Protocol
OBS: Animal hantering och experiment utfördes som godkänts av Göttingen University kommittén etik inom djurförsöks.
1. Beredning av instrument och pipett Fabrication
- Säkerställ att elektroporation inställnings består av ett stereomikroskop med stort arbetsavstånd och är utrustad med fluorescerande belysning och filteruppsättningar för det använda färgämnet.
- För elektroporering använda antingen en dedikerad enda cell elektroporator eller en generisk fyrkantig pulsgenerator kopplad till ett oscilloskop. Anslut elektroporator utgångar till en pipett hållare och ett bad elektrod. Anslut den positiva polen på pulsgeneratorn till mikropipett hållaren och den negativa polen till badet elektroden. Se till både pipetten hållaren och badet elektroden innehåller silvertrådar belagda med ett tunt skikt av silverklorid.
- Mount pipetten hållaren på en mikromanipulator för att tillåta exakt positionering. Tillverka elektroporering mikropipetter från borosilikatglas kapillärer med interna glödtråd.
- Använd en horisontell mikropipett avdragare och tillämpa ett modifierat protokoll för framställning av pipetter för patch clamp-experiment såsom beskrivits av Bestman et al., 13.
- Anpassa parametrar för att producera ett längre skaft och en mindre spetsöppning vilket resulterar i en högre pipett resistans på omkring 15 till 20 MOhm för enkelcell elektroporering. Pipetten motståndet bör vara lägre, t.ex. 3-4 MOhm, för märkning av grupper av celler.
- Mät pipetten motståndet antingen direkt med en dedikerad encelliga elektroporator eller beräkna den med Ohms lag efter mätning strömflödet med ett oscilloskop efter applicering av en definierad spänningspuls.
2. Beredning av elektroporation Solution
- Lös fluorofor-kopplade dextran i groda ringsignal (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MGCl 2, 5 mM glukos, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, pH justerades till 7,8, osmolariteten var 230 mOsmol / l) vid en koncentration av 3 mM. Cellerna får inte så ljust märkas om lägre färgämneskoncentrationer används. Förbered en stor volym stamlösning och dela upp den i små alikvoter. Frysa dem för lagring (stabila under månader).
OBS: Dextraner finns i olika storlekar och en mängd olika utsläpp / excitationsspektra (t.ex. Alexa 488-dextran 10 kD, Alexa 546-dextran 10 kD, Alexa 568-dextran 10 kD, Alexa 594-dextran 10 kD, TMR-dextran 3kD.). - Återfyllning mikropipett med en långsträckt pipettspets med en liten volym av dextran-lösning (1-5 | il). Noggrant flick mikropipett med fingret för att avlägsna kvarvarande luftbubblor från pipettspetsen.
- Montera mikropipett i pipetten hållaren. Kontrollera att silvertråden inuti pipetten kommer i kontakt med färgämneslösningen.
3. Val av Larv X. laevis </ Em>
- Använd albino larver av X. laevis för experimenten. Vildtyp djur besitter pigmentfyllda melanoforer som visar autofluorescens utsläpp under konfokala / multifotonavbildning och är därför inte lämplig för de beskrivna experimenten.
- Iscensätta premetamorphotic grodyngel efter Nieuwkoop och Faber 14. Välj grodyngel av etapperna 45-53 för experimenten.
4. Elektroporation av fluorofor kopplade Dextraner
- Placera en liten bit vävnad i en petriskål och täck den med en liten volym vatten innehållande 0,02% tricaine (etyl 3-aminobensoat metansulfonat, justerad till pH 7).
- Söva grodyngel i vatten innehållande 0,02% tricaine. Efter några minuter djuren upphör flytta. Bekräfta korrekt anestesi genom att peka på grodyngel. De bör vara icke-lyhörd.
- Försiktigt överföra grodyngel från bedövningsmedel till vävnaden övertäckt petriskål.
- Se till att badet elektrode stänger elektroporering kretsen. Säkerställa att elektroden är i kontakt med den våta vävnaden; en direkt kontakt till grodyngel är inte nödvändigt.
- Placera mikropipett spetsen nära luktorganet med hjälp av mikromanipulator.
- Penetrera huden täcker luktorganet med pipettspetsen och försiktigt föra spetsen i centralt belägna sensoriska neuron lager av de viktigaste luktepitel eller vomeronasala epitel.
- Utlösa positiva kvadratspänningspulser för att överföra färgämnet i sensoriska neuroner. Applicera en enda spänningspuls (t.ex.., 25 V, pulslängd 25 ms) eller tåg för flera pulser (t ex., 50 V, pulslängd 300 ^ sek, 400 msek tåg tiden vid 200 Hz).
OBS: Bestäm optimala spänningspulsparametrar för den önskade omfattningen av märkning. Minska spänningspuls amplitud, varaktighet och antal repetitioner för att sänka antalet märkta celler. Ansök högre spänningspuls amplitud, varaktighet och antalet pulses för en mer utbredd märkning. - Visualisera framgångsrik färgämne extrudering och elektroporering av utlösta pulser med fluorescerande belysning av stereomikroskop. Färgen sprider sig snabbt in i cellkroppen och dendrite efter framgångsrik elektroporering.
- Upprepa steg från 4,5 till 4,9 för den andra luktorganet hos grodyngel.
- Överför grodyngel i en bägare fylld med friskt vatten för återvinning. Efter ca. 5 min grodyngel vaknar ur narkos och börja normal simning rörelser.
- Efter 24 timmar electroporated färgämnet sprids i sensoriska nervceller och så småningom når luktbulben via axonal transport.
5. Monterings Djur för in vivo Visualisering av celler och axonal Processer
- Söva grodyngel i vatten innehållande 0,02% tricaine.
- Överför försiktigt grodyngel i en avbildning kammare, t ex, en liten silikongummi övertäckt petriskål med ett grodyngel stor fördjupning. </ Li>
- Skär en liten rektangel i en remsa av Parafilm. Täck grodyngel med Parafilm, lämnar den främre telencefalon exponeras genom det utskurna fönstret. Fäst Parafilm med nålar på skålen utan att skada grodyngel.
- Se till att grodyngel är nedsänkt i tillräckligt med vatten innehållande 0,02% tricaine.
- Montera avbildning kammare på scenen av en upprätt multifotonmikroskop eller konfokalmikroskop.
- Förvärva en tredimensionell stapel av bilder av luktloben. Se till att det bildgivande förfarande är så kort som möjligt och inte överstiger 10 till 15 min.
- Returnera grodyngel i vanligt vatten i en separat tank och förhindra exponering för ljus. Efter 5 min, vaknar grodynglet från anestesi.
- Upprepa steg från 5,1 till 5,7 efter vissa tidsintervall, t ex., Varje dag.
6. Monterings Djur för Ex vivo Visualisering av celler och axonal Processer
- Alternativt till avsnitt 5av protokollet, använd en utskuren hjärn förberedelse för att visualisera de märkta sensoriska nervceller.
- Söva och döda grodynglet genom transektion av hjärnan vid övergången till ryggmärgen. Skära ett block av vävnad som innehåller luktorganen, lukt nerver och den främre telencefalon.
- Överför vävnadsblock till groda Ringer-lösning och avlägsna bindväv med fina saxar för att exponera den ventrala sidan av hjärnan.
- Överför vävnaden blocket till en avbildning kammare och fäst den med en platina ram stränginstrument med nylontrådar.
- Montera avbildning kammare på scenen av ett konfokalt / multifotonmikroskop.
- Förvärva en tredimensionell stapel av bilder av luktloben.
7. Bildbehandling och Data Evaluation
- Optimera och tillämpa icke-lokala medel för filtrering för att förbättra bildkvaliteten och visualisering av neuronala strukturer som beskrivs av Coupé, P. et al. 15.
OBS: Data från avbildningsexperiment i djupare vävnadsskikt av levande exemplar är ofta högljudda. - Skapa maximal intensitet projektioner av bildstaplar för en översikt.
- För tidsförlopp imaging experiment screena dataset för ensamstående entydigt identifierbara axoner av sensoriska neuroner.
- Rekonstruera cellulär morfologi via mjukvara assisterad spårning av neuronala processer som beskrivits av Peng et al. 16.
Representative Results
Den beskrivna protokollet kan med framgång användas för elektroporering och in vivo visualisering av axonal processer av sensoriska neuroner i luktsystemet med sövda X. laevis, med hjälp av konfokal laserskanning eller multifotonmikroskop (Figur 1).
Elektroporation tillåter fluoroforen kopplade dextraner att komma in och att snabbt sprida sig inuti celler av luktorganet. Det är bra att använda fluorescerande belysning att verifiera framgångsrik märkning efter utlösning av spänningspulser. Beroende på de elektroporeringsparametrar, t ex., Pipett motstånd, grupper av celler (figur 2A, B) eller enstaka celler (figur 2C) av luktorganet är märkta. Axoner av märkta sensoriska nervceller kan visualiseras i luktnerven (Figur 2D) och axonal processer kan observeras även i luktbulben, vanligtvis 24 timmar efter lyckad elektroporering(Figur 3). Elektroporering av grupper av sensoriska neuroner tillåter visualisera de grova ledningsdragningsmönster i luktloben (Figur 3A). Enda cell elektroporation kan användas för att undersöka enskilda axonal projektionsmönster, axonal förgreningar och anslutning till glomerulära strukturer i luktbulben (figur 3C-E).
Transparenta albinogrodyngel i X. laevis tillstånd in vivo konfokala eller multifoton avbildning av märkta sensoriska nervceller i den intakta hjärnan hos sövda grodyngel. Utvecklingen av axonal tillväxtmönster kan spåras över flera dagar / veckor genom upprepad in vivo visualisering av samma märkt sensoriska neuron (Figur 4). Beroende på mognad sensoriska neuron vid tidpunkten för elektroporering axonet mönstret i luktbulben kan variera avsevärt. Mogna nervceller redan har genomarbetade axonal grenar som huvudnummer tufted områden anslutna till glomeruli. Den axonal tillväxt mönster av mogna nervceller är ganska stabil, men förlängning av axon grenar och förfiningar av glomerulära knippen är observer (Figur 4A-E). Sensoriska nervceller kan observeras in vivo under längre tidsperioder, t ex., Längre än tre veckor (Figur 4F-I). Å andra sidan, axoner av omogna nervceller är fortfarande i färd med initiala tillväxt, besitter inte tuftade arborizations och har ännu inte anslutna till sina slutliga glomerulära mål. Den experimentella protokollet möjliggör spårning utvecklingen av dessa nervceller under mognad, t ex., Axon töjning, bifurkationer och etablering av tuftade arborizations (figur 4J-L). Fler exempel se även Hassenklöver och Manzini 12.
Figur 1. Schematisk översikt av experimentella protokollet. (A) Sensoriska neuroner i huvud luktepitel (MOE) eller Vomeronasalorganet (VNO) i luktorganet för sövda X. laevis larver märks genom elektroporering med hjälp av ett glas pipett fylld med fluorescerande dextranlösning. Axoner av märkta nervceller kan följas via luktnerven (ON) och så småningom når luktbulben (OB). (B) grodyngel bedövas och de märkta nervceller upprepat undersöks med hjälp av en konfokala eller multifotonmikroskop i specifika tidsintervall. (C) En successiv utveckling av axonal tillväxt mönster av märkta celler kan följas över tidsperioder av dagar till veckor.
Figur 2. Electroporation av sensoriska nervceller i luktorganet. (A) Elektroporering med lågt motstånd pipetter leder till märkning av flera celler i luktorganet. I detta representativt exempel flera luktreceptor neuroner (Örns, fyllda pilspetsar) och två kolonnformade stöd celler (SCS, asterisker) färgades. Streckade linjer avgränsa gränser luktepitel (OE). (B) förfina elektroporation parametrar, t ex., Ökar pipetten motståndet, begränsar antalet märkta celler. I detta exempel framställdes en enda sensoriska neuron (fyllda pilhuvuden) och en intilliggande stödcell (asterisk) färgades efter elektroporering. Notera den enda axon lämnar luktepitel (öppna pilspetsar). (C) Framgångsrika enda cell elektroporering leder till exklusiv märkning av en enskild sensoriska neuron (fylld pilspets) och dess anslutna axon (öppna pilspetsar) i luktepitel. 
Figur 3. Visualisera lukt axon prognoser i utskurna luktbulben. (A) Den grova topologi axonal projektioner av sensoriska nervceller i luktbulben kan visualiseras med hjälp av lägre motstånd elektroporering pipetter. En luktbulben halvklotet och dess tillhörande luktnerven (ON) är avbildade. Fyra dextraner kopplade till olika fluoroforer ades elektro vid fyra avlägsna platser av luktorganet: lateral (grön), intermediär (gul), medial MOE (röd) och VNO (orange). Detta gör det möjligt att visualisera tillbehöret luktloben (AOB), och de tre huvudprojektionsfält huvud luktloben (MOB). 
Figur 4. In vivo tidsförlopp avbildning av enstaka doft neuron axoner. (AE)Efter lyckad enda cell elektroporation den märkta axon kan upprepat visualiseras i luktbulben (OB). Detta exempel visar en enskild axon som undersöktes för en vecka. Den totala morfologi förändras inte avsevärt och två stora grenpunkter kan identifieras (öppna pilspetsar). Observera att under tidsförloppet, genomgår en glomerulär tofs kontinuerlig minskning (fylld pilspets), medan de andra två glomerulära knippen förblir stabila (asterisker). (FI) Detta representativt exempel visar livskraft långsiktiga observationer som denna specifika axon undersöktes i mer än tre veckor. Ingen märkbar förändring av dess tillväxtmönster kan upptäckas. (JL) Ett exempel på en omogen sensoriska axon i färd med att tillväxten avbildas. Det har ännu inte anslutna till glomeruli och karakteristiska glomerulära knippen saknas. Efter 5 dagar axonal grenar avlånga, bifurcated axonet flera gånger och fina arborizations äretablerad.
Discussion
Det förfarande som beskrivs här tillåter märkning sensoriska neuroner i luktorganet av larver X. laevis genom elektroporering av fluoroforen kopplade dextraner och efterföljande visualisering av sensoriska axon tillväxt i levande djur. Genom att variera parametrarna för in vivo elektroporering är det möjligt att styra antalet märkta sensoriska neuroner. Det är därmed möjligt att märka stora grupper av nervceller i en sensorisk epitel, mycket få eller ens enskilda celler.
För att säkerställa den önskade omfattningen av neuronal märkning är det viktigt att vara särskilt försiktiga mikropipett egenskaper och elektroporation pulser. Högre pipett resistanser och minskning av spänningspulsen amplitud, varaktighet och antal upprepningar kan minska mängden av märkta celler, medan minskande pipett resistanser och högre spänning pulsamplituden, varaktigheten och antalet pulser kan leda till mer omfattande märkning. The utnyttjande av fluorescerande dextraner för elektroporering ger omedelbar visuell feedback om de tillämpade inställningarna är lämpliga. Var försiktig så att du använder parametrar för amplitud, längd och antal pulser som överstiger de värden som anges i protokollet kan potentiellt leda till cellskador eller till och med celldöd 17. Igensatta eller trasiga tips av mikropipetter kan också hindra lyckad elektroporering.
In vivo elektroporering i luktorganet för X. laevis är begränsad till larvstadier eftersom huden på postmetamorphotic grodor är tuffare och kan inte vara lätt penetreras med en mikropipett. In vivo visualisering av neuronala processer kan hindras genom spridning av excitation / emission ljus i djupare områden i hjärnan eller av blodkärl. Detta problem blir särskilt tydligt i högre larvstadier på grund av en större hjärna och kan leda till brusiga signaler som gör att tydligt identifiera fina axonal processer svårare.
Tillämpningen av protokollet är inte begränsat till lukt sensoriska neuroner, men kan även användas för att studera andra celltyper, t.ex.., Stam / progenitorceller av neurogena zoner den växande hjärnan eller mitralceller i luktbulben. Förutom den visade tekniken också kan användas i kombination med kalciumkänsliga dextraner eller injiceras membrangenomträngkalcium färgämnen för att få funktionell information om den märkta neuron och / eller den anslutna kretsarna 7,19. Tillgängligheten av ett stort antal fluoroforer kopplade till dextraner tillåter märkning av flera enskilda celler eller populationer med olika färger. Plasmid också DNA-lösning, t ex som kodar för fluorescerande proteiner, är lämplig för elektroporering och kan ytterligare förbättra versatility och nyttan av tekniken 6. Protokollet kan ytterligare förbättras för att möjliggöra kombinerade elektroporering av dextraner och DNA eller laddade morpholinos att manipulera genuttryck 13,17.
Den beskrivna metoden är verkligen ett nytt verktyg för att undersöka det komplexa och fortfarande inte helt klarlagda processer som reglerar axonal vägledning i ryggradsdjur luktsystemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
