Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
इन विवो जीव विज्ञान के कई पहलुओं को बनाए रखते हुए डीएनए की अभिकर्मक जैविक विज्ञान के लिए और organotypic मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी करने के लिए हाल के अग्रिमों के साथ अमूल्य किया गया है, विभिन्न heterologous जीनों का प्रभाव इस तरह आसानी से जांच की जा सकती है. पारंपरिक अभिकर्मक तरीकों इतनी कम पैदावार और व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण नुकसान के रूप में कठिनाइयों से भरा किया गया है जिसके लिए टर्मिनली विभेदित न्यूरॉन्स transfect के लिए बढ़ती ब्याज कर दिया गया है. Biolistic अभिकर्मक यह स्तनधारी ऊतकों में उपयोग के लिए उत्तरदायी है कि इसलिए इन कठिनाइयों से कई अभी तक केवल हाल ही में इस तकनीक को संशोधित किया गया है नाकाम कर सकते हैं.
त्वरक चैम्बर के लिए नए संशोधनों जीन बंदूक की फायरिंग सटीकता बढ़ाया और भी अभिकर्मक दक्षता की हानि के बिना कम गैस के दबाव (50 साई) के उपयोग की अनुमति है, जबकि प्रवेश की अपनी गहराई में वृद्धि हुई है और साथ ही देहात के एक केंद्रित regioselective प्रसार की अनुमति है3 मिमी के भीतर करने के लिए rticles. इसके अलावा, इस तकनीक को सीधे आगे और तेजी से कठिन microinjections से प्रदर्शन करने के लिए है. Episomal अभिव्यक्ति 24 घंटे के भीतर पाया जा सकता है और सेल अस्तित्व से बेहतर है, या, पारंपरिक तरीकों के लिए कम से कम बराबर होना दिखाया गया था जहां क्षणिक और स्थिर अभिव्यक्ति दोनों nanoparticle बमबारी के साथ संभव हो रहे हैं. इस तकनीक को हालांकि एक महत्वपूर्ण लाभ है: यह इस प्रकार anatomically heterologous जीन के प्रभाव को अलग करने के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए एक भी रोका दायरे में स्थानीकृत किया जाए अभिकर्मक परमिट. यहाँ हम एक बेहतर जीन बंदूक का इस्तेमाल अभिकर्मक regioselective लिए व्यवहार्य वयस्क organotypic स्लाइस तैयार करने और उन्हें जमा करने के लिए एक में गहराई प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
मूलतः biolistic तकनीक, "जैविक प्राक्षेपिकी" के लिए एक बारी के वाक्यांश, पादप कोशिकाओं 1 में कण की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के लिए स्थापित किया गया था. सेल परिवर्तन के इस भौतिक विधि डीएनए या रंगों के रूप में cargos देने के क्रम में अभेद्य कोशिका झिल्ली की शारीरिक बाधाओं को दूर करने के लिए उच्च वेग में सूक्ष्म या नैनोकणों accelerates. यह विशिष्ट ligand-रिसेप्टर्स और / या कोशिका की सतह की झिल्ली में जैव रासायनिक गुणों पर निर्भर नहीं है, क्योंकि कण की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण तत्काल ऐसे organotypic मस्तिष्क के स्लाइस के रूप में जैविक प्रणालियों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.
वे इन विवो जीवविज्ञान 2-4 करने के लिए प्रासंगिक हैं कि कई शारीरिक और जैव रासायनिक गुणों को बनाए रखने के बाद से उपयोग organotypic स्लाइस इन विट्रो प्लेटफार्मों में अन्य से अधिक लाभ है. स्लाइस ज्यादातर वे प्रारंभ हुआ और preser है जहां से स्थानीय वास्तु विशेषताओं के संरक्षणनयूरोचेमिकल गतिविधि और synapses के कनेक्टिविटी किया है. बुनियादी अनुसंधान के लिए मस्तिष्क के स्लाइस के उपयोग, और दवा के प्रयासों में, समन्वित उपाय और संदर्भ 3,5-7 तरह एक Vivo में मस्तिष्क के neurobiological व्यवहार की निगरानी के लिए संभव जैव प्रौद्योगिकी जोड़तोड़ की संख्या के साथ बढ़ गया है. organotypic टुकड़ा आधारित परख पद्धति के उपयोग हेतु प्रमुख लाभ यह आसान प्रयोगात्मक नियंत्रण प्रदान करता है और बाह्य वातावरण की सटीक जोड़तोड़ की अनुमति देता है.
लाभकारी, organotypic टुकड़ा संस्कृति प्रणालियों जैसे मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म से स्थापित है, लेकिन प्रांतस्था, रीढ़ की हड्डी, और सेरिबैलम 8-10, तक ही सीमित नहीं किया गया है. इसके अलावा, cocultures के एक नंबर बाहर का मस्तिष्क क्षेत्रों में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन्स और रोग कोशिकाओं 11,12 के बीच कहनेवाला संचार के मूल्यांकन की अनुमति है, जो प्रदर्शन किया गया है. कई प्रोटोकॉल पहले से ही है करने के लिए स्थापित किया गया हैuccessfully संस्कृति organotypic स्लाइस और दीर्घकालिक व्यवहार्यता बनाए रख सकते हैं और हाल ही में कई अध्ययनों से अब यह 13 झिल्ली इंटरफ़ेस तरीकों और विभिन्न संशोधनों का उपयोग. इस सिद्धांत एक झरझरा झिल्ली फिल्टर पर स्लाइस रखकर मध्यम और इनक्यूबेटर की humidified वातावरण के बीच इंटरफेस में organotypic स्लाइस रखता है. मध्यम इस प्रकार केशिका प्रस्ताव के माध्यम से organotypic स्लाइस को खिलाने के लिए पर्याप्त पोषक तत्व प्रदान कर सकते हैं. आमतौर पर स्लाइस जल्दी प्रसव के बाद जानवरों से तैयार किया गया है (- 9 दिन पुरानी 3, पी 3 – 9). हालांकि, इन स्लाइस से मस्तिष्क के ऊतकों सेलुलर plasticity की एक उच्च स्तर का प्रदर्शन और व्यवहार्य संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए उपयोगी है जो यांत्रिक तनाव करने के लिए एक अंतर्निहित प्रतिरोध, है, अभी तक परिपक्व synapses और neuroanatomical circuitry पूरी तरह से उम्र के 2 से 3 सप्ताह तक विवो में विकसित नहीं किया है 14. उदाहरण के लिए, पिछले टिप्पणियों P0 से प्राप्त है कि हिप्पोकैम्पस स्लाइस दिखाया गया था – 1 नवजात शिशुओं अत्यधिक viab हालांकिLe तैयारी के बाद, धीरे धीरे कुछ लक्षण खो दिया है. मूलतः, वे बड़े जानवरों 15,16 से organotypic संस्कृतियों की तुलना-अंतर डे के लिए और अधिक होने की संभावना थे अपरिपक्व कोशिकाओं सुझाव दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए अनुपयुक्त हो दिखाया गया. इस कारण हमारे विधि परिपक्वता और वास्तु विकास उनके टर्मिनल चरणों 13,17-21 पहुँच गए हैं, जिस पर वयस्क organotypic मस्तिष्क के स्लाइस के लिए अनुकूलित किया गया है. फिर भी, इस विधि भी नवजात शिशु और किशोर organotypic स्लाइस के लिए उपयुक्त है.
व्यवहार्य organotypic स्लाइस उत्पादन किया गया है एक बार स्लाइस युक्त पूरी थाली biolistic माउंट करने के लिए लाया जाता है और वितरण और अभिकर्मक regioselective को प्रस्तुत किया जा सकता है. (ऊतक को एपर्चर से) सीधे स्लाइस पर 10 मिमी की दूरी पर 90 डिग्री उन्मुख (चित्रा 1 में वर्णित) जीन बंदूक के समुचित बढ़ते,, 40 एनएम का तेजी biolistic डिलीवरी जाना परमिटएलडी कण cargos लेपित. इस तरह के रंगों और फ्लोरोसेंट डीएनए वैक्टर के रूप में इन cargos, साथ ही ब्याज की किसी भी जीन, आसानी से आसानी से व्यवहार्य स्लाइस में वितरित कर रहे हैं. इस विधि इस प्रकार एक regioselective ढंग से, देने के लिए प्रोटोकॉल आवश्यक वर्णन करता है, व्यवहार्य organotypic मस्तिष्क स्लाइस में कार्गो लेपित सोने के नैनोकणों. जीन बंदूक बैरल और इष्टतम बढ़ते चित्रा 1 में देखा जा सकता है. सुधार बैरल और nanoparticle प्राक्षेपिकी के बारे में अधिक जानकारी के लिए, एट अल. 17 ओ ब्रायन देखें.
इसके बाद शोधन भी उपयोगकर्ता इस तरह microcarrier लोड हो रहा है मात्रा (MLQ) के रूप में परिभाषित लक्ष्य क्षेत्र के प्रति वितरित सोने की उचित राशि के रूप में शर्तों का अनुकूलन करने के लिए, और डीएनए लोड हो रहा है अनुपात के रूप में परिभाषित सोने की मिलीग्राम प्रति लोड डीएनए की राशि का निर्धारण करने के लिए संकेत कर रहे हैं (डीएलआर). सोने के कणों पर डीएनए precipitating और वास्तविक जीन बंदूक 'कारतूस शामिल हैं कि Tefzel ट्यूबिंग में उन्हें लोड करने से पहले9 ;, यह ऊतकों और कानून के बीच थोड़ा अलग कर सकते हैं, जो प्रत्येक अभिकर्मक के लिए आवश्यक डीएनए और सोने की राशि की गणना करने के लिए आवश्यक है (अनुपात 1 के लिए 1 मिलीग्राम सोना और 1 ग्राम डीएनए के बीच बनाए रखा जाना चाहिए: 5). यह रूप में अन्यथा डीएनए लेपित सोने के कणों वृद्धि ऊतकों को नुकसान और cytotoxicity के रूप में भी biolistic प्रसार के समग्र एकरूपता को कम कर सकता है जो उम्मीद की ढेर, की तुलना में बड़ा गठन एक साथ पालन सकता डीएलआर को MLQ का उचित अनुपात तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है.
इस विधि biolistic वितरण में हाल ही में सुधार, परीक्षण और नवजात किशोर और वयस्क organotypic मस्तिष्क के स्लाइस के लिए उत्तरदायी होने के लिए निर्धारित किया गया है जो दिखाता है. इसके अलावा, जीन बंदूक बैरल के कम biolistic फैल शोषण से, उपयोगकर्ता अब चुनिंदा मस्तिष्क में एक पाबंद क्षेत्र transfect करने में सक्षम है. उपयुक्त ऊष्मायन समय के बाद, 24 और 48 के बीच इसकी अधिकतम दरों पहुंचता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति,घंटा, epifluorescence और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं. ये fluorophores जैविक रूप से प्रासंगिक संरचनाओं के भीतर रूपात्मक विश्लेषण और व्यक्ति की कोशिकाओं के स्थानीयकरण की अनुमति. हालांकि, अन्य heterologous जीन द्वारा organotypic स्लाइस की regioselective मॉडुलन भी इन तैयारियों के लिए उत्तरदायी किसी भी अन्य परीक्षणों से नजर रखी जा सकती है. स्थानीयकृत जीन डिलीवरी के लिए संभव काम कर रणनीतियों चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं.
प्रोटोकॉल एक बढ़ाया जीन बंदूक का उपयोग कर वयस्क organotypic स्लाइस में रंगों और आनुवंशिक सामग्री वितरित करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करता है. मूलतः, रंगों के प्रकार और संभव जीनों की विविधता जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब देने के लिए इस विधि बहुमुखी और उत्तरदायी बनाने के. विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र को इस मामले में इस्तेमाल किया regioselective वितरण पद्धति, एक जैविक रूप से प्रासंगिक वास्तुकला के भीतर स्थानीय क्षेत्रों के heterologous जीन मॉडुलन के रूप में प्रयोग के लिए नए रास्ते खोलता से पहले आसानी से संभव नहीं रहा है. हम पहले इस विधि का यह कई सप्ताह 13 के लिए बेहतर सेल अस्तित्व और heterologous जीन अभिव्यक्ति से पता चला है के रूप में परिपक्व synapses पूरी तरह से बनते हैं जहां वयस्क organotypic स्लाइस, पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि निर्धारित किया है. स्तनधारी दिमाग के लिए नए और बेहतर संस्कृति शर्तों के साथ ही अन्य ऊतकों के आगमन के साथ, regioselective आनुवंशिक modulations का उपयोग bioche की एक विस्तृत विविधता के लिए तेजी से उपयोगी हो जाएगाmical का विश्लेषण करती है.
हम दूसरों के 24 से उल्लेख यहाँ और पहले से प्रकाश डाला जाएगा, कई विभिन्न कारकों आसानी biolistic डिलीवरी की सटीकता और विश्वसनीयता को प्रभावित कर सकता है. सबसे पहले, रंग या डीएनए से जुड़ा हुआ सोना कण की तैयारी पर्याप्त रूप से एकत्रीकरण को रोकने के लिए और कारतूस कार्गो निष्कासन की सुविधा के लिए संतुलित किया जाना चाहिए. डीएनए सोने सूक्ष्म कणों समाधान में कैल्शियम और spermidine सोना नैनोकणों के लिए डीएनए अणु के बंधन सहायता कर सकते हैं. कम दबाव के तहत कोशिकाओं घुसना नैनोकणों के लिए क्षमता पहले से 17 निर्धारित किया गया था. दूसरे, जीन बंदूक सही कोण और दूरी के साथ संभव के रूप में स्थिर रखा जा चाहिए. एक विश्वसनीय दबाव गेज ऊतक अखंडता बनाए रखने के लिए, और ठीक से अपने निर्धारित लक्ष्य को सोने के कणों में तेजी लाने के लिए, यह भी reproducibility के लिए आवश्यक है. दरअसल, उपकरणों की दूरी, अभिविन्यास, और स्थिरता भी टी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हैंargeting और regioselective वितरण की शुद्धता. इन मस्तिष्क संरचना बहुत छोटे हैं, फायरिंग कोण में मामूली बदलाव आसानी से पूरी प्रक्रिया में कम विश्वसनीय प्रदान सकता है. और अंत में, तैयारी और व्यवहार्य organotypic स्लाइस के रखरखाव के विभिन्न जानवरों, मस्तिष्क क्षेत्रों, उम्र और cocultures के लिए अभी तक प्रचुर मात्रा में और विश्वसनीय प्रोटोकॉल वर्तमान 2,4,25,26 उपलब्ध हैं कई दशकों के लिए कठिनाइयों से भरा गया है. इन प्रक्रियाओं उपयोगकर्ता अनुकूलित biolistic प्रक्रियाओं के ऊतकों प्रस्तुत करने से पहले होना चाहिए. यह और अधिक आसानी से unbiasedly biolistic कणों के प्रभाव और अपने स्वयं संस्कृतियों पर heterologous जीन के प्रभाव का पता लगाने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति होगी. यह अंत करने के लिए, ऐसे EYFP और EGFP रूप फ्लोरोसेंट जीन के उपयोग को लक्षित परिशुद्धता परीक्षण और भी समय 13 के एक निरंतर अवधि में heterologous जीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से सेलुलर व्यवहार्यता का पालन करने के लिए एक उपन्यास उपयोगकर्ता की अनुमति कर सकते हैं दोनों. विश्वसनीय के लिए महत्वपूर्ण कदम से कईऔर इस प्रोटोकॉल की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपयोग निम्नलिखित तीन पैराग्राफ में डाला जाता है.
कुशल अभिकर्मक के लिए, डीएनए एकाग्रता उपयुक्त होना चाहिए. बहुत अधिक हैं कि सांद्रता नैनोकणों के ढेर पैदा कर सकता है, जबकि बहुत कम हैं कि सांद्रता अभिकर्मक उपज में बाधा होगी. सोने का समुच्चय नाटकीय रूप से, अभिकर्मक दक्षता कम असमान वितरण के कारण, और वृद्धि की cytotoxicity और oxidative तनाव पैदा कर सकते हैं कर सकते हैं. Spermidine समाधान की समाप्ति के लिए (हर 2 से 3 महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए) के कारण कोटिंग दक्षता के साथ कोई समस्या होने की संभावना है. एक पर्याप्त biolistic प्रसार के लिए, लेबलिंग भी होना चाहिए. सोने nanoparticle / डीएनए निलंबन की एक गैर सजातीय लेबलिंग पीवीपी समाधान के कारण हो सकता है. यह भी हर 2 से 3 महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. सोने के नैनोकणों कोटिंग एक उच्च मेगावाट बैंड 27 के रूप में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर देखा जा सकता है.
प्रत्येक जैविक systजांच के तहत उन्हें और साथ ही अभिकर्मक और biolistic प्रसार के अनुकूलित स्तर तक पहुँचने के लिए गैस के दबाव में छोटे परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती इस्तेमाल किया प्रत्येक विभिन्न साधन. महत्वपूर्ण पैरामीटर प्लास्टिक कारतूस से सूक्ष्म या नैनो वाहक पट्टी और ऊतकों में उन्हें प्रेरित करने के लिए आवश्यक हीलियम नाड़ी का दबाव है. यह लक्ष्य भर में सदमे तरंगों बना सकते हैं और बाधित या मैट्रिक्स 17 से ऊतक अलग होगा क्योंकि एक उच्च गैस दबाव, सेल अस्तित्व को प्रभावित करेगा. जीन बंदूक बैरल लक्ष्य और बिल्कुल सीधा ऊतक को तंत्र होने के सटीक biolistic डिलीवरी के लिए महत्वपूर्ण है. चयनित क्षेत्र बाहरी एपर्चर से ठीक 10 मिमी प्रति बैरल के प्रत्यक्ष केंद्र में रखा जाना चाहिए. इस केंद्र के चारों ओर सोने के कण प्रसव के 3 मिमी व्यास में यह परिणाम है. जीन बंदूक बैरल प्रत्येक उपयोग के बाद 70% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए. बड़े कण समुच्चय से ऊतक की रक्षा करने के लिए, प्रति बैरल भी थानेदार कि एक नायलॉन जाल शामिलअनुकूलतम प्रदर्शन को बनाए रखने के लिए नियमित रूप से प्रतिस्थापित किया जा uld. बदलने के लिए आदेश में जाल टोपी तो टोपी और हे अंगूठी के बीच एक नया नायलॉन जाल डालने खोलना.
2 दिन उपरिकेंद्र के आसपास अभिकर्मक के बाद – fluorescently लेबल की कोशिकाओं में कम से कम 1 दिखाई जानी चाहिए. अभाव या लेबलिंग के misalignment जीन बंदूक बढ़ते की अपर्याप्त तैयारी और अस्थिरता से परिणाम कर सकते हैं. confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं की टिप्पणियों के लिए कई कारकों पर निर्भर करता है: / उत्तेजना उत्सर्जन प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, पिनहोल आकार, उद्देश्य लेंस के एनए, प्रकाश पथ में घटकों का अपवर्तनांक, ऊतक, और के संरेखण की गहराई साधन. इन कारकों में जांच के तहत प्रत्येक प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
Biolistics हाल के अग्रिमों में इस विधि की सफलता के लिए शोषण किया गया. इस अध्ययन में इस्तेमाल जीन बंदूक बैरल आवश्यक दबाव को कम करने के साथ ही biolistic कीप के क्रम में संशोधित किया गया थाएक और अधिक विवश और विशिष्ट क्षेत्र 17,19 में बिखराव पैटर्न. अन्य बैरल संशोधनों biolistic प्रसार को सीमित और बहिर्वाह दबाव 28 को कम करने की कोशिश की है अभी तक डॉ ओ 'ब्रायन द्वारा डिजाइन इस कस्टम डिजाइन जीन बंदूक बैरल मानक Helios जीन बंदूक के लिए फिट एक घटक है. इसके बाद उप सुक्ष्ममापी सोने के कणों सेलुलर क्षति और अंत में, निरंतर heterologous जीन अभिव्यक्ति की हानि के कारण हम पहले से निर्धारित था कि माइक्रोमीटर कणों की invasiveness कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया. Biolistic प्रक्रिया के लिए ये परिवर्तन विधि 13 के समग्र व्यवहार्यता और reproducibility सुधार हुआ. ऐसे organotypic मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में में गहराई टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया का निवारण, मस्तिष्क की रक्षा करने के लिए एक DMEM-Agarose मैट्रिक्स का उपयोग, और कई अन्य उपयोगी अग्रिम के रूप में टुकड़ा तैयारी पर अन्य सुधार पहले 13 वयस्क स्लाइस के इस्तेमाल का पता लगाने के लिए सक्षम बताया कि परिपक्व विकसित किया हैsynaptic नेटवर्क.
हमारे अध्ययन में हम मुख्य रूप से अभिकर्मक दक्षता पर एक readout और छवि की क्षमता माउस मस्तिष्क के ऊतकों में न्यूरॉन्स के लक्षण के रूप में सेल आकारिकी कल्पना करने के लिए रंगों और फ्लोरोसेंट heterologous जीन का इस्तेमाल किया. एक परिभाषित दायरे में स्टोकेस्टिक प्रसव के शोर अनुपात करने के लिए संकेत पूरी तरह से अपने मूल संदर्भ में एक एकल कक्ष के dentritic बंदरगाह अलग करने के लिए हमें सक्षम. कई प्रयासों के इन लक्षण की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, मानचित्रण 'connectomics' या विभिन्न विश्लेषण के लिए एकल कक्षों लेबल करने के लिए, इस विधि आसानी से ऐसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और neurite माप 29,30 के रूप में मौजूदा प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है. जाहिर है, फ्लोरोसेंट heterologous जीनों के संयोजन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्टोकेस्टिक वितरण के रूप में एकल कक्षों की एक और अधिक मजबूत चित्रण सक्षम हो सकता है, और उनके संयोजन व्यक्ति की कोशिकाओं 31,32 के रंग का निर्धारण होगा. ऐसे synapsin और heterologous जीन एक्सॉन के अपस्ट्रीम glial fibrillary एसिड प्रोटीन के रूप में सेल विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग भी subpopulations 33 को अभिव्यक्ति सीमित कर सकते हैं. दरअसल, आनुवंशिक सामग्री की अंतहीन विविधता भी इस एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सोने के नैनोकणों से एक regioselective ढंग से दिया जा सकता है. कुल ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्रों इस प्रकार पारंपरिक तरीकों, ऐसे विच्छेदन के रूप में और heterologous जीन के स्थानीय प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए पश्चिमी immunoblotting के लिए उस क्षेत्र प्रस्तुत करने के साथ विश्लेषण किया जा सकता है.
Organotypic टुकड़ा प्रक्रियाओं में सुधार भी व्यापक लंबी अवधि के प्रयोग के लिए मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग के रूप में अच्छी तरह से परमिट के रूप में अन्य ऊतकों और cocultures के उपयोग की अनुमति होगी और अभिकर्मक प्रक्रियाओं में सुविधा होगी. लिपिड और बहुलक अभिकर्मक पहले 34 और अक्सर ते transfect करने के लिए बहुत कम क्षमता दिखाने झिल्ली समस्थिति, internalization, प्रोटीन पारगम्यता को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया हैrminally न्यूरॉन्स विभेदित. सेल विशिष्ट कार्गो लक्ष्यीकरण केवल internalization के लिए आवश्यक कोशिका की सतह रिसेप्टर्स व्यक्त कि कोशिकाओं को भी उत्तरदायी है, और इस विधि अत्यधिक चयनात्मक हो सकता है, यह regioselectivity 35 लक्षित कमी कर सकते हैं. वायरल वैक्टर अन्यथा, निर्माण करने के लिए अक्सर मुश्किल और महंगा हो कड़े नियमों की आवश्यकता होती है और इस अवसर पर सुरक्षा चिंताओं का प्रदर्शन किया. Biolistic वितरण इस प्रकार regioselectively व्यवहार्य ऊतकों के भीतर न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं transfect करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता है. सोने के गैर है biolistics के उपयोग में विषाक्त, आगे अग्रिम ऐसे transdermal दवा वितरण, noninvasive vivo में जीन वितरण, साथ ही स्थानीयकृत nonviral जीन चिकित्सा के रूप में जैव चिकित्सा का उपयोग करता है के लिए मार्ग प्रशस्त कर सके.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों बढ़ाया जीन बंदूक बैरल के उत्पादन के लिए एमआरसी-LMB कार्यशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी उपकरण और संसाधन के उपयोग के लिए टोरंटो विश्वविद्यालय में डॉ डेविड आर HAMPSON धन्यवाद देना चाहूंगा.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |