapporten som følger med programvaren nedlasting på nettstedet til Det Danuser Lab. Leserne oppfordres til å gjennomgå disse dokumentene nøye om det er ytterligere spørsmål om bruken av programvaren.
1. Før bildeanalyse
- Konvertere hver time-lapse film i en sekvens av TIFF (Tagged Image File Format) bildefiler. Hvis det er flere vekstkjegler /-celler i en gitt film, til første utbytte hver vekst membran / celle skape sin egen bildesekvens.
Merk: Dette er ikke nødvendig, som enkelte regioner-of-interesse (ROI) kan velges innen plusTipTracker. Men ved å bruke mindre bildedimensjonene øker hastigheten på beregnings behandling, slik at dette trinnet anbefales hvis det er betydelig tomrom i bildet. - Lagre hvert TIFF serien i sin egenmappe som heter "bilder" innenfor en bane som MATLAB er satt til tilgang (merk at "bildene" er store og små bokstaver). For å legge til en ny bane, naviger til den aktuelle filen katalogen i "Gjeldende mappe"-vinduet, høyreklikk på mappen ikonet, og velg "Legg til forløp - Valgte mapper og undermapper". Det er viktig at plusTipTracker programvaremappen legges til Path, også.
2. plusTipGetTracks
Merk: Det første trinnet i bildeanalyse er å oppdage de EB1-GFP kometer, knytte kometer i spor, og bestemme parametrene av mikrotubulidynamikk. Dette oppnås med kommandoen "plusTipGetTracks" fire.
- Til å begynne analysen, åpen MATLAB program og skriv "plusTipGetTracks" inn i kommandovinduet. Dette vil føre til en ny dialogboks.
- Klikk på "Konfigurer ny Projects" og velg en (eller more) av den tidligere TIFF bildeserie ved å velge de riktige "bilder"-mappen (eller kataloger som inneholder "bilder" mapper). Ved gjennomføring av dette trinnet, en filkatalog (roi_1) vil bli opprettet (i samme mappe som inneholder "bilder") som skal inneholde de fremtidige datafiler. Merk: "Oppsett Nye prosjekter" trinnet kan være ferdig på forhånd, under en egen sesjon.
- Et nytt vindu vil dukke opp: "Velg et polygon, høyreklikker du på siste punktet, og klikk på 'Opprett Mask'». Klikk på "OK". Det første bildet av det valgte bildet serien vil da bli vist. Bruk musen til å klikke og opprette et polygon som omfatter helheten av veksten kjegle. Dobbelklikk på musen for å lukke mangekanten.
- Når polygon har vært stengt, vil en dialogboks dukke opp: "Ønsker du å velge en annen ROI?" Hvis bildet har en annen vekst kjegle å analysere, velge "Ja"; ellers sutvalgte "Nei".
- Velg de prosjektene som vil umiddelbart bli analysert. Klikk på "Velg Projects" og velg mappen (roi_X) å analysere.
- En listSelectGUI skjerm vises. Velg prosjekt (er) fra venstre side av skjermen, og flytte dem over til høyre side av skjermen. Klikk på "OK". Velg hvor du vil lagre prosjektlisten og klikk på "Lagre".
- Velg "Detection", "Tracking", og "Post-Processing". Når disse valgene er gjort, vil høyre side av dialogboksen blitt konfigurerbar. Konfigurer hvert alternativ.
- Disse parameterne brukes for å koble oppdaget kometer i MT spor. Detaljer for å velge disse kontrollparametere for sporing er vist på sidene 9-10 av Technical Report PDF som følger med nedlastingen programvarepakke; lese denne rapporten nøye dersom det oppstår problemer. Med henblikk på å spore EB1-GFP kometer i Xenoposs laevis vekst kjegler, bruke følgende Spore Innstillinger: Søk Radius Range (piksler) 5-12, Minimum Sub-Track Lengde (rammer) 3; Max Gap Lengde (frames) 8; Max Svinn Factor 0.8, Max vinkel Forward 50, Max vinkel bakover 10, Fluctuation Radius 2.5. Disse innstillingene er vist i figur 1.
Merk: Max Svinn Factor er satt til å redusere antall "bakover hull" oppdaget, som "bakover hull" er ikke nyttig å analysere i sammenheng med vekst kjegler, gitt de overfylte forhold og sannsynlige feil i spor bindinger. I tillegg er både Max Videre vinkel samt Svingn Radius satt relativt høy, som vekst koniske MTS oppviser små hyppige translokasjoner i tillegg til vekster og krympninger, og øke disse kontrollinnstillinger tillater denne økte bevegelse under stengene trinn.- Fyll i etterbehandlingen innstillinger avhengig av de ønskede spesifikke bildetakings innstillinger.
- Når innstillingene er konfigurert, klikker du på "Start". Programvaren vil kjøre uansett hvilken innstillinger har blitt valgt. Dette kan ta minutter til timer, avhengig av hvor mange prosjekter er valgt og deres størrelser. Kommandovinduet viser anslått gjenværende tid for hver funksjon. Når plusTipGetTracks trinnet er fullført, vil Command vindusutstillingen "Ferdig!"
Merk: En lang liste av spesifikke parametre for MT dynamikk har nå blitt beregnet av denne programvaren (se Reference 4 for detaljer), men for analyse av MT dynamikken i vekst kjegler, de mest nyttige parametere for å undersøke er MT vekstsporet hastighet (i mikron / minutt), vekstsporet levetid (i sekunder), og vekst sporlengde (i mikron).
3. plusTipSeeTracks
Merk: Nå som microtubuli sporene er definert, er funksjonen "plustipSeeTracks" brukes for spor visualisering fire. Denne funksjonenkan gi flere utganger for visualisering, inkludert romlige MT dynamikk kart og farts filmer, men her er fokuset utelukkende på bruk av "Spor Movies" for å vise MT spor oppå vekst kjegle bilder. Mens plusTipGetTracks kan analysere flere filmer på en gang, kan plusTipSeeTracks bare analysere én film om gangen.
- Skriv "plusTipSeeTracks" inn i kommandovinduet.
- Når dialogboksen laster, klikk på "Velg prosjekt". Velg den overordnede katalogen inneholder prosjekt for å visualisere og klikk på "Velg mappe". Et nytt vindu vil dukke opp: "Velg prosjektet du ønsker å visualisere". Velg filen som skal visualisere og klikk på "OK".
- Deretter klikker du på "Velg Saved ROI". Naviger til samme roi_X mappe som er valgt i forrige trinn, og velg filen som heter "roiYX".
- Klikk på "Velg Output Directory" for å utpeke wher MATLAB vil lagre sporvisualiseringsfiler. Merk: Vi anbefaler at du bruker den samme mappen som inneholder resten av dataene.
- Velg "Make Track Movie" og en skjerm vises med alle sporene plusTipGetTracks beregnet fra + tips kometer. Dette trinnet sparer spores tidsserier i en film format, i filen "allTracks_X_X_X". Det er et alternativ for å lagre filmen som en AVI, ellers standardformatet er som en Quicktime.mov fil.
4. plusTipGroupAnalysis
Merk: Denne siste funksjonen brukes til å opprette grupper av filmer for analyse og sammenlikning av MT spor parametere.
- Skriv "plusTipGroupAnalysis" inn i kommandovinduet. Slik velger du gruppene manuelt å sammenligne, første de-velge "Auto gruppe fra hierarki". Deretter klikker du på "Velg prosjekt". Naviger til de overordnede kataloger som inneholder alle roi_X mapperå analysere.
- En listSelectGUI skjerm vises. Velg alle prosjekter for å inkludere i gruppene fra venstre side av skjermen, og flytte dem over til høyre side av skjermen. Klikk på "OK". Velg hvor du vil lagre prosjektlisten og klikk på "Lagre".
- Et vindu vil dukke opp: "Vennligst velg første gruppen fra listen". Klikk på "OK". Den listSelectGUI vinduet vil vise igjen. Denne gangen velger kun de filene som stemmer med den første gruppen som skal samles sammen. Klikk på "OK".
- Deretter skriver du inn navnet på gruppen, og klikk på "OK". Et vindu vil dukke opp: "Velg en annen gruppe?" Svar tilsvarende og fortsette å velge grupper. Et vindu vil dukke opp: "Velg hvor du vil lagre gruppelisten". Naviger til plasseringen og klikk på "Lagre".
- Klikk på "Velg Output Directory" til å velge hvor de utgå mapper vil værelagret.
- Velg hvilken type gruppe analyse for å gjennomføre - om MT sporene bør være felles for hver gruppe eller per celle analyse bør utføres. De anbefalte statistiske tester er allerede utpekt. For å inkludere alle sporene i analysen, de-velge "Fjern spor ved begynnelsen / slutten av filmen". Ellers har denne boksen valgt fjerner eventuelle MT vekst spor som er i prosess som filmen begynner eller slutter.
- Etter gruppeanalyse valg er gjort, velg "sammenligne grupper".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne programvaren som beskrevet her vil gi flere filer med informasjon som kvantifiserer + tips dynamikken i levende celler.
Funksjons plusTipGetTracks identifiserer sporene (med eksempelinnstillingene vist i figur 1), og gir parametre vedrørende + tips spor da. Hvis du vil vise informasjon om at programvaren har oppnådd, gå inn i roi_X katalogen som ble opprettet i trinn 2.2. Den "feat" mappen inneholder "overlayImages", som er en serie med bilder som viser de oppdagede kometer. Undersøke disse bildene ved hjelp av bildeanalyse programvare kan demonstrere nøyaktigheten av kometen gjenkjenning. Den "meta" mappen inneholder også detaljert informasjon om + tips komet statistikk, inkludert "projData" filen, samt "Stats" filen. Hvis du vil vise "Stats" filen, dra den inn i en åpen regneark av et regnearkprogram. Denne filen inneholder beregned mikrotubulus parametere for hver film (figur 2). Som nevnt ovenfor, er en lang liste av spesifikke parametre for MT dynamikk beregnet av denne programvaren (se Reference 4 for detaljer), inkludert MT vekstsporet hastighet (i mikron / minutt), vekstsporet levetid (i sekunder), og vekst sporlengde (i mikron).
Funksjons plusTipSeeTracks sparer en film av fulgte kometer, som kan gjennomgås ved å åpne filen "allTracks_X_X_X" (figur 3).
Funksjonen plusTipGroupAnalysis kombinerer flere individuelle datasett inn i grupper og skaper mapper (oppkalt perCell eller pooledData, avhengig av hvilken analyse er valgt) som inneholder gruppen parameterdata, inkludert histogrammer, tomter, og regneark for å sammenligne grupper og individuelle parametere innenfor hver gruppe (figur 4).
Figur 1. PlusTipGetTracks innstillingene som brukes for EB1-GFP kometer i Xenopus laevis vekst kjegler. Denne figuren viser de spesifikke innstillingene på "Detection", "Tracking", og "Post-Processing" trinn som kan brukes for analyse av EB1-GFP kometer i Xenopus laevis vekst kjegler. Den plusTipParamSweepGUI verktøy, tilgjengelig innenfor plusTipTracker pakken, kan brukes til å optimalisere innstillinger sporing for andre modellorganismer og / eller celletyper 7.
Figur 2. Skjermbilde av MT parametere hentet fra plusTipGetTracks analyse. Den "meta"-mappen, laget ved å kjøre plusTipGetTracks, inneholder informasjon om + TIP cOMET statistikk. Ved å dra i "Stats"-fil til et regnearkprogram, kan mikrotubulidynamikk parametere undersøkes.
Figur 3. Skjermbilde av MT spor filmen hentet fra plusTipSeeTracks analyse. PlusTipSeeTracks ikke bare åpner for mikrotubulus spor visualisering, men også fungerer som et kontrollverktøy ved å tillate brukeren å vise gyldigheten av data innhentet fra plusTipGetTracks.
Figur 4. Skjermbilde av MT parametere hentet fra plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis tilbyr brukeren en enkel metode for å sammenligne grupper og individuelle parametrene between innenfor hver gruppe ved å kombinere flere individuelle datasett og generere statistisk utgang, noe som kan undersøkes i et regnearkprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PlusTipTracker gir en grei, grafisk brukergrensesnitt for å raskt og automatisk oppdage nesten alle synlige EB1-GFP kometer i en celle eller vekst kjegle, knytte kometer i spor, og beregne MT parametere. Andre publikasjoner har rapportert utformingen av lignende typer programvare (f.eks Marx et al. Også benyttes kvantitativ analyse av merket EB1 dynamikken i vekstkjegler 18). Men, synes denne programvaren til å være unik i sin enkel tilgang, som det er fritt lastes ned fra nettsiden til Danuser Lab, som har spesialisert seg på å designe open-source, turn-key programvare nyttig for cellebiologiske samfunnet. Mens tilgangen til MATLAB er nødvendig, gjør man ikke trenger å være fullt ut kjent med denne dataprogram for å utnytte programvaren. Men det er noen punkter som må tas opp for enkel bruk.
Først av alt, en av de vanligste problemer som oppstår ved bruk av software og dataprogram for første gang er knyttet til filen banen. Hvis denne feilen oppstår (med meldingen "Feil ved hjelp av cd -. Argumentet må inneholde en streng Feil i formatPath ..."), så er den enkleste løsningen for å sikre at plusTipTracker programvare, samt katalogen med alle de "bilder" underkataloger, er begge i samme "MATLAB" filbanen. Det beste er om disse er ikke i "Program Files" katalogen, som det har vært antydet at plassen i "Program Files" navn kan være et problem. Relatert til dette, er det viktig å merke seg at plusTipTracker lagrer filen banen som ble benyttet ved først å beregne plusTipGetTracks analyse, og som sådan, må denne filen banen opprettholdes når disse data er tilgjengelig, og anvendes av en annen komponent av programvaren. Funksjonene plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks, og plusTipGroupAnalysis alle bruke den opprinnelige lagrede filen banen, og dermed prøver å calle disse funksjonene for en gitt film, etter å ha flyttet filene til en annen vei, vil resultere i en feil.
En annen vanlig feil å oppstå under analyse er når Tracking feiler underveis plusTipGetTracks trinn. Dette vil skje hvis en ramme i bildeserie inneholder ingen påvisbare kometer. Dette vil fullstendig stanse analysen, og ingen etterbehandling vil oppstå. En enkel løsning for å omgå dette problemet og la analysen å fortsette, er å lage en mock komet på bildet i et område hvor det ikke vil være feil knyttet til eventuelle faktiske spor. Dette vil ikke påvirke den endelige spor parametere, som enhver komet som ikke finnes i et minimum antall påfølgende rammer vil bli filtrert ut av den endelige analysen.
Et annet problem som kan oppstå er defekt komet gjenkjenning. Dette kan vanligvis løses ved å forbedre region-of-interesse valget i trinn 2.3. Det er viktig å trekke regionen av interesse tett rundt cellen og ikke å trekke awer nødvendig Ider regionen enn. Programvaren bruker denne regionen for å bestemme bakgrunns brukt under komet gjenkjenning. Hvis komet påvisning er fortsatt sub-optimal med standardinnstillingene, kan innstillingene justeres i plusTipGetTracks vinduet (under trinn 2.7).
Etter noen analyse, er det avgjørende å validere automatiserte spore sammenhengene ved øyet, ved hjelp plusTipSeeTracks. Sporing innstillinger må endres for å redusere antall falske positive eller falske negative komet bindinger. Se den opprinnelige plusTipTracker dokumentasjon 4 samt den tekniske rapporten PDF som følger med programvaren nedlasting for detaljer om hvordan du optimaliserer innstillingene. Utførelsen av denne programvaren i forhold til hånd-sporing har tidligere blitt testet i ikke-nevronale celler fire. Vekst kjegler utgjøre en litt annen utfordring, men som vekst kjegle MTS oppviser hyppige translokasjoner i alle retninger 17, i tillegg til MT vekst og krymping. En issue som ikke ble funnet å være et stort problem er om de tettpakkede MTS i vekst kjegler posere sporing vanskeligheter 17. Som bare en undergruppe av MTS er i vekstfase, med EB1-GFP på endene, løse og spore individuelle EB1-GFP kometer var ikke problematisk. Imidlertid bør det legges merke til at disse tidligere studiene benyttet Xenopus laevis vekstkjegler, som ble spesifikt valgt på grunn av deres relativt store vekst kjegle størrelse (ca. 10 mikron), sammenlignet med andre vertebrate vekstkjegler. Ved hjelp av disse større vekst kjegler åpner for mer nøyaktig EB1-GFP komet analyse.
For å vurdere nytten og nøyaktighet av denne programvaren for å analysere EB1-GFP spor i Xenopus laevis vekst kjegler, vi sammenlignet opplevelsen av å bruke plusTipTracker med hånd-sporing av en identisk dataserier (data ikke vist). Tiden det tok å hånd-track EB1-GFP kometer i en gjennomsnittlig vekst kjegle av 39 komet spor (i 1 minutt time-lapse series, med 2 sekunder mellom hver ramme) ble i løpet av to timer, i forhold til to minutter ved hjelp av programvaren. Parametrene oppnådd med de to metodene var lik for MT veksthastighet (7,4 mikron per minutt for automatiske sporings versus 7,0 mikron per minutt for hånd-sporing). Men for vekst levetid og lengde, fører programvare analyse betydelig kortere spor (med om lag halvparten av tiden og avstand). Dette skyldes vekst spor blir delt av programvaren hvis en komet går inn og ut av fokus over tid. Mens det menneskelige øyet kan lett identifisere at det er den samme kometen, ikke programmet. Dette problemet er ikke problematisk om, hvis man bruker programvaren for å sammenligne flere forhold. Siden identiske sporing parameterne brukes for alle forhold (og forutsatt at kometer gå inn og ut av fokus i samme tempo i flere forhold), deretter de relative levetid og lengder er fortsatt ganske nyttige målinger for sammenligning. Som for automatisert analyse error rottees, disse avhenge sterkt på kvaliteten på bildene. I høye signal-til-støy-filmer, er i samme sifre i prosent av misjoined eller feil spor. Selv i lavere kvalitet filmer (hvor enkelte kometer er fortsatt godt synlig ved øyet, men bakgrunnsstøyen er størst), feil prisene er fortsatt lave nok (5-15%) at den betydelige spart tid ved hjelp av programvaren er verdt kostnader i feil. Dette er spesielt tilfelle når analysere hundrevis av vekst kjegler (60-8 vekst kjegler per tilstand ble analysert i en tidligere studie 17).
Det er viktig å merke seg at denne programvaren er designet for å oppdage + tips kometer som bare binder seg til voksende MT ender, slik som EB1-GFP. Gitt at overføring samt sporing algoritmer forventer at kometer bare eksisterer på polymerisering MTS, bruker denne programvaren til å analysere dynamikken i en fluorescently-merket + TIP som binder seg til krympende MT ender i tillegg til voksende endene vil føre til uriktige opplysningerom beregnet MT veksthastigheter.
En av de unike funksjonene i denne programvaren i forhold til andre single-partikkel-sporing av programvare, er at det tar hensyn til kjente MT atferd å beregne ikke bare Polymerisasjon parametere, men også svinn parametere. Det gjør den ved å koble en EB1-GFP komet som har forsvunnet med en som har nylig dannet rett bak den i samme bane (dette kalles en backgap, eller bgap spor). Selv om denne algoritmen virker godt for noen celle-typer, slik som HeLa-celler 4, er det en mindre effektiv funksjon ved analyse MT dynamikken i vekstkjegler. Dette er fordi MT-spor ofte følger hverandre langs de samme stiene i vekst kjegler (ofte følgende sammen F-aktin bunter), og så er det som regel umulig å si om bgap sammenhengene er riktige. Av denne grunn er det ikke anbefalt å benytte bgap data utganger i vekst kjegler.
Til tross for disse mindre ting og problemersom må tas i betraktning når du bruker plusTipTracker (og de fleste noen automatisert bildebehandlingsprogram), kan denne programvaren være et svært nyttig verktøy for å analysere tusenvis av EB1-GFP kometer i en relativt kort tidsperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
