Protocol
NOT: Hayvan Deneyleri Etik için Göttingen Üniversitesi Komite tarafından onaylanmış Hayvan taşıma ve deneyler yapıldı.
Göstergeler ve Pipet Fabrikasyon 1. Hazırlık
- Elektroporasyon kurulum büyük çalışma mesafesi ile stereomicroscope oluşur ve kullanılan boya için floresan aydınlatma ve filtre setleri ile donatılmış olduğundan emin olun.
- Elektroporasyon için özel tek bir hücre elektrogözenekleme veya bir osiloskop bağlı bir genel kare darbe jeneratörü kullanabilirsiniz. Bir pipet tutucu ve bir banyo elektrot için Electroporator çıkışlarını bağlayın. Mikropipet tutucu ve banyo elektrot negatif terminaline darbe üretecinin pozitif terminaline bağlayınız. Pipet tutucu ve banyo elektrot hem gümüş klorür ince bir tabaka ile kaplı gümüş telleri içerir emin olun.
- Tam olarak konumlandırılmasını sağlamak için bir mikromanipülatör pipet tutucu monte edin. İç filament borosilikat cam kılcal damarlardan elektroporasyon Mikropipetler Üretiyor.
- Yatay bir mikropipet çekme aleti kullanarak ve Bestman ve diğ., 13 tarafından tarif edildiği gibi bağlantı klemp deneyleri için pipetler üretimi için değiştirilmiş bir protokol uygulanır.
- Uzun bir sap ve tek hücre elektroporasyon için yaklaşık 15-20 MOhm daha yüksek bir pipet direnç sonuçlanan küçük bir ipucu açılış üretmek için parametreleri uyarlayın. Pipet direnci hücre grubunun etiketlenmesi için, 3-4 Mohm, örneğin, daha düşük olmalıdır.
- Özel tek hücreli elektroporatörü ile pipet direnci ya doğrudan ölçmek veya tanımlanmış bir gerilim darbesi uygulamasından sonra bir osiloskop ile akım ölçümü sonra Ohm Kanunu ile hesaplayın.
Elektroporasyon Çözüm 2. Hazırlık
- Kurbağa zil (98 mM NaCI, 2 mM KCI içinde florofor ile eşleştirilen dekstran çözülür, 1 mM CaCI2, 2 mM MGCl, 2, 3 mM'lik bir konsantrasyonda, 5 mM glukoz, pH 7.8 ayarlanır, 5 mM'lık Na-piruvat, 10 mM HEPES, ozmolarite mOsmol / l, 230 idi). Düşük boya konsantrasyonları kullanıldığında hücreler bu şekilde parlak etiketli olabilir. Bir büyük hacimli stok çözeltisi hazırlayın ve küçük parçalar bölün. Depolama (ay boyunca stabil) onları dondurun.
NOT: Dekstranlar farklı boyutlarda ve emisyon / uyarma spektrumları çeşitli mevcuttur (. Örneğin, Alexa 488-dekstran 10KD, Alexa 546-dekstran 10KD, Alexa 568-dekstran 10KD, Alexa 594-dekstran 10KD, TMR-dekstran 3kD). - Dekstran çözeltisi (1-5 ul) küçük bir hacim ile ince uzun bir pipet ucu ile mikropipet Dolgu. Dikkatle pipet ucundan artık hava kabarcıklarını çıkarmak için parmak ile mikropipet fiske.
- Pipet tutucu mikropipet monte edin. Pipet içine gümüş tel boya çözeltisi ile temas içinde olduğundan emin olun.
Larva X. 3. Seçim laevis </ Em>
- X. albino larvaları kullanın deneyler için laevis. Yabani tip hayvanlarda konfokal / multiphoton görüntüleme sırasında otofloresan emisyon göstermektedirler ve bu nedenle tarif edilen deneyler için uygun değildir pigment doldurulmuş melanophores sahiptir.
- Nieuwkoop ve Faber 14 sonra premetamorphotic Kurbağa yavrularını Sahne. Deneyler için aşamaları 45-53 ve Kurbağa yavrularını seçin.
Florofor çiftli dekstranlar 4. Elektroporasyon
- Bir petri çanağı içinde doku küçük bir parça yerleştirilir ve (pH 7'ye ayarlanır Etil 3-aminobenzoat metansülfonat),% 0.02 tricaine ihtiva eden küçük bir su hacmi ile örtün.
- % 0.02 tricaine içeren su içinde yavrularını anestezisi. Birkaç dakika sonra hayvanlar hareket ateşkes. Kurbağa yavrularını dokunarak uygun anestezi onaylayın. Onlar sigara duyarlı olmalıdır.
- Dikkatlice doku kapalı petri anestezi gelen, tetra aktarın.
- Emin banyo Electr olungazel elektroporasyon devresini kapatır. Elektrot ıslak doku ile temas halinde olduğunu temin etmek; tadpole doğrudan temas gerekli değildir.
- Mikromanipulatör kullanılarak Koku alma organı mikropipet ucu yakın yerleştirin.
- Pipet ile koku organı çevreleyen cilde nüfuz ve dikkatli ana koku epiteli veya vomeronasal epitel merkezi konumdaki duyusal nöron tabakası içine ucu ilerlemek.
- Duyu nöronlarının içine boya aktarmak için pozitif kare voltaj darbeleri tetikler. Tek bir gerilim darbe uygulamak (örn., 25 V, darbe uzunluğu 25 msn) veya birden darbelerinin trenler (örn., 50 V, darbe uzunluğu 300 mikro saniye, 200 Hz 400 msn tren süresi).
Etiketleme uzatmak istenen optimal gerilim darbe parametreleri belirleyin: NOT. Etiketli hücrelerin sayısını düşürmek için gerilim darbe genliği, süresi ve tekrarlama sayısını azaltın. P yüksek gerilim darbe genlik, süresini ve sayısını Uyguladaha yaygın bir etiketleme ulses. - Stereomicroscope floresan aydınlatma kullanılarak tetiklenen darbeleri başarılı boya ekstrüzyon ve elektroporasyon gözünüzde canlandırın. Boya başarılı elektroporasyon sonra bir hücre gövdesi ve dendritin içine hızla yayılır.
- Tekrar tadpole ikinci koku organı için 4,5-4,9 adımları.
- Geri kazanım taze su ile dolu bir beher içine, tetra aktarın. Ca sonra 5 dk iribaşları anesteziden uyanmak ve normal yüzme hareketleri başlar.
- 24 saat sonra elektroporasyonlu boya duyu nöronlarında yayılır ve sonunda aksonal taşıma araçları ile koku ampul ulaşır.
Hücreler ve Akson Süreçlerinin İn Vivo Görselleştirme 5. Montaj Hayvanlar
- % 0.02 tricaine içeren su içinde yavrularını anestezisi.
- Dikkatle örneğin bir görüntüleme odasının içine Kurbağa yavrularını aktarmak, küçük bir silikon kauçuk bir iribaş ölçekli girinti ile petri kaplı. </ Li>
- Parafilmlerin bir şerit içine küçük bir dikdörtgen kesin. Kesik pencere içinden açıkta kalan ön Telencephalon bırakarak Parafilm ile, tetra örtün. Iribaş zarar vermeden yemeğin üzerine iğne ile Parafilm sabitleyin.
- Iribaş% 0.02 tricaine içeren yeterli su altında olduğundan emin olun.
- Dik multiphoton mikroskop veya konfokal mikroskop sahnede görüntüleme odasına monte edin.
- Koku ampul görüntüleri üç boyutlu yığın edinin. Görüntüleme işlemi mümkün olduğu kadar kısa ve 10-15 dk aşmamasına dikkat edin.
- Ayrı bir tanka normal suya iribaş dönmek ve ışığa maruz kalmasını önlemek. 5 dakika sonra, tetra anestezi uyanır.
- Tekrar, belirlenen zaman aralıklarında sonra 5,1-5,7 adımları örn., Her gün.
Hücreler ve Akson Süreçlerinin Ex Vivo Görsellik 6. Montaj Hayvanlar
- Alternatif bölüm 5protokol, etiketli duyusal nöronlar görselleştirmek için bir kesilmiştir beyin hazırlık kullanın.
- Anestezisi ve omuriliğe geçişte beynin transeksiyonu ile, tetra öldürür. Koku organları, koku sinirleri ve ön Telencephalon içeren bir doku blok tüketim.
- Kurbağa zil çözüm doku bloğu aktarın ve beynin ventral tarafında ortaya çıkarmak için ince makas ile bağ dokusu kaldırmak.
- Bir görüntüleme odasına doku bloğu aktarın ve naylon ipliklerle telli bir platin çerçeve ile bunu düzeltmek.
- Konfokal / multiphoton mikroskop sahnede görüntüleme odasına monte edin.
- Koku ampul görüntüleri üç boyutlu yığın edinin.
7. Görüntü İşleme ve Veri Değerlendirme
- Coupé'si, P. ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi uygun hale getirilmesi ve görüntü kalitesi ve nöronal yapıları görselleştirme artırmak için filtreleme yerel olmayan araçlar uygulanır. 15..
NOT: canlı örneklerin derin doku katmanları görüntüleme deneylerinden veriler genellikle gürültülü. - Genel bir bakış için görüntü yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları oluşturun.
- Time-lapse görüntüleme deneyleri duyu nöronlarının tek belirgin olarak teşhis akson için veri setleri ekran.
- Peng ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi nöronal işlemin yazılım destekli izleme ile hücre morfolojisi yeniden yapılandırma. 16.
Representative Results
Açıklanan protokol, başarılı bir elektroporasyon ve anestezi X'in koku alma sisteminin duyusal nöronların aksonal süreçleri in vivo görüntüleme uygulanabilir laevis, odaklı lazer-tarama veya multiphoton mikroskobu (Şekil 1) kullanılarak.
Elektroporasyon fluoroforla birleştiğinde dekstranları girmek için ve hızla koku organın hücreleri içinde yayılmasını sağlar. Bu voltaj darbeleri tetikleyen sonra başarılı etiketleme doğrulamak için floresan aydınlatma uygulamak yararlı olacaktır. , Elektroporasyon parametrelerine bağlı olarak örn., Pipet direnci, hücreleri (Şekil 2A, B) ya da koku organın tek hücreler (Şekil 2C) grupları etiketlenir. Etiketli duyu nöronlarının akson koku sinir (Şekil 2B) olarak görülebilir ve aksonal işlemler başarılı Elektroporasyondan sonra, koku ampul de, genellikle 24 saat gözlenebilir(Şekil 3). Duyusal nöronların gruplarının Elektroporasyon koku ampul (Şekil 3A) içindeki kaba kablo desenleri görselleştirme sağlar. Tek hücre elektroporasyon koku ampul (Şekil 3C-E), glomeruler yapılar tek tek aksonal projeksiyon desenler, aksonal dallanma ve bağlantı araştırmak için uygulanabilir.
X Şeffaf albino iribaşları vivo confocal veya anestezi tadpole bozulmamış beyin etiketli duyu nöronlarının multiphoton görüntülenmesinde laevis izni. Aynı etiketli duyu nöron (Şekil 4) in vivo görselleştirme tekrarlanan tarafından aksonal büyüme desen gelişimi birkaç gün / hafta içinde izlenebilir. Koku ampul akson desen önemli ölçüde değişebilir elektroporasyon zaman noktasında duyusal nöronun vadesine bağlı. Olgun nöronlar zaten bir tutam bulunuyor ayrıntılı akson dalları sahipglomerüllere bağlı ed alanları. Olgun nöronların aksonal büyüme paterni oldukça kararlı olduğunu, ancak akson dalları ve glomerüler kümelerinin inceliklerinin uzama (Şekil 4A-E) gözlenebilir. Duyu nöronlar, uzun süreler boyunca in vivo olarak görülebilir, örneğin., Üç haftadan daha uzun (Şekil 4F) elde edilir. Diğer taraftan, olgun olmayan nöron aksonları, bir araya getirilen arborizations sahip olmayan, ilk büyüme sürecinde hala ve henüz nihai glomerüler hedeflerine bağlı değil. Deneysel protokol, olgunlaşma sırasında bu nöronların gelişimini izlemeye olanak sağlar, örneğin., Akson uzama, çatallanma ve bir araya getirilen arborizations (Şekil 4 J-L) oluşturulması. Daha fazla örnek için de Hassenklöver ve Manzini 12 bkz.
Anestezi X'in koku organı deneysel protokol Şekil 1. şematik genel bakış. (A) ana koku epiteli Duyu nöronları (MEB) veya vomeronasal organı (VNO) laevis larva fluoresan dekstran çözeltisi ile dolu bir cam pipet kullanılarak elektroporasyon yoluyla etiketlenir. Etiketli nöronların aksonları koku sinir (ON) ile takip ve sonunda koku ampul (OB) ulaşır. (B), larva anesteziye tabi tutulmuş ve işaretli sinir art arda belli bir zaman aralığında, bir eş odaklı veya multiphoton mikroskop kullanılarak incelenmiştir edilebilir. (C) işaretli hücrelerin aksonal büyüme kalıpları artan gelişimi hafta gün zaman dönemlerini kapsayan takip edilebilir.
Şekil 2. ElecKoku alma organı duyusal nöronların troporation. düşük dirençli bir pipet (A) Elektroporasyon koku organda birden fazla hücre etiketlenmesi yol açar. Bu temsilci örnekte birden fazla koku reseptörü nöronlar (ORNs, dolu ok başları) ve iki sütunlu şeklindeki destekleyici hücreleri (AVM'ler, yıldız) boyandı. Kesikli çizgiler pipet direncini artırarak, etiketli hücrelerin sayısını sınırlar, koku epiteli (OE). (B) elektroporasyon parametreleri koyan örneğin. Sınırlarını ayırmak. Bu örnekte, tek bir duyu nöronu (dolu ok başları) ve bir bitişik destek hücresi (yıldız) elektroporasyon sonra boyandı. Koku epiteli (açık ok başları) bırakarak tek akson unutmayın. (C) Başarılı tek hücre elektroporasyon bireysel duyusal nöron (dolu ok başı) ve koku epiteli onun bağlı akson (açık ok başları) özel etiketleme yol açar. 
Şekil 3. eksize koku ampul koku alma akson projeksiyonlar görselleştirme. (A) koku ampul duyu nöronlarının aksonal projeksiyonlar kaba topoloji düşük direnç elektroporasyon pipetler kullanılarak görülebilir. Bir koku ampul hemisfer ve ilişkili koku sinir (ON) tasvir edilmektedir. Farklı fluorophoresle bağlanmış dört dekstranları Koku alma organı dört uzak yerlerde elktroporatlandı: Lateral (yeşil), orta (sarı), Moe (kırmızı) ve VNO (turuncu) medial. Bu aksesuar koku ampul (AOB) ve ana koku ampul (MOB) olarak üç ana projeksiyon alanları görselleştirme sağlar. 
Tek bir koku nöron akson vivo time-lapse görüntüleme Şekil 4.. (AE)Başarılı tek hücre Elektroporasyondan sonra etiketli akson defalarca koku ampul (OB) olarak görülebilir. Bu örnek, bir hafta boyunca araştırılmıştır bağımsız bir akson göstermektedir. Genel morfolojisi önemli ölçüde değişmez ve iki büyük dallanma noktaları (açık ok başları) tespit edilebilir. Diğer iki glomerüler kümeleri sabit (yıldız) olarak kalır süresi boyunca, tek bir glomerüler elyaf, sürekli bir azalma (dolu ok başı) maruz unutmayın. (FI) Bu temsili bir örneği, uzun süreli gözlemlerin canlılığını gösteren bu spesifik akson araştırılmıştır olarak fazla üç hafta boyunca. Büyüme modelinin belirgin bir değişiklik tespit edilebilir. (JL) büyüme sürecinde olgunlaşmamış duyusal akson bir örnek tasvir edilmiştir. Henüz glomerüllere ve karakteristik glomerüler püskülleri eksik bağlı değil. Aksonal dalları uzatılmış 5 gün sonra, akson birden çok kez, ince arborizations olan çatalkurdu.
Discussion
Burada tarif edilen deney prosedürü, larva X'in koku organı etiketlenmesi duyu nöronları karşılaştırın fluoroforla birleştiğinde Dekstranların ve canlı hayvanın duyusal akson büyüme sonraki görselleştirme elektroporasyon ile laevis. In vivo elektroporasyon parametrelerinin değiştirilmesi ile, bu etiketlenmiş duyusal nöronların sayısını kontrol etmek mümkündür. Bu çok az ya da tek hücrelerin bir duyu epitel, nöron büyük gruplarını etiketlemek için mümkün olmaktadır.
O mikropipet özellikleri ve elektroporasyon bakliyat konusunda özellikle dikkatli olmak önemlidir nöronal etiketleme uzatmak arzu sağlamak. Yükseköğretim pipet dirençleri ve gerilim darbe genlik, süre ve tekrarlama sayısının azaltılması daha yaygın etiketlemeye neden olabilir pipet dirençleri ve yüksek gerilim darbe genliği, süresi ve bakliyat sayısının azaltılması ise, etiketli hücrelerin miktarını azaltabilirsiniz. Thelektroporasyon için floresan dekstranlardan e kullanılması uygulanan ayarlarının uygun olup olmadığını anında görsel geri bildirim sağlar. Dikkatli olun bu genlik, süre ve potansiyel hücre hasarına hatta ölüme 17 hücre olabilir protokolde verilen değerleri aşması darbelerinin sayısı parametreleri kullanılarak. Mikropipetlerin tıkanmış veya kırık uçlar da başarılı Elektroporasvon sürebiliyor.
X'in Koku alma organı in vivo elektroporasyon postmetamorphotic kurbağaların deri sert ve kolay bir mikropipet ile nüfuz edilemez çünkü laevis larva aşamasında sınırlıdır. Nöron in vivo görüntüleme derin beyin alanlarında ya da kan damarları ile uyarım / emisyon ışık saçılmasıyla engellenmiş edilebilir. Bu sorun, daha büyük bir beyin için daha yüksek bir larva aşamalarında, özellikle belirgin hale gelir ve ince aksonal süreçlerin açıkça tanımlanması daha zor hale gürültülü sinyallere neden olabilir.
Protokolün uygulanması koku duyusal nöronlar ile sınırlı değildir, aynı zamanda, örneğin, diğer hücre tipleri, çalışma için uygulanabilir., Gelişmekte olan beyin ya da koku ampul hücre mitral nörojenik bölgelerin / projenitör hücrelerini. Buna ek olarak gösterilen teknik de etiketli nöron ve / veya bağlı devre 7,19 ile ilgili işlevsel bilgi almak için zan-geçirgen kalsiyum boyalar kalsiyuma duyarlı dekstranlar ile kombinasyon halinde kullanılabilir ya da enjekte edilebilir. Dekstranlar bağlanmış florofor geniş kullanılabilirliği çoklu bireysel hücreler ya da farklı renklere sahip popülasyonlarının etiketleme izin verir. Ayrıca, flüoresan protein için, örneğin, kodlama için bir DNA çözeltisi, plazmit elektroporasyon için müsait olan ve bundan başka versatili artırabilirty ve tekniğin 6 kullanışlılığı. Protokol daha dekstranlar ve DNA ya da yüklü morpholinos birleşik elektroporasyon gen ekspresyonunu 13,17 işlemek için izin vermek için geliştirilmiş olabilir.
Anlatılan yöntem kesinlikle kompleksi ve omurgalı koku sistemi aksonal rehberlik düzenleyen hala tam olarak anlaşılmış değildir süreçlerini araştırmak için yeni bir araç temsil eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
