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Neuroscience

Regioselective biolistic एक संशोधित जीन बंदूक का इस्तेमाल Organotypic मस्तिष्क स्लाइसें में लक्ष्य निर्धारण

doi: 10.3791/52148 Published: October 24, 2014

Abstract

इन विवो जीव विज्ञान के कई पहलुओं को बनाए रखते हुए डीएनए की अभिकर्मक जैविक विज्ञान के लिए और organotypic मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी करने के लिए हाल के अग्रिमों के साथ अमूल्य किया गया है, विभिन्न heterologous जीनों का प्रभाव इस तरह आसानी से जांच की जा सकती है. पारंपरिक अभिकर्मक तरीकों इतनी कम पैदावार और व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण नुकसान के रूप में कठिनाइयों से भरा किया गया है जिसके लिए टर्मिनली विभेदित न्यूरॉन्स transfect के लिए बढ़ती ब्याज कर दिया गया है. Biolistic अभिकर्मक यह स्तनधारी ऊतकों में उपयोग के लिए उत्तरदायी है कि इसलिए इन कठिनाइयों से कई अभी तक केवल हाल ही में इस तकनीक को संशोधित किया गया है नाकाम कर सकते हैं.

त्वरक चैम्बर के लिए नए संशोधनों जीन बंदूक की फायरिंग सटीकता बढ़ाया और भी अभिकर्मक दक्षता की हानि के बिना कम गैस के दबाव (50 साई) के उपयोग की अनुमति है, जबकि प्रवेश की अपनी गहराई में वृद्धि हुई है और साथ ही देहात के एक केंद्रित regioselective प्रसार की अनुमति है3 मिमी के भीतर करने के लिए rticles. इसके अलावा, इस तकनीक को सीधे आगे और तेजी से कठिन microinjections से प्रदर्शन करने के लिए है. Episomal अभिव्यक्ति 24 घंटे के भीतर पाया जा सकता है और सेल अस्तित्व से बेहतर है, या, पारंपरिक तरीकों के लिए कम से कम बराबर होना दिखाया गया था जहां क्षणिक और स्थिर अभिव्यक्ति दोनों nanoparticle बमबारी के साथ संभव हो रहे हैं. इस तकनीक को हालांकि एक महत्वपूर्ण लाभ है: यह इस प्रकार anatomically heterologous जीन के प्रभाव को अलग करने के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए एक भी रोका दायरे में स्थानीकृत किया जाए अभिकर्मक परमिट. यहाँ हम एक बेहतर जीन बंदूक का इस्तेमाल अभिकर्मक regioselective लिए व्यवहार्य वयस्क organotypic स्लाइस तैयार करने और उन्हें जमा करने के लिए एक में गहराई प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Introduction

मूलतः biolistic तकनीक, "जैविक प्राक्षेपिकी" के लिए एक बारी के वाक्यांश, पादप कोशिकाओं 1 में कण की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के लिए स्थापित किया गया था. सेल परिवर्तन के इस भौतिक विधि डीएनए या रंगों के रूप में cargos देने के क्रम में अभेद्य कोशिका झिल्ली की शारीरिक बाधाओं को दूर करने के लिए उच्च वेग में सूक्ष्म या नैनोकणों accelerates. यह विशिष्ट ligand-रिसेप्टर्स और / या कोशिका की सतह की झिल्ली में जैव रासायनिक गुणों पर निर्भर नहीं है, क्योंकि कण की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण तत्काल ऐसे organotypic मस्तिष्क के स्लाइस के रूप में जैविक प्रणालियों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.

वे इन विवो जीवविज्ञान 2-4 करने के लिए प्रासंगिक हैं कि कई शारीरिक और जैव रासायनिक गुणों को बनाए रखने के बाद से उपयोग organotypic स्लाइस इन विट्रो प्लेटफार्मों में अन्य से अधिक लाभ है. स्लाइस ज्यादातर वे प्रारंभ हुआ और preser है जहां से स्थानीय वास्तु विशेषताओं के संरक्षणनयूरोचेमिकल गतिविधि और synapses के कनेक्टिविटी किया है. बुनियादी अनुसंधान के लिए मस्तिष्क के स्लाइस के उपयोग, और दवा के प्रयासों में, समन्वित उपाय और संदर्भ 3,5-7 तरह एक Vivo में मस्तिष्क के neurobiological व्यवहार की निगरानी के लिए संभव जैव प्रौद्योगिकी जोड़तोड़ की संख्या के साथ बढ़ गया है. organotypic टुकड़ा आधारित परख पद्धति के उपयोग हेतु प्रमुख लाभ यह आसान प्रयोगात्मक नियंत्रण प्रदान करता है और बाह्य वातावरण की सटीक जोड़तोड़ की अनुमति देता है.

लाभकारी, organotypic टुकड़ा संस्कृति प्रणालियों जैसे मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म से स्थापित है, लेकिन प्रांतस्था, रीढ़ की हड्डी, और सेरिबैलम 8-10, तक ही सीमित नहीं किया गया है. इसके अलावा, cocultures के एक नंबर बाहर का मस्तिष्क क्षेत्रों में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन्स और रोग कोशिकाओं 11,12 के बीच कहनेवाला संचार के मूल्यांकन की अनुमति है, जो प्रदर्शन किया गया है. कई प्रोटोकॉल पहले से ही है करने के लिए स्थापित किया गया हैuccessfully संस्कृति organotypic स्लाइस और दीर्घकालिक व्यवहार्यता बनाए रख सकते हैं और हाल ही में कई अध्ययनों से अब यह 13 झिल्ली इंटरफ़ेस तरीकों और विभिन्न संशोधनों का उपयोग. इस सिद्धांत एक झरझरा झिल्ली फिल्टर पर स्लाइस रखकर मध्यम और इनक्यूबेटर की humidified वातावरण के बीच इंटरफेस में organotypic स्लाइस रखता है. मध्यम इस प्रकार केशिका प्रस्ताव के माध्यम से organotypic स्लाइस को खिलाने के लिए पर्याप्त पोषक तत्व प्रदान कर सकते हैं. आमतौर पर स्लाइस जल्दी प्रसव के बाद जानवरों से तैयार किया गया है (- 9 दिन पुरानी 3, पी 3 - 9). हालांकि, इन स्लाइस से मस्तिष्क के ऊतकों सेलुलर plasticity की एक उच्च स्तर का प्रदर्शन और व्यवहार्य संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए उपयोगी है जो यांत्रिक तनाव करने के लिए एक अंतर्निहित प्रतिरोध, है, अभी तक परिपक्व synapses और neuroanatomical circuitry पूरी तरह से उम्र के 2 से 3 सप्ताह तक विवो में विकसित नहीं किया है 14. उदाहरण के लिए, पिछले टिप्पणियों P0 से प्राप्त है कि हिप्पोकैम्पस स्लाइस दिखाया गया था - 1 नवजात शिशुओं अत्यधिक viab हालांकिLe तैयारी के बाद, धीरे धीरे कुछ लक्षण खो दिया है. मूलतः, वे बड़े जानवरों 15,16 से organotypic संस्कृतियों की तुलना-अंतर डे के लिए और अधिक होने की संभावना थे अपरिपक्व कोशिकाओं सुझाव दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए अनुपयुक्त हो दिखाया गया. इस कारण हमारे विधि परिपक्वता और वास्तु विकास उनके टर्मिनल चरणों 13,17-21 पहुँच गए हैं, जिस पर वयस्क organotypic मस्तिष्क के स्लाइस के लिए अनुकूलित किया गया है. फिर भी, इस विधि भी नवजात शिशु और किशोर organotypic स्लाइस के लिए उपयुक्त है.

व्यवहार्य organotypic स्लाइस उत्पादन किया गया है एक बार स्लाइस युक्त पूरी थाली biolistic माउंट करने के लिए लाया जाता है और वितरण और अभिकर्मक regioselective को प्रस्तुत किया जा सकता है. (ऊतक को एपर्चर से) सीधे स्लाइस पर 10 मिमी की दूरी पर 90 डिग्री उन्मुख (चित्रा 1 में वर्णित) जीन बंदूक के समुचित बढ़ते,, 40 एनएम का तेजी biolistic डिलीवरी जाना परमिटएलडी कण cargos लेपित. इस तरह के रंगों और फ्लोरोसेंट डीएनए वैक्टर के रूप में इन cargos, साथ ही ब्याज की किसी भी जीन, आसानी से आसानी से व्यवहार्य स्लाइस में वितरित कर रहे हैं. इस विधि इस प्रकार एक regioselective ढंग से, देने के लिए प्रोटोकॉल आवश्यक वर्णन करता है, व्यवहार्य organotypic मस्तिष्क स्लाइस में कार्गो लेपित सोने के नैनोकणों. जीन बंदूक बैरल और इष्टतम बढ़ते चित्रा 1 में देखा जा सकता है. सुधार बैरल और nanoparticle प्राक्षेपिकी के बारे में अधिक जानकारी के लिए, एट अल. 17 ओ ब्रायन देखें.

इसके बाद शोधन भी उपयोगकर्ता इस तरह microcarrier लोड हो रहा है मात्रा (MLQ) के रूप में परिभाषित लक्ष्य क्षेत्र के प्रति वितरित सोने की उचित राशि के रूप में शर्तों का अनुकूलन करने के लिए, और डीएनए लोड हो रहा है अनुपात के रूप में परिभाषित सोने की मिलीग्राम प्रति लोड डीएनए की राशि का निर्धारण करने के लिए संकेत कर रहे हैं (डीएलआर). सोने के कणों पर डीएनए precipitating और वास्तविक जीन बंदूक 'कारतूस शामिल हैं कि Tefzel ट्यूबिंग में उन्हें लोड करने से पहले9 ;, यह ऊतकों और कानून के बीच थोड़ा अलग कर सकते हैं, जो प्रत्येक अभिकर्मक के लिए आवश्यक डीएनए और सोने की राशि की गणना करने के लिए आवश्यक है (अनुपात 1 के लिए 1 मिलीग्राम सोना और 1 ग्राम डीएनए के बीच बनाए रखा जाना चाहिए: 5). यह रूप में अन्यथा डीएनए लेपित सोने के कणों वृद्धि ऊतकों को नुकसान और cytotoxicity के रूप में भी biolistic प्रसार के समग्र एकरूपता को कम कर सकता है जो उम्मीद की ढेर, की तुलना में बड़ा गठन एक साथ पालन सकता डीएलआर को MLQ का उचित अनुपात तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है.

इस विधि biolistic वितरण में हाल ही में सुधार, परीक्षण और नवजात किशोर और वयस्क organotypic मस्तिष्क के स्लाइस के लिए उत्तरदायी होने के लिए निर्धारित किया गया है जो दिखाता है. इसके अलावा, जीन बंदूक बैरल के कम biolistic फैल शोषण से, उपयोगकर्ता अब चुनिंदा मस्तिष्क में एक पाबंद क्षेत्र transfect करने में सक्षम है. उपयुक्त ऊष्मायन समय के बाद, 24 और 48 के बीच इसकी अधिकतम दरों पहुंचता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति,घंटा, epifluorescence और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं. ये fluorophores जैविक रूप से प्रासंगिक संरचनाओं के भीतर रूपात्मक विश्लेषण और व्यक्ति की कोशिकाओं के स्थानीयकरण की अनुमति. हालांकि, अन्य heterologous जीन द्वारा organotypic स्लाइस की regioselective मॉडुलन भी इन तैयारियों के लिए उत्तरदायी किसी भी अन्य परीक्षणों से नजर रखी जा सकती है. स्थानीयकृत जीन डिलीवरी के लिए संभव काम कर रणनीतियों चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं.

Protocol

पशुओं और जानवरों के ऊतकों का उपयोग सख्ती से स्थानीय नियमों और नियमन के तहत नैतिक समिति के अनुमोदन का पालन करना चाहिए. सभी ऊतकों एमआरसी-LMB के पशु प्रयोगों के दिशा निर्देशों का पालन इस अध्ययन के दौरान प्राप्त की.

सामग्री एवं संस्कृति मीडिया के 1 तैयारी

  1. Millipore पानी का उपयोग कर सभी समाधान तैयार; केवल विश्लेषणात्मक ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करें. तैयार है और (जब तक अन्यथा इंगित) आरटी पर सभी अभिकर्मकों की दुकान.
  2. HEPES buffered खारा (10 मिमी HEPES, 120 मिमी NaCl 7.2 पीएच) के 500 मिलीलीटर बनाओ. 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर यूनिट के माध्यम से फिल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  3. (; 10 मिमी ना 2 HPO 4, 2 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, पीएच 7.4 पीबीएस) फॉस्फेट बफर खारा के 500 मिलीलीटर बनाओ. Autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
  4. 100 एन 2 सु: 25 मिमी HEPES, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 30 मिमी ग्लूकोज, 1 साथ DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) सप्लीमेंट द्वारा न्यूरोनल मध्यम तैयारpplement, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 1,100 यू / एमएल; 7.2 पीएच. 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर यूनिट के साथ फिल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  5. 1 मिलीलीटर 100% इथेनॉल में 20 मिलीग्राम पीवीपी साथ Polyvinylpyrrolidone (पीवीपी) शेयर समाधान करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर मात्रा, फ्रीज और दुकान में विभाज्य यह. समाधान कार्य 0.05 मिलीग्राम / एमएल, इसलिए 100% इथेनॉल के हर 4 मिलीलीटर पीवीपी स्टॉक समाधान के 10 μl जोड़ने है.
  6. Millipore पानी में एक 0.05 एम spermidine शेयर समाधान तैयार; 7.2 पीएच को समायोजित.
  7. (एक निष्फल पेंच टोपी बोतल में 100 मिलीलीटर DMEM में 2 जी वैद्युतकणसंचलन ग्रेड agarose) DMEM में एक 2% agarose समाधान करें. Agarose भंग कर दिया है जब तक इस माइक्रोवेव. यदि आवश्यक हो तो, कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर.

Organotypic स्लाइस की 2. तैयारी

  1. सीओ द्वारा C57 काला कत्ल के द्वारा पीछा 2 asphyxiation वांछित उम्र के 6 चूहों euthanize. पार्श्व खोपड़ी कटौती रंध्र मैग्नम पर शुरू और समाप्त होने का उपयोग कर मस्तिष्क निकालेंघ्राण पालियों. धीरे मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए पीछे से खोपड़ी उठा.
  2. सेरिबैलम घ्राण लोब और ललाट प्रांतस्था, और व्याख्यान चबूतरे वाला बीच में कटौती. धीरे मस्तिष्क के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा उठा और ऑप्टिक नसों में कटौती. अंत में, मस्तिष्क को हटाने और बर्फ पर बर्फ के ठंडे HEPES buffered खारा से भरा एक पेट्री डिश में जगह है.
  3. ठीक संदंश का उपयोग कर पिया दूर छील, एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग; ध्यान से मस्तिष्क के आसपास रक्त वाहिकाओं और तानिका हटा दें.
  4. एक छोटे प्राप्तकर्ता मोल्ड में ताजा दिमाग रखें और यह थोड़ा आरटी ऊपर करने के लिए ठंडा agarose समाधान के साथ कवर किया. फिर तेजी से बर्फ पर रखकर 4 डिग्री सेल्सियस तक ढालना शांत.
    नोट: व्यवहार्यता के नुकसान से बचने के लिए तेजी से यथासंभव स्लाइस प्रक्रिया.
  5. Agarose की स्थापना की है जब (5 - 10 मिनट), मिट्टी से agarose एम्बेडेड मस्तिष्क को हटाने (यदि आवश्यक ट्रिम), और फिर vibroslicer मंच करने के लिए यह गोंद. बाँझ बर्फ ठंड पीबीएस युक्त एक vibroslicer चेंबर में इस जगह. डिबाद के संदूषण को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ इस्तेमाल किया जा रहा से पहले vibroslicer कक्ष sinfect.
  6. एक कस्टम बनाया vibroslicer या वाणिज्यिक बराबर का उपयोग कर मस्तिष्क कट. मॉडल अवधारणा ऊर्ध्वाधर कंपन को कम करते हुए ब्लेड की धार को क्षैतिज बड़े आयाम और उच्च आवृत्ति आंदोलनों उत्पन्न कर सकता है कि एक ऊतक slicer डिजाइन करने के लिए किया गया था.
  7. 1.5 की एक आयाम में, 90 हर्ट्ज के कंपन आवृत्ति का प्रयोग करें - 2.0 मिमी, और क्षैतिज विमान को 15 डिग्री के कोण पर तैनात काटने ब्लेड; 1.7 मिमी / ब्लेड की ओर मिनट पर स्थानांतरित करने के लिए agarose एम्बेडेड मस्तिष्क पकड़े बढ़ते ब्लॉक सेट. एक कक्ष युक्त बर्फ ठंड संस्कृति मीडिया में वर्गों (150 माइक्रोन) ले लीजिए (DMEM पेन / Strep + 10% एफसीएस). Arsenault और ओब्रायन 13 में एक अनुपूरक वीडियो के रूप में ऊतक स्लाइस के दृश्य काटने और हेरफेर.
  8. धीरे संस्कृति मेड के साथ एक 6 बहु अच्छी तरह से ट्रे में सेल संस्कृति आवेषण में स्लाइस (0.4 माइक्रोन, 30 मिमी व्यास) जगहडालने के बाहर आइए, और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में सेते हैं.
    नोट: स्थानांतरित और स्लाइस जोड़ तोड़, जबकि उचित ऊतक व्यवहार्यता के लिए, अत्यंत कोमल हो. इसके अलावा, बहुत ज्यादा तरल पदार्थ फिल्टर डालने की झिल्ली का पालन करने से organotypic स्लाइस पाएगा. यदि ऐसा होता है, अधिक तरल पदार्थ को निकालने या फिर थाली.
  9. Organotypic स्लाइस कुछ हफ्तों के लिए संवर्धित किया जा सकता है, सबसे अच्छा अभिकर्मक पैदावार के लिए चढ़ाना के बाद कोई बाद में 4 दिनों से अभिकर्मक के लिए आगे बढ़ें.
    नोट: दीर्घकालिक संस्कृति शर्तों, उपयोग ARAC या सीरम मुक्त मध्यम 2 में glial अतिवृद्धि से बचने के लिए.

डीएनए में लिपटे माइक्रो और नैनो प्रोजेक्टाइल के 3 तैयारी

  1. 40 एनएम व्यास सोने के कणों का उपयोग नैनो प्रोजेक्टाइल तैयार करें. संक्षेप में, 0.05 एम spermidine और सोने के कणों की 10 मिलीग्राम 1 मिलीग्राम / एमएल (pEYFP-N1) के 10 μl डीएनए के 50 μl जोड़ें.
    1. समाधान मिश्रण में कैल्शियम और spermidine जोड़ेंडीएनए सोने सूक्ष्म दौरान संरचना सोना नैनोकणों के लिए डीएनए अणु के बंधन में सहायता करने के क्रम में तैयारी कण.
      नोट: सोने के वाहक के मिलीग्राम (डीएलआर) प्रति इस्तेमाल डीएनए की राशि, सोने की 1 प्रति डीएनए माइक्रोग्राम के बीच 1 और 5 मिलीग्राम सीमा होनी चाहिए. इसके अलावा, कारतूस (MLQ) प्रति गोली मार दी जाएगी कि सोने के वाहक कणों की मात्रा, खुद को 0.1 से सोने की 0.5 मिलीग्राम तक का चाहिए. डीएलआर और MLQ की कोशिश की और जांच के तहत विशेष प्रणाली के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल कण और जीन बंदूक के प्रकार के आधार पर प्रत्येक उपयोगकर्ता के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
  2. 15 μl - धीरे 10 के भागों में 1 एम 2 CaCl के 50 μl जोड़ने जबकि एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं. 30 सेकंड के लिए 1000 XG पर सामयिक vortexing के 5 मिनट, अपकेंद्रित्र बाद फिर सतह पर तैरनेवाला हटायें. 0.075 एम पीवीपी की 3.5 मिलीलीटर में सोने के कण गोली Resuspend.
  3. एक सिरिंज का उपयोग ट्यूबिंग में इस निलंबन (2.36 मिमी आंतरिक व्यास) आकर्षित. ट्यूबिंग तैयारी स्टेशन में ट्यूबिंग रखें. अनुमति देंसोने के कणों बसा है और एक सिरिंज के साथ आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए. समान रूप से बाद में प्रति मिनट 5 पर एक स्थिर नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सूख रहे थे, जो सोने के कणों, प्रसार करने के लिए ट्यूबिंग घुमाएँ.
  4. डीएनए गोलियां बनाने के लिए, 1 सेमी लंबाई में एक टयूबिंग कटर का उपयोग ट्यूबिंग काटा. या तो जीन बंदूक कारतूस में तुरंत डालें या जब तक आवश्यक शुष्क (4 डिग्री सेल्सियस) रहते हैं.

Organotypic स्लाइस पर 4 biolistic अभिकर्मक

  1. एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के भीतर निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.
  2. Helios जीन बंदूक में एक 9 वी बैटरी और एक खाली कारतूस धारक डालें.
  3. हीलियम नली के साथ हीलियम टैंक के लिए जीन बंदूक संलग्न. फायर 2 - 50 साई में 3 कारतूस (खाली स्थान) हीलियम नली और बंदूक में जलाशयों पर दबाव डालने के लिए.
  4. कारतूस धारकों में डीएनए में लिपटे सोने युक्त कारतूस लोड और जीन बंदूक में धारक लोड.
  5. जीन बंदूक स्पेसर खोल देना और देतेजीन बंदूक को संशोधित जीन बंदूक बैरल.
  6. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक बाँझ प्लास्टिक डिश में organotypic टुकड़ा युक्त एक फिल्टर डालने जगह है.
  7. Organotypic स्लाइस से मीडिया निकालें.
  8. 50 साई गैस दबाव निर्धारित करें.
    नोट: नेत्र संरक्षण आवश्यक है और कान संरक्षण की सलाह दी जाती.
  9. 10 मिमी मापा बढ़ते उपयोग करके उचित दूरी पर जीन बंदूक रखें. ध्यान से आनुवंशिक प्रसव के लिए वांछित क्षेत्र पर प्रति बैरल के केंद्र लक्ष्य.
  10. 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर साथ, यानी, 37 डिग्री सेल्सियस फायरिंग के बाद, ताजा मीडिया के साथ वापस अपने डिश में सम्मिलित की जगह है और सामान्य विकास की स्थिति में उन्हें वापस.
  11. समाप्त होने पर,, हीलियम टैंक बंद जीन बंदूक से दबाव जारी है और हीलियम टैंक से जीन बंदूक अलग.
  12. कारतूस धारक निकालें और कारतूस त्यागने और जीन बंदूक साफ.
  13. आकृति विज्ञान के लिए और visua द्वारा सफल प्रवेश के लिए ऊतक जाँचेंएक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइस lizing. Microparticles का उपयोग करते हैं, तो समान रूप से सोने फैलाने; टुकड़ा पर देखा सोने के कणों का कोई सघन क्षेत्रों होना चाहिए. अपने छोटे आकार के कारण नैनोकणों पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीक से एक यूनिट के रूप में नहीं देखा जा सकता.
  14. उचित समय अंतराल के बाद (आमतौर पर 1 - 2 दिन), माइक्रोस्कोपी अवलोकन के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) में स्लाइस को ठीक.
    नोट: पीएफए ​​में फिक्सिंग हमेशा वांछित नहीं है. लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस चरण से बचने.

5 फिक्सिंग और मस्तिष्क स्लाइसें का दृश्य

  1. Biolistic अभिकर्मक के बाद, 2 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइस धो लो.
  2. 20 मिनट के लिए पीबीएस में ताजा बना, बर्फ के ठंडे 4% पीएफए ​​में incubating द्वारा स्लाइस को ठीक करें.
  3. 2 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइस धो लें.
  4. झिल्ली उन पर मुहिम शुरू की स्लाइस परेशान बिना, एक स्केलपेल का उपयोग का समर्थन करता दौर धीरे काटा. एक खुर्दबीन स्लाइड पर प्रत्येक झिल्ली समर्थन / टुकड़ा जगह संदंश का प्रयोग करें. Organotyp आराम करेंकांच स्लाइड पर झिल्ली के शीर्ष पर आईसी स्लाइस.
  5. टुकड़ा के शीर्ष पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें और organotypic टुकड़ा के साथ संपर्क में सीधे किसी भी शक्ति के बिना धीरे एक coverslip जोड़ें.
  6. नाखून वार्निश की एक पतली परत के साथ coverslip सुरक्षित.
  7. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप पर स्लाइस देखें.

6 Confocal आवेदन

  1. एक 60X / 1.4 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ एक ईमानदार स्कैनिंग लेजर confocal खुर्दबीन का उपयोग करके स्लाइस कल्पना.
    नोट: confocal खुर्दबीन के सबसे समस्याग्रस्त सुविधा इस प्रकार सामान्य रूप से एक फ्लोरोसेंट नमूने के साथ देखा फोकस 'धुंध' के बाहर नष्ट करने, अलग और ध्यान की एक विमान का संग्रह करने में सक्षम है जो (1 ए.यू. पर सेट) पिनहोल आकार है. ठीक विवरण अक्सर इस धुंध से छिप कर रहे हैं और एक nonconfocal माइक्रोस्कोप में नहीं पाया जा सकता.
  2. 488 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को आर्गन लेजर सेट और उन्हें संग्रह के लिए अनुकूलन500-520 एनएम बैंड में itted प्रकाश. आमतौर पर, विश्लेषण किया गया था कि प्रत्येक तंत्रिका कोशिका की पूरी चौड़ाई धरना 1,024 x 1,024 पिक्सल और 0.5 माइक्रोन अंतराल पर Z-वर्गों के ढेर के साथ छवियों को इकट्ठा.
    1. नाभिक की आकारिकी का निरीक्षण करने के लिए, काउंटर (4 - 40 एनएम 420 के बीच एकत्र 405 एनएम और उत्सर्जन प्रकाश में सेट उत्तेजना तरंगदैर्ध्य) इन DAPI के साथ कोशिकाओं दाग. उत्सर्जन के लिए 620 एनएम - अंत में, लाल प्रतिदीप्ति की जांच के लिए, उत्तेजना के लिए 561 एनएम और 565 पर लेजर सेट.
  3. आमतौर पर, 57.6 माइक्रोन 2 के एक क्षेत्र को कवर किया है कि एक 4X स्कैन ज़ूम का उपयोग करके छवियों को प्राप्त; छवि आकार 1024 x 1024 पिक्सल के क्षेत्र में थे. रिकॉर्ड 0.5 माइक्रोन अंतराल में Z-वर्गों के ढेर और 5 के अनुमानों - संयुक्त 8 तख्ते.

Representative Results

पहले से 13,22 सूचना मिली थी के रूप में organotypic टुकड़ा व्यवहार्यता लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज गतिविधि, propidium आयोडाइड लेबलिंग, और dUTP धुंधला के साथ नजर रखी जा सकता है. जाहिर है, स्लाइस की व्यवहार्यता और अखंडता को जन्म दिया आनुवंशिक कार्गो की लंबी अवधि के निरंतर अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण हैं. Organotypic स्लाइस में biolistic प्रसव के बाद, फ्लोरोसेंट heterologous जीन की अभिव्यक्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी थी. संशोधित बैरल का उपयोग biolistic प्रसार की तंगी चित्रा 3 ए में देखा जा सकता है. चित्रा 3B डीएनए लेपित सोने के नैनोकणों का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के एक प्रतिनिधि छवि को दर्शाता है. 4 ट्रांसफ़ेक्ट वयस्क माउस organotypic स्लाइस के प्रतिनिधि चित्रों से पता चलता है. चित्रा -4 ए, Purkinje परत के इंटरफेस और प्रमाणपत्र की आणविक परत में पाया एक उल्लेखनीय वृक्ष के समान बंदरगाह के साथ एक Purkinje न्यूरॉन में देखा जा सकता हैebellum pEGFP-N1 साथ क्षणिक biolistic अभिकर्मक निम्नलिखित स्पष्ट लेबलिंग से पता चलता है. 4B चित्रा कांटा मनाया जा सकता है, जहां इन डेन्ड्राइट के एक उच्च बढ़ाई दिखाता है. चित्रा 4C pDSredFP लेपित सोने के नैनोकणों के biolistic डिलीवरी निम्नलिखित हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में पाया एक पिरामिड सेल से पता चलता है .

बजाय फ्लोरोसेंट इनकोडिंग डीएनए cargos के रंगों भी organotypic स्लाइस में लक्षण कल्पना करने के लिए एक समान तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है. प्लाज्मा झिल्ली लेबल जो डियो,, और अधिक तेजी से व्यक्तिगत सेल morphologies चित्रित कर सकते हैं या regioselection पुष्टि करने के लिए एक ही क्षेत्र के लिए दिया एक डीएनए लेपित biolistic के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 5A में देखा जा सकता है हिप्पोकैम्पस में डियो के साथ दाग एक न्यूरॉन भी कई कांटा के साथ लंबे समय डेन्ड्राइट से पता चलता है. एक तीर dentrit की तुलना में synaptic BOUTONS की उपस्थिति द्वारा की पहचान की है जो अक्षतंतु इंगित करता हैआईसी अन्य neurites पर कांटा. चित्रा 5 ब नाभिक लेबल करने के लिए. चित्रा 5C कई कांटा के साथ समानांतर डेन्ड्राइट के इन प्रकार के एक उच्च बढ़ाई पता चलता है एक DAPI काउंटर दाग के साथ कई हिप्पोकैम्पस अनुमानों पर प्रकाश डाला गया है, जो सीए 1, का एक और उदाहरण से पता चलता है.

जाहिर है, इन छवियों सेलुलर लेबलिंग निम्न लक्षण वर्णन. कुछ भी नहीं सोना नैनोकणों पर लेपित exogenous जीन के किसी भी नंबर देने के लिए लागू किया जा रहा से एक ही पद्धति precludes. सफल अभिकर्मक के एक दृश्य पुष्टि अनुमति देने के लिए, एक ही प्लाज्मिड ब्याज की जीन और एक ही वेक्टर पर एक फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन दोनों सह व्यक्त करने के लिए निर्माण किया जा सकता.

चित्रा 1
चित्रा 1 जीन बंदूक बैरल और बढ़ते. (ए) में सुधार कण त्वरण के लिए आवश्यक दबाव को कम से ऊतकों को नुकसान को कम करता है कि एक प्रतिबंधित biolistic फैल गया है कि मलेरिया अनुसंधान केंद्र-LMB पर डॉ ओ 'ब्रायन द्वारा विकसित डी बैरल. (बी) के एक अनुकूलित जीन बंदूक की तरफ देखने डॉ हेंडरसन द्वारा विकसित बढ़ते और टोरंटो विश्वविद्यालय में डॉ एनड्रास नागी. बढ़ते ठीक 90˚ organotypic स्लाइस को सीधा सही रूप biolistic डिलीवरी की दूरी को नियंत्रित करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति है, जबकि कम से जीन बंदूक रखती है. इष्टतम biolistic स्थितियों के लिए बैरल एपर्चर organotypic स्लाइस से एक 10 मिमी दूरी पर ब्याज के क्षेत्र पर सीधे रखा जाना चाहिए. बढ़ते जीन बंदूक (सी) पीछे देखें. ट्रांसफ़ेक्ट हो हित के क्षेत्र बैरल एपर्चर नीचे सीधे रखा जाना चाहिए. लक्ष्य निर्धारण डाई (diolistic) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन tranfection (biolistic) के साथ की पुष्टि की जा सकती है.ANK "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 Organotypic स्लाइस तैयारी और regioselective लक्ष्यीकरण. (ए) टुकड़ा करने की क्रिया के लिए तैयार एक DMEM एम्बेडेड वयस्क माउस मस्तिष्क. (बी) ढालना एक टुकड़ा काट करने के लिए तैयार ब्लेड के साथ बढ़ते vibroslicer पर चिपका था. (सी) Regioselective heterologous जीन अभिव्यक्ति राज्याभिषेक organotypic मस्तिष्क स्लाइस में biolistic डिलीवरी के लिए रणनीति. एलन ब्रेन एटलस संरचनात्मक संदर्भ एटलस 23 से प्राप्त चित्रों से तैयार छवियां. बाएं पैनल एक उदाहरण के रूप में लक्षित दो अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से पता चलता है. बाएँ गोलार्द्ध के cortical क्षेत्र के लिए जीन अभिव्यक्ति (1) को प्रतिबंधित करने के लिए. मस्तिष्क के हाइपोथैलेमस क्षेत्र को heterologous जीन अभिव्यक्ति (2) को प्रतिबंधित करने के लिए. मध्य पैनल था पता चलता हैदो heterologous जीनों की अभिव्यक्ति टी (3 और 4) पृथक और अनिवार्य रूप से प्रभाव से बाहर का crosstalk को संबोधित करने की संभावना विभिन्न वर्गों का उपयोग और / या देने से किसी भी पूर्वाग्रह को नष्ट करने, एक ही organotypic टुकड़ा में दो गोलार्द्धों के हिप्पोकैम्पस तुलना की जा सकती है उन जीनों. राइट पैनल एक और जीन (6) एक असमान में अभी तक अतिव्यापी कॉर्टिकल क्षेत्र व्यक्त करते हुए ट्रांसजेनिक प्रसव की संभावित ओवरलैप एक सटीक cortical क्षेत्र में पहली बार जीन (5) को व्यक्त करने से पता चलता है. यह एक ही टुकड़ा भीतर संयोजन में अकेले और भी प्रत्येक heterologous जीन की आनुवंशिक मॉडुलन के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 biolistic बिखराव पैटर्न filt पर देखाएर कागज और कम बढ़ाई छवि. (ए) में सुधार बैरल सोने के कणों के प्रसार को निर्धारित करने के लिए फिल्टर पेपर पर निकाल दिया गया था. सही पैनल सामान्य बैरल से पता चलता है, जबकि बाईं ओर सुधार बैरल के वितरण से पता चलता है. काली पट्टी: 1 सेमी. छवि, एट अल. ओ 'ब्रायन से लिया biolistic फैल 6 सप्ताह पुरानी चूहों के हिप्पोकैम्पस क्षेत्र में 3 मिमी के भीतर स्टोकेस्टिक अभिकर्मक गपशप दिखा 17. (बी) कम बढ़ाई छवि. सफेद पट्टी:. 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
6 सप्ताह पुरानी चूहों के organotypic स्लाइस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन इनकोडिंग डीएनए की चित्रा 4 biolistic डिलीवरी. (ए) inverteएक pEGFP-N1 लेपित सोने के कणों ट्रांसफ़ेक्ट Purkinje सेल के सेरिबैलम की एक निश्चित organotypic टुकड़ा के डी confocal छवियों. छवि 40X बढ़ाई लिया गया था. काली पट्टी:. 30 माइक्रोन (बी) कांटा उजागर करने के लिए एक और Purkinje सेल के dentritic बंदरगाह के एक 60x बढ़ाई दिखाता है. काली पट्टी:. 5 माइक्रोन (सी) DSredFP पिरामिड कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट चार के 60x बढ़ाई हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से ली तय स्लाइस की एक confocal छवि दिखाता है. काली पट्टी:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
Organotypic स्लाइस में झिल्ली लेबलिंग फ्लोरोसेंट रंगों की चित्रा 5 Diolistic वितरण. (ए) एक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन एल के लाइव इमेजिंग से पता चलता है20X बढ़ाई तहत डियो के साथ abeled. dentritic कांटा स्पष्ट रूप से dentritic कांटा के अभाव और एक सफेद तीर द्वारा संकेत synaptic BOUTONS की उपस्थिति से पहचान के रूप में अक्षतंतु के रूप में भी देखा जा सकता है. सफेद पट्टी:. हिप्पोकैम्पस क्षेत्र डियो के साथ लेबल और DAPI साथ counterstained के 30 माइक्रोन (बी) उच्चारण धुंधला. सफेद पट्टी:. हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में पाया dentritic कांटा के 30 माइक्रोन (सी) उच्च आवर्धन (60X). सफेद पट्टी:. 5 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल एक बढ़ाया जीन बंदूक का उपयोग कर वयस्क organotypic स्लाइस में रंगों और आनुवंशिक सामग्री वितरित करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करता है. मूलतः, रंगों के प्रकार और संभव जीनों की विविधता जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब देने के लिए इस विधि बहुमुखी और उत्तरदायी बनाने के. विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र को इस मामले में इस्तेमाल किया regioselective वितरण पद्धति, एक जैविक रूप से प्रासंगिक वास्तुकला के भीतर स्थानीय क्षेत्रों के heterologous जीन मॉडुलन के रूप में प्रयोग के लिए नए रास्ते खोलता से पहले आसानी से संभव नहीं रहा है. हम पहले इस विधि का यह कई सप्ताह 13 के लिए बेहतर सेल अस्तित्व और heterologous जीन अभिव्यक्ति से पता चला है के रूप में परिपक्व synapses पूरी तरह से बनते हैं जहां वयस्क organotypic स्लाइस, पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि निर्धारित किया है. स्तनधारी दिमाग के लिए नए और बेहतर संस्कृति शर्तों के साथ ही अन्य ऊतकों के आगमन के साथ, regioselective आनुवंशिक modulations का उपयोग bioche की एक विस्तृत विविधता के लिए तेजी से उपयोगी हो जाएगाmical का विश्लेषण करती है.

हम दूसरों के 24 से उल्लेख यहाँ और पहले से प्रकाश डाला जाएगा, कई विभिन्न कारकों आसानी biolistic डिलीवरी की सटीकता और विश्वसनीयता को प्रभावित कर सकता है. सबसे पहले, रंग या डीएनए से जुड़ा हुआ सोना कण की तैयारी पर्याप्त रूप से एकत्रीकरण को रोकने के लिए और कारतूस कार्गो निष्कासन की सुविधा के लिए संतुलित किया जाना चाहिए. डीएनए सोने सूक्ष्म कणों समाधान में कैल्शियम और spermidine सोना नैनोकणों के लिए डीएनए अणु के बंधन सहायता कर सकते हैं. कम दबाव के तहत कोशिकाओं घुसना नैनोकणों के लिए क्षमता पहले से 17 निर्धारित किया गया था. दूसरे, जीन बंदूक सही कोण और दूरी के साथ संभव के रूप में स्थिर रखा जा चाहिए. एक विश्वसनीय दबाव गेज ऊतक अखंडता बनाए रखने के लिए, और ठीक से अपने निर्धारित लक्ष्य को सोने के कणों में तेजी लाने के लिए, यह भी reproducibility के लिए आवश्यक है. दरअसल, उपकरणों की दूरी, अभिविन्यास, और स्थिरता भी टी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हैंargeting और regioselective वितरण की शुद्धता. इन मस्तिष्क संरचना बहुत छोटे हैं, फायरिंग कोण में मामूली बदलाव आसानी से पूरी प्रक्रिया में कम विश्वसनीय प्रदान सकता है. और अंत में, तैयारी और व्यवहार्य organotypic स्लाइस के रखरखाव के विभिन्न जानवरों, मस्तिष्क क्षेत्रों, उम्र और cocultures के लिए अभी तक प्रचुर मात्रा में और विश्वसनीय प्रोटोकॉल वर्तमान 2,4,25,26 उपलब्ध हैं कई दशकों के लिए कठिनाइयों से भरा गया है. इन प्रक्रियाओं उपयोगकर्ता अनुकूलित biolistic प्रक्रियाओं के ऊतकों प्रस्तुत करने से पहले होना चाहिए. यह और अधिक आसानी से unbiasedly biolistic कणों के प्रभाव और अपने स्वयं संस्कृतियों पर heterologous जीन के प्रभाव का पता लगाने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति होगी. यह अंत करने के लिए, ऐसे EYFP और EGFP रूप फ्लोरोसेंट जीन के उपयोग को लक्षित परिशुद्धता परीक्षण और भी समय 13 के एक निरंतर अवधि में heterologous जीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से सेलुलर व्यवहार्यता का पालन करने के लिए एक उपन्यास उपयोगकर्ता की अनुमति कर सकते हैं दोनों. विश्वसनीय के लिए महत्वपूर्ण कदम से कईऔर इस प्रोटोकॉल की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपयोग निम्नलिखित तीन पैराग्राफ में डाला जाता है.

कुशल अभिकर्मक के लिए, डीएनए एकाग्रता उपयुक्त होना चाहिए. बहुत अधिक हैं कि सांद्रता नैनोकणों के ढेर पैदा कर सकता है, जबकि बहुत कम हैं कि सांद्रता अभिकर्मक उपज में बाधा होगी. सोने का समुच्चय नाटकीय रूप से, अभिकर्मक दक्षता कम असमान वितरण के कारण, और वृद्धि की cytotoxicity और oxidative तनाव पैदा कर सकते हैं कर सकते हैं. Spermidine समाधान की समाप्ति के लिए (हर 2 से 3 महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए) के कारण कोटिंग दक्षता के साथ कोई समस्या होने की संभावना है. एक पर्याप्त biolistic प्रसार के लिए, लेबलिंग भी होना चाहिए. सोने nanoparticle / डीएनए निलंबन की एक गैर सजातीय लेबलिंग पीवीपी समाधान के कारण हो सकता है. यह भी हर 2 से 3 महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. सोने के नैनोकणों कोटिंग एक उच्च मेगावाट बैंड 27 के रूप में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर देखा जा सकता है.

प्रत्येक जैविक systजांच के तहत उन्हें और साथ ही अभिकर्मक और biolistic प्रसार के अनुकूलित स्तर तक पहुँचने के लिए गैस के दबाव में छोटे परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती इस्तेमाल किया प्रत्येक विभिन्न साधन. महत्वपूर्ण पैरामीटर प्लास्टिक कारतूस से सूक्ष्म या नैनो वाहक पट्टी और ऊतकों में उन्हें प्रेरित करने के लिए आवश्यक हीलियम नाड़ी का दबाव है. यह लक्ष्य भर में सदमे तरंगों बना सकते हैं और बाधित या मैट्रिक्स 17 से ऊतक अलग होगा क्योंकि एक उच्च गैस दबाव, सेल अस्तित्व को प्रभावित करेगा. जीन बंदूक बैरल लक्ष्य और बिल्कुल सीधा ऊतक को तंत्र होने के सटीक biolistic डिलीवरी के लिए महत्वपूर्ण है. चयनित क्षेत्र बाहरी एपर्चर से ठीक 10 मिमी प्रति बैरल के प्रत्यक्ष केंद्र में रखा जाना चाहिए. इस केंद्र के चारों ओर सोने के कण प्रसव के 3 मिमी व्यास में यह परिणाम है. जीन बंदूक बैरल प्रत्येक उपयोग के बाद 70% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए. बड़े कण समुच्चय से ऊतक की रक्षा करने के लिए, प्रति बैरल भी थानेदार कि एक नायलॉन जाल शामिलअनुकूलतम प्रदर्शन को बनाए रखने के लिए नियमित रूप से प्रतिस्थापित किया जा uld. बदलने के लिए आदेश में जाल टोपी तो टोपी और हे अंगूठी के बीच एक नया नायलॉन जाल डालने खोलना.

2 दिन उपरिकेंद्र के आसपास अभिकर्मक के बाद - fluorescently लेबल की कोशिकाओं में कम से कम 1 दिखाई जानी चाहिए. अभाव या लेबलिंग के misalignment जीन बंदूक बढ़ते की अपर्याप्त तैयारी और अस्थिरता से परिणाम कर सकते हैं. confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं की टिप्पणियों के लिए कई कारकों पर निर्भर करता है: / उत्तेजना उत्सर्जन प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, पिनहोल आकार, उद्देश्य लेंस के एनए, प्रकाश पथ में घटकों का अपवर्तनांक, ऊतक, और के संरेखण की गहराई साधन. इन कारकों में जांच के तहत प्रत्येक प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.

Biolistics हाल के अग्रिमों में इस विधि की सफलता के लिए शोषण किया गया. इस अध्ययन में इस्तेमाल जीन बंदूक बैरल आवश्यक दबाव को कम करने के साथ ही biolistic कीप के क्रम में संशोधित किया गया थाएक और अधिक विवश और विशिष्ट क्षेत्र 17,19 में बिखराव पैटर्न. अन्य बैरल संशोधनों biolistic प्रसार को सीमित और बहिर्वाह दबाव 28 को कम करने की कोशिश की है अभी तक डॉ ओ 'ब्रायन द्वारा डिजाइन इस कस्टम डिजाइन जीन बंदूक बैरल मानक Helios जीन बंदूक के लिए फिट एक घटक है. इसके बाद उप सुक्ष्ममापी सोने के कणों सेलुलर क्षति और अंत में, निरंतर heterologous जीन अभिव्यक्ति की हानि के कारण हम पहले से निर्धारित था कि माइक्रोमीटर कणों की invasiveness कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया. Biolistic प्रक्रिया के लिए ये परिवर्तन विधि 13 के समग्र व्यवहार्यता और reproducibility सुधार हुआ. ऐसे organotypic मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में में गहराई टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया का निवारण, मस्तिष्क की रक्षा करने के लिए एक DMEM-Agarose मैट्रिक्स का उपयोग, और कई अन्य उपयोगी अग्रिम के रूप में टुकड़ा तैयारी पर अन्य सुधार पहले 13 वयस्क स्लाइस के इस्तेमाल का पता लगाने के लिए सक्षम बताया कि परिपक्व विकसित किया हैsynaptic नेटवर्क.

हमारे अध्ययन में हम मुख्य रूप से अभिकर्मक दक्षता पर एक readout और छवि की क्षमता माउस मस्तिष्क के ऊतकों में न्यूरॉन्स के लक्षण के रूप में सेल आकारिकी कल्पना करने के लिए रंगों और फ्लोरोसेंट heterologous जीन का इस्तेमाल किया. एक परिभाषित दायरे में स्टोकेस्टिक प्रसव के शोर अनुपात करने के लिए संकेत पूरी तरह से अपने मूल संदर्भ में एक एकल कक्ष के dentritic बंदरगाह अलग करने के लिए हमें सक्षम. कई प्रयासों के इन लक्षण की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, मानचित्रण 'connectomics' या विभिन्न विश्लेषण के लिए एकल कक्षों लेबल करने के लिए, इस विधि आसानी से ऐसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और neurite माप 29,30 के रूप में मौजूदा प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है. जाहिर है, फ्लोरोसेंट heterologous जीनों के संयोजन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्टोकेस्टिक वितरण के रूप में एकल कक्षों की एक और अधिक मजबूत चित्रण सक्षम हो सकता है, और उनके संयोजन व्यक्ति की कोशिकाओं 31,32 के रंग का निर्धारण होगा. ऐसे synapsin और heterologous जीन एक्सॉन के अपस्ट्रीम glial fibrillary एसिड प्रोटीन के रूप में सेल विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग भी subpopulations 33 को अभिव्यक्ति सीमित कर सकते हैं. दरअसल, आनुवंशिक सामग्री की अंतहीन विविधता भी इस एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सोने के नैनोकणों से एक regioselective ढंग से दिया जा सकता है. कुल ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्रों इस प्रकार पारंपरिक तरीकों, ऐसे विच्छेदन के रूप में और heterologous जीन के स्थानीय प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए पश्चिमी immunoblotting के लिए उस क्षेत्र प्रस्तुत करने के साथ विश्लेषण किया जा सकता है.

Organotypic टुकड़ा प्रक्रियाओं में सुधार भी व्यापक लंबी अवधि के प्रयोग के लिए मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग के रूप में अच्छी तरह से परमिट के रूप में अन्य ऊतकों और cocultures के उपयोग की अनुमति होगी और अभिकर्मक प्रक्रियाओं में सुविधा होगी. लिपिड और बहुलक अभिकर्मक पहले 34 और अक्सर ते transfect करने के लिए बहुत कम क्षमता दिखाने झिल्ली समस्थिति, internalization, प्रोटीन पारगम्यता को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया हैrminally न्यूरॉन्स विभेदित. सेल विशिष्ट कार्गो लक्ष्यीकरण केवल internalization के लिए आवश्यक कोशिका की सतह रिसेप्टर्स व्यक्त कि कोशिकाओं को भी उत्तरदायी है, और इस विधि अत्यधिक चयनात्मक हो सकता है, यह regioselectivity 35 लक्षित कमी कर सकते हैं. वायरल वैक्टर अन्यथा, निर्माण करने के लिए अक्सर मुश्किल और महंगा हो कड़े नियमों की आवश्यकता होती है और इस अवसर पर सुरक्षा चिंताओं का प्रदर्शन किया. Biolistic वितरण इस प्रकार regioselectively व्यवहार्य ऊतकों के भीतर न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं transfect करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता है. सोने के गैर है biolistics के उपयोग में विषाक्त, आगे अग्रिम ऐसे transdermal दवा वितरण, noninvasive vivo में जीन वितरण, साथ ही स्थानीयकृत nonviral जीन चिकित्सा के रूप में जैव चिकित्सा का उपयोग करता है के लिए मार्ग प्रशस्त कर सके.

Acknowledgments

लेखकों बढ़ाया जीन बंदूक बैरल के उत्पादन के लिए एमआरसी-LMB कार्यशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी उपकरण और संसाधन के उपयोग के लिए टोरंटो विश्वविद्यालय में डॉ डेविड आर HAMPSON धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Helios gene gun system Bio Rad 165-2431 Gene gun and tube prep station
HEPES  Sigma 83264-100ML-F
NaCl Sigma S7653-250G
KCl Sigma P9333-500G
Na2HPO4 Sigma S7907-100G
KH2PO4 Sigma P9791-100G
0.2 µm sterile filter unit Millipore SCGPU05RE to filter media
DMEM Gibco 21885-025
Fetal calf serum Gibco 10270-098
D-Glucose Sigma G8270-100G
N2 Life Technologies 17502-048
Penicillin/Streptomycin Sigma p4333
Polyvinylpyrrolidone Sigma 856568-100G
Ethanol  Sigma 277649-100ML
Spermidine Sigma S2626
Agarose Bio Rad 161-3100EDU
Vibroslicer Laica VT1200 We used a custom design
Gene gun mount Built in house at U of T
Humidified cell culture incubator
Gold nanoparticles cytodiagnostics G-40-20
pEYFP-N1 Clontech
Tubing cutter Bio Rad 165-2422
Tefzel tubing Bio Rad 165-2441
Barrel Custom made by the LMB
Cell culture insert Millipore PICM0RG50
Paraformaldehyde Sigma 76240 Fluka
Dissecting microscope for convenience
Confocal microscope user defined for usage
Glass slide VWR 2588-CA48323-185
Microcover glass VWR 2448-CA48366-067-1
Vectashield mounting media Vector laboratories H-1400  

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References

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Regioselective biolistic एक संशोधित जीन बंदूक का इस्तेमाल Organotypic मस्तिष्क स्लाइसें में लक्ष्य निर्धारण
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Arsenault, J., Nagy, A., Henderson, J. T., O'Brien, J. A. Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun. J. Vis. Exp. (92), e52148, doi:10.3791/52148 (2014).More

Arsenault, J., Nagy, A., Henderson, J. T., O'Brien, J. A. Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun. J. Vis. Exp. (92), e52148, doi:10.3791/52148 (2014).

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