Abstract
DNAのトランスフェクションは、生物科学のための非常に貴重であったとのin vivo生物学の多くの側面を維持しながら、器官型脳スライス標本への最近の進歩と、さまざまな異種遺伝子の効果が容易に調べることができた。従来のトランスフェクションの方法は、このような低利回り及び生存率の大幅な損失のような困難が伴うされたために最終的に分化したニューロンをトランスフェクトするために関心が高まっている。バイオリスティックトランスフェクションは、哺乳動物組織での使用に適しているように、まだごく最近、この技術が変更されているこれらの問題の多くを回避することができる。
加速器室に新たな修正は、遺伝子銃の発射精度が向上し、また、トランスフェクション効率の損失なしに低いガス圧（50 psi）での使用を可能にするだけでなく、パの集束位置選択的な拡散を可能にしながら浸透の深さを増加している3ミリメートル以内でrticles。また、この技術は、単純かつ退屈な微量注入よりも速く実行することである。エピソーム発現が24時間以内に検出することができ、細胞の生存はより良い、または、従来の方法に少なくとも等しいことが示された場合、一過性および安定な発現の両方がナノ粒子ボンバードメントで可能である。この技術は、しかし、という重要な利点があります：それは、このように、解剖学的に異種遺伝子の効果を分離するために、ユーザーを可能にする単一の拘束半径内局在することが、トランスフェクションを可能にする。ここでは、実行可能な大人の器官型スライスを準備し、改善された遺伝子銃を使用してトランスフェクションを位置選択的にそれらを提出する綿密なプロトコルを提示する。
Introduction
もともと微粒子銃技術、ターンのフレーズ「生物学弾道」のは、植物細胞1に粒子媒介遺伝子導入のために設立されました。細胞形質転換のこの物理的方法は、DNAまたは染料などのカーゴを送達するために、不浸透性の細胞膜の物理的障壁を克服するために高速でマイクロまたはナノ粒子を加速する。それは、特定のリガンド - 受容体および/または細胞表面膜における生化学的特性に依存しないので、粒子媒介遺伝子導入を容易にそのような器官型脳切片のような生物学的システムの多様に適用することができる。
器官型スライスを使用して、彼らはin vivoでの生物学2-4に関連する多くの解剖学的および生化学的特性を維持するので、他のin vitroのプラットフォームよりも有利で ある。スライスは、主に地元の建築、彼らが発信された場所からの特性およびPRESERを節約神経化学的活動とシナプスの接続性をVEの。基礎研究のため、および医薬品の努力における脳切片の使用は、付随して、コンテキスト3,5-7などにおけるin vivoでの脳の神経生物学的挙動を測定し、監視することが可能生物工学的操作の数が増加している。器官型スライスベースのアッセイ系を使用する主な利点は、それが容易に実験的な制御を提供し、細胞外環境の正確な操作を可能にすることである。
実り、器官型スライス培養系のような脳領域の多様から確立が、皮質、脊髄および小脳8-10、に限定されてきた。さらに、共培養の数は、遠位の脳領域間で細胞間コミュニケーションを評価するだけでなく、神経細胞と病的細胞11,12の間を可能にする、実証されている。多くのプロトコルは、すでにsに確立されているuccessfully培養器官スライスおよび長期的な生存能力を維持することができ、多くの最近の研究では、今から13膜界面方法やさまざまな修正を利用する。この原則は、多孔質メンブレンフィルター上のスライスを配置することによって、培地および培養器の加湿雰囲気との界面での器官型スライスを維持します。メディアは、このように、毛管運動を介して、器官のスライスを養うために十分な栄養素を提供することができます。 （ - ; P3 - 9日齢3）通常のスライスは生後初期動物から調製されてきた。しかし、これらのスライスからの脳組織は、細胞の可塑性の高いレベルを表示し、実行可能な文化を取得すると便利です機械的ストレスに対する固有の抵抗を持って、まだ成熟したシナプスと神経解剖学的回路が完全に生後2〜3週間まで、 生体内で開発されていない14。例えば、以前の観察は、P0から得られた海馬スライス示していた - 、1新生児の高度viabもののル調製後、次第にいくつかの形態学的特徴を失った。基本的に、それらは高齢の動物15,16から器官培養物と比較して、脱分化をする可能性が高かった未熟細胞を示唆して長期培養には不向きであることが示された。このような理由から私たちの方法は、成熟と建築の開発は、その最終段階に達している13,17-21れる成人の器官型脳スライスに最適化されています。それにもかかわらず、この方法はまた、新生児や幼若器官のスライスに適しています。
実行可能な器官のスライスが生成されるとスライスを含む全プレートはバイオリスティックマウントにし、納期およびトランスフェクションを位置選択的に提出することができます。 （組織への開口部から）直接のスライスの上10mmの距離で90°に配向されます（ 図1で説明したように）遺伝子銃の適切な実装は、40nmの迅速なバイオリスティック送達が行く許可ldは粒子は貨物をコーティングした。このような色素や蛍光DNAベクターとして、これらの貨物だけでなく、関心のある任意の遺伝子は、容易に容易に実行可能なスライスに配信されます。従って、この方法は、実行可能な器官型脳切片に、位置選択的な方法で、貨物コーティングされた金ナノ粒子を送達するのに必要なプロトコルについて説明します。遺伝子銃バレルと最適な実装が、図1で見ることができます。改良されたバレルとナノ粒子の弾道についての詳細は、 ら 17オブライエンを参照してください。
その後の改良はまた、ユーザがそのようなマイクロキャリアのローディング量（MLQ）として定義される標的領域ごとに配信金の適切な量、等の条件を最適化するために、及びDNAローディング比として定義金1mg当たりロードされたDNAの量を決定するために示されている（DLR）。金粒子上にDNAを沈殿させ、実際の遺伝子銃」カートリッジを含むテフゼルチューブにそれらをロードする前9 ;,それが組織や条件のうち、わずかに異なることが、各トランスフェクションのために必要とされるDNAと金の量を計算する必要がある（比率は1に1mgの金と1μgのDNAの間に維持されるべきである：5）。それは、そうでなければ、DNA被覆金粒子を微粒子銃の広がりの全体的な均一性を低下させるだけでなく、組織損傷および細胞障害性を高めることができると期待凝集、より大きく形成する互いに接着できたDLRするMLQの適切な比率を準備することが重要である。
この方法は、テストの結果、新生児、若年および成人器官型脳切片のために従順であると決定された、バイオリスティック送達における最近の改善を示している。さらに、遺伝子銃バレルの減少バイオリスティック広がりを活用することにより、ユーザが選択的に脳内の時間を守る地域をトランスフェクトすることができます。適切なインキュベーション時間の後、24および48の間のその最大速度に到達する蛍光タンパク質の発現は、時間は、落射蛍光および共焦点顕微鏡によって可視化することができる。これらのフルオロフォアは、生物学的に関連する構造物内の個別の細胞の形態学的解析や局在を可能にする。しかしながら、他の異種遺伝子による器官型スライスの位置選択的な調節は、これらの調製物に適する任意の他の試験によってモニターすることができる。ローカライズされた遺伝子送達のための可能な作業の戦略を図2に示す。
Protocol
動物や動物組織の使用は厳密にローカルルールと規制の下で倫理委員会の承認を遵守する必要があります。すべての組織は、MRC-LMBの動物実験ガイドラインに付着したこの研究中に得られた。
材料·文化メディアの調製
- ミリポア水を使用して、すべてのソリューションを準備します。唯一の特級試薬を使用しています。 （特に断らない限り）を室温で全ての試薬を準備し、保存します。
- HEPES緩衝生理食塩水（10mMのHEPES、120mMのNaClをpH7.2）に、500mlのを確認します。 0.2μmの無菌フィルターユニットを通して濾過する。 4℃で保存。
- リン酸緩衝生理食塩水（;の10mMのNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、pH7.4のPBS）500mlのを作る。オートクレーブで滅菌する。
- 25mMのHEPES、10％ウシ胎児血清を含むDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）を補充することによって、ニューロン培地を準備し、30 mMグルコース、1：100 N2のsupplement、ペニシリン - ストレプトマイシン1100単位/ ml; pHは7.2。 0.2μmの無菌フィルターユニットをフィルタリングします。 4℃で保存。
- 1ミリリットルの100％エタノール中の20mgのPVPとポリビニルピロリドン（PVP）の原液を作る。 -20℃で1ミリリットル量、凍結ストアに分注し、この。ソリューションの作業は、0.05 mg / mlで、そのための100％エタノールごとに4ミリリットルにPVPストック溶液10μlを追加するだけです。
- ミリポア水中の0.05Mのスペルミジン原液を準備します。 pHを7.2に調整します。
- （滅菌スクリューキャップボトル内100ミリリットルDMEM中で2グラムの電気泳動グレードのアガロース）DMEM中の2％アガロース溶液を作る。アガロースが溶解するまで電子レンジこれ。必要に応じて、数週間、4℃の冷蔵庫に保管してください。
器官型スライスの調製
- 断頭続いてCO 2窒息によりC57ブラックに所望歳の6匹のマウスを安楽死させる。横頭蓋骨カット大後頭孔から始まり、で終わるを用いて脳を削除する嗅覚ローブ。静かに脳を露出させ、後方から頭蓋骨を持ち上げる。
- 小脳への嗅覚葉および前頭皮質、および吻側間をカットします。静かに脳の吻側部分を持ち上げ、視神経を切った。最後に、脳を除去し、氷上で氷冷HEPES緩衝生理食塩水で満たされたペトリ皿に入れてください。
- 解剖顕微鏡を使用して、微細なピンセットを用いてPIAをはがす。慎重に脳の周りの血管および髄膜を除去します。
- 小さな受信者の型の中に新鮮な脳を置き、アガロース溶液でそれをカバーし、わずかRT上記に冷却した。その後急速に氷上に置くことによって4℃に金型を冷却する。
注：生存率の低下を避けるために、可能な限り迅速にスライスを処理します。 - アガロースが設定されている場合（5 - 10分）、（必要に応じてトリム）金型からアガロース包埋脳を削除してからvibroslicerプラットフォームにそれを接着。無菌の氷冷PBSを含むvibroslicer室にこれを配置します。ディその後の汚染を最小限に抑えるために70％エタノールで使用される前にvibroslicerチャンバをsinfect。
- 特注vibroslicerたり、商業同等を使用して脳をカット。モデルのコンセプトは、上下振動を最小限に抑えながら、ブレードのエッジまでの水平大きな振幅と高周波の動きを生成することができる組織スライサーを設計することでした。
- 1.5の振幅で、90ヘルツの振動周波数を使用する - 2.0 mmであり、水平面に対して15°の角度で位置する切断刃;ブレードの方に1.7ミリメートル/分で移動するアガロース包埋脳を保持取り付けブロックを設定します。氷冷培養培地（DMEMペニシリン/ストレプトマイシン+ 10％FCS）を含むチャンバー内にセクション（150μm）を収集します。 Arsenaultとオブライエン13の補助ビデオなどの組織切片のビュー切断および操作。
- 静かに培養メッドでは6マルチウェルトレイ内の細胞培養インサートにスライス（0.4ミクロン、直径30mm）を配置IAインサートの外側に、そして5％CO 2で37℃の加湿インキュベーター中でインキュベートする。
注：転送し、スライスを操作しながら、適切な組織の生存のために、非常に穏やかである。また、あまりにも多くの流体がフィルタインサートの膜に付着器官のスライスを防ぐことができます。その場合は、再度、余分な水分やプレートを取り外します。 - 器官型スライスが数週間培養することができますが、最高のトランスフェクションの収量のため、めっき後遅くとも4日より、トランスフェクションに進んでいない。
注：長期培養条件下で使用のAraCまたは無血清培地2グリア異常増殖を防ぐため。
DNA被覆マイクロ·ナノ発射体の調製
- 40 nmの直径の金粒子を用いたナノ発射を準備します。簡単に言うと、金粒子10mgに1 mg / mlの（pEYFP-N1）で、0.05Mスペルミジンおよび10μlのDNA 50μlを加える。
- ソリューション·ミックスにカルシウムおよびスペルミジンを追加DNA-金マイクロ時のトゥーレは、金ナノ粒子へのDNA分子の結合を助けるために準備粒子。
注：金のキャリアのMG（DLR）ごとに使用されるDNAの量は、金の1あたりのDNAμgの1〜5 mgの範囲であるべきである。さらに、カートリッジ（MLQ）ごとに撮影された金キャリア粒子の量は、それ自体が、0.1からの金を0.5mgの範囲であるべきである。 DLRとMLQを試み、調査対象の特定のシステムだけでなく、使用される粒子と、遺伝子銃の種類に応じて、ユーザーごとに最適化する必要があります。
- ソリューション·ミックスにカルシウムおよびスペルミジンを追加DNA-金マイクロ時のトゥーレは、金ナノ粒子へのDNA分子の結合を助けるために準備粒子。
- 15μlの-ゆっくりと10の画分中の1MのCaCl 2を50μlを加えながらボルテックスを用いて混合する。時折ボルテックスの5分、30秒、1,000×gで遠心分離に続いて上清を取り除く。 0.075MのPVPの3.5ミリリットルに金粒子ペレットを再懸濁します。
- シリンジを使用してチューブ（2.36ミリメートル内径）に、この懸濁液を描画します。チュービング準備ステーションにチューブを置きます。許可する金粒子が沈降し、注射器で吸引して上清を除去する。均等に続いて毎分5リットルで一定窒素流下で乾燥させた金粒子を、広めるためにチューブを回転させます。
- DNA-弾丸を作成するために、1cmの長さにチューブカッターを用いてチューブを切断する。どちらの遺伝子銃カートリッジにすぐに挿入したり、必要になるまで乾燥（4℃）を維持する。
器官型スライス上の4バイオリスティックトランスフェクション
- 無菌層流フード内で、次の手順を実行します。
- ヘリオス遺伝子銃に9 V電池と空のカートリッジホルダを挿入します。
- ヘリウムホースとヘリウムタンクに遺伝子銃を取り付けます。ガンにヘリウムホースや貯水池を加圧するを50psiで3ブランク（空スロット） - 火災2。
- カートリッジホルダーにDNA被覆金を含むカートリッジをロードし、遺伝子銃にホルダーをロードします。
- 遺伝子銃スペーサーを外し、取り付ける遺伝子銃に変更された遺伝子銃バレル。
- 滅菌ピンセットを用いて、滅菌プラスチックシャーレに器官型スライスを含むフィルターインサートを配置します。
- 器官型スライスからメディアを取り出します。
- 50psiのガス圧を設定してください。
注：目の保護が不可欠と耳の保護をお勧めします。 - 10ミリメートルまで測定マウントを使用して、適切な距離での遺伝子銃を置きます。慎重に遺伝的送達のための所望の領域にわたってバレルの中心を目指しています。
- 5％CO 2インキュベーターで、 すなわち 、37℃で焼成した後、新鮮な培地で戻って自分の皿への挿入を交換し、正常な成長条件に戻す。
- いったん終了し、遺伝子銃からの圧力を解放し、ヘリウムタンクを閉じ、ヘリウムタンクから遺伝子銃を切り離します。
- カートリッジホルダーを外し、カートリッジを廃棄し、遺伝子銃を掃除。
- 映像設備によって形態について、成功した浸透のために組織を確認してください倒立顕微鏡を用いてスライスをlizing。微粒子を使用している場合は、均等に金を分散させる。スライス上に見られる金粒子のない密度の高い領域があってはならない。その小さなサイズに起因するナノ粒子は、従来の顕微鏡技術によって単一のユニットとして見ることができない。
- 適切な時間間隔の後（通常1 - 2日間）、顕微鏡観察のために4％パラホルムアルデヒド（PFA）でスライスを固定する。
注：PFAで固定が常に望まれていない。生細胞イメージングのために、このステップを回避する。
5。固定と脳スライスの可視化
- バイオリスティックトランスフェクション後、2分間PBS中で2回のスライスを洗浄する。
- 20分間PBS中で作りたての、氷冷4％PFA中でインキュベートすることにより、スライスを修正しました。
- 2分間PBS中で2回のスライスを洗ってください。
- 膜は、それらに搭載されたスライスを乱すことなく、メスを用いてサポートして周りを優しくカット。顕微鏡スライド上の各膜支持/スライスを配置するために鉗子を使用してください。 organotypを休まガラススライド上の膜の上にICスライス。
- スライスの上に封入剤の一滴を追加し、器官型スライスに接触して直接力を加えず静かにカバースリップを追加します。
- マニキュアの薄い層でカバースリップを固定します。
- 適切な顕微鏡上のスライスを表示します。
6。共焦点アプリケーション
- 60X / 1.4の開口数（NA）油浸対物レンズを直立走査型レーザー共焦点顕微鏡を使用してスライスを視覚化する。
注：共焦点顕微鏡の最も問題の特徴は、このように、通常、蛍光試料で見られた焦点「ヘイズ」のうちを排除し、単離し、そして焦点面を収集することが可能である（1 AUに設定）ピンホールサイズです。細部は、多くの場合、このヘイズによって隠されており、非共顕微鏡で検出することができません。 - 488nmの励起波長にアルゴンレーザーを設定し、全角の収集のために最適化する500から520 nm帯の光をitted。一般的には、分析した各神経細胞の幅全体を包含するように0.5μmの間隔で1,024×1,024ピクセルであり、z切片の積み重ねで画像を収集しています。
- 核の形態を観察するために、カウンタは（4 - 40〜420nmの間に収集された405 nmおよび放出光に設定した励起波長）は、これらのDAPIで細胞を染色する。発光のための620nm - 最後に、赤色蛍光を調べるため、励起及び565のために561 nmのレーザーを設定します。
- 典型的には、57.6平方μm の面積をカバー4Xスキャンズームを使用して画像を取得する。画像サイズは、1,024×1,024ピクセルの領域であった。組み合わせた8フレーム - 0.5μmの間隔や5の凸のzセクションのレコード·スタック。
Representative Results
以前13,22が報告されたように器官型スライスの生存率は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性、ヨウ化プロピジウム標識、およびdUTPの染色によりモニターすることができる。明らかに、スライスの生存能力と整合性が配信遺伝貨物の長期的な持続的な発現のために重要である。器官型スライスにバイオリスティック送達の後、蛍光異種遺伝子の発現を共焦点顕微鏡によりモニタリングした。修正されたバレルを使用する微粒子銃の広がりの気密性 は、 図3Aに見られる。 図3Bは、DNA被覆金ナノ粒子を用いてトランスフェ海馬領域の代表的な画像を示している。 図4は、トランスフェクトされた成体マウスの器官型切片の代表的な写真を示している。 図4A、プルキンエ層の界面とのcerの分子層で発見顕著樹状港とプルキンエニューロンに見られるようにebellumはのpEGFP-N1に よる一過性微粒子銃トランスフェクション後に顕著な標識を示す。 図4Bは、スパインを観察することができるこれらの樹状突起の高倍率を示している。 図4Cは、pDSredFPコーティングされた金ナノ粒子のバイオリスティック送達後の海馬のCA1領域で見られる錐体細胞を示している。
代わりに蛍光符号化されたDNAの貨物の染料はまた、器官型スライスにおける形態学的特徴を可視化するために同様に使用することができる。細胞膜を標識するDIOは、より迅速に個別の細胞形態を描写したりregioselectionを確認するために、同じ領域に送達DNAコーティングしたバイオリスティックと共に使用することができる。 図5Aに見られるように、海馬でDIOで染色ニューロンはまた、多数の棘との長い樹状突起を示しています。矢印はdentritと比較してシナプス終末の存在によって同定された軸索を示す他の神経突起上のIC棘。 図5Bは、核を標識するためのDAPIカウンター染色で多数の海馬投影を強調してCA1、の他の例を示している。 図5Cは、多数の棘と並行して、樹状突起のこれらのタイプの高倍率を示している。
明らかに、これらの画像は細胞標識後の形態学的特徴を示している。何も金ナノ粒子上に被覆外因性遺伝子の任意の数を提供するために適用されるのと同じ方法を排除しない。成功したトランスフェクションの視覚的確認を可能にするために、単一のプラスミドは、目的の遺伝子と同じベクター上の蛍光レポータータンパク質の両方を共発現するように構築することができる。
図1：遺伝子砲身と装着。（A）を向上させる粒子加速に必要な圧力を低下させることによって組織の損傷を最小に制限された微粒子銃の広がりを有してMRC-LMB博士オブライエンによって開発されたd個のバレル（B）最適化された遺伝子銃の側面図がヘンダーソン博士によって開発された実装とトロント大学の博士アンドラーシュナジ。取り付けは正確に90˚器官型スライスに垂直な正確バイオリスティック送達の距離を制御することをユーザに可能にしながらでの遺伝子銃を保持する。最適なバイオリスティック条件についてはバレル開口は器官のスライスから10mmの距離で、関心領域の上に直接配置する必要があります。取り付け遺伝子銃の（C）は背面図を。トランスフェクトされるべき関心領域は、バレル開口部の下に直接配置される必要がある。ターゲティングは、染料（diolistic）または蛍光タンパク質トランスフェクション（遺伝子銃）を用いて確認することができる。ANK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。器官型スライス標本や位置選択的ターゲティング。（A）スライスの準備、DMEM埋め込 ま成体マウスの脳。（B）は、金型がスライスをカットする準備刃で取り付けvibroslicer上に接着した。（C）位置選択的異種遺伝子発現冠状器官脳スライスへのバイオリスティック送達するための戦略。アレン脳アトラス解剖学的基準アトラス23から得られた写真から調製イメージ。左図は、一例として目標と二つの異なる脳領域を示している。左半球の皮質領域に遺伝子発現（1）を制限します。脳の視床下部領域に異種遺伝子発現（2）を制限します。中央のパネルには、股関節を示しています2つの異種遺伝子（3,4）の発現を単離し、同じ器官型スライス内の2つの半球の海馬を比較して、本質的に異なる部分を使用して、及び/又は影響から遠位クロストークに対処する可能性を付与するから任意の偏りを解消することができるトンそれらの遺伝子。右のパネルは、異種まだ重なり合う皮質領域に別の遺伝子（6）を発現しながら、正確な皮質領域で最初の遺伝子（5）を発現するように遺伝子組換え配達の可能性の重なりを示している。これは、同じスライス内の組み合わせで、単独で、また、それぞれの異種遺伝子の遺伝的変調の影響を分析することを可能にする。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FILTに見られる図3微粒子銃の散乱パターン小胞体紙と低倍率画像（A）が改善バレルは、金粒子の広がりを決定するために濾紙上に焼成した。右側のパネルは、通常のバレルを示して左側が改善された樽の分布を示している。ブラックバー：1センチメートル。イメージは、 らオブライエンから取らバイオリスティックスプレッド6週齢のマウスの海馬領域内の3ミリメートル以内の確率的なトランスフェクションパタパタを示す17。（B）低倍率画像。ホワイトバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
6週齢のマウスの器官型スライスに蛍光タンパク質コード化されたDNAの図4微粒子銃配信。（A）Inverteプルキンエ細胞にトランスフェクトするpEGFP-N1、コーティングされた金粒子の小脳の固定器官型スライスのdの共焦点画像。画像は40倍の倍率で撮影された。ブラックバー：30μmの（B）は、棘を強調するための別のプルキンエ細胞の樹状港の60倍の倍率を表示します。ブラックバー：5μmの（C）は DSredFPは錐体細胞をトランスフェクト4の60倍の倍率で海馬領域から採取した固定スライスの共焦点画像を表示します。ブラックバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5器官型スライスに膜標識蛍光色素のDiolisticデリバリー。（A）は、海馬ニューロンリットルのライブイメージングを示している20X倍率でDIOとabeled。樹状突起棘は明らかに樹状突起棘の不在、白矢印で示されるシナプス終末の存在によって識別される軸索と同様に観察することができる。ホワイトバー：30μmの（B）DIOで標識された海馬領域の染色を発音し、DAPIで対比。ホワイトバー：30μmの海馬のCA1領域で見られる樹状突起棘の（C）は高倍率（60倍）。ホワイトバー：5μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
プロトコルが強化された遺伝子銃を使用して、大人の器官型スライスに染料および遺伝物質を提供するためのアプローチについて説明します。本質的には、色素の種類と可能な遺伝子の多様な生物学的な問題の広い範囲に答えることが、この方法は、多面的かつ従順にする。生物学的に関連するアーキテクチャ内の局所的な領域の異種遺伝子変調が前に簡単に実現可能ではなかったように、特定の脳領域に、この場合に、使用される位置選択的配信方法は、実験のための新たな道を開く。私たちは、以前に、この方法は、それが何週間13のための改良された細胞の生存および異種遺伝子発現を示した成熟シナプスが完全に形成され、成体器官スライスに使用することができることを決定した。哺乳類の脳、並びに他の組織のための新規で改良された培養条件の出現により、位置選択的な遺伝的変調の使用はbioche多種多様のためにますます有用になるであろうmical分析。
私たちがここで強調表示して、以前に他の人が言及しなければならない24のように、多くの異なる要因が容易にバイオリスティックデリバリーの精度や信頼性に影響を与える可能性があります。第一に、染料またはDNAに連結された金粒子の調製は、十分に凝集を防止し、カートリッジ貨物排出を容易にするためにバランスをとらなければならない。 DNA-金微粒子溶液中のカルシウムおよびスペルミジンは、金ナノ粒子へのDNA分子の結合を補助することができる。減圧下で細胞に浸透するナノ粒子の能力は、以前に17を決定した。第二に、遺伝子銃、正しい角度と距離を可能な限り安定したマウントする必要があります。信頼性の高い圧力計は、組織の完全性を維持するために、及び適切に意図されたターゲットへの金粒子を加速するために、また再現性のために必要である。実際に、機器の距離、方向、および安定性は、tのための重要な因子であるargetingと位置選択的配信の精度。これらの脳構造が非常に小さいとして、発射角の小さな変化を簡単に信頼性の低い手順全体をレンダリング可能性があります。そして最後に、実行可能な器官型スライスの準備と維持は、異なる動物のために、まだ脳の領域に豊富で信頼性の高いプロトコルに何十年もの間の困難に満ちていた、年齢や共培養は現在、2,4,25,26ご利用いただけます。これらの手順は、バイオリスティックプロシージャに組織を提出する前に、ユーザーに最適化されなければならない。これは、より容易にunbiasedlyバイオリスティック粒子の衝突、自分培養物に対する異種遺伝子の効果を確認するためにユーザーを可能にする。この目的を達成するために、そのようなEYFPおよびEGFPなどの蛍光遺伝子の使用は、ターゲティングの精度をテストし、また、時間13の持続的な期間にわたり、異種遺伝子発現を介した細胞の生存率を追跡する新たなユーザーに許可することができます両方。信頼性のための重要なステップの多くは、そしてこのプロトコルの再現性のある使用は、次の3つの段落で強調表示されます。
効率的なトランスフェクションのために、DNA濃度が適切である必要があります。高すぎる濃度は、ナノ粒子の凝集を引き起こす可能性がありながら、低すぎる濃度は、トランスフェクション収量を妨げる。金の凝集体は劇的に、トランスフェクション効率を低下させる不均一な分布を引き起こし、増加細胞毒性と酸化ストレスにつながることができます。スペルミジン溶液の満了（2〜3ヶ月毎に交換する必要があります）による塗着効率の問題が可能性があります。適切なバイオリスティックスプレッドについては、ラベリングは偶数でなければなりません。金ナノ粒子/ DNA懸濁液の不均一な標識は、PVP溶液に起因する可能性がある。また、2〜3ヶ月毎に交換する必要があります。金ナノ粒子のコーティングは、より高いMWバンド27としてアガロースゲル電気泳動上で見ることができる。
各生物学的SYST調査中の全角だけでなく、使用される各異なる機器は、トランスフェクションおよびバイオリスティック広がりの最適化されたレベルに到達するために、ガス圧の小さな変化を必要とする場合があります。重要なパラメータは、プラスチックカートリッジからマイクロまたはナノキャリアを除去し、組織にそれらを推進するために必要なヘリウムパルスの圧力である。それは、ターゲットを横切って衝撃波を作成し、マトリックス17からの組織を破壊または離脱するため、高いガス圧は、細胞の生存に影響を与える。遺伝子銃バレルを目指して組織に正確に垂直装置を有することは、正確なバイオリスティック送達のために重要です。選択されたエリアは、外側の開口部から正確に10ミリメートルでバレルの直接の中央に配置する必要があります。これは、震源の周りに金粒子送達の直径3mmになる。遺伝子銃バレルは、各使用後に70％エタノールで清掃する必要があります。大粒子凝集体から組織を保護するために、バレルもSHOナイロンメッシュが含まれています最適な性能を維持するために定期的に交換することがULD。メッシュを交換するために、キャップとOリングとの間の新たなナイロンメッシュを挿入し、次にキャップを外します。
2日震源地周辺でトランスフェクション後 - 蛍光標識された細胞は、少なくとも1表示されるはずです。不在または標識の位置ずれは、遺伝子銃実装の不十分な準備と不安定に起因することができます。共焦点顕微鏡を用いた細胞の観察は、多くの要因に依存する：励起/発光光の波長、ピンホールサイズ、対物レンズのNA、光路中の成分の屈折率、組織の深さ、および配置を楽器。これらの要素は、調査中の各システムのために最適化されるべきである。
微粒子銃における最近の進歩は、この方法の成功のために活用された。本研究で用いた遺伝子銃のバレルは、必要な圧力を減少させるだけでなく、遺伝子銃を集中させるために改変されたより制約と特定の領域17,19への散乱パターン。他のバレルの変更はバイオリスティック広がりを制限し、流出圧力28を削減することを試みた、まだ博士オブライエンがデザインし、このカスタム設計された遺伝子銃バレルは、標準的なヘリオス遺伝子銃に取り付けられた単一のコンポーネントです。続いて、サブミクロンの金粒子は、細胞の損傷および最終的には、持続的な異種遺伝子発現の損失を引き起こした私たちは、以前に決定されたマイクロ粒子の侵襲性を減少させるために使用した。バイオリスティックプロシージャへのこれらの変更は、方法13の全体的な実現可能性と再現性を向上させた。そのような器官型脳スライス標本中の深いスライス手順のトラブルシューティング、脳を維持するためにDMEM-アガロースマトリックスを用いて、および多数の他の有用な進歩としてスライス標本上のその他の改良点は、以前13は大人のスライスの使用を探索することができましたことを報告成熟した開発したシナプスのネットワーク。
われわれの研究では、主にトランスフェクション効率の読み出し及び画像化する能力、マウス脳組織における神経細胞の形態学的特徴として、細胞の形態を可視化するために染料や蛍光異種遺伝子を使用した。定義された半径内の確率的デリバリーの信号対雑音比は完全にネイティブのコンテキスト内で、単一の細胞の樹状港を隔離することができました。多くの努力は、これらの形態学的特徴、マッピング'connectomics」を調査することや各種分析のための単一の細胞を標識するために使用されているように、この方法は簡単にそのような電気生理学および神経突起の測定値29,30などの既存のプロトコルと組み合わせることができる。明らかに、蛍光異種遺伝子の組み合わせは、蛍光タンパク質の確率的な分布として単一細胞のより堅牢な描写を可能にすることができ、その組み合わせは、個別のセル31,32の色を決定するであろう。そのような異種遺伝子エクソンの上流シナプシンおよびグリア線維酸性タンパク質のような細胞特異的プロモーターの使用も、亜集団33に式を制限することができます。実際に、遺伝物質の果てしない多様も、これと同じ手順を使用して金ナノ粒子による位置選択的方法で送達することができる。総トランスフェクションした領域は、このようにそのような解剖などの伝統的な方法で分析し、異種遺伝子の局所的な影響を分析するために西部の免疫ブロッティングにその領域を提出することができた。
器官型スライス手順の改善は、長期の実験のために脳組織のより広い使用を可能にするだけでなく、他の組織との共培養の使用を許可し、トランスフェクション手順を容易にするであろう。脂質とポリマーのトランスフェクションは、予め34及び頻繁にはテトランスフェクトする非常に低い効率を示す膜ホメオスタシス、内在化、タンパク質の透過性に影響を与えることが報告されているrminallyニューロンを分化した。細胞標的の特定の貨物は、内在化に必要な細胞表面受容体を発現する細胞にも適しており、そしてこの方法は、高度に選択的であり得るが、それは位置選択性35標的欠くことができる。ウイルスベクターは、他の方法でしばしば製造が困難かつ高価であり、厳しい規制を必要とする際に安全性の懸念が実証されている。バイオリスティック送達は、このように位置選択的に生存可能な組織内のニューロンおよび他の細胞型をトランスフェクトするための比類のない能力を有する。金は、非毒性であるため、微粒子銃の使用におけるさらなる進歩は、経皮薬剤送達、非侵襲的in vivoでの遺伝子送達のほか、ローカライズされた非ウイルス遺伝子治療などの生物医学用途のために道を開く可能性があります。
Acknowledgments
著者らは、強化された遺伝子銃バレルの生産のために、MRC-LMBのワークショップに感謝したいと思います。また、機器やリソースの使用のためにトロント大学のデビッド·R·ハンプソンに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
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