Abstract
Transfektion af DNA har været uvurderlig for biologiske videnskaber og med de seneste forskud til organotypiske hjerne skive præparater, kan effekten af forskellige heterologe gener således undersøges nemt samtidig opretholde mange aspekter af in vivo biologi. Der har været en stigende interesse for at transficere terminalt differentierede neuroner, for hvilke traditionelle transfektionsfremgangsmåder har været behæftet med vanskeligheder, såsom lave udbytter og betydelige tab i levedygtighed. Biolistisk transfektion kan omgå mange af disse vanskeligheder alligevel kun for nylig er denne teknik blevet modificeret, så det er modtagelig til anvendelse i mammale væv.
Nye ændringer speederen kammer har forbedret genkanonen fyring nøjagtighed og øget sine dybder penetration samtidig tillader anvendelse af lavere gastryk (50 psi) uden tab af transfektionseffektiviteten samt tillader en fokuseret regioselektiv spredning af paRTIKLER inden for 3 mm. Desuden er denne teknik er ligetil og hurtigere at udføre end kedelige microinjections. Både forbigående og stabil ekspression er muligt med nanopartikel bombardement hvor episomal ekspression kan detekteres inden 24 timer og den celle overlevelse viste sig at være bedre end, eller i det mindste svarer til, konventionelle metoder. Denne teknik har imidlertid en afgørende fordel: den tillader transfektion at være lokaliseret i en enkelt behersket radius således at brugeren anatomisk isolere heterologe gen virkninger. Her præsenterer vi en grundig protokollen til at forberede levedygtige voksne organotypiske skiver og indsende dem til regioselektive transfektion ved hjælp af en forbedret gen pistol.
Introduction
Oprindeligt biolistiske teknik, en turn-of-sætning til "biologiske ballistik", blev oprettet med partikel-medieret genoverførsel i planteceller 1. Denne fysiske metode celletransformation accelererer mikro- eller nanopartikler ved høj hastighed for at overvinde de fysiske barrierer i det uigennemtrængelige cellemembraner for at levere laster, såsom DNA eller farvestoffer. Fordi det ikke er afhængig af specifikke ligand-receptorer og / eller biokemiske egenskaber på celleoverfladen membraner, kan partikel-medieret genoverførsel let anvendes til en række af biologiske systemer som organotypiske hjernesnit.
Brug organotypiske skiver har fordele i forhold til andre in vitro-platforme, da de opretholder mange anatomiske og biokemiske egenskaber, der er relevante for in vivo biologi 2-4. Skiverne meste bevare de lokale arkitektoniske karakteristika fra, hvor de har oprindelse og preserve neurokemiske aktivitet og tilslutning af synapser. Brugen af hjerneskiver til grundforskning, og i farmaceutiske bestræbelser, har samtidig øges med antallet af mulige bioteknologiske manipulationer til at måle og overvåge neurobiologiske adfærd i hjernen i en in vivo ligesom sammenhæng 3,5-7. De store fordele ved at bruge organotypiske skive-baserede assay-systemer er, at det giver nem eksperimentel kontrol og tillader præcise manipulationer af ekstracellulære miljøer.
Frugtbart, har organotypisk skive kultur systemer er etableret fra en række forskellige områder af hjernen, såsom, men ikke begrænset til, cortex, rygmarv, og lillehjernen 8-10. Desuden er der påvist en række cokulturer, som giver mulighed for vurdering af intercellulære kommunikation på tværs distale hjerneregioner samt mellem neuroner og patologiske celler 11,12. Mange protokoller er allerede blevet etableret for at successfully kultur organotypiske skiver og kan opretholde langsigtede rentabilitet og mange nyere undersøgelser nu udnytte de membran-interface metoder og forskellige modifikationer af det 13. Dette princip fastholder de organotypiske skiver på grænsefladen mellem mediet og inkubatoren er fugtig atmosfære ved at placere skiver på en porøs membran-filter. Mediet kan således give tilstrækkelige næringsstoffer til at fodre organotypiske skiver via kapillær bevægelse. Typisk skiver er blevet fremstillet fra begyndelsen af postnatale dyr (3 - 9 dage gamle P3 - 9). Imidlertid hjernevæv fra disse skiver vise et højt niveau af cellulær plasticitet og har en iboende modstandsdygtighed over for mekaniske påvirkninger, som er nyttige til opnåelse af levedygtige kulturer, men modne synapser og neuroanatomiske kredsløb har ikke fuldt udviklet in vivo indtil 2 til 3 uger gamle 14. For eksempel havde tidligere bemærkninger vist, at hippocampusskiver opnået fra P0 - 1 nyfødte, selvom meget viaBle efter tilberedningen efterhånden mistet nogle morfologiske karakteristika. Væsentlige, blev de vist sig at være uegnede til langvarige kulturer tyder umodne celler var mere tilbøjelige til at de-differentiere i forhold til organotypiske kulturer fra ældre dyr 15,16. Af denne grund vores metode er blevet optimeret for voksne organotypiske hjerneskiver hvor modning og arkitektoniske udvikling har nået deres terminale fase 13,17-21. Ikke desto mindre er denne metode er også egnet til nyfødte og unge organotypiske skiver.
Når man har produceret de levedygtige organotypiske skiver hele pladen indeholder skiverne kan bringes til biolistiske mount og indsendes til regioselektive levering og transfektion. Korrekt montering af genkanonen (som beskrevet i figur 1), orienteret 90 ° i en afstand på 10 mm direkte over skiverne (fra åbningen til væv), tillader den hurtige biolistisk levering af de 40 nm gåld partikel belagt laster. Disse laster såsom farvestoffer og fluorescerende DNA-vektorer, såvel som enhver gen af interesse, let leveres til de levedygtige skiver med lethed. Beskriver denne metode således protokollen er nødvendige for at levere, i en regioselektiv måde, fragt belagt guld nanopartikler til levedygtige organotypiske hjerneskiver. Genet geværløbet og optimal montering kan ses i figur 1. For yderligere oplysninger om de forbedrede tønde og nanopartikler ballistik, se O'Brien et al. 17..
Efterfølgende forbedringer er også angivet for brugeren at optimere forhold som den rette mængde guld leveret pr målområdet, defineret som microcarrier Loading Mængde (MLQ), og for at bestemme mængden af DNA indlæst per mg guld, defineret som DNA Loading Ratio (DLR). Forud for bundfældning af DNA på guldpartikler og lægger dem i Tefzel slanger, der omfatter selve gen pistol 'patroner9 ;, er det nødvendigt at beregne mængden af DNA og guld kræves for hver transfektion, som kan adskille sig lidt væv og forhold (forholdet bør holdes mellem 1 mg guld og 1 ug DNA til 1: 5). Det er vigtigt at forberede den korrekte andel af MLQ DLR andet DNA coatede guldpartikler kan klæbe sammen danner større end forventet byområde, hvilket kan reducere den samlede homogenitet biolistiske spredning samt øge vævsskade og cytotoksicitet.
Denne metode viser de seneste forbedringer i biolistisk levering, som er testet og bestemt til at være modtagelig for neonatale, unge og voksne organotypiske hjerneskiver. Endvidere, ved at udnytte gen geværløbet reducerede biolistisk spredning, brugeren er nu i stand til selektivt at transficere en punktlig region i hjernen. Efter passende inkubationstid, ekspressionen af de fluorescerende proteiner, der når sin maksimale satserne mellem 24 og 48time, kan visualiseres ved epifluorescens og konfokal mikroskopi. Disse fluorophorer tillade morfologisk analyse og lokalisering af de enkelte celler i biologisk relevante strukturer. Imidlertid kan regioselektive graduering af de organotypiske skiver af andre heterologe gener også blive overvåget af andre forsøg modtagelige for disse præparater. Mulige arbejder strategier for lokal levering af gener er vist i figur 2.
Protocol
Anvendelsen af dyr og animalske væv, bør strengt til etisk komité godkendelse i henhold til de lokale regler og regulering. Alle væv opnået under denne undersøgelse klæbet til MRC-LMB har dyreforsøg retningslinjer.
1. Fremstilling af Materialer & Kultur Medier
- Forbered alle løsninger ved hjælp af Millipore vand; kun bruge analytiske reagenser. Forberede og gemme alle reagenser ved stuetemperatur (medmindre andet er angivet).
- Lav 500 ml HEPES-bufret saltvand (10 mM HEPES, 120 mM NaCl, pH 7,2). Filtreres gennem et 0,2 um sterilfilter enhed. Opbevares ved 4 ° C.
- Lav 500 ml phosphatbufret saltvand (PBS, 10 mM Na-2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH 7,4). Der steriliseres ved autoklavering.
- Forbered neuronal medium ved at supplere DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium) med 25 mM HEPES, 10% føtalt kalveserum, 30 mM glucose, 1: 100 N2 supplement, penicillin-streptomycin 1.100 U / ml; pH 7,2. Filter med en 0,2 um sterilfilter enhed. Opbevares ved 4 ° C.
- Gør polyvinylpyrrolidon (PVP) stamopløsning med 20 mg PVP i 1 ml 100% ethanol. Alikvot dette i 1 ml mængder, fryse og opbevares ved -20 ° C. Arbejde opløsning er 0,05 mg / ml, derfor tilsættes 10 ul PVP stamopløsning til hver 4 ml 100% ethanol.
- Forbered en 0,05 M spermidin stamopløsning i Millipore vand; justere pH til 7,2.
- Lav en 2% agaroseopløsning i DMEM (2 g agarose af elektroforesekvalitet i 100 ml DMEM i en steriliseret skruelåg flaske). Microwave dette indtil agarosen er opløst. Opbevar i 4 ° C køleskab i flere uger, hvis det er nødvendigt.
2. Fremstilling af organotypisk Skiver
- Aflive C57 Sort 6 mus af den ønskede alder ved CO 2 kvælning efterfulgt af halshugning. Fjern hjernen ved hjælp af laterale kraniet nedskæringer starter ved foramen magnum og slutter vedolfaktoriske lapper. Løft forsigtigt kraniet bagfra at udsætte hjernen.
- Klip mellem de olfaktoriske lapper og frontale cortex og rostralt til lillehjernen. Løft forsigtigt rostrale del af hjernen og skære de optiske nerver. Endelig fjernes hjernen og placere den i en petriskål fyldt med iskoldt HEPES saltvand på is.
- Ved hjælp af et dissektionsmikroskop, skræl væk pia hjælp fine tænger; forsigtigt fjerne blodkar og meninges omkring hjernen.
- Placer friske hjerne ind i en lille modtager mug og dække det med agaroseopløsningen afkølet til lidt over stuetemperatur. Så hurtigt at afkøle formen til 4 ° C ved at anbringe den på is.
BEMÆRK: Proces skiverne så hurtigt som muligt for at undgå tab af levedygtighed. - Når agarosen er indstillet (5 - 10 min), fjern agarose-embedded hjerne fra formen (trim om nødvendigt), og derefter lim det til vibroslicer platformen. Placer dette i en vibroslicer kammer indeholdende steril iskold PBS. Disinfect den vibroslicer kammer inden den anvendes med 70% ethanol for at minimere efterfølgende forureninger.
- Skær hjernen ved hjælp af en specialbygget vibroslicer eller kommerciel tilsvarende. Modellen koncept var at designe et væv pålægsmaskine, der kunne generere stor amplitude og høj frekvens bevægelser vandret til kanten af bladet og samtidig minimere lodrette svingninger.
- Brug oscillationsfrekvens på 90 Hz med en amplitude på 1,5 - 2,0 mm, og skærebladet anbragt i en vinkel på 15 ° i forhold til vandret plan; indstille monteringsblokken holder agarose-embedded hjernen til at bevæge sig 1,7 mm / min imod kniven. Saml sektioner (150 um) i et kammer indeholdende iskold dyrkningsmedium (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Se skæring og manipulation af vævssnit som en supplerende video i Arsenault og O'Brien 13.
- Anbring forsigtigt skiverne i cellekultur skær (0,4 um, en diameter på 30 mm) i en 6 multi-brønds bakke med kulturen withbl.a. på ydersiden af indsatsen, og der inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: For korrekt vævslevedygtighed, være meget blid mens overførsel og manipulere skiver. Desuden vil for meget væske forhindre organotypiske skiver klæbe til membranen af filterindsatsen. Hvis dette sker, skal du fjerne den overskydende væske eller en plade igen. - Selvom organotypiske skiver kan dyrkes i et par uger, skal du fortsætte til transfektion senest 4 dage efter udpladning efter de bedste transfektionsreagenser udbytter.
BEMÆRK: For at undgå glial overvækst i dyrkningsbetingelser langsigtede, brug Arac eller serum frit medium 2.
3. Fremstilling af DNA-coatede Micro & Nano-projektiler
- Forbered nano-projektiler ved hjælp af 40 nm i diameter guldpartikler. Kort fortalt tilsættes 50 ul 0,05 M spermidin og 10 pi DNA ved 1 mg / ml (pEYFP-N1) til 10 mg guldpartikler.
- Tilføj calcium og spermidin i opløsningen blandingratur under DNA-guld mikro partikler forberedelse for at hjælpe i binding af DNA-molekyler til nanopartiklerne af guld.
BEMÆRK: Mængden af DNA anvendt per mg guld luftfartsselskaber (DLR), bør ligge mellem 1 og 5 ug DNA pr 1 mg guld. Desuden er mængden af guld bærerpartikler, der vil blive skudt per patron (MLQ), bør selv i området fra 0,1 til 0,5 mg af guld. DLR og MLQ bør være forsøgt og optimeret for hver bruger, afhængigt af det særlige system, der undersøges, samt type partikel og genpistol anvendes.
- Tilføj calcium og spermidin i opløsningen blandingratur under DNA-guld mikro partikler forberedelse for at hjælpe i binding af DNA-molekyler til nanopartiklerne af guld.
- Bland ved hjælp af en hvirvel under langsom tilsætning af 50 pi 1 M CaCl2 i fraktioner af 10 - 15 ul. Efter 5 min af lejlighedsvis vortexbehandling centrifugeres ved 1.000 xg i 30 sek og fjern supernatanten. Resuspender guldpartikel pellet i 3,5 ml 0,075 M PVP.
- Tegn denne suspension i rørledningen (2,36 mm indvendig diameter) under anvendelse af en sprøjte. Placer røret i slangen forberedelse station. Ladguldpartikler at bosætte sig og fjern supernatanten ved aspiration med en sprøjte. Drej slangen til jævnt fordelt guldpartiklerne, der efterfølgende blev tørret under en konstant nitrogenstrøm på 5 l pr min.
- At skabe DNA-kugler, skære slangen ved hjælp af en slange kutter i 1 cm længder. Sæt enten straks i genkanonen patron eller holde udtørret (4 ° C), indtil behov.
4. Biolistic Transfektion på organotypisk Skiver
- Udfør følgende trin i en steril laminar flow hætte.
- Sæt et 9 V batteri og en tom patron holderen i Helios gen pistol.
- Fastgør genkanonen til helium tank med helium slange. Fire 2 - 3 blanke (tomme pladser) ved 50 psi til tryk helium slange og reservoirer i pistolen.
- Læg kassetterne indeholder DNA-coatede guld ind i patronen indehavere og indlæse holderen i gen pistol.
- Skru genkanonen afstandsstykke og vedhæftedet modificerede gen bøsseløb til genkanonen.
- Ved hjælp af steril pincet, placere en filterindsats, der indeholder den organotypiske skive i en steril plastik skål.
- Fjern medier fra organotypiske skiver.
- Indstil gastrykket ved 50 psi.
BEMÆRK: Øjenbeskyttelse er afgørende, og høreværn tilrådeligt. - Placer genkanonen på passende afstand ved hjælp af montering målt til 10 mm. Omhyggeligt sigte centrum af cylinderen over det ønskede område for genetisk levering.
- Efter brændingen udskifte skærene tilbage i deres skål med friske medier og returnere dem til normale vækstbetingelser, dvs 37 ° C med 5% CO 2 inkubator.
- Når færdig, skal du lukke heliumtank Slip pres fra genkanonen og tag genkanonen fra helium tank.
- Fjerne kassetteholderen og kassér patronerne og rense genkanonen.
- Kontroller væv til morfologi og for en vellykket gennemtrængning af udstyr og forretnilisering skiver under anvendelse af et omvendt mikroskop. Hvis der anvendes mikropartikler, jævnt sprede guld; bør der ikke være tætte områder af guldpartikler set på skive. Nanopartikler på grund af deres lille størrelse kan ikke ses som enkelte enheder ved konventionelle mikroskopi teknikker.
- Efter passende tidsinterval (normalt 1 - 2 dage), fastsætte de skiver i 4% paraformaldehyd (PFA) til mikroskopi observation.
BEMÆRK: Fastsættelse i PFA er ikke altid ønsket. For levende celler undgå dette trin.
5. Fastsættelse og Visualisering af hjerneskiver
- Efter biolistisk transfektion vaskes skiver to gange i PBS i 2 minutter.
- Fix skiver ved at inkubere i frisk gjort, iskold 4% PFA i PBS i 20 minutter.
- Vask skiver to gange i PBS i 2 minutter.
- Forsigtigt skære rundt membranen støtter ved hjælp af en skalpel, uden at forstyrre skiver monteret på dem. Brug pincet til at placere hver membran support / skive på et objektglas. Hvile organotypic skiver på toppen af membranen på objektglasset.
- Tilsæt en dråbe montering medier oven på skive og tilføje et dækglas forsigtigt uden nogen kraft direkte i kontakt med organotypiske skive.
- Fastgør dækglasset med et tyndt lag af neglelak.
- Se skiverne på en passende mikroskop.
6. Konfokale Applikationer
- Visualiser skiverne ved hjælp af en opretstående scanning laser konfokal mikroskop med en 60X / 1,4 numerisk åbning (NA) olieimmersion objektiv.
BEMÆRK: Det mest problematiske træk ved den konfokale mikroskop er pinhole størrelse (fastsat til den 1. AU), som er i stand til at isolere og indsamle et fly af fokus, således at eliminere ud af fokus 'tåge' normalt ses med et fluorescerende prøve. Fine detaljer er ofte skjules af denne tåge og ikke kan påvises i en nonconfocal mikroskop. - Indstil Argon laser til en excitationsbølgelængde på 488 nm og optimere til indsamling af emitted lys i 500 til 520 nm-båndet. Typisk indsamle billeder på 1.024 x 1.024 pixels, og med stakke af z-sektioner på 0,5 um mellemrum for at omfatte hele bredden af hver nerve celle, der blev analyseret.
- At observere morfologi af kernen, tæller plette disse celler med DAPI (excitationsbølgelængde sat ved 405 nm og emission lys opsamlet mellem 420-4 40 nm). Endelig for behandlingen rød fluorescens, indstille laseren på 561 nm for excitation og 565-620 nm for emission.
- Typisk erhverve billeder ved at bruge en 4X scanning zoom, der dækkede et område på 57,6 um 2; billed størrelser var i størrelsesordenen 1.024 x 1.024 pixels. Optag stakke af z-sektioner i 0,5 um intervaller og fremskrivninger af 5-8 frames tilsammen.
Representative Results
Organotypiske skive levedygtighed kan overvåges med lactatdehydrogenaseaktivitet, propidiumiodid mærkning og dUTP farvning som tidligere rapporteret 13,22. Åbenbart, levedygtighed og integritet skiverne er vigtige for den langsigtede vedvarende udtryk for den leverede genetiske last. Efter biolistisk afgivelse til de organotypiske skiver blev ekspressionen af det fluorescerende heterologe gen kontrolleres ved konfokal mikroskopi. Tæthed biolistisk spredning anvendelse af den modificerede tønde kan ses i figur 3A. 3B viser et repræsentativt billede af den transficerede hippocampus-regionen ved hjælp af DNA-coatede guld nanopartikler. Figur 4 viser repræsentative billeder af transficerede voksen mus organotypiske skiver. Som det kan ses i figur 4A, en Purkinje neuron med en bemærkelsesværdig dendritisk havn findes ved grænsefladen Purkinje lag og den molekylære lag af cerebellum viser udtalt mærkning efter forbigående biolistisk transfektion med pEGFP-N1. 4B viser en større forstørrelse af disse dendritter hvor pigge kan observeres. Figur 4C viser en pyramideformet celle findes i CA1-regionen i hippocampus efter biolistisk afgivelse af pDSredFP overtrukne nanopartikler af guld .
Farvestoffer stedet for fluorescerende kodet DNA-ladninger kan også anvendes på en lignende måde at visualisere morfologiske karakteristika i organotypiske skiver. DiO, hvilke etiketter plasmamembranerne kan hurtigere afgrænse individuelle celle morfologier eller kan anvendes i forbindelse med en DNA-overtrukket biolistisk leveret til samme region for at bekræfte regioselection. Som det kan ses i figur 5A en neuron farvet med DiO i hippocampus viser også lange dendritter med mange pigge. En pil angiver Axon, som er identificeret ved tilstedeværelsen af synaptiske boutons i forhold til dentritic pigge på de andre neuritter. Figur 5B viser et andet eksempel på CA1, hvilket understreger talrige hippocampale fremspring med DAPI tæller plet at mærke kernen. Figur 5C viser en større forstørrelse af disse typer af parallelle dendritter med mange pigge.
Åbenbart, disse billeder viser morfologiske karakteristika efter cellulær mærkning. Intet er til hinder for den samme metode i at blive anvendt til at levere et vilkårligt antal exogene gener coatet på guld nanopartikler. For at muliggøre en visuel bekræftelse på vellykket transfektion kan et enkelt plasmid konstrueres til at co-udtrykke både genet af interesse og en fluorescerende reporter protein på den samme vektor.
Figur 1. Gene geværløbet og montering. (A) forbedre d tønde udviklet af Dr. O'Brien ved MRC-LMB, der har en begrænset biolistisk spredning, der minimerer vævsskade ved at sænke det nødvendige tryk til partikelacceleration. (B) Den side med henblik på optimeret genpistol montering udviklet af Dr. Henderson og Dr. Andras Nagy ved University of Toronto. Monteringen holder genkanonen på præcis 90˚ vinkelret på organotypiske skiver mens den tillader brugeren til præcist at styre afstanden biolistisk levering. For optimale biolistiske betingelser tromleåbning skal placeres direkte over regionen af interesse på en 10 mm afstand fra de organotypiske skiver. (C) Bagsiden af genkanonen montering. Regionen af interesse transficeres skal placeres direkte under blænde. Målretning kan bekræftes med farvestof (diolistic) eller fluorescerende protein tranfektion (biolistiske).ANK "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. organotypiske skive forberedelse og regioselektiv målretning. (A) en DMEM indlejret voksen musehjerne klar til udskæring. (B) Formen blev limet på vibroslicer montering med bladet klar til at skære en skive. (C) Regioselektiv heterolog genekspression strategier for biolistisk afgivelse til koronale organotypiske hjernesnit. Billeder fremstillet ud fra billeder opnået fra Allen Brain Atlas anatomiske referencepunkter atlas 23. Venstre panel viser to forskellige hjerneregioner målrettet som et eksempel. For at begrænse genekspression (1) til den korticale område af den venstre hemisfære. For at begrænse den heterologe genekspression (2) til hypothalamus region af hjernen. Midterste panel viser THAt udtryk for to heterologe gener (3 og 4) kan isoleres og sammenligner hippocampus af to hjernehalvdele i samme organotypisk skive væsentlige fjerne enhver partiskhed fra at bruge forskellige sektioner og / eller ydelse mulighed for at behandle distal krydstale fra virkningerne af disse gener. Højre panel viser den mulige overlapning af transgene levering til at udtrykke det første gen (5) i et præcist kortikal region, men udtrykker et andet gen (6) i en uensartet endnu overlappende kortikale område. Dette tillader at analysere effekten af genetiske modulation af hver heterologt gen alene og også i kombination inden for samme skive. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Biolistic scatter mønster ses på filtare papir og lav forstørrelse billede. (A) forbedrede tønde blev fyret på filtrerpapir til at bestemme udbredelsen af guldpartikler. Venstre side viser fordelingen af den forbedrede tønde, mens det højre panel viser den normale tønde. Sort bar: 1 cm. Billede taget fra O'Brien et al. 17.. (B) lav forstørrelse billede, der viser den stokastiske transfektion trommen inden for 3 mm biolistisk spredning inden for hippocampale region på 6 uger gamle mus. Hvidt bar:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Biolistic levering af fluorescerende protein, der kodes af DNA i organotypiske skiver af 6 uger gamle mus. (A) inverteD konfokale billeder af en fast organotypisk udsnit af lillehjernen af en pEGFP-N1 coatede guldpartikler transficeret Purkinje celle. Billedet blev taget ved 40X forstørrelse. Sort bjælke:. 30 um (b) viser en 60x forstørrelse af en anden Purkinje celles dendritiske havn at fremhæve de pigge. Sort bjælke:. 5 um (c) viser et konfokalt billede af faste skiver taget fra hippocampus-regionen ved 60x forstørrelse på fire DSredFP transficerede pyramideformede celler. Sort bjælke:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Diolistic levering af mærkning af membran fluorescerende farvestoffer i organotypiske skiver. (A) viser live billeder af en hippocampalt neuron labeled med DiO under 20X forstørrelse. De dendritiske pigge kan klart iagttages samt Axon som identificeres ved fraværet af dendritiske pigge og tilstedeværelsen af synaptiske boutons angivet med en hvid pil. Hvidt bar:. 30 um (B) Udtalte farvning af hippocampus region mærket med DiO og modfarvet med DAPI. White bar:. 30 um (C) Højere forstørrelse (60x) af de dendritiske pigge fundet i CA1-regionen i hippocampus. Hvidt bar:. 5 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen beskriver metoder til at levere farvestoffer og genetisk materiale til voksne organotypiske skiver ved anvendelse af et forstærket gen pistol. Væsentlige, de typer af farvestoffer og de mange forskellige mulige gener gør denne metode mangesidet og medgørlige til at besvare en lang række biologiske spørgsmål. Den regioselektive levering anvendte metode i dette tilfælde til specifikke område af hjernen, åbner nye muligheder for eksperimenter som heterologt gen graduering af lokaliserede områder inden for en biologisk relevant arkitektur har ikke været let at gøre før. Vi har tidligere bestemt, at denne metode kan anvendes på voksne organotypiske skiver, hvor modne synapser er fuldt dannet, da det viste forbedret celleoverlevelse og heterolog genekspression i mange uger 13. Med fremkomsten af nye og forbedrede dyrkningsbetingelser for mammale hjerner samt andre væv, vil brugen af regioselektive genetiske modulationer blevet stadig mere anvendelige til en bred vifte af BiocheMICAL analyser.
Som vi skal fremhæve her og tidligere nævnt af andre 24, kan mange forskellige faktorer let påvirke nøjagtigheden og pålideligheden af biolistisk levering. For det første skal fremstillingen af guldpartikler bundet til farvestoffer eller DNA tilstrækkeligt afbalanceret til at forhindre aggregering og lette patronen last udvisning. Calcium og spermidin i DNA-guld mikropartikler løsning kan hjælpe binding af DNA-molekyler til nanopartiklerne af guld. Muligheden for nanopartikler til at trænge ind i cellerne under reduceret tryk blev bestemt tidligere 17. For det andet skal genkanonen monteres så stabil som muligt med den korrekte vinkel og afstand. En pålidelig trykmåler er også nødvendig for reproducerbarhed, for at opretholde væv integritet, og til korrekt accelerere guldpartiklerne til deres tilsigtede mål. Faktisk afstand, retning og stabilitet af udstyret er også en afgørende faktorer for targeting og præcision regioselektiv levering. Da disse hjernens strukturer er meget lille, kunne mindre variationer i affyringen vinkel nemt gøre hele proceduren mindre pålidelige. Og endelig, udarbejdelse og vedligeholdelse af levedygtige organotypiske skiver har været behæftet med vanskeligheder i mange årtier endnu rigelige og pålidelige protokoller for forskellige dyr, hjerne regioner, aldre og cokulturer er i øjeblikket tilgængelige 2,4,25,26. Disse procedurer bør være brugervenlig optimeret inden fremlæggelsen servietterne biolistiske procedurer. Dette vil lettere tillade brugeren at unbiasedly fastslå virkningen af biolistiske partikler og virkningen af det heterologe gen på deres egne kulturer. Til dette formål, kan brugen af fluorescerende gener, såsom EYFP og EGFP både tillade en ny bruger til at teste målretning præcision og også følge den cellulære levedygtighed ved heterolog genekspression i en længere periode 13. Mange af de kritiske trin for pålideligog reproducerbar brug af denne protokol, er fremhævet i de følgende tre stykker.
Til effektiv transfektion, skal DNA-koncentrationen være passende. Koncentrationer, der er for lavt vil kunne hindre transfektion udbytte, mens koncentrationer, der er for høj, kan forårsage agglomerering af nanopartikler. Aggregater af guld kan dramatisk reducere transfektionseffektivitet forårsage ujævne fordelinger, og kan føre til øget cytotoksicitet og oxidativ stress. Problemer med belægning effektivitet er sandsynligvis på grund af udløbet af spermidin opløsning (skal udskiftes hver 2 til 3 måneder). For en tilstrækkelig biolistisk spredning, skal mærkningen være endnu. En ikke-homogen mærkning af guld nanopartikel / DNA-suspensionen kan skyldes PVP opløsning. Det skal også udskiftes hver 2 til 3 måneder. Belægning af nanopartiklerne af guld kan ses på agarosegelelektroforese som en højere MW-bånd 27.
Hver biologisk System, der undersøges, samt hver anden instrument, der anvendes kan kræve små ændringer i gastryk at nå optimerede niveauer af transfektion og biolistisk spredning. Den kritiske parameter er trykket af helium puls kræves for at fratage mikro- eller nano-bærere fra plasten patron og drive dem ind i vævet. Et højt gastryk vil påvirke celleoverlevelse, fordi den vil skabe chokbølger over målet og forstyrre eller fjerne væv fra matricen 17. Sigter genet geværløbet og under apparatet nøjagtigt vinkelret på vævet er vigtig for nøjagtig biolistisk levering. Det valgte område skal placeres i direkte centrum af tønden på præcis 10 mm fra den ydre åbning. Dette resulterer i en diameter på 3 mm af guldpartikler levering omkring epicentret. Genet geværløbet skal rengøres med 70% ethanol efter hver brug. For at beskytte væv fra store partikelaggregater, cylinderen indeholder også et nylonnet, der shoULD udskiftes jævnligt for at opretholde optimal ydeevne. For at erstatte masken skru hætten derefter indsætte en ny nylonnet mellem hætten og O-ringen.
Fluorescens-mærkede celler skal være synlige mindst 1 - 2 dage efter transfektion omkring epicentret. Manglende eller forskydning af mærkningen kan skyldes utilstrækkelig forberedelse og ustabilitet genkanonen montering. Observationerne af celler ved hjælp af konfokal mikroskopi afhænger af en række faktorer: bølgelængden af excitation / emission lys, pinhole størrelse, NA i objektivlinsen, brydningsindeks af komponenter i strålegangen, dybde af vævet, og tilpasning af instrumentet. Disse faktorer bør optimeres for hvert system, der undersøges.
Nylige fremskridt i biolistik blev udnyttet for succes i denne metode. Genet geværløbet anvendt i denne undersøgelse blev ændret for at mindske presset nødvendig samt tragt biolistiskescatter mønster i et mere begrænset og bestemt område 17,19. Andre tønde modifikationer har forsøgt at begrænse biolistiske spredning og mindske udstrømningen tryk 28 endnu denne specialfremstillede genkanon tønde designet af Dr. O'Brien er en enkelt komponent monteret på standard Helios Gene pistol. Efterfølgende blev sub-mikrometer guldpartikler anvendes til at reducere invasiv mikrometer partikler, som vi tidligere havde bestemt forårsagede cellulær skade og i sidste ende tab af vedvarende heterolog genekspression. Disse ændringer i biolistiske procedure forbedret den samlede gennemførlighed og metodens reproducerbarhed 13. Andre forbedringer på skive forberedelse såsom dybdegående fejlfinding af udskæring procedure, ved hjælp af en DMEM-agarosematrix at bevare hjernen, og mange andre nyttige fremskridt i organotypisk hjerne skive forberedelse tidligere rapporterede 13 muligt for os at udforske brugen af voksne udsnit, har udviklet modnesynaptiske netværk.
I vores undersøgelse anvendes hovedsagelig vi farvestoffer og fluorescerende heterologe gener til at visualisere cellemorfologi som en udlæsning på transfektionseffektivitet og en evne til billede morfologiske karakteristika af neuroner i mus hjernevæv. Signal-støjforholdet af den stokastiske levering inden for en defineret radius for at aktiveret os til helt at isolere en enkelt celles dendritiske havn i sin native kontekst. Som mange bestræbelser er vant til at undersøge disse morfologiske kendetegn, at kortlægning 'connectomics «eller etiket enkelte celler til forskellige analyser, kan denne metode nemt kombineres med de eksisterende protokoller såsom elektrofysiologi og neurit målinger 29,30. Åbenbart kunne kombinationer af fluorescerende heterologe gener muliggøre en langt mere robust afgrænsning af enkelte celler som den stokastiske fordeling af fluorescerende proteiner, og deres kombination vil bestemme farven på de enkelte celler 31,32. Anvendelsen af cellespecifikke promotorer, såsom synapsin og glial fibrillært syreprotein opstrøms for det heterologe gen exon kan også begrænse udtrykket til subpopulationer 33. Faktisk kunne den endeløse række af genetisk materiale også leveres i en regioselektiv måde ved guld nanopartikler anvender samme procedure. De samlede transficeret regioner kan således analyseres med traditionelle metoder, såsom dissektion og afgiver denne region til vestlig immunblotting at analysere lokal virkning af det heterologe gen.
Forbedringer i organotypiske skive procedurer vil også muliggøre en bredere anvendelse af hjernevæv for langsigtet eksperimenter samt tillade brugen af andre væv og cokulturer og ville lette transfektionsfremgangsmåder procedurer. Lipid og polymer transfektion er tidligere blevet rapporteret at påvirke membranen homeostase, internalisering, protein permeabilitet 34 og ofte viser meget lav effektivitet til transfektion af terminally differentierede neuroner. Cellespecifik last målretning er også modtagelig kun til celler, der udtrykker celleoverfladereceptorer nødvendige for internalisering, og selv om denne metode kan være meget selektiv, kan det ikke har tilstrækkelige målrettet regioselektivitet 35. Virale vektorer ellers ofte er vanskeligt og dyrt at fremstille, kræver strenge regler og har til tider demonstreret sikkerhedsproblemer. Biolistisk levering har således en enestående evne til regioselektivt transficere neuroner og andre celletyper i levende væv. Da guld er ikke giftige, yderligere fremskridt i brugen af biolistik kunne bane vejen for biomedicinske anvendelser, såsom transdermal farmaceutisk levering, invasiv in vivo gen-levering, samt lokaliserede virale genterapi.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke MRC-LMB værksted til produktion af den forbedrede gen geværløbet. Vi vil også gerne takke Dr. David R. Hampson ved University of Toronto for brug af udstyr og ressourcer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
References
- Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
- Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
- Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
- Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
- Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
- Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
- Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
- Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544 (2013).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
- Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
- Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
- Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
- Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
- Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017 (2012).
- Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).
- Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
- Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
- Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).
