Abstract
A transfecção de DNA tem sido inestimável para ciências biológicas e com os recentes avanços em preparações fatia do cérebro organotypic, o efeito de vários genes heterólogos poderia, assim, ser investigado facilmente, mantendo muitos aspectos da biologia in vivo. Tem havido um interesse crescente para transf neurônios terminalmente diferenciadas para que os métodos de transfecção convencionais têm sido repleta de dificuldades, como os baixos rendimentos e perdas significativas para a viabilidade. Biolistic transfecção pode contornar muitas destas dificuldades ainda apenas recentemente esta técnica foi modificada de modo que é favorável para uso em tecidos de mamíferos.
Novas modificações na câmara de acelerador ter maior precisão de tiro da arma do gene e aumentou suas profundidades de penetração ao mesmo tempo, permitindo o uso de menor pressão de gás (50 psi), sem perda de eficiência de transfecção, bem como permitir a propagação regiosseletiva focalizada do paARTIGOS para dentro de 3 mm. Além disso, esta técnica é para a frente e mais rapidamente do que para realizar microinjections fastidiosos. Ambos transitória e expressão estável de nanopartículas são possíveis com bombardeamento onde expressão episómico podem ser detectados dentro de 24 horas e a sobrevivência de células mostrou-se melhor do que, ou igual a, pelo menos, os métodos convencionais. Esta técnica tem contudo uma vantagem importante: ela permite a transfecção para ser localizada dentro de um único raio retido permitindo assim que o utilizador isolar anatomicamente efeitos do gene heterólogo. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para preparar adultos viável fatias organotypic e submetê-los a regiosseletiva transfecção utilizando uma arma gene melhorado.
Introduction
Originalmente, a técnica de biobalística, uma frase da virada para "balística biológicos", foi criada para a transferência de genes mediada por partículas em células de plantas 1. Este método físico de transformação celular ou nanopartículas micro acelera a velocidade elevada para superar as barreiras físicas das membranas celulares impermeáveis de modo a fornecer cargas, tais como o DNA ou corantes. Porque não dependem de ligando-receptores específicos e / ou as propriedades bioquímicas nas membranas da superfície das células, a transferência de genes mediada por partículas pode ser facilmente aplicado a uma variedade de sistemas biológicos, tais como fatias cerebrais organotípicas.
Usando fatias organotypic têm vantagens sobre outros em plataformas in vitro, uma vez que manter muitas propriedades anatômicas e bioquímicas que são pertinentes para in vivo biologia 2-4. As fatias de conservar a maior parte das características arquitetônicas locais de onde eles se originaram e preserve atividade neuroquímica ea conectividade das sinapses. O uso de fatias do cérebro para a pesquisa básica, e em empreendimentos farmacêuticos, concomitantemente tem aumentado com o número de possíveis manipulações biotecnológicas para medir e monitorar os comportamentos neurobiológicos do cérebro em um in vivo como contexto 3,5-7. As grandes vantagens para a utilização de sistemas de ensaio baseados em organotípicas de fatias é que ele proporciona um controlo fácil e experimental permite manipulações precisas de ambientes extracelulares.
Proveitosamente, sistemas de cultura organotípica fatia foram estabelecidas a partir de uma variedade de regiões cerebrais, tais como, mas não limitado a, o córtex, medula espinhal e cerebelo de 8-10. Além disso, tem sido demonstrado uma série de co-culturas, o que permite a avaliação da comunicação intercelular entre as regiões cerebrais distais, bem como entre os neurônios e células patológicas 11,12. Muitos protocolos já foram estabelecidos para successfully fatias cultura organotypic e pode manter a viabilidade a longo prazo e muitos estudos recentes agora utilizar os métodos de interface membrana e diversas modificações para ele 13. Este princípio mantém as fatias organotípicas na interface entre o meio e uma atmosfera humidificada da incubadora, colocando as fatias em um filtro de membrana porosa. O meio pode, assim, proporcionar nutrientes suficientes para alimentar as fatias organotípicas através movimento capilar. Normalmente fatias foram preparados a partir de animais pós-natal precoce (3-9 dias de idade; P3 - 9). No entanto, a partir de tecidos cerebrais essas fatias apresentam um elevado grau de plasticidade celular e tem uma resistência inerente às solicitações mecânicas, o que é útil para obter culturas viáveis, ainda sinapses maduras e circuitos neuroanatômico não totalmente desenvolvido in vivo, até 2 a 3 semanas de idade 14. Por exemplo, observações anteriores tinham demonstrado que os obtidos a partir de fatias de hipocampo P0 - 1 neonatos, embora altamente VIABle seguinte preparação, foi perdendo algumas características morfológicas. Essencialmente, eles mostraram-se inadequadas para as culturas de longo prazo, sugerindo células imaturas eram mais propensos a de-diferenciada em comparação com culturas organotypic de animais mais velhos 15,16. Por esta razão, o nosso método foi otimizado para fatias de cérebro organotypic adultos em que a maturação e desenvolvimento arquitetônico tenham atingido os seus estágios terminais 13,17-21. No entanto, este método também é adequado para recém-nascidos e fatias organotípicas juvenis.
Uma vez que as fatias organotípicas viáveis foram produzidos toda a placa contendo as fatias pode ser trazido para a montagem biolística e submetidos a entrega regiosselectiva e transfecção. A montagem adequada da pistola de genes (tal como descrito na Figura 1), orientado a 90 °, a uma distância de 10 milímetros directamente sobre as fatias (a partir da abertura para o tecido), permite o fornecimento biolístico rápida dos 40 nm irld cargas de partículas revestidas. Estas cargas, tais como corantes fluorescentes e vectores de ADN, bem como qualquer gene de interesse, são facilmente entregue nas fatias viáveis com facilidade. Este método, portanto, descreve o protocolo necessário para fornecer, de uma maneira regio-selectiva, carga nanopartículas de ouro revestido em fatias de cérebro organotípicas viáveis. O cano da arma gene e montagem ideal pode ser visto na Figura 1. Para mais informações sobre o barril e nanopartículas melhorou balística, consulte O'Brien, et al. 17.
Refinamentos subsequentes também são indicados para o utilizador para optimizar as condições, tais como a quantidade adequada de ouro entregue por área alvo, como definido microtransportador quantidade de carregamento (MLQ), e para determinar a quantidade de ADN carregado por mg de ouro, definido como ADN Carregando Proporção (DLR). Antes de precipitar DNA em partículas de ouro e colocá-los na tubulação Tefzel que compreende os cartuchos da arma gene real '9 ;, é necessário para calcular a quantidade de ADN e de ouro necessária para cada transfecção, que podem diferir um pouco entre os tecidos e condições (proporção deve ser mantida entre 1 mg de ouro e 1 ug de ADN de 1: 5). É vital para preparar a proporção adequada de MLQ a DLR em contrário DNA revestido partículas de ouro poderia aderir juntos formando maior do que a aglomeração esperado, o que poderia reduzir a homogeneidade global da propagação biobalística, bem como danos aumento do tecido e citotoxicidade.
Este método mostra as recentes melhorias na prestação de biobalística, que foram testados e considerados passíveis de fatias do cérebro organotypic neonatais, jovens e adultos. Além disso, através da exploração de spread reduzido biobalística do cano da arma gene, o usuário agora é capaz de transfecção seletivamente uma região pontual no cérebro. Após o tempo de incubação apropriado, a expressão das proteínas fluorescentes, que atinge os seus valores máximos entre 24 e 48h, pode ser visualizada por microscopia confocal e epifluorescência. Estes fluorophores permitir a análise morfológica e localização das células individuais dentro de estruturas biologicamente relevantes. No entanto, a modulação regiosselectiva das fatias organotípicas de outros genes heterólogos também podem ser monitorizadas por quaisquer outros testes passíveis para estas preparações. Possíveis estratégias úteis para a entrega de genes localizados são apresentados na Figura 2.
Protocol
A utilização de animais e tecidos de origem animal devem aderir estritamente a aprovação ética comitê sob regras e regulamentos locais. Todos os tecidos obtidos durante este estudo seguiram os critérios de experimentação animais do MRC-LMB.
1 Preparação de Materiais e Meios de Cultura
- Prepare todas as soluções que utilizam água Millipore; utilizar apenas reagentes de grau analítico. Preparar e armazenar todos os reagentes à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário).
- Adicione 500 ml de solução salina tamponada com HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C.
- Adicione 500 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS; de 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Esterilizar em autoclave.
- Preparar meio neuronal, completando DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) com HEPES 25 mM, 10% de soro fetal de vitelo, 30 mM de glucose, 1: 100 N2 supplement, penicilina-estreptomicina 1100 U / ml; pH 7,2. Filtro com uma unidade de filtro estéril de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C.
- Faça solução de polivinilpirrolidona (PVP) de ações com 20 mg em 1 ml PVP 100% de etanol. Alíquota isso em 1 ml quantidades, congelar e armazenar a -20 ° C. A solução de trabalho é de 0,05 mg / ml, por conseguinte, adicionam-se 10 ul de solução de reserva de PVP a cada 4 ml de etanol a 100%.
- Prepara-se uma solução de reserva 0,05 M, espermidina em água Millipore; ajustar o pH para 7,2.
- Adicione uma solução de agarose a 2% em DMEM (2 g de agarose grau electroforese em 100 ml de DMEM em um frasco de tampa de rosca esterilizado). Microondas isso até que a agarose foi dissolvida. Guarde na geladeira a 4 ° C durante várias semanas, se necessário.
2 Preparação de Organotípicas Fatias
- Eutanásia C57 Preto 6 machos da idade desejada por asfixia com CO2, seguido por decapitação. Remover o cérebro usando cortes lateral do crânio, partindo do forame magno e terminando noos lobos olfativos. Suavemente elevar a partir da parte traseira do crânio para expor o cérebro.
- Cortar entre os lóbulos olfactivas e o córtex frontal e rostral ao cerebelo. Suavemente elevar a porção rostral do cérebro e cortar os nervos ópticos. Por fim, retire o cérebro e colocá-lo em uma placa de petri preenchida com soro fisiológico gelado frio HEPES no gelo.
- Usando um microscópio de dissecação, retire a pia usando uma pinça fina; cuidadosamente remover meninges e vasos sanguíneos em torno do cérebro.
- Coloque o cérebro fresco em um pequeno molde recipiente e cubra-o com a solução de agarose arrefecido a ligeiramente acima da RT. Em seguida, arrefecer rapidamente o molde a 4 ° C, colocando-o em gelo.
NOTA: Processar os fatias tão rapidamente quanto possível para evitar a perda de viabilidade. - Quando a agarose foi definido (5 - 10 min), remoção do cérebro embebidas em agarose a partir do molde (guarnição se necessário) e, em seguida, cola-lo para a plataforma vibroslicer. Coloque isso em uma câmara vibroslicer contendo gelo estéril PBS frio. Disinfect a câmara vibroslicer antes de serem utilizados com etanol a 70% para minimizar as contaminações subsequentes.
- Corte o cérebro usando um vibroslicer personalizado construído ou equivalente comercial. O conceito de modelo foi desenhar um fatiador de tecidos que podem gerar uma grande amplitude e alta frequência de movimentos horizontais para a aresta da lâmina, enquanto minimiza as vibrações verticais.
- Utilizar a frequência de oscilação de 90 Hz, a uma amplitude de 1,5 - 2,0 mm, e a lâmina de corte posicionada num ângulo de 15 ° em relação ao plano horizontal; definir o bloco de montagem prende o cérebro embebidas em agarose a mover-se em 1,7 mm / min, para a lâmina. Recolhe secções (150 um) para um meio contendo gelo cultura câmara fria (DMEM Pen / Strep + 10% de FCS). Ver corte e manipulação das fatias de tecido como um vídeo complementar em Arsenault e O'Brien 13.
- Delicadamente, coloque as fatias em inserções de cultura de células (0,4 um, 30 milímetros de diâmetro) em uma bandeja 6 multi-bem com os med culturaIA no exterior do inserto, e incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2.
NOTA: Para a viabilidade do tecido adequado, ser extremamente gentil ao transferir e manipular as fatias. Além disso, o excesso de fluido irá impedir que as fatias organotípicas de aderir à membrana do cartucho do filtro. Se isso acontecer, remova o excesso de fluido ou placa novamente. - Apesar de os cortes organotypic podem ser cultivadas por algumas semanas, prossiga para a transfecção, o mais tardar quatro dias após o plaqueamento para melhores rendimentos de transfecção.
NOTA: Para evitar o crescimento excessivo da glia em condições de cultura de longo prazo, o uso AraC ou meio sem soro 2.
3 Preparação revestido de ADN Micro e Nano-projéteis
- Prepare nano-projéteis usando 40 nm partículas de ouro diâmetro. Resumidamente, adicionar 50 ul de espermidina 0,05 M, e 10 uL de ADN a 1 mg / ml (pEYFP-N1) e 10 mg de partículas de ouro.
- Adicionar cálcio e espermidina no mix de soluçãotura durante ADN micro-partículas de ouro de preparação, a fim de auxiliar a ligação de moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro.
NOTA: A quantidade de DNA usada por mg de ouro transportadoras (DLR), deve situar-se entre 1 e 5 ug de ADN por mg de ouro 1. Além disso, a quantidade de partículas de ouro transportadoras que vai ser disparado por cartucho (MLQ), em si deve variar de 0,1 a 0,5 mg de ouro. O DLR e MLQ devem ser julgados e otimizado para cada usuário, dependendo do sistema particular sob investigação, bem como o tipo de partícula e gene arma usada.
- Adicionar cálcio e espermidina no mix de soluçãotura durante ADN micro-partículas de ouro de preparação, a fim de auxiliar a ligação de moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro.
- Misturar utilizando um vórtice enquanto se adicionavam lentamente 50 mL de 1 M de CaCl2 em fracções de 10 - 15 mL. Após 5 min de vórtex ocasional, centrifugar a 1000 xg por 30 segundos, em seguida, remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de partículas de ouro em 3,5 ml de 0,075 M de PVP.
- Desenhar desta suspensão em tubos (diâmetro interno 2,36 milímetros), utilizando uma seringa. Coloque o tubo na estação de preparação de tubulação. Permitir que opartículas de ouro para assentar e remover o sobrenadante por aspiração com uma seringa. Girar o tubo de espalhar uniformemente as partículas de ouro, que foram subsequentemente secas sob uma corrente de azoto constante de 5 L por min.
- Para criar ADN balas, cortar o tubo usando um cortador de tubos em um centímetro de comprimento. Ou imediatamente inserir no interior do cartucho de pistola de genes ou manter desidratado (4 ° C), até ser necessário.
4. Biolistic transfecção em Organotípicas Fatias
- Execute as seguintes etapas dentro de uma capela de fluxo laminar estéril.
- Insira uma bateria de 9 V e um suporte de cartucho vazio na arma gene Helios.
- Fixe a pistola de genes para o tanque de hélio, com a mangueira de hélio. Fogo 2-3 espaços em branco (espaços vazios) a 50 psi para pressurizar o tubo de hélio e os reservatórios da arma.
- Carregar os cartuchos contendo o ouro revestido de ADN dentro dos suportes de cartucho e carregar o suporte na pistola de genes.
- Desaperte o gene gun espaçador e anexaro cano da arma de genes modificados para a pistola de genes.
- Utilizando uma pinça estéril, colocar um elemento filtrante contendo a fatia organotípica em um prato de plástico estéril.
- Remova a mídia da fatias organotypic.
- Ajuste a pressão do gás a 50 psi.
Observação: A proteção dos olhos é essencial e protetores de ouvido aconselhável. - Coloque a pistola de genes nas distâncias adequadas, utilizando a montagem de medição para 10 mm. Procurar com cuidado o centro do tambor sobre a região desejada para entrega genética.
- Após o disparo, substituir as pastilhas de volta para o seu prato com meio fresco e devolvê-las às condições normais de crescimento, isto é, 37 ° C com 5% de CO 2 incubadora.
- Uma vez terminado, feche o tanque de hélio, solte a pressão da pistola de genes e retirar a arma gene do tanque de hélio.
- Retire o suporte do cartucho e descartar os cartuchos e limpar a arma gene.
- Verifique o tecido para a morfologia e para a penetração bem sucedida por viLízing as fatias utilizando um microscópio invertido. Se estiver usando micropartículas, dispersar uniformemente o ouro; não deve haver áreas densas de partículas de ouro visto na fatia. As nanopartículas, devido ao seu pequeno tamanho não pode ser visto como unidades individuais por técnicas de microscopia convencional.
- Após o intervalo de tempo apropriado (normalmente 1-2 dias), as fatias de fixar em 4% de paraformaldeído (PFA) para observação microscópica.
NOTA: Fixação em PFA nem sempre é desejado. Para imagem de células vivas evitar este passo.
5 Fixação e visualização de fatias do cérebro
- Após transfecção biolística, fatias lavar duas vezes em PBS durante 2 min.
- Fix fatias por incubação em frescos, gelada PFA a 4% em PBS durante 20 min.
- Lavar as fatias duas vezes em PBS durante 2 min.
- Gentilmente cortar rodada da membrana suporta o uso de um bisturi, sem perturbar as fatias montadas sobre eles. Use uma pinça para colocar cada membrana apoio / fatia em uma lâmina de microscópio. Descanse o organotypic fatias por cima da membrana da lâmina de vidro.
- Adicionar uma gota de meio de montagem por cima da fatia e adicionar uma lamela suavemente sem qualquer força directamente em contacto com a fatia organotípicas.
- Fixe a lamela com uma fina camada de verniz para as unhas.
- Ver as fatias em um microscópio apropriado.
6. Aplicações confocal
- Visualize as fatias usando uma confocal de varredura a laser microscópio vertical com um 60x / 1,4 abertura numérica (NA) de imersão em óleo lente objetiva.
NOTA: A característica mais problemática do microscópio confocal é o tamanho pinhole (fixado em 1 UA), que é capaz de isolar e recolher um plano de foco, eliminando assim o fora de foco 'névoa' normalmente visto com uma amostra fluorescente. Os detalhes finos são muitas vezes obscurecido pela névoa e este não pode ser detectada num microscópio nonconfocal. - Defina o laser de argônio para um comprimento de onda de excitação de 488 nm e otimizar a coleta de lositted luz na banda de 500-520 nm. Tipicamente, recolhem imagens em 1024 x 1024 pixels e com pilhas de z-secções em intervalos de 0,5 micron para abranger toda a largura de cada uma das células do nervo, que foi analisada.
- Para observar a morfologia do núcleo, contra-coram as células com DAPI (comprimento de onda de excitação fixado em 405 nm e a emissão de luz recolhida entre 420-4 40 nm). Finalmente, para o exame de fluorescência vermelha, colocar o laser em 561 nm para excitação e 565-620 nm para emissão.
- Normalmente, aquisição de imagens usando um zoom de 4X varredura que cobriu uma área de 57,6 mM 2; tamanhos de imagem foram na região de 1.024 x 1.024 pixels. Pilhas recordes de z-seções em intervalos de 0,5 micron e projeções de 5-8 quadros combinados.
Representative Results
Viabilidade fatia organotípicas pode ser monitorizado com a actividade de lactato desidrogenase, rotulagem iodeto de propídio, e coloração dUTP como foi anteriormente relatado 13,22. Evidentemente, a viabilidade ea integridade das fatias são importantes para a expressão sustentada a longo-prazo da carga genética entregue. Após a entrega biol�tica nas fatias organotípicas, a expressão do gene heterólogo fluorescente foi monitorizado por microscopia confocal. O aperto da propagação biol�tica usando o barril modificado pode ser visto na Figura 3A. Figura 3B mostra uma imagem representativa da região do hipocampo transfectadas utilizando ADN nanopartículas de ouro revestido. Figura 4 mostra imagens representativas de fatias organotípicas adulto rato transfectadas. Como pode ser observado na Figura 4A, um neurónio, com um porto de Purkinje dendrítica notável encontrada na interface da camada de Purkinje e da camada molecular do cerebellum mostra rotulagem pronunciado após transfecção transitória com biol�tica pEGFP-N1. Figura 4B mostra uma ampliação maior do que estes dendritos espinhas podem ser observadas. Figura 4C mostra uma célula piramidal encontrada na região CA1 do hipocampo após o fornecimento biolístico de nanopartículas de ouro revestidas pDSredFP .
Corantes fluorescentes codificado em vez de cargas de DNA também pode ser usado de um modo semelhante ao visualizar as características morfológicas em fatias organotípicas. DiO, que marca as membranas de plasma, pode delinear mais rapidamente morfologias celulares individuais ou pode ser utilizado em conjunto com um biolística de ADN revestido entregues para a mesma região para confirmar a regioselection. Como pode ser visto na Figura 5A um neurónio coradas com DiO no hipocampo, também mostra longos dendritos com numerosos espinhos. Uma seta indica o axónio o qual é identificado pela presença de boutons sinápticas em comparação com o dentritic espinhas nos outros neurites. Figura 5B mostra um outro exemplo de CA1, que destaca numerosas saliências do hipocampo, com um contra-corante de DAPI para marcar o núcleo. Figura 5C mostra uma ampliação maior destes tipos de dendrites paralelas com numerosos espinhos.
Evidentemente, essas imagens ilustram características morfológicas seguintes rotulagem celular. Nada impede que a mesma metodologia a ser aplicada para entrega de qualquer número de genes exógenos que revestem as nanopartículas de ouro. Para permitir a confirmação visual da transfecção bem sucedida, um único plasmídeo pode ser construída para co-expressar tanto o gene de interesse e uma proteína repórter fluorescente no mesmo vector.
Figura 1 Gene cano da arma e de montagem. (A) A melhorar d barril desenvolvido pelo Dr. O'Brien no MRC-LMB, que tem uma distribuição restrita biolistico que minimiza os danos de tecidos, diminuindo a pressão necessária para a aceleração de partículas. (B) A vista lateral de uma pistola de genes optimizados montagem desenvolvido pelo Dr. Henderson e Dr. Andras Nagy, da Universidade de Toronto. A montagem segura a arma de genes, precisamente 90˚ perpendicular às fatias organotípicas enquanto permite ao utilizador controlar com precisão a distância de distribuição biolistica. Para condições ideais biolística a abertura barril deve ser colocado diretamente sobre a região de interesse a uma distância de 10 mm da fatias organotypic. (C) Vista traseira da arma gene montagem. A região de interesse para ser transfectada necessita de ser colocado directamente por baixo da abertura do tambor. Segmentação pode ser confirmado com corante (diolistic) ou transfecção proteína fluorescente (biobalística).ank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. preparação organotípicas fatia e direccionamento regiosselectiva. (A) Um DMEM incorporado cérebro do rato adulto pronto para corte. (B) O molde foi colada sobre a montagem com a lâmina pronta para cortar uma fatia vibroslicer. (C) regiosseletiva expressão de genes heterólogos estratégias para entrega biol�tica coronais em fatias de cérebro organotípicas. Imagens preparados a partir de imagens obtidas a partir dos Atlas Cerebral Allen atlas de referência anatômica 23. O painel esquerdo mostra duas regiões diferentes do cérebro direccionadas, tal como um exemplo. Para restringir a expressão do gene (1) para a área cortical do hemisfério esquerdo. Para restringir a expressão de genes heterólogos (2) a região do hipotálamo no cérebro. Painel do meio mostra that a expressão de dois genes heterólogos (3 e 4) pode ser isolado e compara o hipocampo dos dois hemisférios na mesma fatia organotípica, eliminando essencialmente qualquer tendência de utilizar secções diferentes e / ou que assegurem a possibilidade de tratar a diafonia distal dos efeitos do esses genes. O painel direito mostra a possível sobreposição de entrega transgénico para expressar o primeiro gene (5) em uma região cortical preciso ao expressar um outro gene (6) em uma díspar ainda sobreposição área cortical. Isso permite analisar o efeito da modulação genética de cada gene heterólogo sozinho e também em combinação dentro da mesma fatia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 padrão de dispersão Biolistic visto em filter imagem de baixa ampliação e papel. (A) O tambor foi disparado melhorada sobre papel de filtro para determinar a propagação de partículas de ouro. O lado esquerdo mostra a distribuição do barril melhorada enquanto o painel da direita mostra o tambor normal. Preto bar: 1 cm. A imagem obtida a partir de O'Brien et al. 17. (B) imagem baixa ampliação que mostra o padrão de transfecção estocástica dentro dos três milímetros propagação biol�tica dentro da região do hipocampo de ratinhos seis semanas de idade. Branco bar.: 100 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Biolistic entrega de proteína fluorescente de ADN codificados em fatias organotípicas de seis semanas ratos velhos. (A) inverted imagens confocais de uma fatia organotípicas fixo do cerebelo de uma célula de Purkinje pEGFP-N1 partículas de ouro revestidas transfectadas. A imagem foi tirada em 40X. Preto bar.: 30 mm (B) mostra uma ampliação de porto dendrítica de outra célula Purkinje para destacar as espinhas 60x. Preto bar.: 5 m (C) mostra uma imagem confocal de fatias fixos retirados na região do hipocampo em 60x ampliação de quatro DSredFP transfectadas células piramidais. Preto bar.: 10 m Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 Diolistic entrega de corantes fluorescentes de rotulagem membrana em fatias organotípicas. (A) mostra a imagem ao vivo de um neurónio do hipocampo labeled com DiO sob ampliação 20X. As espinhas dendríticas pode claramente ser observada, bem como o axónio como identificados pela ausência de espinhas dendríticas e a presença de boutons sinápticas indicados por uma seta branca. Branco bar: (B) coloração 30 mm pronunciada da região do hipocampo marcado com DiO e contrastado com DAPI.. Barra branca:. De 30 um (C) Maior ampliação (60x) de espinhas dendríticas encontrados na região CA1 do hipocampo. Branco bar.: 5 m Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descreve abordagens para entregar corantes e materiais genéticos em fatias organotípicas adultas utilizando uma pistola de genes melhorada. Essencialmente, os tipos de corantes e a variedade de possíveis genes fazem deste método multifacetado e passível de responder a uma grande variedade de questões biológicas. O método de entrega regiosseletiva utilizado, neste caso, a região específica do cérebro, abre novos caminhos para a experimentação como modulação de genes heterólogos de áreas localizadas dentro de uma arquitetura biologicamente relevante não foi facilmente exequível antes. Temos previamente determinado que este método pode ser usado em fatias organotípicas adulto, onde sinapses maduras são totalmente formados, tal como revelou melhoria na sobrevivência de células e expressão de genes heterólogos para muitas semanas 13. Com o advento de novas e melhoradas as condições de cultura para o cérebro de mamíferos, bem como outros tecidos, a utilização de modulação genéticas regiosselectiva se tornará cada vez mais úteis para uma grande variedade de BiocheMical analisa.
Como vamos destacar aqui e anteriormente mencionado por outros 24, muitos fatores diferentes podem facilmente afetar a precisão e confiabilidade de entrega biobalística. Em primeiro lugar, a preparação das partículas de ouro ligados a corantes ou de DNA deve ser adequadamente equilibrado para evitar a agregação e a fim de facilitar a expulsão da carga do cartucho. Cálcio e espermidina na solução de micro partículas de ADN-ouro pode ajudar a ligação das moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro. A capacidade para as nanopartículas de penetrar nas células, sob pressão reduzida foi previamente determinado 17. Em segundo lugar, a arma gene deve ser montado o mais estável possível com o ângulo ea distância correta. Um manómetro de confiança é também necessário para a reprodutibilidade, para manter a integridade do tecido, e para acelerar adequadamente as partículas de ouro para os seus objectivos pretendidos. Com efeito, a distância, a orientação, e a estabilidade do equipamento também estão factores cruciais para a targeting e precisão de entrega regiosseletiva. Como estas estruturas cerebrais são muito pequenas, pequenas variações no ângulo de disparo poderia facilmente tornar todo o processo mais confiável. E, finalmente, a preparação e manutenção de fatias organotypic viáveis foram repleta de dificuldades para muitas décadas ainda protocolos abundantes e confiáveis para animais diferentes, regiões do cérebro, idades e co-culturas estão disponíveis 2,4,25,26. Estes procedimentos devem ser antes de submeter os tecidos para procedimentos biolística otimizado pelo usuário. Isto irá mais facilmente permitir ao utilizador verificar unbiasedly o impacto das partículas biolística e o efeito do gene heterólogo nas suas próprias culturas. Para este fim, a utilização de genes fluorescentes tais como EYFP EGFP e tanto pode permitir um novo utilizador para testar a precisão de direccionamento e também a seguir a viabilidade celular através da expressão do gene heterólogo ao longo de um período sustentado de tempo 13. Muitos dos passos críticos para fiávele uso reprodutível deste protocolo são destacados nos três parágrafos seguintes.
Para a transfecção eficaz, a concentração de DNA deve ser apropriado. As concentrações que são muito baixos prejudicaria o rendimento transfecção enquanto que as concentrações muito altas pode causar aglomeração das nanopartículas. Os agregados de ouro pode reduzir drasticamente a eficiência da transfecção, causar distribuições irregulares, e pode levar a um aumento da citotoxicidade e stress oxidativo. Problemas com a eficácia do revestimento são provavelmente devido à expiração da solução espermidina (deve ser substituído a cada 2 a 3 meses). Para uma propagação biobalística adequada, a rotulagem deve ser mesmo. A marcação não-homogénea da suspensão de nanopartículas de ouro / ADN pode ser devido à solução de PVP. Também deve ser substituído cada 2 a 3 meses. Revestimento das nanopartículas de ouro pode ser visto na electroforese em gel de agarose, como uma faixa de MW mais elevado 27.
Cada sist biológicalos sob investigação, bem como cada instrumento diferente usado pode exigir pequenas mudanças na pressão do gás para atingir níveis optimizados de transfecção e propagação biobalística. O parâmetro crítico é a pressão do impulso de hélio necessário para retirar o micro ou nano-transportadores a partir do cartucho de plástico e empurrá-las para o tecido. A pressão do gás de alta vai afetar a sobrevivência da célula, porque vai criar ondas de choque em todo o alvo e interromper ou retirar o tecido da matriz 17. Visando o cano da arma de genes e possuindo o aparelho exatamente perpendicular ao tecido é importante para a entrega precisas biolística. A área seleccionada deve ser colocado no centro do tambor directa, precisamente de 10 mm da abertura exterior. Isto resulta em um diâmetro de 3 mm de distribuição de partículas de ouro em volta do epicentro. O cano da arma gene deve ser limpa com álcool 70% após cada utilização. Para proteger o tecido a partir de grandes agregados de partículas, o tambor também contém uma malha de nylon que should ser substituídas regularmente para manter o desempenho ideal. A fim de substituir as malhas desapertar a tampa, em seguida, inserir uma nova malha de nylon entre a tampa eo O-ring.
Células marcadas por fluorescência deveria ser visível pelo menos 1 - 2 dias após a transfecção em torno do epicentro. Ausência ou desalinhamento de rotulagem pode ser resultado de uma preparação inadequada e instabilidade da montagem arma gene. As observações de células usando microscopia confocal depende de uma série de factores: o comprimento de onda da luz de excitação / emissão, o tamanho do orifício, NA da lente objectiva, de índice de refracção dos componentes no caminho da luz, a profundidade do tecido, e o alinhamento de o instrumento. Esses fatores devem ser otimizados para cada sistema sob investigação.
Recentes avanços em biol�tica foram exploradas para o sucesso deste método. O cano da arma de genes utilizados no presente estudo foi modificado de modo a reduzir a pressão necessária, assim como canalizar o biol�ticapadrão de dispersão para uma forma mais restrita e específica área de 17,19. Outras modificações barril tentaram restringir a disseminação de biobalística e reduzir a pressão de saída 28 ainda este gene cano da arma projetado projetado pelo Dr. O'Brien é um único componente instalado na arma Helios Gene padrão. Subsequentemente, as partículas sub-micrométricas de ouro foram usadas para reduzir a capacidade de invasão das partículas micrométricas que determinaram previamente causado dano celular e em última instância, a perda de expressão do gene heterólogo sustentada. Estas modificações do procedimento de biolística melhorou a viabilidade global e reprodutibilidade do método 13. Outras melhorias na preparação fatia como solução de problemas em profundidade do processo de corte, usando uma matriz de DMEM-Agarose para preservar o cérebro, e vários outros avanços úteis para organotípica preparação fatia do cérebro relatado anteriormente 13 nos permitiu explorar o uso de fatias de adultos que desenvolveram maduraredes sinápticas.
Em nosso estudo, principalmente utilizados corantes e genes heterólogos fluorescentes para visualizar a morfologia das células como uma leitura sobre a eficiência de transfecção e uma capacidade de imagem das características morfológicas dos neurônios nos tecidos cerebrais do rato. A relação sinal-ruído da entrega estocástica dentro de um raio definido nos permitiu isolar completamente porto dendrítica de uma única célula dentro de seu contexto de origem. Como são utilizados numerosos esforços para investigar essas características morfológicas, de mapeamento 'conectonomia "ou para marcar células individuais para várias análises, este método pode ser facilmente combinada com protocolos existentes, tais como eletrofisiologia e neurite medições 29,30. Evidentemente, as combinações de genes heterólogos fluorescentes poderia permitir uma delineação muito mais robusta das células individuais como da distribuição estocástica de proteínas fluorescentes, e a sua combinação poderia determinar a cor das células individuais 31,32. A utilização de promotores específicos de células, como a sinapsina e proteína glial fibrilar ácida a montante do exão do gene heterólogo pode também restringir a expressão de 33 subpopulações. Com efeito, a variedade sem fim de material genético pode também ser administrado de uma maneira regio-selectiva por nanopartículas de ouro, utilizando o mesmo procedimento. As regiões totais transfectadas podia assim ser analisados com os métodos tradicionais, tais como a dissecção e submetendo-a região inmunotransferência para analisar o efeito localizado do gene heterólogo.
As melhorias nos processos fatia organotypic também permitirá uma maior utilização de tecidos do cérebro para a experimentação de longo prazo, bem como permitir o uso de outros tecidos e co-culturas e facilitaria os procedimentos de transfecção. Lipid e transfecção polímero previamente relatado para afetar a homeostase da membrana, internalização, permeabilidade proteína 34 e freqüentemente mostram uma eficiência muito baixa para transf terminally diferenciado neurônios. Direccionamento celular específico de carga é também susceptível apenas a células que expressam os receptores da superfície celular necessários para a internalização, e embora este método pode ser altamente selectivo, que pode faltar regiosselectividade 35 segmentada. Os vetores virais de outra forma são muitas vezes difíceis e caros de produzir, exigem normas rígidas e têm na ocasião demonstrou preocupações com a segurança. Entrega biobalística, portanto, tem uma capacidade inigualável para transf regiosseletivamente neurônios e outros tipos de células dentro dos tecidos viáveis. Como o ouro é não tóxico, mais avanços no uso de biobalística poderia pavimentar o caminho para usos biomédicos, tais como a administração transdérmica farmacêutica, na entrega gene vivo não invasiva, bem como terapias genéticas não virais localizadas.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a oficina MRC-LMB para a produção do cano da arma gene reforçada. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. David R. Hampson na Universidade de Toronto para o uso de equipamentos e recursos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
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