Abstract
Transfektion av DNA har varit ovärderlig för biologiska vetenskaper och nya framsteg till organotypiska hjärnan slice förberedelser, kunde effekten av olika heterologa gener alltså undersökas lätt bibehållen många aspekter av in vivo biologi. Det har funnits ett ökande intresse för att transfektera terminalt differentierade nervceller som konventionella transfektionsmetoder har varit fylld av svårigheter som låg avkastning och betydande förluster i lönsamhet. Biolistisk transfektion kan kringgå många av dessa svårigheter men först nyligen har denna teknik modifierats så att den är mottaglig för användning i däggdjursvävnader.
Nya ändringar i acceleratorkammaren har förbättrat genen pistolens avfyrnings noggrannhet och ökade djup penetration samtidigt som den tillåter användning av lägre gastryck (50 psi) utan förlust av transfektionsverkan samt tillåter en fokuserad regioselektiv spridning av paRTIKLARNA att inom 3 mm. Dessutom är denna teknik rakt framåt och snabbare att utföra än tråkiga microinjections. Både övergående och stabilt uttryck är möjliga med nanopartikelbombardemang där episomal uttryck kan detekteras inom 24 timmar och cellöverlevnad visade sig vara bättre än eller åtminstone lika med konventionella metoder. Denna teknik har dock en avgörande fördel: den tillåter transfektion att vara lokaliserade inom ett och samma återhåll radie vilket gör det möjligt för användaren att anatomiskt isolera heterologa gen effekter. Här presenterar vi en djupgående protokoll för att förbereda livskraftig vuxna organotypiska skivor och överlämna dem till regioselektiv transfektion med hjälp av en förbättrad genkanon.
Introduction
Ursprungligen biolistiska tekniken, en turn-of-fras för "biologiska ballistik", fastställdes för partikel genöverföring i växtceller 1. Denna fysiska metod för celltransformation accelererar mikro eller nanopartiklar med hög hastighet för att övervinna de fysikaliska barriärer av de ogenomträngliga cellmembran i syfte att leverera laster såsom DNA eller färgämnen. Eftersom den inte är beroende av specifika ligand-receptorer och / eller biokemiska egenskaper vid cellytan membran, kan partikel genöverföring lätt appliceras på en mängd olika biologiska system som organotypiska hjärnan skivor.
Använda organotypiska skivor har fördelar jämfört med andra in vitro-plattformar, eftersom de upprätthåller många anatomiska och biokemiska egenskaper som är relevanta för in vivo biologi 2-4. Skivorna främst bevara den lokala arkitektoniska egenskaper än där de har sitt ursprung och bevaradeve neurokemiska aktivitet och anslutning av synapser. Användningen av hjärnan skivor för grundforskning och inom läkemedels strävanden, har samtidigt ökat med antalet möjliga biotekniska manipulationer för att mäta och övervaka neurobiologiska beteenden i hjärnan i en in vivo som sammanhanget 3,5-7. De stora fördelarna för användning organotypiska slice-baserade analyssystem är att det ger enkel experimentell kontroll och tillåter precisa manipulationer av extracellulära miljöer.
Fruktbart, har organotypisk slice kultursystem etablerats från en mängd olika hjärnregioner såsom, men inte begränsat till, cortex, ryggmärg och lillhjärnan 8-10. Dessutom har ett antal samodlingar visats, vilket gör det möjligt att bedöma intercellulära kommunikation över distala hjärnan samt mellan nervceller och patologiska celler 11,12. Många protokoll har redan inrättats för att successfully kultur organotypic skivor och kan upprätthålla långsiktig lönsamhet och många nya studier nu utnyttja de metoder membran gränssnitt och olika modifieringar av den 13. Denna princip bibehåller organotypic skivor vid gränsytan mellan mediet och Kuvösens fuktad atmosfär genom att placera skivorna på ett poröst membranfilter. Mediet kan därmed ge tillräckligt med näringsämnen för att mata organotypiska skivor via kapillär rörelse. Vanligtvis skivor har framställts från tidig postnatal djur (3-9 dagar gammal, P3 - 9). Men hjärnvävnader från dessa skivor visar en hög nivå av cellulär plasticitet och har en inneboende motståndskraft mot mekaniska påfrestningar, vilket är till hjälp för att uppnå livskraftiga kulturer, men ändå mogna synapser och neuroanatomiska kretsar har inte fullt utvecklade in vivo förrän 2 till 3 veckors ålder 14. Till exempel hade tidigare observationer visat att hippocampus skivor erhållna från P0 - en nyfödda, även om mycket VIABle efter beredning, gradvis förlorat några morfologiska egenskaper. I huvudsak var de visat sig vara olämpliga för långtidskulturer tyder omogna celler var mer benägna att de-differentiate jämfört med organotypiska kulturer från äldre djur 15,16. Därför vår metod har optimerats för vuxna organotypiska hjärnan skivor där mognad och arkitektoniska utveckling har uppnått slutliga faser 13,17-21. Icke desto mindre är denna metod också lämplig för nyfödda och juvenila organotypic skivor.
När livskraftiga organotypiska skivor har producerats hela plattan innehåller skivorna kan föras till den biolistiska berget och in till regioselektiva leverans och transfektion. Korrekt montering av genkanon (såsom beskrivs i figur 1), orienterad 90 ° på ett avstånd av 10 mm direkt över skivorna (från öppningen till vävnaden), medger den snabba biolistisk leverans av 40 nm gåld partikelbelagda last. Dessa laster såsom färgämnen och fluorescerande DNA-vektorer, liksom varje gen, lätt lämnad i lönsamma segment med lätthet. Denna metod beskriver alltså det protokoll som krävs för att leverera på ett regioselektivt sätt, last belagda guldnanopartiklar i livskraftiga organotypiska hjärnan skivor. Genen eldröret och optimal montering kan ses i figur 1. För ytterligare information om de förbättrade fat och nanopartiklar ballistik, se O'Brien et al. 17.
Efterföljande förbättringar är också indicerat för användaren att optimera förhållandena såsom rätt mängd guld som levereras per målområde, som definieras som mikrobärare Loading Antal (MLQ), och för att bestämma mängden DNA lastas per mg guld, definierad som DNA Laddar Ratio (DLR). Före utfällning DNA på guldpartiklar och lägger dem i Tefzel slangen som omfattar själva genen pistol "patroner9 ;, det är nödvändigt att beräkna mängden DNA och guld som krävs för varje transfektion som kan skilja sig något mellan vävnader och villkor (kvoten skall hållas mellan 1 mg guld och 1 ng DNA till 1: 5). Det är viktigt att förbereda den rätta andelen MLQ till DLR inte annat DNA belagda guldpartiklar kan häfta ihop bildar större än väntat agglomerering, vilket skulle kunna minska den totala homogenitet biolistiska spridning samt skador ökning vävnad och cytotoxicitet.
Denna metod visar den senaste tidens förbättringar i biolistisk leverans, som testats och beslutsamma att vara mottaglig för nyfödda, unga och vuxna organotypiska hjärnan skivor. Genom att utnyttja den gen eldröret har minskat biolistisk spridning, är att användaren nu kan selektivt transfektera en punktlig region i hjärnan. Efter en lämplig inkubationstid, uttrycket av fluorescerande proteiner, som når sin maximala grader mellan 24 och 48h, kan visualiseras genom epifluorescence och konfokalmikroskopi. Dessa fluoroforer tillåta morfologisk analys och lokalisering av enskilda celler inom biologiskt relevanta strukturer. Däremot kan den regioselektiva modulering av de organotypiska skivor av andra heterologa gener också övervakas av andra undersökningar som kan bli föremål för dessa preparat. Möjliga arbetsstrategier för den lokaliserade genleverans presenteras i figur 2.
Protocol
Användningen av djur och animaliska vävnader bör strikt följa etisk kommitté godkännande enligt lokala regler och föreskrifter. Alla vävnader som erhållits under studien följs MRC-LMB: s djurförsök riktlinjer.
1 Beredning av material & Kultur Media
- Förbered alla lösningar med hjälp av Millipore vatten; endast använder analyskvalitet reagenser. Förbered och lagra alla reagenser vid RT (om inte annat anges).
- Gör 500 ml HEPES-buffrad saltlösning (10 mM HEPES, 120 mM NaCl, pH 7,2). Filtrera genom ett 0,2 | im steril filterenhet. Förvara vid 4 ° C.
- Gör 500 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Sterilisera genom autoklavering.
- Förbered neuronal medium genom komplettering DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium) med 25 mM HEPES, 10% fetalt kalvserum, 30 mM glukos, 1: 100 N2 supplement, penicillin-streptomycin 1100 U / ml; pH 7,2. Filter med en 0,2 | im steril filterenhet. Förvara vid 4 ° C.
- Gör polyvinylpyrrolidon (PVP)-stamlösning med 20 mg PVP i en ml 100% etanol. Fördela detta i 1 ml mängder, frysa och lagra vid -20 ° C. Arbetslösning är 0,05 mg / ml, därför lägga till 10 | il av PVP-förrådslösning till varje 4 ml 100% etanol.
- Förbered en 0,05 M spermidin stamlösning i Millipore vatten; justera pH till 7,2.
- Lägg till en 2% agaros-lösning i DMEM (2 g elektroforeskvalitet agaros i 100 ml DMEM i en steriliserad skruvkork flaska). Micro detta tills agarosen hade löst sig. Förvara i 4 ° C kylskåp i flera veckor, om det behövs.
2 Beredning av Organotypiska Skivor
- Euthanize C57 Black 6 möss i önskad ålder av CO2 kvävning följt av halshuggning. Ta hjärnan med hjälp av sido nedskärningar skallen startar vid foramen magnum och slutar vidlukt lober. Lyft försiktigt skallen bakifrån att exponera hjärnan.
- Klipp mellan luktlober och frontala cortex och rostralt till lillhjärnan. Lyft försiktigt rostralt delen av hjärnan och skär synnerverna. Slutligen, ta bort hjärnan och placera den i en petriskål fylld med is kall HEPES saltlösning på is.
- Med hjälp av en dissekera mikroskop, skala bort det pia med fin pincett; försiktigt bort blodkärl och hjärnhinnorna runt hjärnan.
- Placera den färska hjärnan i en liten mottagare mögel och täck den med agaroslösningen kyld till något över rumstemperatur. Därefter snabbt kyla formen till 4 ° C genom att placera den på is.
OBS: Behandla skivorna så snabbt som möjligt för att undvika förlust av livskraft. - När agaret har satt (5-10 min), ta bort agarosen inbäddade hjärnan från formen (trim om det behövs) och sedan limma fast den på vibroslicer plattformen. Placera i en vibroslicer kammare som innehåller steril iskall PBS. Disinfect den vibroslicer kammaren innan de användes med 70% etanol för att minimera efterföljande kontamination.
- Skär hjärnan med hjälp av en specialbyggd vibroslicer eller kommersiell motsvarande. Modellen Konceptet var att designa en vävnad slicer som skulle kunna generera stora amplitud och hög frekvens rörelser horisontella kanten på bladet samtidigt minimera vertikala vibrationer.
- Använd oscillationsfrekvensen 90 Hz, vid en amplitud av 1,5 - 2,0 mm och skärbladet placerat i en vinkel på 15 ° till horisontalplanet; ställa in monteringsblocket som håller agaros-inbäddade hjärna att flytta på 1,7 mm / min i riktning mot bladet. Samla sektioner (150 | im) i en kammare, som innehåller iskall odlingsmedia (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Visa skärning och manipulation av vävnadsskivor som en kompletterande video i Arsenault och O'Brien 13.
- Placera försiktigt skivorna i cellodlingsinsatser (0,4 um, 30 mm i diameter) i en 6 flera brunnar bricka med kultur Media på utsidan av insatsen, och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: För korrekt vävnadsviabilitet, vara extremt försiktig när du överför och manipulera skivorna. Dessutom kommer för mycket vätska förhindrar de organotypic skivor från att vidhäfta till membranet av filterinsatsen. Om detta händer, ta bort överflödig vätska eller platta igen. - Även organotypiska skivor kan odlas i några veckor, vidare till transfektion senast 4 dagar efter plätering för bästa transfektion avkastning.
OBS: För att undvika gliaceller överväxt i långsiktiga odlingsbetingelser, användning AraC eller serumfritt medel 2.
3 Framställning av DNA-belagda Micro & nano projektiler
- Förbered nano projektiler med hjälp 40 nm guld diameter partiklar. I korthet, tillsätt 50 | il av 0,05 M spermidin och 10 | il DNA vid 1 mg / ml (pEYFP-N1) och 10 mg guldpartiklar.
- Lägg kalcium och spermidin i lösningen mixenratur under DNA-guld mikropartiklar beredning i syfte att hjälpa till vid bindning av DNA-molekyler till guldnanopartiklar.
OBS: Mängden DNA används per mg guldföretag (DLR), skall variera mellan 1 och 5 mikrogram DNA per 1 mg guld. Vidare mängden guld bärarpartiklar som kommer att skjutas per patron (MLQ), bör i sig sträcker sig från 0,1 till 0,5 mg av guld. DLR och MLQ bör prövas och optimeras för varje användare, beroende på det särskilda systemet som undersöks samt vilken typ av partikel och genkanon används.
- Lägg kalcium och spermidin i lösningen mixenratur under DNA-guld mikropartiklar beredning i syfte att hjälpa till vid bindning av DNA-molekyler till guldnanopartiklar.
- Blanda med hjälp av en virvel medan långsam tillsats av 50 pl 1 M CaCl2 i fraktioner om 10 - 15 pl. Efter 5 min av enstaka vortex, centrifugera vid 1000 xg under 30 sekunder avlägsna supernatanten. Resuspendera guldpartikel pelleten i 3,5 ml 0,075 M PVP.
- Rita denna suspension i slang (2,36 mm innerdiameter) med hjälp av en spruta. Placera slangen i slang beredningen stationen. Låtguldpartiklar sedimentera och avlägsna supernatanten genom aspiration med en spruta. Vrid slangen för att jämnt sprida guldpartiklarna, vilka därefter torkades under ett konstant kväveflöde vid 5 L per min.
- För att skapa DNA-kulor, klippa slangen med hjälp av en slang fräs i 1 cm längder. Antingen infoga omedelbart i pistolpatron genen eller hålla uttorkad (4 ° C) fram till användning.
4. Biolistic Transfektion på Organotypiska Slices
- Utför följande steg i en steril laminärt flöde huva.
- Sätt i ett 9 V batteri och en tom patronhållaren i Helios genkanon.
- Fäst genkanon till heliumtanken med helium slangen. Fire 2-3 blanka (tomma slots) vid 50 psi för att trycksätta helium slangen och behållarna i pistolen.
- Fyll på patroner som innehåller DNA-belagda guld in i patronhållare och ladda hållaren i genen pistol.
- Skruva genkanonen distans och fästden modifierade genen eldröret till genen pistol.
- Med hjälp av steril pincett, placera en filterinsats som innehåller den organotypisk skiva i en steril plastskål.
- Ta ut mediet från organotypiska skivor.
- Ställ in gastrycket vid 50 psi.
OBS: Ögonskydd är viktigt och hörselskydd rekommenderas. - Placera genkanon vid lämpliga avstånd genom att använda monteringen uppmättes till 10 mm. Noggrant mål i mitten av trumman över det önskade området för genetisk leverans.
- Efter bränning, byt insatserna tillbaka i sin skål med färska media och returnera dem till normala tillväxtförhållanden, dvs 37 ° C med 5% CO2 inkubator.
- När du är klar, stäng heliumtanken, släpper trycket från genen pistol och lossa genkanon från heliumtanken.
- Ta ut patronhållaren och kasta patronerna och rengör genkanonen.
- Kontrollera vävnad för morfologi och för framgångsrik penetration av videoanläggninglizing skivorna med användning av ett inverterat mikroskop. Om du använder mikropartiklar, jämnt sprida guldet; Det bör inte finnas några täta områden av guldpartiklar sett på skiva. Nanopartiklar på grund av sin ringa storlek kan inte ses som enskilda enheter med konventionella mikroskopitekniker.
- Efter det lämpligt tidsintervall (normalt 1-2 dagar), fixera skivorna i 4% paraformaldehyd (PFA) för mikroskopi observation.
OBS: Fastställande i PFA är inte alltid önskvärt. För levande cell imaging undvika det här steget.
5. Fastställande och visualisering av hjärnan skivor
- Efter biolistisk transfektion, tvätta segment två gånger i PBS under 2 min.
- Fix skivor genom inkubation i nygjorda, iskall 4% PFA i PBS i 20 min.
- Tvätta segment två gånger i PBS under 2 min.
- Skär försiktigt runt membranet stöder med hjälp av en skalpell, utan att störa skivorna monterade på dem. Använd pincett för att placera varje membranstöd / skiva på ett objektglas. Vila organotypic skivor på toppen av membranet på ett objektglas.
- Lägg en droppe monterings media ovanpå skiva och lägg på ett täckglas försiktigt utan att någon kraft direkt kontakt med organotypisk slice.
- Fäst täckglas med ett tunt lager av nagellack.
- Visa skivorna på ett lämpligt mikroskop.
6. Konfokala Tillämpningar
- Visualisera skivorna med hjälp av en upprättstående scanning laser konfokalmikroskop med 60X / 1,4 numeriska bländaröppningen (NA) oljeimmersionsobjektiv.
OBS: Det mest problematiska inslag i konfokalmikroskop är pinhole storlek (inställd på 1 AU), som har förmåga att isolera och samla en plan fokus, vilket eliminerar ofokuserad "haze" normalt sett med ett fluorescerande prov. Fina detaljer är ofta skyms av denna dis och kan inte upptäckas i en nonconfocal mikroskop. - Ställ Argon laser för att en excitationsvåglängd av 488 nm och optimera för insamling av emitted ljus i 500-520 nm-bandet. Vanligtvis samla bilder på 1024 x 1024 bildpunkter och med högar av z-sektioner på 0.5 um intervall för att omfatta hela bredden av varje nervcell som analyserades.
- För att observera morfologin hos kärnan, räknaren färga dessa celler med DAPI (excitationsvåglängd som fastställdes vid 405 nm och emission ljus uppsamlades mellan 420-4 40 nm). Slutligen, för att pröva röd fluorescens, ställa lasern vid 561 nm för excitation och 565-620 nm för emission.
- Vanligtvis förvärva bilder med en 4X scan zoom som täckte en yta på 57,6 um 2; bildstorlekar var i området 1,024 x 1,024 pixlar. Rekord högar av z-sektioner i 0.5 um intervaller och prognoser för 5-8 ramar kombineras.
Representative Results
Organotypisk slice livskraft kan övervakas med laktatdehydrogenas aktivitet propidiumjodid märkning och dUTP färgning som tidigare rapporterats 13,22. Uppenbar, livskraft och integritet skivorna är viktiga för den långsiktiga ihållande uttryck av den levererade genetiska lasten. Efter biolistisk leverans in i de organotypiska skivor, var uttrycket av den fluorescerande heterologa genen övervakades genom konfokalmikroskopi. Tätheten hos biolistiska spridning med användning av den modifierade cylindern kan ses i figur 3A. Figur 3B visar en representativ bild av den transfekterade hippocampus region med DNA belagda guldnanopartiklar. Figur 4 visar representativa bilder av transfekterade vuxen mus organotypic skivor. Såsom kan ses i figur 4A, en Purkinje neuron med en anmärkningsvärd dendritisk hamn hittades vid gränsytan av Purkinje-skiktet och det molekylära skiktet i cerebellum visar uttalad märkning efter gående biolistisk transfektion med pEGFP-N1. Figur 4B visar en större förstoring av dessa dendriter där kan observeras ryggar. Figur 4C visar en pyramidcell finns i CA1 regionen i hippocampus efter biolistisk leverans av pDSredFP belagda guldnanopartiklar .
Färgämnen i stället för lysrör kodade DNA-laster kan också användas på ett liknande sätt att visualisera morfologiska egenskaper i organotypiska skivor. DiO, vilka etiketter plasmamembran, kan snabbare beskriva enskilda cell morfologier eller kan användas i kombination med en DNA-belagd biolistisk levereras till samma region för att bekräfta regioselection. Såsom kan ses i figur 5A en neuron färgade med DiO i hippocampus visar också långa dendriter med många ryggar. En pil indikerar axonet, vilken identifieras genom närvaron av synaptiska boutons i jämförelse med dentritic ryggar på de andra neuriter. Figur 5B visar ett annat exempel på CA1, som belyser många hippocampus utsprång med en DAPI räknare fläck för att märka kärnan. Figur 5C visar en större förstoring av dessa typer av parallella dendriter med många ryggar.
Uppenbar, dessa bilder visar morfologiska egenskaper efter cellulär märkning. Ingenting hindrar att samma metod från att tillämpas för att leverera valfritt antal exogena gener belagda på guldnanopartiklar. För att möjliggöra en visuell bekräftelse på framgångsrik transfektion kan en enda plasmid konstrueras att co-uttrycka både genen av intresse och en fluorescerande reporterprotein på samma vektor.
Figur 1 Gene eldröret och montering. (A) Den förbättrar d fat utvecklats av Dr O'Brien på MRC-LMB som har en begränsad biolistisk spridning som minimerar vävnadsskada genom att sänka det tryck som krävs för partikelacceleration. (B) sidovy av en optimerad genkanon mounting utvecklats av Dr Henderson och Dr Andras Nagy vid University of Toronto. Monteringen håller genkanonen vid exakt 90˚ vinkelrät mot organotypic skivor medan den tillåter användaren att noggrant styra avståndet av biolistisk leverans. För optimala biolistiska villkor pipan bländare ska placeras direkt över det intressanta området på 10 mm avstånd från organotypiska skivor. (C) Baksidan av genen pistol montering. Regionen av intresse att transfekteras måste placeras direkt under pipan öppningen. Inriktning kan bekräftas med färgämne (diolistic) eller fluorescerande protein tranfection (biolistisk).ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Organotypic slice förberedelse och regioselektiv inriktning. (A) En DMEM inbäddade vuxen mushjärna redo för skivning. (B) Formen limmades på vibroslicer montering med bladet redo att skära en skiva. (C) Regioselektiv heterologt genuttryck strategier för biolistisk leverans i koronala organotypiska hjärnan skivor. Bilder framställda av bilder som erhållits från Allen Brain Atlas anatomiska referens atlas 23. Vänster panel visar två olika områden i hjärnan riktade som ett exempel. För att begränsa genuttryck (1) till det kortikala område i den vänstra hemisfären. För att begränsa den heterologa genexpressionen (2) till hypotalamus-regionen av hjärnan. Middle panel visar that uttrycket av två heterologa gener (3 och 4) kan isoleras och jämför hippocampus av två halvklot i samma organotypisk skiva, i huvudsak eliminera någon bias från att använda olika sektioner och / eller bevilja möjligheten att ta itu med distal överhörning från effekterna av dessa gener. Höger panel visar den möjliga överlappningen av transgena leverans för att uttrycka den första genen (5) på ett exakt kortikala region samtidigt uttrycka en annan gen (6) i en disparat men överlappande kortikala område. Detta gör det möjligt att analysera effekten av genetisk modulering av varje heterologa genen ensam och även i kombination inom samma segment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Biolistisk scatter mönster ses på filtER papper med låg förstoring bild. (A) Den förbättrade fat avfyrades på filterpapper för att bestämma utbredningen av guldpartiklar. Vänster sida visar fördelningen av den förbättrade fat medan den högra panelen visar den normala pipan. Svart bar: 1 cm. Bild tagen från O'Brien et al. 17. (B) med låg förstoring bild visande den stokastiska transfektion patter inom de 3 mm biolistisk sprids inom hippocampala regionen av 6 veckor gamla möss. Vit bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Biolistic leverans av fluorescerande proteinet kodat DNA i organotypiska skivor av 6 veckor gamla möss. (A) Inverted konfokala bilder av en fast organotypisk del av lillhjärnan av en pEGFP-N1 belagda guldpartiklar transfekterade Purkinje cell. Bild tagen vid 40X förstoring. Svart bar:. 30 m (B) Visar en 60x förstoring av en annan Purkinje cellens dentritic hamnen för att lyfta fram de ryggar. Svart bar:. 5 pm (C) Visar en konfokala bild av fasta skivor tagna från hippocampus regionen vid 60x förstoring av fyra DSredFP transfekterade pyramidala celler. Svart bar:. 10 mikrometer klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Diolistic leverans av membranmärkning fluorescerande färgämnen i organotypiska skivor. (A) visar den levande avbildning av en hippocampus neuron labeled med DiO enligt 20x förstoring. De dentritic ryggar kan tydligt iakttas samt axonet som identifieras genom frånvaron av dentritic ryggar och förekomsten av synaptiska boutons indikeras med en vit pil. Vit bar:. 30 m (B) Uttalade färgning av hippocampus regionen märkt med DiO och motfärgades med DAPI. Vit bar:. 30 m (C) Högre förstoring (60x) av de dentritic spines finns i CA1 regionen i hippocampus. Vit bar:. 5 um Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet beskriver metoder för att leverera färgämnen och genetiska material till vuxna organotypiska skivor med hjälp av en förbättrad genkanon. I huvudsak de typer av färgämnen och olika möjliga gener gör denna metod mångfacetterat och lämpade att svara på en rad olika biologiska frågeställningar. Den regioselektiv leveransmetod som används, i detta fall till specifika hjärnregionen, öppnar nya vägar för experiment som heterolog gen modulering av lokala områden inom en biologiskt relevant arkitekturen har inte varit lätt genomförbart tidigare. Vi har tidigare fastställt att denna metod kan användas på vuxna organotypic skivor, där mogna synapser är fullt utformade, eftersom det visade förbättrad cellöverlevnad och heterolog genexpression i många veckor 13. Med tillkomsten av nya och förbättrade odlingsbetingelser för däggdjurshjärnor och andra vävnader, kommer användningen av regioselektiv genetiska modulationer blivit allt användbart för en mängd olika biochekemiska analyser.
Som vi skall lyfta fram här och som tidigare nämnts av andra 24, kan många olika faktorer lätt påverka noggrannheten och tillförlitligheten i biolistisk leverans. För det första måste beredningen av guldpartikel kopplad till färgämnen eller DNA vara tillräckligt balanseras för att förhindra aggregering och underlätta patronlast utvisning. Kalcium och spermidin i DNA-guld mikropartiklar lösning kan hjälpa bindningen av DNA-molekyler till guldnanopartiklar. Förmågan för nanopartiklarna att penetrera cellerna under reducerat tryck bestämts tidigare 17. För det andra måste genkanon monteras så jämn som möjligt med rätt vinkel och avstånd. En tillförlitlig tryckmätare är också nödvändig för att reproducera, att hålla vävnader integritet och att korrekt accelerera guldpartiklar till sina avsedda mål. Indeed, avståndet, orientering och utrustningens stabilitet är också en avgörande faktorer för targeting och precision regioselektiv leverans. Eftersom dessa hjärnstrukturer är mycket små, kan mindre variationer i tändvinkeln enkelt göra hela proceduren mindre tillförlitliga. Och slutligen, har att förbereda och bevara livskraftiga organotypiska skivor varit fylld med svårigheter för många decennier ännu rikligt och pålitliga protokoll för olika djur, hjärnan, åldrar och samodlingar är för närvarande tillgängliga 2,4,25,26. Dessa förfaranden bör vara användaroptimerad innan de lämnar in vävnaderna till biolistiska förfaranden. Detta kommer mera lätt tillåta användaren att unbiasedly utröna effekten av de biolistiska partiklar, och effekten av den heterologa genen på sina egna kulturer. För detta ändamål kan användningen av fluorescerande gener såsom EYFP och EGFP både möjliggöra en ny användare för att testa den målinriktande precision och också följa cellulär viabilitet genom heterolog genexpression under en utdragen tidsperiod 13. Många av de kritiska stegen för tillförlitligoch reproducerbar användning av detta protokoll markeras i följande tre punkter.
För effektiv transfektion, måste DNA-koncentrationen vara lämplig. Koncentrationer som är för låg skulle hindra transfektion avkastningen medan koncentrationer som är för höga kan orsaka agglomerering av nanopartiklar. Aggregat av guld kan dramatiskt reducera transfektionseffektiviteten, orsaka ojämna fördelningar, och kan leda till ökad cytotoxicitet och oxidativ stress. Problem med beläggnings effektivitet är sannolikt på grund av utgången av spermidine lösningen (bör bytas var 2 till 3 månader). För en adekvat biolistisk spridning, måste märkningen vara ännu. En icke-homogen märkning av guldnanopartiklar / DNA suspensionen kan bero på PVP lösningen. Det bör också bytas var 2 till 3 månader. Beläggning av guldnanopartiklar kan ses på agarosgelelektrofores som ett högre MW-bandet 27.
Varje biologisk system under utredning samt varje annat instrument som används kan kräva små förändringar i gastryck för att nå optimala nivåer av transfektion och biolistisk spridning. Den kritiska parametern är trycket av heliumpuls som krävs för att skala av mikro eller nanobärare från plastpatronen och driva dem i vävnaden. Ett högt gastryck kommer att påverka cellöverlevnad, eftersom det kommer att skapa chockvågor i hela målet och störa eller lösgöra vävnad från matrisen 17. Sikta genen eldröret och med apparaten exakt vinkelrätt mot vävnaden är viktiga för en korrekt biolistisk leverans. Det markerade området bör placeras i den direkta centrum av cylindern vid exakt 10 mm från den yttre öppningen. Detta resulterar i en 3 mm diameter guldpartikel leverans runt epicentrum. Genen eldrör bör rengöras med 70% etanol efter varje användning. För att skydda vävnaden från stora partikelaggregat, tunnan innehåller också ett nylonnät som should bytas regelbundet för att bibehålla optimal prestanda. För att ersätta de mask skruva av locket sätter sedan en ny nylonnät mellan locket och O-ringen.
Fluorescerande celler bör kunna synas minst 1-2 dagar efter transfektion runt epicentrum. Avsaknad av eller felaktig inriktning av märkningen kan bero på bristande förberedelser och instabilitet av genen pistol montering. Observationerna av celler med hjälp konfokalmikroskopi beror på ett antal faktorer: våglängden för excitation / emission ljus, pinhole storlek, NA på objektivlinsen, brytningsindex av komponenter i strålgången, djup vävnad och anpassningen av instrumentet. Dessa faktorer bör optimeras för varje system under utredning.
Senaste framstegen inom biolistik utnyttjades för framgången med denna metod. Genen eldrör som används i denna studie ändrades för att minska trycket behövs samt tratt biolistiskaspridningsmönster till en mer begränsad och specifikt område 17,19. Andra fat ändringar har försökt att begränsa biolistiska spridningen och minska utflödet trycket 28 men detta specialdesignade gen eldröret designad av Dr O'Brien är en enda komponent monterad på standard Helios Gene pistol. Därefter tillsattes sub-mikrometerguldpartiklar används för att reducera invasivitet av mikrometerpartiklar som vi tidigare hade bestämts orsakade cellulär skada och slutligen förlust av fördröjd heterolog genexpression. Dessa förändringar i biolistiska förfarande förbättrat den allmänna genomförbarhet och metodens reproducerbarhet 13. Andra förbättringar på skiva beredning såsom fördjupad felsökning av skivning förfarandet, med hjälp av en DMEM-agarosmatris att bevara hjärnan, och många andra användbara framsteg inom organotypisk hjärnan skiva beredning tidigare rapporterade 13 gjorde det möjligt att undersöka användningen av vuxna skivor som har utvecklat mognasynaptiska nätverk.
I vår studie använde vi främst färgämnen och fluorescerande heterologa gener att visualisera cellmorfologin som en avläsning på transfektionsverkan och en förmåga att bilden morfologiska kännetecken av nervceller i mus hjärnvävnader. Den signal-brusförhållandet för stokastiska leverans inom en definierad radie möjligt för oss att helt isolera en enda cell är dentritic hamn inom dess naturliga sammanhang. Som många insatser används för att undersöka dessa morfologiska egenskaper, för att kartlägga "connectomics" eller märka enstaka celler för olika analyser, kan denna metod enkelt kombineras med befintliga protokoll såsom elektrofysiologiska och neurite mätningar 29,30. Uppenbar, kombinationer av fluorescerande heterologa gener skulle kunna göra det möjligt för en mycket mer robust avgränsning av enskilda celler som stokastiska fördelningen av fluorescerande proteiner, och deras kombination skulle bestämma färgen på de enskilda cellerna 31,32. Användningen av cellspecifika promotorer såsom synapsin och gliafibrillärt surt protein uppströms om den heterologa genen exonen kan också begränsa expressionen till subpopulationer 33. I själva verket skulle den ändlösa rad av genetiskt material även levereras i ett regioselektivt sätt av guldnanopartiklar som använder samma procedur. De totala transfekterade regionerna skulle därmed analyseras med traditionella metoder, såsom dissektion och skicka det området till västra immunoblotting att analysera lokal effekt av den heterologa genen.
Förbättringar i organotypiska slice förfaranden kommer också att tillåta ökad användning av hjärnvävnader för långtidsexperiment samt tillåter användning av andra vävnader och samodlingar och underlätta transfektionsmetoder förfaranden. Lipid och polymer transfektion tidigare har rapporterats påverka membran homeostas, interna, protein permeabilitet 34 och ofta visar mycket låg effektivitet att transfektera terminally differentierade neuroner. Cell specifik last Inriktning är också mottaglig endast för celler som uttrycker cellytreceptorer behövs för intemalisering, och även om denna metod kan vara mycket selektiv, kan det saknar riktade regioselektivitet 35. Virusvektorer annars ofta är svåra och kostsamma att tillverka, kräver strikta regler och har ibland visat oro för säkerheten. Biolistisk leverans har alltså en enastående förmåga att regioselektivt transfektera nervceller och andra celltyper inom viabla vävnader. Eftersom guld är inte giftiga, ytterligare framsteg i användningen av biolistik kan bana väg för biomedicinska användningar såsom transdermal läkemedelsleverans, icke-invasiv in vivo genleverans, samt lokala icke-virala genterapi.
Acknowledgments
Författarna vill tacka MRC-LMB verkstad för tillverkning av den förbättrade genen eldröret. Vi vill också tacka Dr David R. Hampson vid universitetet i Toronto för användning av utrustning och resurser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
References
- Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
- Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
- Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
- Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
- Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
- Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
- Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
- Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544 (2013).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
- Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
- Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
- Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
- Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
- Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017 (2012).
- Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).
- Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
- Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
- Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).
