Abstract
Transfectie van DNA van onschatbare waarde voor biologische wetenschappen en recente vorderingen op organotypische brain slice preparaten zijn, het effect van verschillende heterologe genen kan dus gemakkelijk onderzocht met behoud van vele aspecten van in vivo biologie. Er is steeds meer interesse geweest om terminaal gedifferentieerde neuronen waarvoor conventionele transfectie methoden zijn beladen met moeilijkheden geweest, zoals lage opbrengsten en een aanzienlijk verlies in levensvatbaarheid transfecteren. Biolistische transfectie kan omringen deze problemen maar pas onlangs deze techniek aangepast zodat het vatbaar voor gebruik in zoogdierlijke weefsels.
Nieuwe veranderingen van het gaspedaal kamer hebben nauwkeurigheid afvuren het gen pistool verbeterde en verhoogde de diepte van penetratie, terwijl ook de mogelijkheid voor het gebruik van lagere gasdruk (50 psi) zonder verlies van transfectie-efficiëntie alsook op een gerichte regioselectieve spreiding van de partikelen binnen 3 mm. Daarnaast is deze techniek is eenvoudig en sneller worden uitgevoerd dan vervelende micro-injecties. Zowel de tijdelijke als stabiele expressie mogelijk met nanodeeltjes bombardement waar episomale expressie kan worden opgespoord binnen 24 uur en celoverleving bleek beter dan of ten minste gelijk aan conventionele methoden. Deze techniek heeft echter een belangrijk voordeel: het maakt het mogelijk de transfectie te worden gelokaliseerd binnen een enkele ingetogen straal waardoor de gebruiker in staat om de effecten van het heterologe gen anatomisch isoleren. Hier presenteren we een diepgaande protocol om levensvatbare volwassen organotypische plakjes bereiden en legt deze voor aan transfectie Regioselectieve behulp van een verbeterde gen pistool.
Introduction
Oorspronkelijk werd de biolistische techniek, een draai-van-zin voor "biologische ballistiek", werd opgericht voor-deeltje gemedieerde genoverdracht in plantencellen 1. Deze fysieke Werkwijze celtransformatie versnelt micro of nanodeeltjes met hoge snelheid naar de fysieke grenzen van de niet-doorlaatbare celmembranen om ladingen zoals DNA of kleurstoffen leveren overwinnen. Omdat het niet door specifieke ligand-receptoren en / of biochemische eigenschappen op het celoppervlak membranen, kunnen deeltjes-gemedieerde genoverdracht gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen zoals organotypische hersencoupes.
Met behulp van organotypische plakjes hebben voordelen ten opzichte van andere in vitro platforms, omdat ze te behouden vele anatomische en biochemische eigenschappen die relevant zijn voor in vivo biologie 2-4 zijn. De plakjes vooral de instandhouding van het lokale architectonische kenmerken van waar zij zijn ontstaan en preserve neurochemische activiteit en connectiviteit van de synapsen. Het gebruik van de hersenen plakjes voor fundamenteel onderzoek, en in de farmaceutische inspanningen, heeft gelijktijdig verhoogd met het aantal mogelijke biotechnologische manipulaties te meten en monitoren van de neurobiologische gedrag van de hersenen in een in vivo als context 3,5-7. De belangrijkste voordelen voor het gebruik organotypische slice gebaseerde testsystemen is dat het eenvoudig experimentele controle en is nauwkeurige manipulaties van extracellulaire omgeving.
Vruchtbaar zijn organotypische slice cultuur systemen ontwikkeld uit verschillende hersengebieden zoals, maar niet beperkt tot, de cortex, ruggenmerg en cerebellum 8-10. Daarnaast is een aantal hulpkweken aangetoond, dat de beoordeling van intercellulaire communicatie tussen distale hersengebieden en tussen neuronen en pathologische cellen 11,12 toestaan. Veel protocollen zijn al ingesteld op successfully cultuur organotypische plakjes en kunnen levensvatbaarheid op lange termijn te behouden en vele recente studies nu gebruik maken van het membraan-interface methodes en diverse aanpassingen aan het 13. Dit principe houdt de organotypische plakken aan het grensvlak tussen het medium en bevochtigde atmosfeer van de incubator door het plaatsen van de plakjes op een poreus membraan filter. Het medium kan dus voldoende voedingsstoffen naar de organotypische plakjes waarbij via capillaire beweging. Typisch plakjes werden bereid uit de vroege postnatale dieren (3-9 dagen oud; P3 - 9). Echter, hersenweefsel van deze segmenten vertonen een hoge mate van cellulaire plasticiteit en een inherente bestandheid tegen mechanische spanningen, die nuttig levensvatbare kweken verkrijgen, toch volwassen synapsen en neuroanatomisch circuits niet volledig ontwikkeld in vivo tot 2 tot 3 weken oud 14. Bijvoorbeeld, had vorige observaties laten zien dat de hippocampus plakjes verkregen uit P0 - 1 pasgeborenen, hoewel zeer VIABle na de bereiding, verloor een aantal morfologische kenmerken. Wezen, werden ze getoond ongeschikt voor de lange termijn culturen suggereert onrijpe cellen zijn, hadden meer kans om de-differentiëren ten opzichte van organotypische culturen uit oudere dieren 15,16. Daarom onze methode is geoptimaliseerd voor volwassen organotypische hersencoupes waarbij rijping en architectuurontwikkeling de eindstadia 13,17-21 bereikt. Toch is deze werkwijze ook geschikt voor pasgeborenen en jonge organotypische plakjes.
Zodra de levensvatbare organotypische plakjes zijn geproduceerd de hele plaat met de schijfjes kan met de biolistische mount worden gebracht en voorgelegd aan de levering en transfectie regioselectieve. Een goede bevestiging van het genenkanon (zoals beschreven in figuur 1), 90 ° ten op een afstand van 10 mm direct over de segmenten (van het diafragma op het weefsel), maakt de snelle biolistische levering van de 40 nm gaanld deeltje gecoat ladingen. Deze ladingen zoals kleurstoffen en fluorescerende DNA vectoren, alsmede gen van belang, worden gemakkelijk afgegeven in de levensvatbare plakjes met gemak. Deze methode beschrijft dus het protocol nodig is om te leveren, in een regioselectieve manier lading goud gecoate nanodeeltjes in levensvatbare organotypische plakjes hersenen. Het gen geweerloop en optimale bevestiging is te zien in figuur 1. Meer informatie over de verbeterde loop en nanodeeltjes ballistiek Zie O'Brien, et al. 17.
Latere verfijningen worden ook geïndiceerd voor de gebruiker te optimaliseren zoals de goede hoeveelheid goud geleverd per doelgebied, gedefinieerd als microdrager geladen Hoeveelheid (MLQ), en de hoeveelheid DNA per mg goud beladen, gedefinieerd als DNA beladingsgraad bepalen (DLR). Voorafgaand aan het neerslaan van DNA op gouddeeltjes en ze in de Tefzel slangen die cartridges de eigenlijke gen pistool 'bestaat9 ;, moet de hoeveelheid DNA en goud voor elke transfectie die enigszins kunnen verschillen tussen weefsels en condities berekenen (verhouding wordt gehouden tussen 1 mg goud en 1 ug DNA tot 1: 5). Het is essentieel om de juiste verhouding van MLQ bereiden op DLR anders DNA-gecoate gouddeeltjes kon aaneenhechten vormen groter dan verwacht agglomeratie, die de totale homogeniteit van het biolistische verspreiding en kan verminderen als schade toename weefsel en cytotoxiciteit.
Deze methode geeft de recente verbeteringen in biolistische levering, die zijn getest en bepaald vatbaar voor pasgeborenen, jeugdige en volwassen organotypische plakjes hersenen te zijn. Bovendien, door gebruik te maken van het gen geweerloop's verminderd biolistische spreiding, de gebruiker is nu in staat om selectief te transfecteren een punctuele regio in de hersenen. Na de geschikte incubatietijd, de expressie van het fluorescerende eiwitten, waarbij de maximale weer tussen 24 en 48 bereikthr, kunnen worden gevisualiseerd door epifluorescentie en confocale microscopie. Deze fluoroforen maken de morfologische analyse en lokalisatie van afzonderlijke cellen in biologisch relevante structuren. Echter, de regioselectieve modulatie van de organotypische plakjes andere heterologe genen worden gecontroleerd door andere proeven vatbaar voor deze preparaten. Mogelijke werken strategieën voor de gelokaliseerde genafgifte zijn weergegeven in figuur 2.
Protocol
Het gebruik van dieren en dierlijke weefsels moeten zich strikt houden aan ethische goedkeuring commissie onder lokale regels en regelgeving. Alle weefsels verkregen tijdens dit onderzoek heeft gehouden aan de MRC-LMB's dierproeven richtlijnen.
1 Voorbereiding van Materials & Cultuur Media
- Bereid alle oplossingen met behulp van Millipore water; Gebruik alleen reagentia van analytische kwaliteit. Te bereiden en op te slaan alle reagentia op kamertemperatuur (tenzij anders aangegeven).
- Voeg 500 ml HEPES-gebufferde zoutoplossing (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filteren door middel van een 0,2 um steriele filter unit. Bewaren bij 4 ° C.
- Voeg 500 ml van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7.4). Steriliseren in autoclaaf.
- Bereid neuronale medium door aanvulling DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's) met 25 mM HEPES, 10% foetaal kalfsserum, 30 mM glucose, 1 100 N2 supplement, penicilline-streptomycine 1100 U / ml; pH 7.2. Filter met een 0,2 um steriele filter unit. Bewaren bij 4 ° C.
- Maak polyvinylpyrrolidon (PVP) stock-oplossing met 20 mg PVP in 1 ml 100% ethanol. Aliquot dit in 1 ml bedraagt, te bevriezen en bewaar bij -20 ° C. Werkoplossing 0,05 mg / ml, dus voeg 10 ul van PVP voorraadoplossing elk 4 ml 100% ethanol.
- Bereid een 0,05 M spermidine stockoplossing in Millipore water; de pH op 7,2.
- Voeg een 2% agarose-oplossing in DMEM (2 g agarose elektroforese rang in 100 ml DMEM in een gesteriliseerde schroefdop fles). Magnetron dit totdat de agarose is opgelost. Bewaar in de 4 ° C koelkast gedurende enkele weken, indien nodig.
2 Voorbereiding van Organotypische Slices
- Euthanaseren C57 Black 6 muizen van de gewenste leeftijd van CO 2 stikken, gevolgd door onthoofding. Verwijder de hersenen met behulp van laterale schedel bezuinigingen beginnen bij het foramen magnum en eindigt bijde olfactorische kwabben. Til de schedel van de achterzijde naar de hersenen bloot.
- Snijd tussen de olfactorische kwabben en de frontale cortex, en rostraal van de kleine hersenen. Til de rostrale deel van de hersenen en snijd de oogzenuwen. Ten slotte wordt de hersenen en plaats deze in een petrischaal gevuld met ijskoude HEPES-gebufferde zoutoplossing op ijs.
- Met behulp van een stereomicroscoop, schil de pia weg met fijn pincet; zorgvuldig bloedvaten en hersenvliezen rond de hersenen verwijderd.
- Leg de verse hersenen in een kleine ontvanger mal en bedek het met de agarose oplossing afgekoeld tot iets boven kamertemperatuur. Dan koel snel de mal tot 4 ° C door het te plaatsen op ijs.
OPMERKING: Verwerk de plakjes snel mogelijk verlies van levensvatbaarheid voorkomen. - Wanneer de agarose is ingesteld (5 - 10 min), verwijder de agarose ingebedde hersenen tegen de matrijs (op lengte indien nodig), en lijm aan de vibroslicer platform. Plaats deze in een vibroslicer kamer met daarin steriele ijskoude PBS. Disinfect de vibroslicer kamer vóór gebruik met 70% ethanol om verdere verontreinigingen te minimaliseren.
- Snijd de hersenen met behulp van een custom-built vibroslicer of commerciële equivalent. Het model concept was om een tissue slicer dat grote amplitude en hoge frequentie mutaties horizontaal naar de rand van het blad kan genereren met minimale verticale trillingen ontwerpen.
- Gebruik de oscillatiefrequentie van 90 Hz bij een amplitude van 1,5 - 2,0 mm, en het snijblad in een hoek van 15 ° met het horizontale vlak; Stel de montageblok met de agarose ingebedde hersenen te bewegen met 1,7 mm / min naar het mes. Verzamel secties (150 micrometer) in een kamer met ijskoud voedingsbodems (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Bekijken snijden en manipulatie van de weefselcoupes als aanvullende video Arsenault en O'Brien 13.
- Plaats voorzichtig het plakken in celkweek inserts (0,4 urn, 30 mm diameter) in een 6 multi-well tray met de cultuur media aan de buitenzijde van het inzetstuk en incuberen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
OPMERKING: Voor een goede levensvatbaarheid van het weefsel, uiterst zacht, terwijl het overbrengen en het manipuleren van de plakjes. Ook zal te veel vocht te voorkomen dat de organotypische plakjes van vast te houden aan het membraan van het filterelement. Als dit gebeurt, verwijder de overtollige vloeistof of plaat weer. - Hoewel organotypische plakjes gekweekt gedurende enkele weken kan zijn, overgaan tot transfectie niet later dan 4 dagen na uitplaten De beste transfectie opbrengsten.
OPMERKING: Om gliale overgroei in kweekomstandigheden lange termijn, gebruik AraC of serum vrij medium 2 te voorkomen.
3 Voorbereiding van DNA-gecoate Micro & Nano-projectielen
- Bereid nano-projectielen met 40 nm goud diameter deeltjes. Kortom, voeg 50 ui 0,05 M spermidine en 10 pl DNA bij 1 mg / ml (pEYFP-N1) tot 10 mg gouddeeltjes.
- Calcium en spermidine toe te voegen in de oplossing mixture tijdens DNA-gold microdeeltjes voorbereiding om te helpen bij de binding van DNA moleculen aan het goud nanodeeltjes.
OPMERKING: De hoeveelheid gebruikte DNA per mg goud dragers (DLR), moet liggen tussen 1 en 5 ug DNA per 1 mg goud. Bovendien, de hoeveelheid goud dragerdeeltjes die wordt opgenomen per cartridge (MLQ) moet zich tussen 0,1 en 0,5 mg goud. De DLR en MLQ worden beproefd en geoptimaliseerd voor elke gebruiker afhankelijk van het specifieke systeem onderzochte alsmede het type deeltje en genpistool gebruikt.
- Calcium en spermidine toe te voegen in de oplossing mixture tijdens DNA-gold microdeeltjes voorbereiding om te helpen bij de binding van DNA moleculen aan het goud nanodeeltjes.
- Meng met een vortex onder langzaam toevoegen van 50 ui 1 M CaCl2 in fracties van 10 - 15 pl. Na 5 min van incidentele vortexen, centrifuge bij 1000 xg gedurende 30 seconden en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet gouddeeltje in 3,5 ml 0,075 M PVP.
- Teken deze schorsing in buis (2,36 mm inwendige diameter) met behulp van een injectiespuit. Plaats de buis in de slang voorbereiding station. Laat hetgouddeeltjes om zich te vestigen en verwijder het supernatant door aspiratie met een spuit. Draai de slang aan gelijkmatig verdeeld de gouddeeltjes, die vervolgens werden gedroogd onder een constante stikstofstroom op 5 L per min.
- Om DNA-kogels creëren, snijd de slang met behulp van een buis snijder in 1 cm lengte. Ofwel steek onmiddellijk in het gen pistool cartridge of houden verdroogde (4 ° C) totdat ze nodig.
4 Biolistische Transfection op Organotypische Slices
- Voer de volgende stappen in een steriele laminaire stroming kap.
- Plaats een 9 V batterij en een lege patroonhouder in het Helios-gen pistool.
- Bevestig het gen pistool om de helium tank met de helium slang. Fire 2 - 3 blanco's (lege slots) bij 50 psi aan de helium slang en de stuwmeren in het geweer onder druk.
- Laad de cartridges met de DNA-gecoate goud in de houders cartridge en plaats de houder in het gen pistool.
- Schroef het gen pistool afstandhouder en bevestighet gemodificeerde gen geweerloop het genpistool.
- Met behulp van een steriel pincet, plaats een filter insert met de organotypische slice in een steriele plastic schotel.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit organotypische plakjes.
- Stel de gasdruk bij 50 psi.
OPMERKING: Oogbescherming is essentieel en gehoorbescherming aan te raden. - Plaats het gen pistool op de juiste afstand met de montage gemeten tot 10 mm. Doel het midden van het vat in de gewenste regio genetische levering zorgvuldig.
- Na het bakken vervangt de inserts terug in hun schaal met vers medium en terug naar normale groeiomstandigheden, dat wil zeggen 37 ° C met 5% CO2 incubator.
- Zodra u klaar bent, sluit u de helium tank, laat de druk van het gen pistool en verwijder het gen pistool uit de helium tank.
- Verwijder de patroonhouder en gooi de cartridges en het reinigen van de gen-gun.
- Controleer het weefsel voor de morfologie en voor een succesvolle penetratie door Visualizing de plakken met een omgekeerde microscoop. Bij gebruik van microdeeltjes, gelijkmatig verspreiden het goud; Er mogen geen dichte gebieden gouddeeltjes gezien op de slice. Nanodeeltjes door hun kleine grootte kan niet worden beschouwd als afzonderlijke eenheden met conventionele microscopie.
- Na de juiste tijdsinterval (meestal 1-2 dagen), bevestig de plakjes in 4% paraformaldehyde (PFA) voor microscopie observatie.
OPMERKING: Bevestiging in PFA is niet altijd gewenst. Voor live-cell imaging vermijden deze stap.
5 Bevestiging en Visualisatie van Brain Plakjes
- Na biolistische transfectie was segmenten tweemaal in PBS gedurende 2 minuten.
- Fix segmenten door incuberen in vers gemaakte, ijskoude 4% PFA in PBS gedurende 20 minuten.
- Was segmenten tweemaal in PBS gedurende 2 minuten.
- Voorzichtig snijden rond het membraan ondersteunt met behulp van een scalpel, zonder verstoring van de plakjes gemonteerd op hen. Een tang elke membraandrager / slice plaatsen op een microscoopglaasje. Rest de organotypic plakjes bovenop het membraan op het glaasje.
- Voeg een druppel fixeermiddelen bovenop het segment en voeg een dekglaasje voorzichtig zonder kracht direct contact met de organotypische slice.
- Verzeker dekglaasje met een dunne laag nagellak.
- Bekijk de plakjes op een geschikte microscoop.
6 Confocal Toepassingen
- Visualiseer de plakjes met behulp van een verticaal scannen laser confocale microscoop met een 60x / 1,4 numerieke apertuur (NA) olie-immersie objectief.
OPMERKING: De meest problematische eigenschap van de confocale microscoop pengat formaat (ingesteld op 1 AE) die in staat is het isoleren en verzamelen van een vlak gericht, waardoor het uit focus "haze" normaal gezien met een fluorescent monster elimineren. Fijne details worden vaak verduisterd door deze nevel en niet kan worden gedetecteerd in een nonconfocal microscoop. - Stel de Argon laser een golflengte van 488 nm en optimaliseren voor het verzamelen van emitted licht in het 500-520 nm band. Typisch afbeeldingen verzamelen 1.024 x 1.024 pixels en stapels z-secties 0,5 um intervallen de volledige breedte van elke zenuwcel die geanalyseerd omvatten.
- Om de morfologie van de nucleus nemen, tegen vlekken deze cellen met DAPI (excitatiegolflengte ingesteld op 405 nm en emissie licht verzameld tussen 420-4 40 nm). Tot slot, voor de behandeling van rode fluorescentie, stel de laser bij 561 nm voor excitatie en 565-620 nm voor de emissie.
- Typisch, afbeeldingen met behulp van een scan zoom 4X dat een oppervlakte van 57,6 micrometer 2 overdekte verwerven; beeldformaten waren in het gebied van 1.024 x 1.024 pixels. Record stapels z-secties in 0,5 micrometer intervallen en projecties van 5-8 frames gecombineerd.
Representative Results
Organotypische levensvatbaarheid slice kan worden gecontroleerd met lactaat dehydrogenase activiteit, propidiumjodide etikettering, en dUTP vlekken zoals eerder werd gemeld 13,22. Blijkbaar, de levensvatbaarheid en integriteit van de segmenten zijn belangrijk voor langdurig aanhoudende expressie van de geleverde genetische lading. Na biolistische levering in de organotypische plakken, de expressie van het fluorescerende heterologe gen werd gevolgd door confocale microscopie. De dichtheid van de biolistische spread toepassing van de gemodificeerde vat kan worden gezien in figuur 3A. Figuur 3B toont een representatief beeld van de getransfecteerde hippocampus gebied met DNA beklede goud nanodeeltjes. Figuur 4 toont representatieve Foto getransfecteerde volwassen muis organotypische plakjes. Zoals te zien in figuur 4A, een Purkinje met een opmerkelijke dendritische haven gevonden op het grensvlak van de Purkinje laag en de moleculaire laag van de cerebellum toont uitgesproken etikettering volgens biolistische transiënte transfectie met pEGFP-N1. Figuur 4B toont een sterkere vergroting van deze dendrieten waar stekels kan worden waargenomen. Figuur 4C toont een piramidale cellen in het CA1 regio van de hippocampus na biolistische levering van pDSredFP beklede gouden nanodeeltjes .
Kleurstoffen plaats van fluorescente gecodeerde DNA ladingen kunnen ook worden gebruikt op een soortgelijke wijze als morfologische kenmerken in organotypische plakjes visualiseren. DiO, dat de plasmamembranen labels kunnen sneller bakenen individuele celmorfologieën of kan worden gebruikt in combinatie met DNA beklede biolistische afgeleverd dezelfde regio de regioselection bevestigen. Zoals in figuur 5A een neuron gekleurd met DiO in de hippocampus toont ook lange dendrieten met talrijke stekels. Een pijl geeft de axon die volgens de aanwezigheid van synaptische boutons in vergelijking met de dentritic stekels anderzijds neurieten. Figuur 5B toont een ander voorbeeld van de CA1 met talloze hippocampale uitsteeksels belicht met DAPI kleuring tegen de kern labelen. Figuur 5C toont een sterkere vergroting van dit soort parallel dendrieten met talrijke stekels.
Blijkbaar zijn deze beelden illustreren morfologische kenmerken volgende cellulaire etikettering. Niets verzet zich ertegen dezelfde methode wordt toegepast op een willekeurig aantal exogene genen aangebracht op de gouden nanodeeltjes te leveren. Om een visuele bevestiging van succesvolle transfectie mogelijk, kan een plasmide worden geconstrueerd om co-expressie zowel het gen van belang en een fluorescerende reporter proteïne op dezelfde vector.
Figuur 1 Gene geweerloop en montage. (A) Het verbeteren d vat ontwikkeld door Dr O'Brien op MRC-LMB die een beperkte biolistische spread die weefselbeschadiging minimaliseert door het verlagen van de vereiste druk voor deeltjesversneller heeft. (B) Het zijaanzicht van een geoptimaliseerde gen gun montage ontwikkeld door Dr Henderson en Dr Andras Nagy aan de Universiteit van Toronto. De montage houdt het gen pistool op precies 90˚ loodrecht op de organotypische plakken terwijl het toelaten van de gebruiker nauwkeurig te regelen van de afstand van biolistische levering. Voor optimale biolistische voorwaarden de lensopening direct over de regio van belang moet worden geplaatst op een 10 mm afstand van de organotypische plakjes. (C) Achter mening van het gen pistool montage. Het gebied van belang worden getransfecteerd moet direct onder het diafragma geplaatst. Targeting kan worden bevestigd met een kleurstof (DiOLISTIC) of fluorescerend eiwit transfectie (biolistische).ank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 organotypische slice voorbereiding en regioselectieve targeting. (A) A DMEM ingebed volwassen muizenhersenen klaar voor het snijden. (B) De matrijs werd gelijmd op de vibroslicer montage met het blad direct een plakje gesneden. (C) Regioselectieve heterologe genexpressie strategieën voor biolistische levering in coronale organotypische plakjes hersenen. Afbeeldingen bereid uit foto's verkregen van de Allen Brain Atlas anatomische verwijzing atlas 23. Linkerpaneel toont twee verschillende hersengebieden gericht als voorbeeld. De genexpressie (1) om het corticale gebied van de linker hersenhelft beperken. De heterologe genexpressie (2) het hypothalamus gebied van de hersenen te beperken. Middelste paneel toont that de expressie van twee heterologe genen (3 en 4) kan worden geïsoleerd en vergelijkt de hippocampus twee hemisferen dezelfde organotypische slice wezen wegnemen van bias met verschillende secties en / of verlenen de mogelijkheid distale overspraak van de effecten van pakken deze genen. Rechter paneel toont de mogelijke overlapping van transgene levering aan de eerste gen (5) in een nauwkeurige corticale regio te uiten terwijl het uitdrukken van een ander gen (6) in een disparate nog overlappende corticale gebied. Dit maakt het mogelijk om het effect van genetische modulatie van elke heterologe gen alleen en ook in combinatie binnen hetzelfde stukje te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Biolistische scatter patroon gezien op filtER beeld lage vergroting papier. (A) De verbeterde cilinder werd ontslagen op filterpapier om de verspreiding van gouddeeltjes bepalen. Linkerzijde toont de verdeling van de verbeterde vat terwijl het rechter paneel toont de normale vat. Zwarte balk: 1 cm. Foto genomen van O'Brien, et al. (B) image 17. Lage vergroting met de stochastische transfectie babbel binnen de 3 mm biolistische verspreiding in de hippocampus regio van 6 weken oude muizen. Witte balk:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Biolistische levering van fluorescerend eiwit gecodeerd DNA in organotypische plakjes van 6 weken oude muizen. (A) stijd confocale beelden van een vaste organotypische plakje het cerebellum van pEGFP-N1 beklede gouddeeltjes getransfecteerde Purkinje cellen. Het beeld werd genomen bij een vergroting van 40x. Zwarte balk:. 30 micrometer (B) toont een 60x vergroting van dendritische haven ander Purkinje cel om de stekels te markeren. Zwarte balk:. 5 micrometer (C) Toont een confocale beeld van vaste schijven uit de hippocampus regio bij 60x vergroting van vier DSredFP getransfecteerde piramidale cellen. Zwarte balk:. 10 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 DiOLISTIC levering membraan labeling fluorescerende kleurstoffen in organotypische plakjes. (A) toont de live imaging van hippocampale neuron labeled met DiO onder 20x vergroting. De dendritische stekels kan duidelijk ook in acht worden genomen als het axon als geïdentificeerd door de afwezigheid van de activatie van dendritische stekels en de aanwezigheid van synaptische boutons aangegeven met een witte pijl. Witte balk:. 30 micrometer (B) Uitgesproken kleuring van de hippocampus regio gelabeld met DiO en tegengekleurd met DAPI. Witte balk:. 30 micrometer (C) Hogere vergroting (60x) van de activatie van dendritische stekels gevonden in de CA1 regio van de hippocampus. Witte balk:. 5 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Het protocol beschrijft benaderingen kleurstoffen en genetisch materiaal in volwassen organotypische plakjes leveren met een verbeterde genpistool. In wezen, de soorten kleurstoffen en de vele mogelijke genen methode veelzijdige en vatbaar voor uiteenlopende biologische vragen. De regioselectieve levering methode gebruikt, in dit geval aan specifieke regio hersenen, opent nieuwe wegen voor experimenten als heterologe gen modulatie van gelokaliseerde gebieden binnen een biologisch relevante architectuur heeft niet eerder gemakkelijk haalbaar geweest. We hebben eerder vastgesteld dat deze werkwijze kan worden toegepast op volwassen organotypische segmenten, waarbij volwassen synapsen volledig gevormd, zoals bleek verbeterde celoverleving en heterologe genexpressie wekenlang 13. Met de komst van nieuwe en verbeterde kweekomstandigheden voor zoogdierlijke hersenen en andere weefsels, zal het gebruik van regioselectieve genetische modulaties steeds bruikbaar voor allerlei Bioche gewordensche analyses.
Zoals we hier eerder en zorgen voor het propageren door anderen 24 gasten, kan veel verschillende factoren direct van invloed op de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van biolistische levering. Ten eerste moet de bereiding van het goud deeltje verbonden kleurstoffen of DNA adequaat evenwicht gehouden om aggregatie te voorkomen en de cartridge lading uitzetting te vergemakkelijken. Calcium en spermidine in de DNA-gouden microdeeltjes oplossing kan helpen de binding van DNA moleculen aan het goud nanodeeltjes. Het vermogen van de nanodeeltjes aan de cellen penetreren onder verminderde druk werd vooraf bepaalde 17. Ten tweede moet het gen pistool zo stabiel mogelijk gemonteerd met de juiste hoek en afstand. Een betrouwbare manometer is ook noodzakelijk voor reproduceerbaarheid, met weefselintegriteit te behouden en om de gouddeeltjes hun beoogde doelen behoren versnellen. Inderdaad, de afstand, oriëntatie, en de stabiliteit van de apparatuur zijn ook een cruciale factoren voor de targeting en nauwkeurigheid van regioselectieve levering. Aangezien deze hersenstructuren zijn erg klein, kunnen kleine variaties in de aansnijhoek gemakkelijk de gehele procedure minder betrouwbaar maken. Tenslotte, de bereiding en het onderhoud van levensvatbare organotypische plakjes werden beladen met problemen voor vele decennia nog overvloedig en betrouwbare protocollen voor verschillende dieren, hersengebieden, leeftijden en hulpkweken beschikbaar 2,4,25,26. Deze procedures moeten door de gebruiker geoptimaliseerd voor het indienen van de weefsels te biolistische procedures. Dit zal gemakkelijker de gebruiker mogelijk om het effect van de biolistische deeltjes en het effect van het heterologe gen op hun eigen cultuur unbiasedly bepalen. Hiertoe kan het gebruik van fluorescerende genen zoals EYFP en EGFP zowel mogelijk een nieuwe gebruiker het richtende nauwkeurigheid testen en volgen ook de cellulaire levensvatbaarheid door heterologe genexpressie gedurende langere tijd 13. Veel van de kritische stappen voor betrouwbareen reproduceerbare gebruik van dit protocol worden gemarkeerd in de volgende drie alinea's.
Voor een efficiënte transfectie, moet de DNA-concentratie geschikt. Concentraties te lage opbrengst zou de transfectie worden gehinderd concentraties te hoge agglomeratie van de nanodeeltjes kan veroorzaken. Aggregaten van goud kan drastisch verminderen transfectie-efficiëntie, veroorzaakt ongelijkmatige verdelingen, en kan leiden tot verhoogde cytotoxiciteit en oxidatieve stress. Problemen met coating efficiency waarschijnlijk vanwege het verstrijken van het spermidine-oplossing (moeten elke 2 tot 3 maanden worden vervangen). Voor een adequate biolistische spread moet het etiket zelfs. Een niet-homogene kenmerken van de gouden nanodeeltjes / DNA suspensie kan door de PVP-oplossing. Ook dient elke 2 tot 3 maanden worden vervangen. Coating van de gouden nanodeeltjes te zien op agarose gelelektroforese als hogere MW-band 27.
Elke biologische system in onderzoek evenals alle verschillende instrumenten gebruikt kunnen kleine veranderingen in gasdruk nodig om optimale niveaus van transfectie en biolistische spreiding te bereiken. De kritische parameter is de druk van het helium puls vereist het micro-of nano-dragers van het plastic cartridge strip en deze voortbewegen in het weefsel. Een hoge gasdruk beïnvloedt celoverleving, omdat schokgolven over het doel zal creëren en verstoren of los weefsel van de matrix 17. Richten het gen geweerloop en met de inrichting exact loodrecht op het weefsel van belang voor een nauwkeurige biolistische levering. De geselecteerde gebied moet in het directe midden van het vat worden geplaatst precies 10 mm van de buitenste opening. Dit resulteert in een 3 mm diameter gouddeeltje levering rond het epicentrum. Het gen geweerloop reinigen met 70% ethanol na gebruik. Om het weefsel van grote deeltjesaggregaten beschermen, de loop bevat ook een nylon mesh die should regelmatig worden vervangen om optimale prestaties te behouden. Met het oog op vervanging van het gaas draai de dop en plaats vervolgens een nieuwe nylon gaas tussen de kap en de O-ring.
Fluorescent gelabelde cellen moet zichtbaar zijn minimaal 1 - 2 dagen na transfectie rond het epicentrum. Afwezigheid of verkeerde uitlijning van de etikettering kunnen het gevolg zijn van onvoldoende voorbereiding en instabiliteit van het gen pistool montage. De opmerkingen van cellen met confocale microscopie afhankelijk van een aantal factoren: de golflengte van de excitatie / emissie licht, pinhole grootte NA van de objectieflens brekingsindex van componenten in het lichtpad, de diepte van het weefsel, en de aanpassing van het instrument. Deze factoren worden geoptimaliseerd voor elk systeem onderzocht.
Recente ontwikkelingen in biolistiek uitgebuit voor het succes van deze werkwijze. Het gen geweerloop in deze studie werd gewijzigd om de nodige druk te verlagen en de trechter biolistischescatter patroon in een bepaald gebied beperkt en 17,19. Andere vat wijzigingen geprobeerd de biolistische verspreiding beperken en verminderen de uitstroom druk 28 Nog dit douane ontworpen gen gun barrel gemaakt door Dr O'Brien een los onderdeel ingericht als de Helios Gene gun. Vervolgens werden sub-micrometer gouddeeltjes gebruikt om de invasiviteit van micrometer deeltjes die we eerder vastgestelde vermindering veroorzaakte cellulaire schade en uiteindelijk verlies van aanhoudende heterologe genexpressie. Deze wijzigingen in de biolistische procedure verbeterd de algehele haalbaarheid en de reproduceerbaarheid van de methode 13. Andere verbeteringen op segment preparaat zoals grondig oplossen van het snijden procedure, met een DMEM-Agarose matrix naar de hersenen te behouden, en talrijke andere bruikbare ontwikkelingen in organotypische brain slice voorbereiding eerder beschreven 13 konden we het gebruik van volwassen segmenten exploreren hebben volwassen ontwikkeldsynaptische netwerken.
In onze studie hebben we voornamelijk kleurstoffen en fluorescerende heterologe genen celmorfologie visualiseren als een uitlezing voor transfectie-efficiëntie en het vermogen om het beeld morfologische kenmerken van neuronen in muizenhersenen weefsels. De signaal-ruisverhouding van het stochastische levering binnen een bepaalde straal konden wij loskoppelen dendritische haven een enkele cel in zijn natuurlijke context. Aangezien talrijke inspanningen worden gebruikt om deze morfologische onderzoeken mapping 'connectomics' of enkele cellen label voor verschillende analyses kan deze werkwijze eenvoudig worden gecombineerd met de bestaande protocollen zoals elektrofysiologische metingen en neuriet 29,30. Blijkbaar kunnen combinaties van fluorescente heterologe genen veel robuuster afbakening van afzonderlijke cellen zoals de stochastische verdeling van fluorescerende eiwitten mogelijk, en de combinatie zou de kleur van de individuele cellen 31,32 bepalen. Het gebruik van celspecifieke promoters zoals synapsin en gliale fibrillaire zure proteïne stroomopwaarts van het heterologe gen exon kan ook de expressie subpopulaties 33 beperken. Inderdaad, de oneindige verscheidenheid van genetisch materiaal kan ook in een regioselectieve manier uit met goud nanodeeltjes met dezelfde procedure. De totale getransfecteerde regio dus kan worden geanalyseerd met traditionele methoden, zoals dissectie en het indienen van die regio om de westerse immunoblottingtest naar de gelokaliseerde effect van het heterologe gen te analyseren.
Verbeteringen in organotypische slice procedures ook in staat ruimer gebruik van hersenweefsel langdurig experimenteren en het gebruik toestaan van andere weefsels en hulpkweken en zou transfectie te vergemakkelijken. Lipide en polymeer transfectie zijn eerder gerapporteerd membraan homeostase, internalisatie, eiwit permeabiliteit beïnvloeden 34 Vaak vertonen zeer lage efficiëntie te transfecterenrminally gedifferentieerde neuronen. Celspecifieke targeting lading is vatbaar alleen cellen die het celoppervlak receptoren nodig voor internalisatie drukken, en hoewel deze werkwijze zeer selectief is, kan het ontberen gericht regioselectiviteit 35. Virale vectoren anders zijn vaak moeilijk en kostbaar om te produceren, moeten strengere regelgeving en hebben soms gedemonstreerd bezorgdheid over de veiligheid. Biolistische aflevering heeft dus een ongeëvenaarde mogelijkheid om regioselectief transfecteren neuronen en andere celtypes binnen levensvatbare weefsels. Aangezien goud is niet giftig, verdere vooruitgang in het gebruik van biolistiek kan de weg voor biomedische toepassingen zoals transdermale farmaceutische levering invasieve in vivo gentherapie, als lokaal virale gentherapie effenen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de MRC-LMB workshop bedanken voor de productie van de verbeterde gen geweerloop. Wij zouden ook graag Dr David R. Hampson danken aan de Universiteit van Toronto voor het gebruik van apparatuur en middelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
References
- Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
- Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
- Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
- Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
- Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
- Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
- Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
- Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544 (2013).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
- Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
- Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
- Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
- Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
- Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017 (2012).
- Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).
- Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
- Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
- Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).
